PL59963B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 29.IX.1966 Stany Zjednoczone Ameryki Opublikowano: 30.V.1970 59963 KI. 30 h, 2/04 MKP A 61 k /)' UKD 4|oe Wspóltwórcy wynalazku: Gianfranco Bertellini, Adriano Butti, Giuseppe Prino Wlasciciel patentu: Prephar Prospection de Recherches Pharmaceutiaues S.A., Schaffhausen (Szwajcaria) Sposób otrzymywania glikopeptydu ze sluzówki zoladka lub z dwunastnicy swin Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia .glikopeptydu z sluzówki zoladka lub dwunast¬ nicy swin, nadajacego sie do leczenia chorobowych stanów zapalnych w ogólnosci, a zwlaszcza wrzo¬ dów.Istnienie w organach zwierzecych makroczaste¬ czek o budowie posredniej miedzy budowa bialek prostych i budowa polisacharydów • zostalo wielo¬ krotnie wykazane i substancje te nazwano gliko- proteinami. W pewnym przyblizeniu mozna przy¬ puszczac, ze budowa tych makroczasteczek jest wynikiem polaczenia jednej lub kilku czasteczek polisacharydu z jedna lub kilkoma czasteczkami bialka prostego. Polaczenie takie powstaje dzieki kowalencyjnym wiazaniom, totez produkt ten nie jest adduktem czy kompleksem, lecz stanowi ra¬ czej pojedyncza czasteczke.W glikoproteinach niektórych typów moze prze¬ wazac czesc proteinowa, podczas gdy w innych przewaza czesc polisacharydowa. Zwiazki drugiego typu nazywa sie przeto zwykle glikopeptydami, przy czym do tej klasy naleza niektóre substancje bardzo wazne biologicznie, na przyklad te, które charakteryzuja grupy krwi.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze organ trawienny swini, zwlaszcza sluzówke zolad¬ ka lub dwunastnicy, poddaje sie ekstrakcji przez lagodne traktowanie hydrolityczne, po czym usu¬ wa sie wieksza czesc skladników proteinowych i polisacharydowych sluzówki przez stracanie 15 25 i nastepnie rozszczepia bialka za pomoca enzy¬ mów.Nalezy podkreslic, ze wedlug danych z literatu¬ ry, dotyczacych zwiazków innego typu, enzyma¬ tyczna proteoliza, czyli rozszczepianie bialek, po¬ woduje calkowite zniszczenie lancuchów bialek, które wystepuja jako zanieczyszczenia, ale nie na¬ rusza czesci peptydowej, która cechuje produkt ekstrakcji.Hydrolizie poddaje sie organ zwierzecy rozdrob¬ niony i zmieszany z woda, przy czym proces hy¬ drolizy moze byc prowadzony w srodowisku o war¬ tosci pH zawartej w szerokich granicach, w tempe¬ raturze &0—.100°C, w ciagu 10—4S minut.W celu uproszczenia toku pracy i ulatwienia kontroli przebiegu, korzystnie jest prowadzic hy¬ drolize w temperaturze wrzenia, to jest okolo 100°C. Wartosc pH reguluje sie w granicach 1,5—10 przez dodatek odpowiednich kwasów lub alkalii.Nalezy unikac wartosci pH powyzej 10, gdyz wówczas material ulega szybkiemu zniszczeniu.Z tych samych wzgledów, przy wysokiej wartosci pH, wyzszej niz 9, trzeba zwracac uwage, aby tem¬ peratura nie byla zbyt wysoka. Pod koniec procesu hydrolizy korzystnie jest niekiedy powodowac stracenie wszystkich substancji organicznych o