PL60446B1 - - Google Patents

Description

.VI.1967 Niemiecka Republika Demokratyczna Opublikowano: 10.VII.1970 KI. 6 a, 22/04 MKP C 12 d, 13/10 CZYTELNIA l| UMUpMfllN L Wspóltwórcy wynalazku: Johan Huber, Rudolf Dickscheit, Barbara Her- fort, Helga Hiiller, Barbara Hafner, Klaus Riedel Wlasciciel patentu: Forschungsinstitut fur die Garungsindustrie Enzy- mologie und technische Mikrobiologie, Berlin (Nie¬ miecka Republika Demokratyczna) Sposób biotechnicznego otrzymywania enzymu rozszczepiajacego glukan (1-1,3- i /?-l,4-glukanazy) Przedmiotem wynalazku jest sposób biotech¬ nicznego otrzymywania enzymu rozszczepiajacego gluikan (/?-l,3- i /M,4-glukanazy).Znane sa specyficzne enzymy rozszczepiajace poszczególne glukany w zaleznosci od zawartych w nich wiazan. Z grzybów otrzymuje sie /?-l,3- -glukanaze. Dostepne sa równiez dane dotyczace metod oczyszczania i wlasciwosci /?-l,3-glukanazy otrzymywanej przy uzyciu Bacillus circulans. Za pomoca /0-1,3-glukanazy rozszczepia sie polisa¬ charyd laminaran na laminarobioze, laminarotrio- ze i inne glikosacharydy. Podobny enzym mozna otrzymac z soku zoladkowego Helix pomatia. Opi¬ sano takze metode wydzielania glukanazy otrzy¬ mywanej z koncentratu amylazowego. Nie ma na¬ tomiast zadnych danych odnosnie otrzymywania samego koncentratu amylazowego.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wy¬ twarzania i otrzymywania ^-glukanazy o duzej aktywnosci, przy zastosowaniu bakterii.Wedlug wynalazku osiaga sie to w ten sposób, ze szczep bakterii z grupy Bacillus subtilis pod¬ daje sie hodowli prowadzonej przemiennie na pod¬ lozu stalym i cieklym, zawierajacym glukan i/lub nie zawierajacym glukanu, przy czym szczep ten uzyskuje wysoka zdolnosc rozszczepiania glukanu, po czym po wyselekcjonowaniu najaktywnieszego szczepu przeszczepia sie go na podloze produkcyj¬ ne, gdzie w warunkach fermentacji glebinowej wydziela on glukanaze do roztworu hodowlanego. 20 25 30 Enzym glukanazy oddziela sie i oczyszcza w zna¬ ny sposób.Enzym otrzymany sposobem wedlug wynalazku rozszczepia najlepiej glukan wystepujacy w jecz¬ mieniu, przy czym produktami rozszczepiania sa oligosacharydy i w malym stopniu glikoza. Za pomoca otrzymanego enzymu nie mozna rozszcze¬ pic enzymatycznie laminaranu. Poniewaz w glu- kanie wystepujacym w jeczmieniu, zarówno wia¬ zania glukanowe ^-1,3- jak i /Z-1,4, wystepuja w okreslonej kolejnosci i sa odpowiednio upo¬ rzadkowane sterycznie, zdolnosc rozszczepiajaca wyeliminowanego enzymu jest specyficzna dla chemicznej struktury glukanu wystepujacego w jeczmieniu.Szczep produkujacy glukanaze nie wykazuje juz zdolnosci do redukcji azotanów. Jest to nieocze¬ kiwane, poniewaz reduktaza azotanowa jest we¬ dlug Bergey'a (1957) oraz Smith'a i wspólpracow¬ ników (1951) cecha systematyczna bakterii typu Bacillus subtilis,. Zgodnie z wynalazkiem nadawa¬ nie szczepowi Bacillus subtilis wysokiej zdolnosci rozszczepiania glukanu przeprowadza sie przez stosowanie zródla glukanu pochodzenia roslinnego takiego jak grubo zmielony jeczmien, otreby pszenne, grubo zmielona pszenica lub maka pszen¬ na w polaczeniu ze skrobia jako skladnika se¬ lekcyjnego podloza odzywczego, inokulum i sro¬ dowiska produkcyjnego. 60 44660 ' ¦¦- 3 ¦ - -'..