Pierwszenstwo: Opublikowano: 30.Y.1970 60015 KI. 42 h, 15/01 MKP G02bZnlC$ CZYTELNIA Wspóltwórcy wynalazku: mgr Maksymilian Pluta, mgr inz. Tadeusz Ste¬ faniak Wlasciciel patentu: Centralne Laboratorium Optyki, Warszawa (Polska) Przyslona aperturowa kondensora do urzadzen mikroskopowych do obserwacji fluorescencyjnej i fazowo-kontrastowej Przedmiotem wynalazku jest przyslona aperturo¬ wa kondensora do mikroskopowych urzadzen umo¬ zliwiajaca obserwacje preparatów badz to tylko w swietle fluorescencyjnym, badz tez tylko w kontras¬ cie fazowym albo równoczesnie w swietle fluores¬ cencyjnym i kontrascie fazowym oraz pozwalajaca na szybkie przechodzenie od fluorescencyjnej obser¬ wacji mikroskopowej do fazowo-kontrastowej i na odwrót.Obecnie stosowane sa dwie metody równoczes¬ nego obserwowania preparatów mikroskopowych w swietle fluorescencyjnym i w kontrascie fazowym.Pierwsza z nich polega na dwustronnym oswietle¬ niu preparatu. Z jednej strony kieruje sie na pre¬ parat przez obiektyw swiatlo krótkofalowe (niebies- Jko-fioletowe lub ultrafioletowe) pobudzajace fluo- rescencje, a z drugiej strony przez kondensor fazo- wo-kontrastowy — swiatlo biale lub monochroma¬ tyczne dlugofalowe (na przyklad zielone) sluzace do obserwacji w kontrascie fazowym.Druga metoda polega na stosowaniu oswietlenia jednostronnego przez kondensor, w którym zasto¬ sowana jest odpowiednia przyslona pierscieniowa, przezroczysta dla swiatla bialego tylko w obszarze waskiego pierscienia, optycznie sprzezonego z piers¬ cieniem fazowym w obiektywie, natomiast dla swia¬ tla krótkofalowego przezroczysta na calym swym obszarze w obrebie pelnego otworu kondensora.Przyslony te dotychczas wykonywane sa ze szkla ciemnego, przepuszczajacego tylko swiatlo fioletowe 10 15 lub ultrafioletowe, albo tez z filtrów polaryzacyj¬ nych o wysokim stopniu polaryzacji dla swiatla zólto-zielonego, a znikomo malym stopniu polary¬ zacji dla swiatla krótkofalowego. Pierwszego ro¬ dzaju przyslona wymaga stosowania specjalnego szkla ciemnego nielatwo dostepnego, zas w przy¬ padku drugiego rodzaju przyslony preparat przy obserwacji fazowo-kontrastowej jest oswietlony swiatlem spolaryzowanym liniowo, co niekiedy jest niepozadane. Poza tym wykonawstwo tych przyslon jest dosc klopotliwe i kosztowne.Postawiono sobie zatem za cel zrealizowanie urza¬ dzenia fluorescencyjnego sprzezonego z kontrastem fazowym, które nie posiadaloby wyzej wymienio¬ nych wad i zezwalalo na obserwacje w swietle fluo¬ rescencyjnym i w kontrascie fazowym przez sto¬ sowanie badz to jednego zródla swiatla zawieraja¬ cego zarówno promieniowanie krótkofalowe jak i dlugofalowe oraz równoczesnie dwóch zródel swia¬ tla, krótkofalowego do obserwacji fluorescencyjnej i dlugofalowego do obserwacji fazowo-kontrastowej.Cel ten osiagnieto dzieki zastosowaniu w kon¬ densorze przyslony aperturowej, wykonanej w po¬ staci dwuskladnikowego filtru interferencyjnego: jednego o ksztalcie pierscienia przepuszczajacego swiatlo dlugofalowe a nie przepuszczajacego