PL60826B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki z oslabionego zywego wi¬ rusa rózyczki, w drodze pasazowania wirusa w ho¬ dowli tkankowej zarodka kurzego, przy czym ogól¬ nie wirus rózyczki izoluje sie z materialu klinicz¬ nego przez zaszczepienie go badz w hodowli tkan¬ kowej zarodka kurzego, badz tez hodowli tkanko¬ wej malpy „Cercopitheaus aethiops" i poddanie tej hodowli inkubacji w temperaturze 30—38°, a na¬ stepnie sukcesywnie pasazuje sie wirus w srodowi¬ skach hodowlanych dostateczna ilosc razy w celu oslabienia wirusa, przy czym co najmniej dziesiec z wymienionych pasazy dokonuje sie w srodowisku dziesiecio — do — jedenastodniowego embrionu kur¬ czecia w srodowisku wzrostu komórki w tempera¬ turze 30—38°C.Po kazdym pasazu dokonuje, sie oznaczenia zdol¬ nosci na zbiorach pobranych w odstepach 2—14 dni 6082660826 zamrozonych do chwili przeprowadzania pomiarów.O ile pomiary wykazuja zbyt duzy stopien wiru- lentnosci wirusa, poddaje sie go ponownemu pasa- zowaniu w srodowisku hodowlanym. Ten sposób wytwarzania szczepionki polega na przeprowadze¬ niu nastepujacych etapów: A — wyizolowaniu wi¬ rusa zlosliwego w jednej z odmian komórek w ho¬ dowli i jego adaptacje do hodowli komórek em¬ brionu kurzego, B — wytworzeniu oslabionego zy¬ wego wirusa w drodze seryjnych pasazy w tkance embrionu kurzego; C — przygotowaniu tego osla¬ bionego zywego wirusa do uzytku.A — wyodrebnianie i adaptacja wirusa rózyczki moga byc wykonane w hodowli tkankowej embrio¬ nu kurzego przy uzyciu materialu klinicznego lub wirusa uprzednio rozmnozonego w innym rodzaju hodowli tkankowej, jak nerki malpy lub embrionu kaczki. Inkubacji zakazonych hodowli dokonuje sie w temperaturze 30-34°C (optymalnie 32°C) lub 35- 38°C (optymalnie 36°C). Przykladowo procedury wy¬ odrebniania wirusa sa nastepujace: Procedura 1. Wirus rózyczki izoluje sie w ho- , dowli tkankowej nerki malpy „Cercopithecus ae- thiops" i nastepnych pasazach na zarodkowych ja¬ jach kurzych hodowli tkankowej nerki malpiej, ho¬ dowlach tkankowych embrionu kaczego i embrionu kurzego.Procedura 2. Wirus rózyczki izoluje sie w ho¬ dowli tkankowej nerki malpy „Cercopothecus ae- thiops" oraz pasazach hodowli tkankowych nerki malpiej i hodowli tkankowej embrionu kurzego.Procedura 3. Wirus rózyczki wyodrebnia sie z materialu klinicznego w hodowli tkankowej em¬ brionu kaczego i hodowli tkankowej embrionu kacz¬ ki i hodowli tkankowej embrionu kurzego w naste¬ pnych pasazach.B. Wytwarzanie szczepionki z oslabionego zywego wirusa rózyczki polega na tym, ze rozpoznany w etapie A jako wirus rózyczki wprowadza sie do bu¬ telek szklanych, zawierajacych hodowle tkankowa embrionu kurzego, przygotowana z posiekanych in- strypsynowanych dziesieciodniowych embrionów kurzych. Srodowiskiem hodowli moze byc kazde srodowisko sprzyjajace rozwojowi komórek, na przyklad znane srodowisko 199, do którego dodano surowice cieleca. Sklad srodowiska 199 zostal opi¬ sany w np. publikacji Diagnostic Procedures for Rickettsial Diseases, 1964, str. 158—163.Po Wprowadzeniu wirusa, zakazone hodowle ko¬ mórkowe poddaje sie inkubacji w kolejnych pasa¬ zach w temperaturze 30—38°C korzystnie 30—34°C (optymalnie 32°C) oraz 35-38°C (optymalnie 36°C) znanym sposobem na przyklad wstrzasajac lub sta¬ cjonarnie w zmiennych okresach czasu, w których wirus rozmnaza sie w znacznych ilosciach, a jedno¬ czesnie oslabia sie.Powyzsze seryjne pasaze byly dokonywane przy uzyciu rozcienczonego lub nierozcienczonego mater¬ ialu zakaznego do szczepienia (inoculum), przy czym uzyskano wielokrotne zbiory w róznych okresach I czasu. Oznaczenie miana dokonywane bylo w hodo¬ wlach tkankowych malpy „Cercopithecus aethiops".W odpowiednich okresach czasu hodowle byly traktowane przy uzyciu 1000 TDIDso wirusa prowo¬ kujacego, wykazujacego wlasnosci oddzialywania 30 (Buyamwera). Hodowle nie wykazujace objawów cytopatologicznych prowokujacego Wirusa w ciagu 3—4 dni po traktowaniu, uwazane byly za zakazone wirusem rózyczki. 