Pierwszenstwo: Opublikowano: 31.111.1971 62789 KI. 30 h, 2/04 MKP A 61 k, 23/00 UKD Twórca wynalazku: Tadeusz Wegrzecki Wlasciciel patentu: Ministerstwo Zdrowia i Opieki Spolecznej, wa (Polska) Warsza- Sposób otrzymywania trwalych roztworów surowic wzorcowych, przeznaczonych do okreslania grup krwi i innych badan serologicznych Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania trwa¬ lych glicerynowych roztworów surowic wzorco¬ wych, stosowanych w diagnostyce serologicznej do okreslania grup krwi, nadajacych sie do przechowy¬ wania w ciagu wieloletniego okresu, bez wzgledu 5 na stan jalowosci w temperaturach od dowolnie niskiej do +50°C, bez utraty aktywnosci.Dotychczasowe sposoby zapobiegania utraty wlas¬ ciwosci serologicznych przez surowice polegaja na ich przechowywaniu w stanie plynnym, jalowym, 10 w temperaturze 4° — 6°C, lub bez wzgledu na ja- lowosc w glebokim zamrozeniu (—20° do —30°C), albo w stanie suchym (liofilizowanym) — w tem¬ peraturze otoczenia.Przechowywane w temperaturze 4° — +6°C su- 15 r owice w stanie plynnym maja okres waznosci pól roku. Dodawane srodki antyseptyczne nie gwaran¬ tuja ochrony tych surowic przed zniszczeniem w przypadku ich zakazenia przez mikroorganizmy.Przechowywane w glebokim zamrozeniu (—20° 20 do —30°C) surowice plynne maja wieloletni okres waznosci, jednak moga utracic swoje wlasciwosci, na skutek ich kilkakrotnego zamrazania i odta- 3ania.Surowice liofilizowane musza byc przechowywa- ^ ne w hermetycznym opakowaniu, a po rozherme- tyzowaniu — niezwlocznie uzyte, poniewaz jako hygroskopijne chlona wode, co powoduje powstanie stezonych roztworów soli, denaturujacych bialka, a w konsekwencji — utrate wlasciwosci serologicz- 30 nych. Rozpuszczone (warunek uzycia) surowice lio¬ filizowane nabywaja wszystkie wady surowic plyn¬ nych.Znane jest stosowanie gliceryny jako srodka kon¬ serwujacego leki, szczepionki, komórki zwierzece oraz krwinki czerwone i plemniki w niskiej tem¬ peraturze. Na przyklad, do rozcienczania zageszczo¬ nej tuberkuliny stosuje sie 50% wodny roztwór gli¬ ceryny. Znane jest równiez sporzadzanie wyciagów watrobowych, zawierajacych 20% wodny roztwór gliceryny lub szczepionek ospowych, w których za¬ wiesina zywego zarazka ospy jest konserwowana dodatkiem gliceryny.Krwinki przeznaczone do transfuzji moga byc konserwowane w. srodowisku wodnym, w glebokim zamrozeniu z dodatkiem gliceryny, zapewniajacym koncowe stezenie tego zwiazku w krwinkach, w za¬ kresie 17,5%—40% (to samo dotyczy plemników uzywanych do sztucznej inseminacji).Dotychczasowe zastosowanie gliceryny, jako srod¬ ka konserwujacego, polega na wykorzystaniu jej wlasciwosci bakteriostatycznych. Wodne roztwory gliceryny jednak nie hamuja rozwoju plesni, co zmusza do dodatkowego stosowania fungicydów, badz jalowego przygotowania preparatów. Gliceryna stosowana w konserwacji tkanek moze byc zastapio¬ na przez inne zwiazki chemiczne, na przyklad mocznik, sorbitol, dwumetylosulfotlenek, benzoesan sodu, fenol itp., a dodawana w wodnym roztworze jako srodek konserwujacy nie jest rozpuszczalni- 62 7893 kiem bialka komórek i chroni ich strukture. W konserwacji tkanek i komórek pozostaja nie roz¬ puszczone subtelne struktury komórkowe, takie jak mitochondria i jadra komórkowe. W konserwowa¬ niu krwinek i plemników w niskiej temperaturze 5 ochronne dzialanie gliceryny polega na zapobiega¬ niu tworzenia sie duzych krysztalków lodu wew¬ natrz i poza komórka oraz posiadaniu zdolnosci przenikania do komórki i wiazania wolnej wody.W zastosowaniach tych gliceryna nie zostala uzy- 10 ta jako rozpuszczalnik suchego, bezwodnego bialka, zawierajacego immunoglobuliny.Bedacy przedmiotem wynalazku sposób sporza¬ dzania trwalych roztworów surowic wzorcowych polega na rozpuszczeniu liofilizowanej surowicy w 15 glicerynie, bez zadnych innych dodatków. Bialka surowicy calkowicie rozpuszczaja