¦ Wytwarzanie enzymu jff-1,3- i ^-1,4-glukanazy -za pomoca szczepu Bacillus subtilis przeprowadza sie metoda fermentacji glebinowej. W skali pro¬ dukcyjnej stosowane sa do tego aparaty fermen¬ tacyjne z nierdzewnej stali zaopatrzone w doplyw 5 wyjalowionego powietrza. Objetosc starannie wy¬ jalowionego podloza moze wynosic ponad 10 ms.Pozywka plynna musi zawierac odpowiednie zró¬ dla wegla i azotu, które nie • moga byc naruszone podczas sterylizacji. Zaszczepianie wyjalowionego podloza odbywa sie najlepiej za pomoca 1—1,5% -objetosciowych szczepionki, a temperature hodowli korzystnie jest utrzymywac w granicach 28—37°C.Jako srodki przeciwdzialajace pienieniu stosuje sie z powodzeniem oleje silikonowe, tluszcze albo oleje roslinne lub zwierzece oraz inne srodki przeciw- pianowe. Ilosc doprowadzanego powietrza w za¬ leznosci od kazdorazowego stanu fizjologicznego hodowli wynosi 0,3—1 l/min. Czas trwania hodo¬ wli wynosi 24—72 godziny w zaleznosci od skla¬ du pozywki plynnej.Pod koniec okresu fermentacyjnego uzyskuje sie 100—150 j. a./ml glukanazy, 3000—5000 j. a./ml amy- lazy i 1—2 PUcas proteazy. Oznaczanie glukanazy przeprowadza sie zgodnie z zaleceniami IUB (z 1961 r.) stosujac jako substrat glukan wystepujacy w jeczmieniu. (I. A. Preece and KG Mackenzie J.Inst. Brew. 58, 353—362, 1952), za pomoca kwasu '¦ 3,5-dwunitrosalicylowego. Po zakonczeniu fermen¬ tacji oddziela sie bakterie i skladniki pokarmowe, 3 a znajdujaca sile w przesaczu pohodowlanym glu- kanaze wyosabnia sie znanym sposobem oddziela¬ nia i oczyszczania enzymów. Enzym stosuje sile do rozszczepiania glukanu zawartego w jeczmieniu, pszenicy i innych surowcach pochodzenia roslin- 3, nego, ^zawierajacego wiazania /?-l,3- i ^-1,4, zwla¬ szcza przy produkcji piwa.Przytoczone przyklady wyjasniaja wynalazek nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad I. Wyselekcjonowany z populacji 4I wyjsciowej (poczatkowej) szczep Bacillus subtilis rozszczepiajacy glukan poddaje sie hodowli pro¬ wadzonej przemiennie na ogólnie stosowanych sta¬ lych i plynnych pozywkach nie zawierajacych glu¬ kanu i na takich samych pozywkach, do których 4E zgodnie z wynalazkiem dodaje sie zródla glukanu pochodzenia roslinnego najlepiej 1,5% wagowych grubo zmielonego jeczmienia lub pszenicy, otrab pszennych albo maki pszennej oraz 2% wagowych skrobi jako induktora, Po dokonanej adaptacji wy- 50 selekcjonowywuje sie bardzo aktywny szczep wy¬ twarzajacy glukanaze, który równoczesnie wytwa¬ rza w odpowiednich roztworach hodowlanych amy- laze i proteaze. Ten wyselekcjonowany bardzo aktywny szczep przenosi sie nastepnie jako ino- 55 kulum do kolb wytrzasanych wypelnionych srodo¬ wiskiem odzywczym, skladajacym sie z bulionu, z dodatkiem 1% wagowych peptonów i 0,5% wa¬ gowych NaCl, przy czym stopien napelnienia kolb wynosi okolo 10% objetosciowych. W okresie in- 60 kubacji inokulum, kolby wytrzasa sie w ciagu 18 —24 godzin w temperaturze 30°C na wytrzasarce przy okolo 220 wstrzasów na minute. Nastepnie przeszczepia sie zawiesine bakterii do srodowiska produkcyjnego. 65 ."-.-¦" 4 W skali laboratoryjnej zastosowano pozywke 6 nastepujacym skladzie w % wagowych:. 