5 Wirus nastepnie zabierano i przechowywano w stanie zamrozonym lub w niskiej temperaturze, w celu utrzymania jego zakaznosci.C. Przygotowanie do uzytku wirusa rózyczki, polega na tym, ze wirus zebrany po tym powtarzal- 10 nym pasazu stabilizuje sie-przy uzyciu odpowied¬ niego stabilizatora, jak cukru trzcinowego, bialka ludzkiego, glutaminy, fosforanu lub mieszaniny tych substancji. Po oznaczeniu miana w celu ustalenia jego mocy, material wirusowy dzieli sie i wlewa do 15 ampulek, do bezposredniego uzytku.Produkt nalezy przechowywac i rozprowadzac w stanie zamrozenia lub w postaci liofilizowanej. Na¬ lezy przechowywac go bez dostepu wilgoci.Poniewaz stwierdzono, ze produkt nie jest cho- 20 robotwórczy dla malpy i gryzoni, celowe jest jego wypróbowanie na czlowieku, w celu ustalenia wlas¬ nosci immunizacyjnych. Wynalazek jest blizej wy¬ jasniony w nastepujacych przykladach: Przyklad I. Jako wyjsciowe inoculum stosuje sie material otrzymany w procedurze 1. Dziewie- cio- do jedenastodniowe embriony kurze po usunie¬ ciu glów i konczyn, sieka sie w warunkach asep- tycznych, a rozdrobniona tkanke przemywa sie kil¬ kakrotnie w plynie Hanksa BSS. Przemyta tkanke trypsynuje sie w temperaturze 36°C przy uzyciu trypsyny 0,25'Vo (firmy Difco 1 :250) w zbuforowa- nym roztworze solnym trzech soli w ciagu dwóch do trzech godzin.Sklad mieszaniny trzech soli jest nastepujacy: 35 Sole — mieszanina 1 litr roztworu NaCL 8,00 g: KCL 0,38 g Na2HP04 0,10 g dekstroza % 1,00 g 40 trójhydroksymetyloaminometan 3,00 g: trypsyna 2,50 g wartosc pH 4= nastawia sie na 7,4 przed dodaniem . trypsyny.Zawiesine komórki trypsynowej zbiera sie za po- 45 moca dwóch warstw gazy jalowej i odwirowuje sie przy 1500 obr/min w ciagu 5 min. Komórki przepro¬ wadza sie ponownie w zawiesine w srodowisku ho¬ dowli w celu ich przeliczenia. Srodowisko hodowli sklada sie ze srodowiska 199 (Morgan, J. F., Mor- 50 ton, H. J. i Parker, R. C. Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 73: 1—8, 1950), zawierajacego 2°/o surowicy cielecej agamma ogrzanej do temperatury 50°C w ciagu 30 minut i 50 mcg/ml neomycyny. Surowica agamma jest to surowica, z której usunieto gamma 55 globuline w procesie frakcjonowania.Hodowle butelkowe posiewa sie tak, aby uzyskac stezenie 350.000 zywych komórek na ml. Po inku¬ bacji w temperaturze 36°C w ciagu 48—96 godzin,, hodowle butelkowe. moga byc uzyte do seryjnego 60 pasazowania lub przygotowania szczepionki.Hodowle tkankowe embrionu kurzego przygoto¬ wuje sie w butelkach szklanych, przy zastosowaniu srodowiska 199, zawierajacego 2°/o inaktywowanej agamma surowicy cielecej, jako pozywki wzrosto* €5 WeJ'80826 6 Po trzech lub czterech dniach od rozpoczecia ho¬ dowli, wybiera sie pozywke wzrostowa w warun¬ kach aseptycznych, a hodowle butlekowe przemywa sie cztery razy plynem Hanksa BSS, 100 ml na je¬ dno przemycie i nastepnie zaszczepia 2—3 ml wyzej wymienionego posiewu wirusa rózyczki, na jedna butelke.Siedemdziesiat do stu ml pozywki 199, zawieraja¬ cej 10Vo odpowiedniego stabilizatora zakaznosci na przyklad sorbitolu lub albumisolu-na fiolke dodaje sie do kazdej hodowli butelkowej a butelki podda¬ je sie inkubacji w temperaturze 30—34°C. Do po¬ zywki wzrostowej i utrzymujacej dodaje sie neomy¬ cyne w stezeniu 50 mcg/1.Wielokrotne zbiory dokonuje sie w odpowiednich odstepach czasu, od 2 do 4 dni, a hodowle butelko¬ we ponownie zasila sie swieza pozywka, zawieraja¬ ca wyzej wymieniony stabilizator.Oznaczenia wskaznika zakazenia kazdego zbioru wykonywane sa w hodowlach tkankowych nerki malpy „Cercopithecus aethiops". Kazdy zbiór doko¬ nywany jest w warunkach aseptycznych i umiesz¬ czany w wyjalowionych naczyniach, próbki pobiera sie do wyjalowienia a