PL60449B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 10.VII.1970 60449 KI. 30 h, 6 MKP C 12 k, 5/00 UKD Wlasciciel patentu: Merck and Co., Inc., Rahway (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób otrzymywania szczepionki rózyczki Wynalazek dotyczy otrzymywania szczepionki rózyczki zawierajacej oslabiony zywy wirus ró¬ zyczki.Dzieki temu, ze szczepionka zawiera wirus' w oslabionej formie, powoduje ona niewielka go¬ raczke i nieznaczne kliniczne reakcje organizmu.Wytwarza ona natomiast dostateczna ilosc prze¬ ciwcial w organizmie czlowieka i zwierzecia, wy¬ starczajaca do zabezpieczenia organizmu przed in¬ fekcja wirusowa. Rózyczka jest zwykle lagodnie przebiegajaca choroba u dzieci, chociaz moze po¬ wodowac komplikacje artretyczne, zapalenie ner¬ wów, zapalenie mózgu. Choroby umyslowe zdarza¬ ja sie rzadziej niz w przypadku odry. Infekcja kobiety w pierwszych trzech miesiacach ciazy, mo¬ ze spowodowac opóznienia w okresie dojrzewania plodu. Wirus atakuje zarodek powodujac nie¬ wlasciwy rozwój embrionu, co w efekcie powo¬ duje takie defekty jak: mikrocefal, gluchote, de¬ fekty oczu, nieprawidlowy rozwój serca i ukladu zebowego. Niebezpieczenstwo wirusa rózyczki dla plodu w pierwszych dwóch lub trzech miesiacach ciazy jest tak wielkie, ze mlode dziewczeta po¬ winny byc zaszczepione przed uzyskaniem doj¬ rzalosci plciowej. Szczepionka oslabionego wirusa zgodnie z niniejszym wynalazkiem moze uodpor¬ nic organizm.Celem wynalazku jest wynalezienie sposobu otrzymywania szczepionki wywolujacej powsta¬ wanie przeciwcial zwalczajacych wirus rózyczki. 15 20 30 Cel ten osiagnieto dzieki temu, ze wirus rózycz¬ ki izoluje sie z materialu klinicznego przez za¬ szczepienie hodowli tkankowej embrionu kaczki lub hodowli tkankowej nerki malpy i inkubacje tej hodowli w temperaturze 30—38°C, nastepnie sukcesywnie pasazuje sie wymieniony wirus do¬ stateczna ilosc razy w osrodku hodowlanym w celu oslabienia wirusa, przy czym przynajmniej dziesiec z wymienionych pasazy dokonuje sie w srodowiskach zawierajacych hodowle pokrajane¬ go i potraktowanego trypsyna dziesiecio- lub je- denastodniowego, pozbawionego glowy i konczyn embrionu kaczki, w srodowisku wzrostu komórek w temperaturze 30-=-38°C, a jednoczesnie po kaz¬ dym wspomnianym pasazu przeprowadza sie oznaczenie zdolnosci zakazenia na zbiorach prób¬ nych w odstepach dwu do czternastu dni, które to zbiory zamraza sie do momentu dokonywania pomiaru, przy czym w przypadku jezeli wirusy wykazuja zbyt duzy stopien wirulentnosci, pod¬ daje sie go ponownemu pasazowaniu w srodowis¬ ku hodowlanym.Sposób wedlug wynalazku obejmuje nastepu¬ jace etapy: A, izolacji zlosliwego wirusa w jakiej¬ kolwiek odmianie komórek w hodowli, jego ada¬ ptacji do hodowli komórkowej embrionu kaczki; B, rozwoju oslabionego zywego wirusa poprzez szereg etapów rozwoju w tkance kaczego embrio¬ nu i C, przygotowanie szczepionki opartej na wy- 60 4493 zej wspomnianym wirusie. Etapy te sa ponizej oddzielnie opisane.A. Izolacja i adaptacja zlosliwego wirusa.Mozna dokonac izolacji i adaptacji wirusa ró¬ zyczki w hodowli tkankowej embrionu kaczki, u- zywajac materialu klinicznego (na przyklad tam¬ ponu za pomoca którego pobiera sie wymaz z gardla) lub za posrednictwem uprzednio rozprze¬ strzenionego wirusa w innym typie hodowli ko¬ mórkowej, takiej jak nerka malpy lub zaplod¬ nione jajka. Mozna przeprowadzac inkubacje zain¬ fekowanych hodowli w temperaturze pomiedzy 30°C a 38°C, najlepiej w.30—34°C (optymalna 32°C) lub w temperaturze 35--380C (optymalna 36°C). 