9% grubo zmielonego jeczmienia 3% grubo zmielonej soi 0,25% (NH4)2S04 0,2% KH2P04 1,2% Na2HP04 • 12 H20 oraz woda wodociagowa.Wartosc pH pozywki przed sterylizacja wynosi 7,2, a po sterylizacji 6,5—6,9. Srodowiskiem pro¬ dukcyjnym w ilosciach po 50 ml napelnia sie 500 ml kolby plaskodenne ii zaszczepia zawiesine bakterii w ilosci 1—2% objetosciowych. Stezenie zarodników w szczepionce powinno wynosic 6 • 10® zarodników w 1 ml. Wytrzasanie prowadzi sie w ciagu 3 dni najlepiej w temperaturze 30°C. W ok¬ resie trzydniowego cyklu inkubacji, obok znacz¬ nych ilosci glukanazy, a mianowicie 80—150 j. a./ml. tworza sie takze amylaza (2090—5000 j.a./ml) i proteaza. Ilosc ta jest niezalezna od ilosci wy¬ tworzonej glukanazy. Roztwór pohodowlany od¬ wirowuje sie, a do przesaczu pohodowlanego do¬ daje sie w temperaturze 0°C acetonu do uzyska¬ nia stopnia nasycenia wynoszacego 0,65, po czym wartosc pH ustala sie na poziomie 7 za pomoca buforu fosforanowego. Wytracony produkt oddzie¬ la sie i suszy w prózni. Otrzymuje sie staly pro-, dukt zawierajacy /?-glukanaze (wydajnosc 82%) i a-amylaze (wydajnosc 77%).Przyklad II. Do produkcji glukanazy na skale techniczna zastosowano 500 litrowy aparat fermentacyjny zaopatrzony w urzadzenie napo¬ wietrzajace. Sklad pozywki w % wagowych jest na¬ stepujacy: 2% grubo zmielonego jeczmienia 2% skrobi ziemniaczanej 0,95% maczki sojowej 1,5% (NH4)2HP04 0,08% cytrynianu sodowego oraz woda wodociagowa (rózne pierwiastki w ilos¬ ciach sladowych).Po wyjalowieniu w temperaturze 120°C, trwa¬ jacym 30 minut, ustala sie wartosc pH na pozio¬ mie 7,0—7,2. Po oziebieniu zaszczepia sie pozywke w warunkach sterylnych, zawiesina bakterii w ilo¬ sci 2% objetosciowych. Ilosc dostarczanego powie¬ trza w czasie logarytmicznej fazy wzrostowej wy¬ nosi 0,7 1 powietrza na 1 1 cieczy/min. Liczba obro- • tów mieszadla wynosi 160—420 na minute. Po u- plywie 36 godzin przerywa sie fermentacje, ponie¬ waz weglowodany zostaly wyczerpane. Otrzymu¬ je sie 100—150 j.a./ml glukanazy, 2000—5000 j. a./ml. amylazy i okolo 1 PUcas proteazy. Roztwór pohodowlany oddziela sie i klaruje przez dodanie zelu wapiennego. Nastepnie zateza sie do 1:4.Wytracanie enzymu przeprowadza sie mieszajac roztwór ze stalym (NH4)2 S04 w temperaturze 10— 20°C. Osad suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze nie przekraczajacej 40°C, a nastep¬ nie homogenizuje sie go. W celu skrócenia czasu suszenia, wilgotny produkt przeplukuje sie moz¬ liwie szybko acetonem, osiagajac przy tym roz¬ jasnienie barwy preparatu. Produkt koncowy jest5 60 446 6 proszkiem niehigroskopijnym dobrze rozpuszczal¬ nym w wodzie. Uzyskuje sie /?-glukanaze z wy¬ dajnoscia 90%, a a-amylaze — z wydajnoscia 35%. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób biotechnicznego otrzymywania enzy¬ mu rozszczepiajacego glukan (/?-l,3- i /?-l,4 glukanazy), znamienny tym, ze szczep Bacillus subtilis poddaje sie hodowli prowadzonej prze¬ miennie w srodowisku odzywczym stalym i plyn¬ nym, zawierajacym glukan i/lub nie zawierajacym glukanu, przy czym szczep ten uzyskuje wysoka zdolnosc rozszczepiania glukanu, nastepnie wy¬ selekcjonowany, wysokoaktywny szczep poddaje sie hodowli glebinowej, po czym z przesaczu poho- dowlanego oddziela sie w znany sposób glukana- ze.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako skladnik podloza odzywczego, inokulum i srodowiska produkcyjnego stosuje sie zródlo glu¬ kanu pochodzenia roslinnego, zwlaszcza grubo zmielone jeczmien i pszenice, make pszenna lub otreby pszenne w polaczeniu ze skrobia. 5 10 ; PL