reszte zamraza sie w kapieli alkoholowej przy uzyciu suchego lodu.Plyny zawierajace wirusy przechowuje sie w tem¬ peraturze —70°C w elektrycznych chlodziarkach, do czasu wybrania zbioru lub zbiorów do przygoto¬ wania szczepionki. Odpowiedni zbiór lub zbiory wybiera sie po oznaczeniu zdolnosci zakazenia.Wybrany material usuwa sie z chlodziarki i od¬ mraza sie. Nastepnie pobiera sie próbke w celu kon¬ troli. Do pozostalego plynu dodaje sie dodatkowo odpowiedni wspomniany stabilizator. Material na¬ stepnie oczyszcza sie, po czym pobiera sie próbke do próbnego zaszczepienia malpy. Po osuszeniu, fiol¬ ki kapsluje sie, lakuje i przechowuje sie az do chwi¬ li uzycia szczepionki po dodaniu wody sterylizowa¬ nej.Moc produktu ocenia sie na podstawie zdolnosci infekcyjnej hodowli komórkowych.Przyklad II. Przeprowadza sie procedure jak w przykladzie I, lecz inkubacja wirusa rózyczki od¬ bywa sie w temperaturze 35—38°C, najkorzystniej okolo 36°C.Mozna wykonac ponad dziesiec pasazy wirusa na hodowli tkankowej embrionu kurzego, w celu dal¬ szego oslabienia wirusa. Seryjne pasaze moga obej¬ mowac równiez inkubacje hodowli nerki malpy „Cercopithecus aethiops" lub zarodkowych jaj ku¬ rzych, co wyjasnione jest na nastepujacych przykla¬ dach: GMK — oznacza hodowle malpy „Cercopithecus aethiops".EAM — oznacza zarodkowe jaja kurze.CEF — oznacza hodowle tkankowa embrionu ku¬ rzego.DEF — oznacza hodowle tkankowa embrionu kacz¬ ki.Przyklad III. 2 GMK — i EAM — 9 GMK — 5 DEF (36°C) - 26 DEF (32°C) - CEF (32°C).Przyklad IV. GMK - CEF (32°C; 36°C).Przyklad V. 77 GMK - 3 DEF - CEF (32°C) Przyklad VI. Material kliniczny (wypluczyny z gardla) - DET - CEF (32°C).Przyklad VII. 5 GMK - 1 CEF - 2 DEF - CEF (32°C). io Wynalazek zostal opisany ze szczególnym uwzgle¬ dnieniem dziesieciu seryjnych pasazy przez hodowle tkankowa embrionu kurzego w celu oslabienia wi¬ rusa, jednak wystarczajaca jest mniejsza ilosc ope¬ racji. 15 Tak wiec, wynalazek przewiduje pojedyncza in¬ kubacje w hodowli tkankowej embrionu kurzego, w celu otrzymania wirusa wywolujacego reakcje przeciwciala wirusa u czlowieka, przy zmniejszeniu powaznych objawów choroby wystepujacych w nor- 20 malnych jej przebiegu.Nastepne procesy po pierwszym wzroscie w ho¬ dowli tkankowej embrionu kurzego, moga przyczy¬ nic sie do dalszego oslabienia wirusa. 25 55 PL PL PL PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania szczepionki rózyczki, znamienny tym, ze wirus rózyczki izoluje sie z ma- 30 terialu klinicznego przez zaszczepienie go w hodowli tkankowej embrionu kurzego lub w hodowli tkan¬ kowej malpy „Cercopithecus aethiops" i inkubacje wymienionej hodowli w temperaturze 30—38°C, na¬ stepnie sukcesywnie pasazuje sie wymieniony wi- 35 rus w srodowiskach hodowlanych w celu oslabie¬ nia wirusa, przy czym co najmniej dziesiec z wy¬ mienionych pasazy dokonuje sie w srodowisku za¬ wierajacym hodowle dziesiecio-. do jedenastodnio- wego embrionu kurczecia, pozbawionego glowy 40 i konczyn, posiekanego i strypsynowanego, w sro¬ dowisku wzrostu komórki w temperaturze 30—38°C, a jednoczesnie po kazdym pasazu dokonuje sie ozna¬ czenia , zdolnosci zakazania na zbiorach próbnych, pobranych w odstepach 2—14 dni, przy czym zbiory 45 te zamraza sie do momentu dokonywania pomiaru, zas jezeli wirusy wykazuja zbyt duzy stopien wiru- lentnosci, poddaje sie je ponownemu pasazowaniu w srodowisku hodowlanym.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 50 stosuje sie dziesieciodniowy embrion kurzy.

3. Sposób wedlug zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, ze inkubacje wirusa zarówno w etapie izolacji jak „ i pasazowania prowadzi sie w temperaturze 30— 34°C.

4. Sposób wedlug zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, ze inkubacje wirusa zarówno w etapie izolacji jak i pasiazowania prowadzi sie w temperaturze 34— 38°C. PL PL PL PL