15 Ponizej podano typowe procedury etapu A Procedura 1. Wirus rózyczki izoluje sie w hodo¬ wli tkankowej embriona kaczki z materialu kii- 20 nicznego, na przyklad z gardla osoby zarazonej rózyczka. * Procedura 2. Wirus rózyczki z klinicznego ma¬ terialu jest wyizolowany w hodowli tkankowej ?.s nerki malpy.B. Rozwój szczepionki oslabionego zywego wi¬ rusa rózyczki 3C Wirus,' po jego zidentyfikowaniu w etapie A, dodaje sie do szklanych butelek zawierajacych hodowle tkankowa embrionu kaczki! przygotowana z rozdrobnionego i potraktowanego trypsyna dziesieciodniowego embrionu kaczki. Srodowisko 35 hodowlane moze byc jednym z jakichkolwiek sro¬ dowisk podtrzymujacych wzrost komórki. Moze to byc na przyklad srodowisko 199, do którego zo¬ stala dodana surowica cieleca. Sklad tego srodo¬ wiska opisany zostal ,np. w publikacji Dilagnostic 40 Procedures for Viral and Rickettsial Diseases, 1964, str. 158—163. Po dodaniu wirusa, zainfeko¬ wane hodowle komórkowe poddaje sie inkuba¬ cji w sukcesywnych etapach, w temperaturze po¬ miedzy 30°C a 38°C (optymalna 36°C). Podczas 45 powyzszego procesu, wirus rozmnaza sie w wiel¬ kich ilosciach i zostaje oslabiony. Powyzsze suk¬ cesywne etapy zostaly przeprowadzone przy za¬ stosowaniu rozcienczonej lub nierozcienczonej szczepionki (inoculum). Pobierano w róznorodnych 50 odstepach czasu rózne próbki. Przeprowadzono na¬ stepnie, miareczkowanie w hodowlach tkankowych nerki malpy. W odpowiednich okresach czasu, hodowle byly traktowane okolo 1000 TDID50 wi¬ rusa prowokujacego, majacego wlasciwosci od- 55 dzialywania (ECHOn, Bunyamwera, itd.). Hodo¬ wle w probówkach nie wykazujace objawów cy- topatologicznych prowokujacego wirusa — w cia¬ gu 3—4 dni po potraktowaniu, uwazane byly za zakazone wirusem rózyczki. Wirus zbiera sie na- 6& stepnie i przechowuje w niskiej temperaturze, aby utrzymac jego zakaznosc.C. Stwierdzono, ze wirus rózyczki otrzymany po szeregu etapach rozwoju byl ntepatogeniczny dla 65 449 4 - malp i gryzoni, i powodowal lekka chorobe u lu¬ dzi oraz powstawanie pozadanej ilosci neutrali¬ zujacych przeciwcial. Zdolnosc infekcyjna wirusa stabilizuje sie za pomoca odpowiedniego stabili¬ zatora takiego jak sacharoza, ludzka albumina, glutamina lub fosforan lub ich mieszanina. Po operacji miareczkowania ustalajacego jego moc, mase wirusa dzieli sie i napelnia nia ampulki przeznaczone do pózniejszego uzycia. Produkt mozna przechowywac w stanie zamrozonym w suchym otoczeniu pozbawionym wilgoci.Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Jako wyjsciowe inoculum sto¬ suje sie material Otrzymany w sposób opisany w procedurze 1. Embriony kacze 9-11-dniowe, po od¬ laczeniu glcwy i czesci wystajacych (odnóza) do¬ kladnie sie rozdrabnia w warunkach aseptj^cz- nych, a rozdrobniona tkanke przemywa szereg ra¬ zy w swiezym plynie Hanksa BBS. Wymyta tkan¬ ke nastepnie traktuje sie 0,25% trypsyna w tem¬ peraturze 26°0 \(Difco 1 : 259) w mieszaninie trzech soli buforowych (sól trypsynowa), w tym przypad¬ ku w ciagu dwóch i pól-godzin.Sklad mieszaniny soli: 1,0 litr roztworu NaCI 8,00 g KC1 0,38 g Na2HP04 0,10 g dekstroza 1,00 g trójhydroksymetyloaminometan 3,00 g trypsyna 2,50 g Wartosc pH nastawia sie na 7,4 przed dodaniem trypsyny. Nastepnie, zawiesine komórek potrakto¬ wanych trypsyna odsiewa sie poprzez dwie gru¬ bosci wysterylizowanej gazy. i odwirowuje przy 1500 obr/min w ciagu 5 minut. Upakowane ko¬ mórki umieszcza sie w osrodku wzrostowym w celu policzenia. Srodowisko wzrostowe sklada sie ze srodowiska 199 (Morgan, J. F. Morton. H. J. and Parker, R. C. Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., •73:1-8, 1950) zawierajacego 2% surowicy cielecej agamma (Surowica cieleca agamma oznacza su¬ rowice cieleca, z której usunieto globuline gam¬ ma w procesie frakcjonowania) ogrzewanej w temperaturze 56°C w ciagu 30 minut i 50 mcg/ml neomycyny. Hodowle w butelkach posiewa sie w celu otrzymania stezenia 350 000 zdolnych do zycia komórek na ml. Po operacji inkubacji w tempe¬ raturze 36°C w ciagu 36—48 godzin, hodowle bu¬ telkowe mozna zastosowac w seryjnym etapie roz¬ woju lub do przygotowania szczepionki.Hodowle tkankowe embrionu kaczki przygoto¬ wuje sie w szklanych butelkach przy zastosowa¬ niu srodowiska 199, zawierajacego 2% dezaktywo- wanej cielecej surowicy jako srodowiska wzrosto¬ wego. Trzy do czterech dni po posianiu, odciaga sie w' aseptycznych warunkach srodowisko wzro¬ stowe, a hodowle butelkowe przemywa cztery ra¬ zy BBS Hanksa, 100 ml na jedno przemycie, a nastepnie zaszczepia 2,5 milimetrami wyzej wspom-60 449 6 nianego nierozcienczonego wirusa rózyczki na bu¬ telke. Szescdziesiat ml srodowiska 199, zawiera¬ jacego 10% sorbitolu w charakterze stabilizatora zakaznosci, dodaje sie do kazdej hodowli butelko¬ wej, a nastepnie butelki poddaje sie inkubacji w temperaturze 30—34°C. Neomycyne o stezeniu 50 mcg/ml wlacza sie do srodowiska wzrostowego.Przeprowadza sie szereg zbiorów w odstepach cza¬ su 2—4 dni, przy czym butelki z hodowla sa po¬ wtórnie wypelniane swiezym srodowiskiem, za¬ wierajacym wyzej wspomniany czynnik stabili¬ zujacy. Kolejne etapy rozwoju odbywaja sie w temperaturze 32°C. Przeprowadza sie miareczko¬ wanie zdolnosci infekcyjnej kazdego zbioru* w ho¬ dowlach tkankowych nerki malpy. Kazdy zbiór gromadzi sie w warunkach aseptycznych w wy- sterylizowanym pojemniku. Zostaja pobrane prób¬ ki do mikrobiologicznych badan wysterylizowania, pozostalosc tworzy zamarznieta warstwa w suchej kapieli zamarznietego alkoholu.Plyny zawierajace wirus sa magazynowane w temperaturze —70°C w elektrycznym urzadzeniu chlodniczym, przed selekcja odsiewu lub odsie¬ wów po dokonaniu kompletnych operacji miarecz¬ kowania majacych na celu okreslenie stopnia za¬ kazenia. Wybrany material nastepnie usuwa sie z urzadzenia chlodniczego i rozmraza. Przeprowadza sie kontrole i próby bezpieczenstwa próbki. Po¬ zostala ciecz oczyszcza nastepnie, a próbke pod¬ daje sie próbom bezpieczenstwa na malpach. Do pozostalej cieczy dodaje sie dodatkowo odpowiedni czynnik stabilizujacy. Ciecze rozprowadza sie do poszczególnych ampulek, a nastepnie suszy. Po procesie osuszenia, ampulki kapsluje sie i zatapia z mozliwoscia uzyskania szczepionki po dodaniu wyjalowionej wody. Moc produktu ocenia sie na podstawie zdolnosci infekcyjnej hodowli komór¬ kowych. Dodatkowo oslabiona szczepionka, zaszcze¬ piona malpom pozajelitowo w sposób regularny, powoduje powstawanie duzej ilosci specyficznych neutralizujacych przeciwcial, które zostaja w or¬ ganizmie w niezmienionej ilosci przez przynaj¬ mniej rok.Doswiadczenia z ludzmi. Siedmiorgu dzieciom nie zakazonym uprzednio wirusem rózyczki podano pozajelitowo szczepionke oslabionego wirusa ró¬ zyczki. W organizmie wszystkich powstala duza ilosc neutralizujacych przeciwcial (1:16 — 1:64) w okresie jednego miesiaca po szczepieniu. Ilosc tych przeciwcial równa sie z grubsza ilosci, która jest wytwarzana przy rozwoju choroby naturalnej.Niektóre dzieci mialy goraczke niewielka, nie¬ wielka i przemijajaca wysypke i klinicznie slabo zaznaczona limfodemopatiie.Przyklad II. Postepuje sie jak w przy¬ kladzie I, z tym, ze inkubacja wirusa rózyczki odbywa sie w temperaturze okolo 36°C.Przyklad III. Postepuje sie jak w przy¬ kladzie II, z tym, ze trzy seryjne inkubacje wiru¬ sa przeprowadza sie w temperaturze 36°C, a na¬ stepnie siedem w temperaturze 32°C. Aby dodat¬ kowo oslabic wirus, mozna