swiatla krótkofalowego (niebieskofioletowego lub ultrafio¬ letowego) i sluzacego do obserwacji fazowo-kon¬ trastowej oraz drugiego filtru zlaczonego z poprzed¬ nim i wypelniajacego pozostale pola otworu kon- 43001560015 densora oraz przepuszczajacego swiatlo krótkofa¬ lowe, wywolujace fluorescencje, albo tez filtru in¬ terferencyjnego przepuszczajacego promieniowanie krótkofalowe w calym polu i zawierajacego calko¬ wicie przezroczysty pierscien przepuszczajacy wszy¬ stkie dlugosci fal swietlnych.Przedmiot wynalazku w przykladowym- wykona¬ niu urzadzenia przeznaczonego do równoczesnej lub rozlacznej obserwacji w swietle fluorescencyjnym, pobudzanym swiatlem niebiesko-fioletowym i ultra¬ fioletowym oraz w kontrascie fazowym w swietle zielonym lub innym dlugofalowym pokazano na ry¬ sunkach, na których fig. 1 — przedstawia plytke szklana pokryta pomocnicza warstwa sadzy, fig. 2 przedstawia te sama plytke pokryta sadza z wyto¬ czonym pierscieniem przezroczystym, fig. 3 — plyt¬ ke pokryta warstwa z wytoczonym pierscieniem i z naparowanymi warstwami interferencyjnymi, fig. 4;— plytke szklana z pierscieniem interferencyjnym, fig. 5 — plytke szklana z pomocnicza warstwa sa¬ dzy, fig. 6 — plytke szklana z pierscieniem sadzo- wym fig. 7 — plytke szklana z pierscieniem sadzo- wym z naparowanymi warstwami interferencyjny¬ mi, fig. 8 — plytke szklana z warstwami interferen¬ cyjnymi i przezroczystym pierscieniem, fig. 9 — dwuskladnikowa pierscieniowa przyslone interfe¬ rencyjna, fig. 10 — przyslone przedstawiona na fig. 9 w widoku z góry, fig. 11 — schemat urzadzenia fluorescencyjnego z zastosowaniem pierscieniowej przyslony interferencyjnej przedstawionej na fig. 9 i 10.Na rysunkach przedstawiajacych sposób wykona¬ nia pierscieniowej przyslony interferencyjnej we¬ dlug wynalazku A i B — oznaczaja plytki szklane (lub kwarcowe) S — pomocnicza warstwe sadzy, P4 -^ pierscieniowy kanalik wytoczony w warstwie sa¬ dzy, Pa — pomocniczy pierscien z sadzy, Mi, Mif M3 i M4 — warstwy metaliczne (na przyklad srebro¬ we) naparowane w prózni, Bt i Dt — warstwy di¬ elektryczne (na przyklad z fluorku magnezu) rów¬ niez naparowane w prózni, Z — pierscieniowy filtr interferencyjny przepuszczajacy swiatlo zielone, lub inne dlugofalowe, F —* filtr interferencyjny prze¬ puszczajacy swiatlo fioletowe lub ultrafioletowe, C — kleiwo optyczne, za pomoca którego sklejone sa plytki szklane A i B z wykonanymi na nich fil¬ trami interferencyjnymi F i Z.Kolejnosc postepowania prowadzaca do wykona¬ nia pierscieniowej przyslony interferencyjnej, w której filtr pierscieniowy przepuszcza na przyklad swiatlo o dlugosci fali ^ = 546 nm a filtr F swiatlo fioletowe o dlugosci fali X2 = 405 nm jest nastepu¬ jaca. Na starannie oczyszczonej plytce szklanej A (Fig. 1) nanosi sie znanym sposobem pomocnicza warstwe sadzy S, równiez w znany sposób wytwarza sie przezroczysty kanalik pierscieniowy Pi o zadanych wymiarach. Nastepnie w aparaturze prózniowej przy cisnieniu okolo 5 X106 torra naparowuje sie kolej¬ no: warstwe srebrowa Mi przepuszczajaca okolo 9Vo swiatla o dlugosci fali fa = 546 nm, nastepnie war¬ stwe fluorku magnezu Dt o grubosci optycznej n.d = 394 nm (n— wspólczynnik zalamania war¬ stwy fluorku magnezu, d — grubosc geometryczna warstwy) oraz druga warstwe srebrowa Ma ana¬ logiczna do warstwy Mi.Po wyjeciu szklanej plytki z aparatury próznio¬ wej pomocnicza warstwe sadzy S odgrywajaca role- maski, zdejmuje sie wraz z osadzonymi na niej pa¬ rami srebra i fluorku magnezu stosujac to sama 5 urzadzenie i ten sam sposób postepowania co przy wytaczaniu pierscieniowego kanalika Pt (Fig. 1). W rezultacie na plytce A, otrzymuje sie pierscieniowy filtr interferencyjny Z o maksymalnej przepuszczal¬ nosci dla wybranej dlugosci fali swietlnej Xi = 10 = 546 nm.Aby ta dlugosc fali byla maksymalnie przepusz¬ czana, a fale o krótszych i dluzszych dlugosciach wy¬ gaszane, optyczna grubosc warstwy dielektrycznej Di musi byc scisle okreslona, tak aby swiatlo od- 15 bijajace sie wielokrotnie miedzy warstwami srebro¬ wymi Mi i M2 i interferiijace ze soba po przejsciu przez pierscien Z maksymalnie sie wzmacnialo dla dlugosci fali ^ = 546 nm, a oslabialo dla pozosta¬ lych dlugosci fal swietlnych. Warunek ten jest spel- 20 niony, jezeli grubosc optyczna warstwy fluorku magnezu Di wynosi okolo 394 nm.Z kolei bierze sie druga szklana plytke B po¬ kryta pomocnicza warstwa sadzy S i oczyszcza sie¬ ja z sadzy w srodkowym i zewnetrznym obszarze, 25 pozostawiajac pierscien z sadzy Pa o srednicy ta¬ kiej samej jaka mial poprzednio przezroczysty pier¬ scien Pi (Fig. 2), ale o szerokosci nieco wiekszej.Stosuje sie przy tym te sama wytaczarke co przy wykonywaniu pierscienia Pi na plytce A. Nastepnie 30 w sposób analogiczny jak poprzednio naparowuje sie w prózni filtr interferencyjny przepuszczajacy swiatlo fioletowe, z maksimum przepuszczalnosci na przyklad dla dlugosci fali X2 = 405 nm.W tym celu na powierzchni plytki B z pomocni- 35 czym pierscieniem sadzowym S, spelniajacym role maski napar owy wu je sie kolejno: warstwe srebro¬ wa M3 o przepuszczalnosci swiatla okolo 10%, war¬ stwe fluorku magnezu Di o grubosci optycznej! n.d = 263 nm ofraz druga warstwe srebrowa M4 40 analogiczna do warstwy Mg. Po wyjeciu plytki z aparatury prózniowej wykonuje sie z kolei przezro¬ czysty kanalik T wytaczajac pomocniczy pierscien sadzowy S z osadzonymi na niej parami srebra i fluorku magnezu. 45 Nastepnie plytke B skleja sie z plytka A za po¬ moca przezroczystego kleiwa optycznego C w spo¬ sób przedstawiony na Fig, 9. W rezultacie otrzy¬ muje sie dwuskladnikowy filtr interferencyjny, w którym pierscien Z przepuszcza maksymalnie tylko 50 swiatlo zielone, a czesc srodkowa i zewnetrzna F tylko swiatlo fioletowe. Widok tego filtru z góry przedstawia Fig. 10, na której przez H oznaczono te obszary gdzie filtr zielony Z i fioletowy F czes¬ ciowo na siebie zachodza. Obszary te widoczne sa 55 w swietle przechodzacym jako waskie ciemne ob¬ wódki Dobierajac odpowiednio grubosc warstwy Dj oraz grubosc warstwy