PL61680B1 - - Google Patents

Description

Sól sodowa antybiotyku 19.402 R.P. mozna zidentyfikowac metoda migracji elektroforetycznej na zelu agarozowym, którego pH utrzymywane jest na poziomie 8 za pomoca kwasu aminoocto- wego jako substancji buforujacej (agaroza jest liniowym, obojetnym polimerem galaktozy); szyb¬ kosc migracji w kierunku anody wynosi 10.10—3 cm/V/godz.Sól sodowa antybiotyku 19.402 R.P. mozna takze zidentyfikowac metoda chromatograficzna, stosu¬ jac rózne nosniki. W tabeli 2 podano wartosci Rf przy stosowaniu róznych rozpuszczalników rozwi¬ jajacych (rozwijanie chromatogramu w tempera¬ turze 20°C; wywolywanie metoda mikrobiologicz¬ na przez przylozenie chromatogramów w ciagu 5 minut do plytek agarowych posianych Staphy- lococcus aureus 209 P, a nastepnie inkubacje w ciagu nocy w temperaturze 37°C).Tabela 2 Nosnik zel krzemionko¬ wy G zel krzemionko¬ wy G + tlenek glinu G (stosunek wago¬ wy 70:30) zel krzemionko¬ wy H papier Arches 302 Rozpuszczalnik izopropanol — 2 n roztwór amoniaku (stosunek objetoscio¬ wy 70:30) izopropanol-n-buta- nol-woda (stosunek objetosciowy 50:40:30) dioksan — woda stosunek objetoscio¬ wy 80:20) n-butanol-kwas octo¬ wy (stosunek objeto¬ sciowy 60:40) n-butanol-kwas octo- wy-woda (stosunek objetosciowy 60:40:10) octan etylu-pirydyna- -woda (stosunek ob¬ jetosciowy 50:40:30) Rf 0,37 0,30 0,20 0,62 0,48 0,30 4 Aktywnosc bakteriostatyczna antybiotyku 19.402 R.P. w stosunku do róznych szczepowa okreslono metoda rozcienczen, nalezaca do metod powszech¬ nie stosowanych w tym celu. Dla kazdego szcze- 5 pu oznaczano najmniejsze stezenie substancji, które w okreslonych warunkach hamuje wzrost bakterii na odpowiednim podlozu bulionowym.Wyniki badan zestawiono w tabeli 3, w której minimalne stezenie bakteriostatyczne wyrazono- w mikrogramach substancji na 1 cm3 srodowi¬ ska.Tabela 3 Badane organizmy Staphylococcus aureus-szczep 209P- -ATCC 6538P . . , . • Staphylococcus aureus-szczep 133 (Instytut Pasteura) Staphylococcus aureus-szczep Smi¬ tha Sarcina lutea ATCC 9341 Streptococcus faecalis — ATCC 9790 Streptococcus viridans (Instytut Pasteura) Streptococcus pyogenes hemolyticus (szczep Dig 7, Instytut ¦ Pasteura) Neisseria gonorrhaeae (A150-Insty- tut Pasteura) Diplococcus pneumoniae (szczep Til, Instytut Pasteura) 1 Bacillus subtilis — ATCC 6633 Bacillus cereus — ATCC 6630 Mycobacterium species — ATCC 607 Mycobacterium .... para smegrnatis (A75-Lausanne) Escherichia coli — ATCC 9637 Shigella dysentariae — Shiga 1 (Instytut Pasteura) Salmonella paratyphi A (Lacassa, Instytut Pasteura) Salmonella schottmuelleri (parathy- pi B) Fougenc (Instytut Pasteura) Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae — ATCC 10.031 Pseudomonas aeruginosa (szczep Bass-Instytut Pasteura) Brucella bronchiseptica (CN 387- Wellcome Instytut) Brucella abortus bovis B 19 Pasteurella multocida (A 125, In¬ stytut Pasteura) 1 Treponema Reitera i Minimal¬ ne stezenie bakterio¬ statyczne (wg/cm3) 0,10 0,10 0,25 40 150 0,8 0,01 2,5 0,07 20 0,01 30 40 30 70 90 60 125 75 50 15 1 0,8 10 Wykonane oznaczenia wykazuja, ze aktywnosc antybiotyku 19.402 R.P. dotyczy glównie szczepów gramdodatnich; jego aktywnosc w stosunku do 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6061680 e Streptococcus hemolyticus jest szczególnie wyso¬ ka. Jest on natomiast stosunkowo malo aktywny w stosunku do szczepów gramujemnych, jakkol¬ wiek w stosunku do Neisseria gonorrhaeae i Bru- cella