przeprowadzac wiecej niz dziesiec sukcesywnych etapów rozwoju wiru¬ sa w hodowli 'tlenkowej amibriotnu kaczki. Etapy te 30 35 moga obejmowac inklinacje w hodowlach w ner¬ kach malpy lub w zaplodnionych jajach kurzych.Jest to zilustrowane w nastepujacych przykla¬ dach w których: GMK oznacza hodowle nerki malpy EAM oznacza zaplodnione jaja kurze DEF oznacza hodowle tkankowa embrionu kaczki Przyklad IV. 2 GMiK -^ [1 EAM -^9 GMK -J- -^5 DEF (36aC) -^ 5 DEF <32°C) Przyklad V. 2 GMK -r- 1 EAIM -*- 13 GMK r2 DEF <36°C) -f- 8 DEF (32°C) Przyklad VI. 2 GMK -^ 1 EAM +• 17 GiMK -7-10 DEF (32°C) Przyklad VII. 21 GMK -r- 3 DEF 36°C) -r- -h 7 DEF (32°C) W wyniku postepowania opisanego w przykla¬ dach IV, V, VI d VII otrzymuje sile szczepionki których moc przedstawiono w ponizszym zestawie¬ niu. Moc szczepionki wyrazona jest w postaci miana zakaznosci, które odpowiada stezeniu zaka¬ zajacego drobnoustroju w srodowisku. Miano to mozna okreslic równiez jako minimalna dawke zakazajaca kulture tkankowa. Zazwyczaj okresla sie je jako odwrotnosc rozcienczenia.Jednostka TCID50 (dawka zakazajaca kulture tkankowa w odniesieniu do 50%) jest miara ste¬ zenia wirusa. Tak wiec np. sporzadza sie dwu¬ krotne rozcienczenie zawiesiny wirusowej, której miano ma sie okreslic i bada sie ich stopien za¬ kaznosci tkanek, przy czym dla kazdlego rozcien¬ czenia stosuje sie kilka próbek. Za jednostke za¬ kaznosci przyjmuje sie dawke wirusa w takim roz¬ cienczeniu, które wywoluje rozpad tkanek w polo¬ wie próbek. Miano wyrazone w TCIDso na ml za¬ wiesimy oblicza sie jako wielokrotnosc tej dawki. 40 Przyklad IV V VI VII Moc (TCID50) 10-2.5/1,0 ml 10-4.0/1,0 ml 10-2.5/1,0 ml 10-2.8/1,0 ml 55 60 65 Wynalazek zostal opisany w odniesieniu do dziesieciu seryjnych etapów przejscia przez DEF, w celu zapewnienia oslabienia wirusa, lecz moze okazac sie wystarczajaca równiez mniejsza ich ilosc.Wynalazek moze takze obejmowac pojedynczy proces inkubacji w DEF w celu osiagniecia zada¬ nej formy wirusa, który spowoduje powstanie przeciwcial w organizmie, przeciwdzialajacych ciezkim objawom choroby. Mozna oczekiwac, ze nastepne etapy rozwoju po procesie pierwszego wzrostu w DEF moga dac w wyniku zwiekszone oslabienie wirusa. PL PL PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania szczepionki rózyczki, znamienny tym, ze wirus rózyczki izoluje sie z7 60 449 8 materialu klinicznego przez zaszczepienie go w hodowli tkankowej embrionu kaczki lub hodowli tkankowej nerki malpy i inkubacje tej hodowli w temperaturze 30—38°C, nastepnie sukcesywnie pasazuje sie wymieniony wirus dostateczna ilosc razy w srodowiskach hodowlanych w celu osla¬ bienia wirusa, przy czym przynajmniej dziesiec z wymienionych pasazy dokonuje sie w srodowis¬ kach zawierajacych hodowle pokrajanego i po¬ traktowanego trypsyna dziesiecio- lub jedenasto- dniowego, pozbawionego glowy i konczyn embrio¬ nu kaczki, w srodowisku wzrostu komórek, w temperaturze 30—38°C, a jednoczesnie po kazdym wymienionym pasazu przeprowadza sie oznaczenie zdolnosci zakazenia na zbiorach próbnych w od¬ stepach 2—14 dni, przy czym zbiory te zamraza sie do momentu dokonywania pomiaru, zas je¬ zeli wirusy wykazuja zbyt duzy stopien wirulent- nosci, poddaje sie je ponownemu pasazowaniu w srodowisku hodowlanym.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie dziesieciodniowy embrion kaczki.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze inkubacje prowadzi sie na etapie pasazowania w temperaturze 35—38°C.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze inkubacje prowadzi sie na etapie pasazowania w temperaturze 30—34°C. 10 Bltk 1340/70 r. 220 egz. A4 PL PL PL