D2 mozna otrzymac filtr pierscie¬ niowy Z i filtr F przepuszczajace inne dowolne wy¬ go cinki widma dlugofalowego i krótkofalowego. War¬ stwy metaliczne. Mt i M* oraz M, i M4 nie maja decydujacego wplywu na dlugosc przepuszczalnych fal swietlnych.Od ich przepuszczalnosci zalezy tylko natezenie w swiatla przepuszczanego i wygaszanego przez filtry.60015 5 W szczególnosci warstwy metaliczne M*, M2 i M3, M4 moga byc zastapione wielowarstwowymi powloka¬ mi zwierciadlanymi dielektrycznymi podobnie jak to sie czyni przy wykonywaniu zwyklych filtrów interferencyjnych waskopasmowych.Przykladowe zastosowanie wyzej omówionego dwuskladnikowego filtru interferencyjnego w cha¬ rakterze pierscieniowej przyslony aperturowej zez¬ walajacej na obserwacje preparatów w swietle fluo¬ rescencyjnym i w kontrascie fazowym przedstawia Fig. 11, na której przez J oznaczono zarówke, KA — kolektor oswietlacza, Dj — jego przyslone polowa, Lj — zwierciadlo, Ej — miejsce na umieszczenie filtru barwnego, R — lampe rteciowa wysokocisnie¬ niowa, K2 — kolektor tej lampy, D2 — jej przyslone polowa, E — miejsce na umieszczenie filtru prze¬ puszczajacego tylko swiatlo zielone lub tylko swia¬ tlo fioletowe, L2 — przesuwne zwierciadlo z war¬ stwa odbijajaca W lub interferencyjna przepuszcza¬ jaca swiatlo dlugofalowe Sx wychodzace z zarówki J, a odbijajaca swiatlo krótkofalowe S2 wychodzace z lampy rteciowej R, D — wyzej opisana interfe¬ rencyjna przyslone pierscieniowa, w której pierscien Z przepuszcza swiatlo dlugofalowe (na przyklad zielone), a obszary F — swiatlo fioletowe lub ultra¬ fioletowe, K — kondensor, P badany preparat, Ob — obiektyw z pierscieniem fazowym Ph, G — filtr optyczny tak zwany zaporowy pochlaniajacy swiatlo fioletowe, Ok — okular.Zasada dzialania urzadzenia zgodnie z wynalaz¬ kiem jest nastepujaca. Lampa rteciowa wysokocis¬ nieniowa R wysyla swiatlo o róznych dlugosciach fali, zarówno w czesci ultrafioletowej, fioletowo-nie- bieskiej jak i zólto-zielonej czesci widma. Najwie¬ cej wysyla swiatla ultrafioletowego o dlugosci fali 360—370 nm, fioletowego o dlugosci fali 400—410 nm oraz zielonego o dlugosci fali 546 nm.W przedstawionym wariancie rozwiazania urza¬ dzenia fluorescencyjnego wedlug wynalazku swia¬ tlo fioletowe lampy rteciowej R wykorzystywane jest do fluorescencji, a swiatlo zielone do obserwa¬ cji w kontrascie fazowym. W tym celu w plaszczyz¬ nie ogniskowej kondensora K umieszczona jest in¬ terferencyjna przyslona D bedaca odpowiednikiem przyslony pokazanej na Fig. 9 i 10, która w obszarze pierscienia Z przepuszcza swiatlo dlugofalowe (na przyklad zielone), a w obszarach F swiatlo fioleto¬ we lub ultrafioletowe.Pierscien Z sprzezony jest optycznie z pierscie¬ niem fazowym Ph, podobnie jak to jest w normal¬ nych mikroskopach fazowych, to znaczy w tym przy¬ padku obraz pierscienia Z po przejsciu swiatla przez kondensor K i obiektyw Ob tworzy sie na pierscie¬ niu fazowym Ph. Jezeli na drodze swiatla S2 ida¬ cego z lampy R i odbijajacego sie od zwierciadla L2 