abortus bovis jego aktywnosc jest znaczna.W przypadku tego antybiotyku nie wystepuje zja¬ wisko uodpornienia sprzezonego z nastepujacymi antybiotykami: penicylina, stroptomycyna, tetra- cyklina, chloramfenikolem, spiramycyna, karbomy- cyna, erytromycyna, piristinamycyna i nowobio- cyna.Aktywnosc bakteriobójcza antybiotyku 19.402 R.P. okreslano w badaniach prowadzonych in vivo na zwierzetach doswiadczalnych zarazonych ekspery¬ mentalnie szczepami takich mikroorganizmów, jak streptokoki, pneumokoki, i staphylokoki. Wyka¬ zal on szczególna aktywnosc u myszy przy sto¬ sowaniu podskórnym, a takze cenne wlasciwosci profilaktyczne przy zakazeniu myszy staphyloko- kami lub streptokokami, podskórnym lub dozyl¬ nym.Toksycznosc antybiotyku 19.402 R.P. badano glównie na myszach. Dawke smiertelna DL30 oznaczono wprowadzajac preparat do otrzewnej.Wynosi ona 600 mg/kg. Preparat jest wiec nisko- toksyczny.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania anty¬ biotyku 19.402 R.l\ polega na tym, ze hodowle aerobowa szczepu Streptomyces peruviensis (NRRL 2757) poddaje sie procesowi wyodrebniania i oczyszczania sposobem odpowiednim dla wyosob¬ niania antybiotyku nie dializujacego, o charakte¬ rze kwasnym. Sposobem takim moze byc wy¬ dzielanie antybiotyku z brzeczki fermentacyjnej przez filtracje. Proces filtracji korzystnie jest pro¬ wadzic przy wartosci pH nizszej od 5, a najlepiej wynoszacej okolo 4. W tych warunkach cala ilosc antybiotyku 19.402 R.P. pozostaje w placku filtra¬ cyjnym, z którego mozna go wyodrebnic przy war¬ tosci pH 3—7 za pomoca wodnego roztworu alko¬ holu o niskim ciezarze czasteczkowym, na przy¬ klad metanolu. Brzeczke fermentacyjna mozna równiez filtrowac przy wartosci pH wyzszej lub równej 5, najlepiej 7—9, lecz znaczna czesc an¬ tybiotyku 19.402 R.P. pozostaje wtedy w placku filtracyjnym, który musi byc takze odpowiednio przerabiany w celu wydobycia z niego tego pro¬ duktu. Ponadto wynika wówczas problem oddzie¬ lenia antybiotyku 19.402 R.P. od antybiotyku 6.798 R.P., który przechodzi takze do przesaczu.Brzeczke fermentacyjna mozna takze przepusz¬ czac przez kolumne wypelniona zywica jonitowa o charakterze silnie anionowym i duzej porowa¬ tosci, a nastepnie wymywac produkt roztworem alkoholu, na przyklad wodnym roztworem meta¬ nolu, zawierajacym elektrolit. Niedogodnoscia tej metody jest takze koniecznosc rozdzielania anty¬ biotyków 19.402 R.P. i 6.798 R.P.Antybiotyk 19.402 R.P. jako produkt surowy mozna wydzielic z wymienionych wyzej roztwo¬ rów wodnoalkoholowych przez zatezenie roztworu do malej objetosci. Zatezenie to dogodnie jest pro¬ wadzic w temperaturze ponizej 40°C i pod cisnie¬ niem nizszym od atmosferycznego. Surowy anty¬ biotyk 19.402 R.P. wytraca sie z zatezonego roz¬ tworu przez oziebienie lub przez dodanie innego rozpuszczalnika, w którym jest on zle rozpuszczal¬ ny, takiego jak bezwodny etanol lub aceton.Antybiotyk 19.402 R.P. mozna nastepnie oczy- 5 scic przez zwiazanie na zywicy jonitowej o cha¬ rakterze silnie anionowym i duzej porowatosci i nastepnie wymycie roztworem wodnoalkoholo- wym zawierajacym elektrolit, takim jak chlorek sodowy, chlorek amonowy, chlorek potasowy, chlo^ 10 rek wapniowy lub chlorek magnezowy, w steze-* niu 5 do 50 g/l. Eluat zateza sie nastepnie do ma¬ lej objetosci w .temperaturze ponizej 40°C, pod obnizonym cisnieniem; uzyskany koncentrat dia¬ lizuje sie stosujac przeplyw wody destylowanej 15 i membrany z celulozy regenerowanej. Woda uno¬ si sole mineralne i rózne zanieczyszczenia, a anty¬ biotyk 19.402 R.P. pozostaje calkowicie w dializo^ wanym roztworze. Przez liofilizacje otrzymuje sie nastepnie produkt oczyszczony.M Celem otrzymania antybiotyku 19.402 R.P. o wyz¬ szej czystosci mozna posluzyc sie powszechnie sto¬ sowanymi metodami, takimi jak chromatografia na róznych sorbentach, rozdzielanie w przeciwpradzie lub podzial pomiedzy dwa rózne rozpuszczalniki. 