charakterze kwasnym, na przyklad mukopolisa- charydów zawierajacych siarke.W tym celu, jezeli hydroliza byla prowadzona w srodowisku zasadowym, wówczas mieszanine za- 5996359963 kwasza sie dodajac slabego kwasu, na przyklad kwasu octowego, co powoduje wytracanie sie wspomnianych substancji. Mieszanine przesacza sie nastepnie i z przesaczu usuwa odpady bialkowe za pomoca enzymu trypsyny lub papainy, przy wlasciwej wartosci pH.Moze tez byc korzystne, przed traktowaniem en¬ zymami stracac wstepnie wiekszosc odpadów bial¬ kowych za pomoca odpowiedniego reagentu, na przyklad kwasu trój chlorooctowego. Przez rozcien¬ czanie otrzymywanych przy tym przesaczów orga¬ nicznymi rozpuszczalnikami, na przyklad alkoho¬ lem zwlaszcza nizszym alkanolem lub acetonem, otrzymuje sie surowy glikopeptyd w postaci pro¬ szku o barwie bialej do orzechowej. Produkt ten, jak to uwidaczniaja wyniki analiz podane ponizej w przykladach, cechuje brak kwasów uronowych oraz zawartosc jedynie sladów siarki.Dalsze oczyszczanie surowego produktu ma na celu usuniecie zen przede wszystkim zanieczy¬ szczen o charakterze soli i otrzymanie produktu o ustalonym skladzie.Oczyszczanie moze byc prowadzone dwiema dro¬ gami, a mianowicie za pomoca dializy, gdyz zanie¬ czyszczenia poddaja sie latwo dializie, lub za po¬ moca zywicznych wymieniaczy jonowych typu kwasowego lub mieszanego, wykorzystujac silnie jonowy charakter zanieczyszczen. Dialize przepro¬ wadza sie za pomoca zde jonizowanej wody wodo¬ ciagowej w ciagu 24 godzin, przy czym produkt uprzednio rozpuszcza sie w wodzie, odwirowuje i doprowadza do wartosci pH = 6—7. Wydajnosc procesu oczyszczania, niezaleznie od metody, wy¬ nosi 65—75% w stosunku wagowym, przy czym uzyskuje sie produkt w postaci proszku bezbarw¬ nego, bezwonnego i bezpostaciowego.Zawartosc fosforu i siarki w produkcie jest tak nieznaczna, ze praktycznie biorac moze byc pomi¬ nieta. Produkt nie zawiera równiez kwasów uro¬ nowych, natomiast zawiera 40—50°/o heksozamin, 13—18% aminokwasów, 27—31% heksoz oraz 4—6% pochodnych kwasu neuraminowego.Produkt otrzymany sposobem wedlug wynalaz¬ ku, jak wykazuja badania analityczne na drodze elektroforezy, chromatografii bibulowej itp., jest jednolity i siarczan miedzi w srodowisku alkalicz¬ nym (odczynnik biuretowy) straca go ilosciowo. Te dane analityczne uzasadniaja zaszeregowanie pro¬ duktu do rzedu glikopeptydów, podczas gdy rów¬ noczesnie obecnosc heksozamin oraz brak kwasów uronowych i wszelkiego rodzaju ugrupowan zawie¬ rajacych siarke, nadaje produktowi cechy charak¬ terystyczne polisacharydów.-Badania laboratoryjne na zwierzetach wykazaly, ze produkt otrzymany sposobem wedlug wynalaz¬ ku, podawany w dawkach 12,5 lub 25 wzglednie 50. mg/kg zapobiega miejscowemu obrzekowi, po¬ wodowanemu przez karragenine i serotonine, dy¬ fuzji blekitu Evansa w sródskórnych bablach po¬ wodowanych serotonina, dekstranem oraz wzrosto¬ wi ziarniniaków u szczurów. Dawka produktu 100 mg/kg lagodzi schorzenia wrzodowe odzwierni- ka powodowane metoda Shay'a oraz trwale owrzo¬ dzenia. Poza tym produkt ten leczy schorzenia czynnosciowe czlonków dotknietych zapaleniem,, jak atretyzm wywolany azotanem srebra.Wynalazek jest blizej wyjasniony w nizej poda¬ nych przykladach. 