sie w glicerynie.Otrzymany preparat jest przezroczysty, koloru i kon¬ systencji plynnego miodu.Nowosc sposobu wedlug wynalazku polega na 20 tym, ze gliceryne stosuje sie nie w polaczeniu z wodnymi roztworami leków, w celu konserwacji ko¬ mórek i tkanek zawierajacych wode lub chronienia komórek przed uszkodzeniem krysztalkami lodu, lub w charakterze srodka ekstrakcyjnego, lecz w po- 25 staci bezwodnego rozpuszczalnika suchego bialka surowicy. Dodana bezwodna gliceryna chroni labil- ne immunoglobuliny przed zniszczeniem w warun¬ kach, w których w kazdej innej postaci utracilyby one swoje wlasciwosci serologiczne. 30 Wedlug wynalazku, bezwodne glicerynowe roz¬ twory surowic wzorcowych sporzadza sie w naste¬ pujacy sposób: zakwalifikowana do badan serolo¬ gicznych surowice liofilizuje sie. Cieplo doprowa¬ dzane do surowicy (konieczny warunek procesu lio- 35 filizacji) nie moze spowodowac jej ogrzania w kon¬ cowym etapie liofilizacji powyzej +40°C; otrzyma¬ na w ten sposób sucha surowice rozdrabnia sie przy uzyciu bagietki na proszek, do którego dodaje sie gliceryne o ciezarze wlasciwym 1,224 — 1,235 40 w proporcji 0,33 ml na sucha pozostalosc z 1 ml plynnej surowicy, miesza sie bagietka rozcierajac wszystkie grudki; naczynie z otrzymanym roztwo¬ rem (nieprzezroczystym na skutek zawartosci drob¬ nych pecherzyków powietrza) wraz z bagietka po- 45 zostawia sie w spokoju na okres 1 doby, a nastep¬ nego dnia ponownie dokladnie miesza i po usunieciu bagietki — zamyka gumowym korkiem; po kilku dobach nastepuje calkowite sklarowanie preparatu.Liofilizowana surowica uzyta do produkcji pre- 50 paratu moze byc niejalowa. Podobnie, rozpuszcza¬ nie suchej surowicy w glicerynie nie wymaga ja¬ lowych warunków. Preparat porcjuje sie do nieja- lowionych flakonów i po zatkaniu gumowym kor¬ kiem przechowuje w temperaturze otoczenia (od dowolnie niskiej do +50°C). 4 Mozna pobrac do uzycia czesc preparatu z opako¬ wania, bez zachowania warunków jalowosci. Roz- hermetyzowanie opakowania na okres kilku dni nie powoduje spadku serologicznej aktywnosci pre¬ paratu. Preparat jest termostabilny i odporny na zakazania mikroorganizmami oraz na dzialanie swiatla. Sprawdzony okres zachowania wlasciwosci otrzymanego preparatu nie jest krótszy niz 3 lata.W postaci bezwodnego roztworu glicerynowego mozna przygotowywac surowice do okreslania anty¬ genów czerwonych krwinek ukladów ABO i Rh, surowice antyglobulinowe (do odczynu Coombsa) i inne, stosowane w diagnostyce laboratoryjnej.Korzysci techniczne wynikajace ze sposobu we¬ dlug wynalazku polegaja na mozliwosci pracy w warunkach niejalowych i gromadzeniu zapasów surowic wzorcowych, bez koniecznosci posiadania urzadzen chlodniczych.Przyklad I. 100 ml surowicy wzorcowej ukla¬ du ABO o mianie 1:64 lub wyzszym oraz dobrej aktywnosci aglutynacyjnej w odczynie solnym za¬ mraza sie obrotowo (stale obracanie naczynia dooko¬ la wlasnej osi, co powoduje zamarzanie surowicy na sciankach naczynia, w postaci wydrazonego walca) i liofilizuje.W tym samym naczyniu sucha surowice roz¬ drabnia sie na proszek, dodaje 33 ml gliceryny, do¬ kladnie miesza bagietka, pozostawia w spokoju do nastepnego dnia, po czym ponownie miesza sie ba¬ gietka i zamyka gumowym korkiem.Przyklad II. 100 ml surowicy wzorcowej ukladu Rh o mianie 1:32 lub wyzszym oraz dobrej aktywnosci w odczynie koloidowym zamraza sie obrotowo i liofilizuje. Sucha pozostalosc rozpuszcza sie w 33 ml gliceryny i postepuje jak w przykla¬ dzie I.Przyklad III. 100 ml wodnego roztworu su¬ rowicy zwierzecia immunizowanego przeciw globuli¬ nom ludzkim, o skladzie 2 ml surowicy zwierzecia o mianie roboczym 1:50, 30 ml surowicy zwierzecia tego samego gatunku nie immunizowanego, 68 ml wody destylowanej zamraza sie obrotowo i liofili¬ zuje. Sucha pozostalosc rozpuszcza sie w 33 ml gli¬ ceryny i postepuje dalej jak w przykladzie I. PL PL