25» Szczególnie korzystne okazalo sie stosowanie me¬ tody chromatograficznej przy uzyciu zelu krzemo¬ wego i wodnego roztworu antybiotyku, który wy¬ mywa sie mieszanina alkoholu propylowego i amo¬ niaku. j- Oczyszczony antybiotyk ewentualnie przeprowa= dza sie w sól metalu alkalicznego.Jest rzecza oczywista, ze rózne metody stoso¬ wane do ekstrakcji, wyodrebnienia i oczyszczenia antybiotyku 19.402 R.P. mozna powtarzac wiele razy, zgodnie z rezimem technologicznym produk¬ cji, którego celem jest otrzymanie tego antybio¬ tyku w postaci odpowiadajacej wymaganiom zwia¬ zanym z jego przeznaczeniem.Szczególnie korzystna postacia antybiotyku 19.402 R.P., otrzymywana w wyniku opisanych zabiegów technologicznych, jest postac soli metalu alkalicz¬ nego. Sól te — jezeli jest to niezbedne — mozna nastepnie przeprowadzic w wolny kwas przepusz¬ czajac stezony wodny jej roztwór przez zywice jonitowa o charakterze silnie kationowym.Podane ponizej przyklady, nie wyczerpujace wszystkich mozliwosci stosowania sposobu wedlug wynalazku, wskazuja mozliwosci jego realizacji w praktyce. W przykladach tych aktywnosc ozna¬ czano za pomoca testu biologicznego, metoda dy¬ fuzji, stosujac jako wskaznik Bacillus subtilis i od¬ noszac rezultaty do wzorca czystego preparatu 19.402 R.P. Aktywnosc te wyrazono w jednostkach na mg dla produktów stalych i w jednostkach na cm* dla roztworów (jednostke definiuje sie jako 55 najmniejsza ilosc produktu, która rozpuszczona w 1 cm1 srodowiska inhibituje wzrost Staphylo- coccus aureus 209 P w okreslonych warunkach).Przyklad I. Do kadzi fermentacyjnej o p^ 60 jemnosci 170 litrów zaladowuje sie namok z kukurydzy 4,800 kg cereloze 2,400 kg chlorek sodowy 0,600 kg siarczan magnezowy 0,120 kg 65 wode do pojemnosci : 110 litrów 40 4561680 8 Po doprowadzeniu pH mieszaniny do wartosci 7,40 za pomoca 660 cm8 stezonego (d = 1,33) roz¬ tworu wodorotlenku sodowego dodaje sie nastepnie 600 g weglanu wapniowego.Podloze wyjalawia sie przepuszczajac pare o temperaturze 122°C w ciagu 40 minut. Po ozie¬ bieniu objetosc pozywki wynosi 120 litrów, a jej wartosc pH = 6,95. Podloze to posiewa sie 200 cm8 hodowli wytrzasanej w kolbie stozkowej zawiera¬ jacej szczep „Streptomyces peruviensis (NRRL 2757)". Rozwój kultury zachodzi przy mieszaniu i napowietrzaniu srodowiska wysterylizowanym po¬ wietrzem, w temperaturze 30°C, w ciagu 26 go¬ dzin; w tym stanie jest ona przydatna do posie- wania hodowli produkcyjnej.Hodowle w skali produkcyjnej prowadzi sie w kadzi fermentacyjnej o pojemnosci 800 1, do której zaladowuje sie nastepujace substancje: pulpe kukurydziana 22 kg skrobie 8,250 kg olej sojowy 8,250 1 weglan wapniowy 5,500 kg fosforan jednopotasowy 1,100 kg siarczan magnezowy 1,100 kg chlorek kobaltawy uwodniony lig wode do objetosci 510 litrów Podloze wyjalawia sie przepuszczajac belkotkowo pare wodna o temperaturze 122°C w ciagu 40 mi¬ nut. Ro ochlodzeniu objetosc mieszaniny wynosi 550 1, a jej wartosc pH — po uprzednim dodaniu 250 ml