wstawi sie w miejscu E filtr zielony to przez przyslone D przejdzie tylko swiatlo zielone w ob¬ szarze pierscienia Z i wtedy bedziemy mieli do czy¬ nienia z obserwacja fazowo kontrastowa.Jezeli na odwrót w miejscu E wstawi sie filtr fioletowy, to przez przyslone przejdzie tylko swia¬ tlo fioletowe zdolne do wywolywania fluorescencji preparatu P. Swiatlo fluorescencyjne zawsze jest bardziej dlugofalowe od swiatla pobudzajacego fluo- 6 rescencje i aby go oddzielic od tego ostatniego sto¬ suje sie tak zwany filtr zaporowy G, który prze¬ puszcza dlugofalowe swiatlo fluorescencyjne a za¬ trzymuje swiatlo fioletowe, podobnie jak to jest w 5 zwyklych mikroskopach fluorescencyjnych. Jezeli natomiast w miejscu E nie umiesci sie zadnego fil¬ tru, to na preparat bedzie padac zarówno swiatlo zielone, przechodzace przez pierscien Z, sprzezony z pierscieniem fazowym Ph oraz swiatlo fioletowe 10 przechodzace przez obszary F i wtedy bedzie sie równoczesnie obserwowac badany preparat P za¬ równo w swietle fluorescencyjnym jak i kontrascie fazowym.W tym przypadku natezenie swiatla dlugofalo- 15 wego powinno byc mozliwie male, aby nie „tlumilo" obrazów fluorescencyjnych, które z reguly sa nie¬ zbyt jasne. Filtr Z powinien zatem przepuszczac 'stosunkowo nieduzo swiatla dlugofalowego (kilka procent lub nawet ulamek procenta). Dla odróznie- 20 nia obrazów fluorescencyjnych, które w wiekszosci przypadków swieca swiatlem zielonym lub zielon- kawo-zóltym, od obrazów fazowo-kontrastowych, dobrze jest te ostatnie obserwowac w swietle o barwie wyraznie rózniacej sie od barwy swiatla 25 fluorescencyjnego to znaczy czerwonym. W tym przypadku lepiej jest aby filtr pierscieniowy Z byl wykonany jako filtr interferencyjny czerwony.Niekiedy zanim przystapi sie do obserwacji fluo¬ rescencyjnej przeprowadza sie przez dluzszy czas 30 obserwacje w zwyklym oswietleniu lub w kontras¬ cie fazowym. Aby w takich przypadkach nie uzy¬ wac lampy rteciowej R, zwierciadlo L2 jest prze¬ suwane w kierunku strzalki v i wówczas mozna korzystac ze swiatla zwyklej mikroskopowej lam- 35 py zarowej J. Mozna równiez zwierciadlo L2 wyko¬ nac w taki sposób, ze warstwa W bedzie przepusz¬ czac swiatlo zielone, a odbijac swiatlo fioletowe i wówczas przy przejsciu od obserwacji fazowo-kon¬ trastowej wykorzystujacej swiatlo zarówki J do 40 obserwacji fluorescencyjnej, wykorzystujacej wy¬ lacznie swiatlo lampy rteciowej R nie trzeba prze¬ suwac zwierciadla L2.Ponadto w tym przypadku mozna równoczesnie przeprowadzac obserwacje fluorescencyjna korzy- 45 stajac z lampy rteciowej R oraz w kontrascie fa¬ zowym korzystajac z lampy zarowej J. Takie roz¬ wiazanie jest o tyle korzystniejsze od poprzedniego, ze mozna zrezygnowac z peirscieniowego filtru in¬ terferencyjnego Z, zastepujac go przezroczystym 50 pierscieniem przepuszczajacym wszystkie dlugosci fal swietlnych, a odpowiednia barwe obrazu fazo- wo-kontrastowego uzyskujac przez wstawianie w bieg promieni swietlnych Si w miejscu Et odpo¬ wiednich filtrów barwnych. 55 PL