5 Przyklad I. 10,2 kg zamrozonej, wolnej od tluszczu dwunastnicy swinskiej rozdrabnia sie w urzadzeniu wyposazonym w plyte o otworach o srednicy 1,1 mm. Rozdrobniony material miesza sie z 10 litrami wody i utrzymuje we wrzeniu w ciagu 10 15 minut, mieszajac. W tym czasie do zawiesiny dodaje sie porcjami 3 n roztwór wodorotlenku so¬ dowego, utrzymujac wartosc pH zawiesiny 9,2. Na¬ stepnie zakwasza sie do wartosci pH = 4,7 za po¬ moca okolo 600 ml 80% kwasu octowego i pozosta- 15 wia mieszanine do ochlodzenia do temperatury 30°C, po czym dodaje sie 10 litrów acetonu i i kg pomocniczego srodka filtracyjnego, zwlaszcza cel- litu i przesacza przez plótno.Otrzymuje sie 22 litry przesaczu, który rozcien- 20 cza sie 55 litrami acetonu. Wytracony produkt od¬ dziela sie przez dekantacje, przemywa acetonem,. suszy pod zmniejszonym cisnieniem i miele. Otrzy¬ muje sie okolo 3 kg produktu w postaci proszku.Proszek ten miesza sie z 9 litrami wody, dodaje sie: 25 2 n kwasu solnego w celu uzyskania wartosci pH = 5,7 i nastepnie dodaje sie 20 g chlorku sodo¬ wego i 20 g papainy, mieszajac ogrzewa mieszani¬ ne do temperatury 60°C w ciagu 24 godzin. Pod koniec procesu papainizacji dodaje sie 50 g pomoc- 30 niczego srodka filtracyjnego i przesacza przez plót¬ no. Przesacz steza sie pod cisnieniem 50 mm Hg. do objetosci 3 litrów i traktuje 2,7 litra acetonu..Otrzymany osad oddziela sie przez dekantacje, przemywa acetonem i suszy pod zmniejszonym ci- 35 snieniem. Otrzymuje sie okolo 66 g surowych gli- koprotein. Analiza produktu wykazuje zawartosó 3,63% P, 0,21% S, 5,91% N i 7,12% grup acetylo- wych. Lepkosc 1'% roztworu w temperaturze 20°C wynosi 1,2699 cp, a wartosc pH tego roztworu wy- 40 nosi 6,9.Przyklad II. 3,8 kg zamrozonej sluzówki zo¬ ladka swini rozdrabnia sie w urzadzeniu, wyposa¬ zonym w plyte z otworami o srednicy 1,1 mm. Roz¬ drobniony material miesza sie z 7,5 litrami wody 45 i utrzymuje we wrzeniu w ciagu 15 minut, dodajac stopniowo 2 n roztwór wodorotlenku sodowego w celu utrzymania pH zawiesiny 8,6. Nastepnie do¬ daje sie 250 ml 80%-owego kwasu octowego, a po tym tyle kwasu trójchlorooctowego (okolo 160 g), 50 aby uzyskac wartosc pH = 1,8. Powstaly osad od¬ wirowuje sie i czysty przesacz rozciencza cztero¬ krotna objetoscia acetonu. Wytracony osad odsa¬ cza sie, przemywa acetonem, suszy pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i miele. 