stezonego roztworu wodorotlenku sodo¬ wego o gestosci 1,33—6,60. Nastepnie wprowadza sie w celu posiania 55 1 hodowli ze 170 1 kadzi fermentacyjnej. Proces prowadzi sie w tempera¬ turze 30°C w ciagu 123 godzin, mieszajac srodo¬ wisko za pomoca mieszadla o szybkosci obrotów 285/min. i napowietrzajac je wysterylizowanym powietrzem, wprowadzanym w ilosci 25 ni8/h. War¬ tosc pH srodowiska po tym czasie wynosi 8,10, a objetosc 520 litrów. Brzeczka fermentacyjna za¬ wiera w 1 cm1 2420 jednostek antybiotyku.Przyklad II. 520 litrów brzeczki fermenta¬ cyjnej zawierajacej 2420 jednostek antybiotyku w 1 cm8, o wartosci pH = 8,1 (wytworzonej jak opisano wyzej) umieszcza sie w kadzi zaopatrzonej w mieszadlo i doprowadza pH srodowiska do war¬ tosci 4 przez dodanie 37 procentowego roztworu kwasu fosforowego. Nastepnie wprowadza sie 15 kg substancji ulatwiajacej filtracje. Mieszanine fil¬ truje sie na prasie filtracyjnej, a osad przemywa sie 250 1 wody wodociagowej.Przesacz i wody z przemycia osadu (praktycznie nieaktywne) odprowadza sie do kanalizacji scieko¬ wej. Placek filtracyjny rozprowadza sie, miesza¬ jac w 350 1 mieszaniny metanolowo-wodnej za¬ wierajacej 270 1 metanolu. pH mieszaniny dopro¬ wadza sie do wartosci 7 za pomoca 10 n roztworu weglanu sodowego. Calosc miesza sie w ciagu 1 go¬ dziny, a nastepnie zawiesine poddaje sie filtracji na prasie filtracyjnej. Filtrat .odbiera sie, a pla¬ cek przemywa sie 100 1 mieszaniny metanolowo- -wodnej zawierajacej 70 procent objetosciowych metanolu.Polaczone . przesacze, których objetosc wynosi lacznie 440 litrów zawieraja 2320 jednostek anty¬ biotyku w 1 cm8. Placek filtracyjny stanowi od¬ pad produkcyjny.Przesacze zateza. sie pod obnizonym cisnieniem (35 mm Hg) w temperaturze 37°C do objetosci 6 1. 5 Do skoncentrowanego roztworu dodaje sie 3 litry alkoholu etylowego, a nastepnie wytraca sie osad wprowadzajac mieszanine 30 1 alkoholu etylowego i 40 1 acetonu. Wytracony antybiotyk oddziela sie przez filtracje, przemywa acetonem i suszy w su- io czarni pracujacej pod cisnieniem 5 mm Hg. Otrzy¬ muje sie 1009 g surowego produktu barwy brazo¬ wej o mianie 950 jednostek/mg, stanowiacego sól sodowa preparatu 19.402 R.P.Przyklad III. 900 g surowego produktu otrzy- 15 manego sposobem opisanym w przykladzie II, o mianie 950 jednostek/mg, rozpuszcza sie w 10 1 wody destylowanej. Roztwór filtruje sie i przepusz¬ cza przez kolumne o srednicy wewnetrznej 9 cm, zawierajacej 8 litrów zywicy jonitowej Dowex 20 1X2 (w cyklu chlorowym); natezenie przeplywu wynosi okolo 2 l/h. Kolumne przemywa sie suk¬ cesywnie: woda destylowana az do zaniku barwy 8 1 po 12 Uh, 25 mieszanina kwasu mrówkowego z woda, zmiesza¬ nych w stosunku objetosciowym 10 :90, 24 1 po 12 l/h, mieszanina kwasu mrówkowego, z woda i meta¬ nolem, zmieszanych w stosunku objetosciowym 30 10 :10 :80, 24 1 po 12 l/h, mieszanina metanolu z woda zmieszanych w sto¬ sunku objetosciowym 80 : 20, 24 1 po 12 l/h.Antybiotyk wymywa sie mieszanina wody z me¬ tanolem zmieszanymi w stosunku objetosciowym 35 20 :80, zawierajacej dodatek 10 g/l chlorku pota¬ sowego, która przepuszcza sie przez kolumne z szybkoscia odpowiadajaca przeplywowi 10 l/h. Od¬ biera sie oddzielnie frakcje po 10 1. Frakcje od¬ znaczajace sie najwyzsza aktywnoscia (4—6) laczy 40 sie i zateza pod obnizonym cisnieniem w tempe¬ raturze ponizej 40°C do objetosci 3 litrów.Koncentrat poddaje sie dializie stosujac trzy¬ krotnie po 40 1 wody destylowanej i blone z ce¬ lulozy regenerowanej, uwalniajac produkt od soli 45 i innych zanieczyszczen, a nastepnie liofilizuje sie go.Otrzymuje sie 35 g soli potasowej antybiotyku 19.402 R.P. o postaci bezpostaciowego proszku barwy piaskowej i mianie 13800 jednostek/mg; 50 jego maksimum absorpcji w nadfiolecie wystepuje przy 257 mu{E ^= 84).Przyklad IV. 5 g antybiotyku oczyszczonego 55 sposobem opisanym w przykladzie III rozpuszcza sie w 20 cm8 wody destylowanej i zarabia z 25 g aktywnej krzemionki. Otrzymana paste suszy sie w temperaturze otoczenia w ciagu nocy pod ci¬ snieniem 2 mm Hg, a nastepnie umieszcza w gór¬ nej czesci kolumny o srednicy wewnetrznej 4 cm wypelnionej 500 g suchej aktywnej krzemionki.Chromatogram rozwija sie za pomoca nastepu¬ jacych rozpuszczalników stosowanych sukcesywnie: — mieszanina n^propanolu z 2 n roztworem amo- 65 niaku (stosunek objetosciowy 100 :20), 2,4 1.61680 9 — mieszanina n-propanolu z 2 n roztworem amo¬ niaku (stosunek objetosciowy 80 : 20), 2 1, a na¬ stepnie eluuje sie go mieszanina n-propanolu z 2 n roztworem amoniaku (stosunek objetoscio¬ wy 80 :30), odbierajac frakcje po 50 cm3.Frakcje 1—50 oraz 51—75 laczy sie, zateza pod obnizonym cisnieniem, w temperaturze ponizej 40°C. w celu odpedzenia propanolu, a nastepnie koncentrat liofilizuje sie.Z frakcji 1—50 otrzymuje sie produkt A w ilo¬ sci 1300 mg o mianie 15.700 jednostek/mg.Z frakcji 91—75 otrzymuje sjte produkt B w ilo¬ sci 1300 mg o mianie 15.700 jednostek/mg. 1200 mg produktu A rozpuszcza sie w 20 cm3 wody destylowanej i miesza, wprowadzajac maly¬ mi porcjami, z zywica jonitowa Amberlite IR 120 (w cyklu kwasowym) az do ustalenia sie pH. Zy¬ wice odfiltrowuje sie i przemywa 10 cm3 wody destylowanej. Przesacz glówny i z przemycia laczy sie i dodaje sody az do uzyskania roztworu o war¬ tosci pH = 8. Nastepnie dializuje 'sie- go w ciagu nocy stosujac dwukrotnie po 1 l wody destylowanej i blone z celulozy regenerowanej. Przez liofilizacje roztworu, który nie dializuje (nie przeszedl) przez blone z celulozy regenerowanej otrzymuje sie 945 mg soli sodowej antybiotyku 19.402 R.P. w po¬ staci stalej.Produkt ten zawiera 17.800 jednostek/mg i cha¬ rakteryzuje sie nastepujacym skladem elementar¬ nym. 10 C — 46,25%; H — 6,9%; O — 36,70%; N — 2,l°/o; P — 2,4%; S — 0,6%; Na — 3,05%. 5 PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku ozna¬ czonego symbolem 19.402 R.P. ewentualnie w po¬ staci soli, znamienny tym, ze hodowle aerobowa io szczepu Streptomyces Peruviensis (NRRL. 2757) pod¬ daje sie pro sposobem odpowiednim dla wyosobniania antybio¬ tyku nie dializujacego o charakterze kwasnym ta¬ kim jak filtracja brzeczki fermentacyjnej przy 15 wartosci pH nizszej od 5 i nastepna ekstrakcja placka filtracyjnego przy wartosci pH = 3—7 wod¬ nym roztworem alkoholu o niskim ciezarze cza¬ steczkowym lub tez przepuszczanie brzeczki fer¬ mentacyjnej przez kolumne wypelniona zywica jo- 20 nitowa o charakterze silnie anionowym i o duzej porowatosci, nastepne wymywanie roztworem wod- noalkoholowym elektrolitu, nastepne zatezanie otrzymanego roztworu organicznego w kazdym z tych sposobów do malej objetosci i wytracanie 25 z niego antybiotyku przez dodanie innego rozpusz¬ czalnika takiego jak etanol lub aceton, w którym antybiotyk jest zle rozpuszczalny i kolejne oczysz¬ czanie zwyklymi metodami fizykochemicznymi, po czym otrzymany antybiotyk ewentualnie przypro- 30 wadza sie w sól metalu alkalicznego. PL PL