47 g otrzymanego proszku 55 poddaje sie papainowej proteolizie, uprzednio do¬ prowadziwszy pH zawiesiny do wartosci 5,7 w spo¬ sób opisany w przykladzie I. Otrzymuje sie 20 g surowego proszku, zawierajacego 4°/o P oraz 6,2% N. 60 Przyklad III. 1 kg zamrozonej wolnej od tlu¬ szczu dwunastnicy swinskiej rozdrabnia sie w spo¬ sób opisany w przykladzie I, miesza z 1 litrem wo¬ dy, dodaje 80% kwasu octowego do uzyskania war¬ tosci pH zawiesiny 4 i miesza we wrzeniu w ciagu Rt- 15 minut. Po ochlodzeniu mieszanine odwirowuje5 sie, przesacz traktuje 10 g octanu sodowego i roz¬ ciencza czterokrotna objetoscia acetonu.Powstaly osad-'-oddziela sie przez dekantacje, przemywa acetonem suszy pod zmniejszonym ci¬ snieniem i miele. 11 g otrzymanego proszku pod¬ daje sie papainowej proteolizie po doprowadzeniu pH mieszaniny do wartosci 5,7 w sposób opisany w przykladzie I. Otrzymuje sie 5,2 g produktu, za¬ wierajacego 2,5% P oraz 6,03% N.Przyklad IV. 1 kg zamrozonej, wolnej od tlu¬ szczu dwunastnicy swinskiej rozdrabnia sie w spo¬ sób opisany w przykladzie I, miesza sie z 1 litrem wody i po doprowadzeniu pH zawiesiny za pomoca kwasu trójchlorooctowego do wartosci 1,7 ogrzewa do temperatury 50°C w ciagu 30 minut, mieszajac.Po ochlodzeniu zawiesiny odwirowuje sie, przesacz traktuje 15 g octanu sodowego i rozciencza cztero¬ krotna objetoscia acetonu. Powstaly osad oddziela sie przez dekantacje, przemywa acetonem, suszy pod zmniejszonym cisnieniem i miele. 10 g otrzy¬ manego proszku poddaje sie papainowej proteoli¬ zie, po uprzednim doprowadzeniu pH mieszaniny do wartosci 5,7 w sposób opisany w przykladzie I.Otrzymuje sie 4,8 g surowego produktu, zawiera¬ jacego 2,6% P oraz 6,1% N.Przyklad V. 100 g surowego glikoproteidu, otrzymanego w sposób opisany w przykladach I—IV miesza sie z 1 litrem wody, odwirowuje w celu oddzielenia czesci nierozpuszczonych i prze¬ sacz traktuje 2 n roztworem wodorotlenku sodo¬ wego w celu uzyskania wartosci pH = 7,8. Roztwór poddaje sie dializie za pomoca zdejonizowanej wo¬ dy w temperaturze 20°C, stosujac przepone celulo¬ zowa o grubosci 0,03 mm.Po uplywie 48 godzin uzyskuje sie 2 litry roz¬ tworu, który nastepnie odparowuje sie pod cisnie¬ niem 50 mm Hg do pierwotnej objetosci 1000 ml, traktuje 5 g chlorku sodowego i rozciencza 1200 ml acetonu lub 2500 ml metanolu. Powstaly osad od¬ dziela sie przez dekantacje, przemywa rozpuszczal¬ nikiem uzytym uprzednio do stracania, suszy pod zmniejszonym cisnieniem i miele. Otrzymuje sie 60 g produktu o skladzie 0,25% S, 5,81% N, 9,75% grup CH-jCO, 0,71% Na, 39,2% heksozamin, 16,3% protein (folina), 29,5% heksoz oraz 4,55% pochód-* nych kwasu neuraminowego. Produkt ten nie za¬ wiera fosforu ani kwasów uronowych, jego lepkosc w 1% roztworze w temperaturze 20°C wynosi 1,6409 cp, a wartosc pH 1% roztworu wynosi 6,3.Przyklad VI. 100 g surowego glikoproteidu, otrzymanego w sposób opisany w przykladzie I—IV, miesza sie z ii litrem wody, odwirowuje za¬ wiesine w celu oddzielenia od czesci nierozpu¬ szczonych i przesacz traktuje w temperaturze po¬ kojowej w ciagu 1/2 godziny 150 ml zywicy Am¬ berlite I R 120 w postaci kwasowej. Po odsaczeniu przemywa sie zywice 100 ml destylowanej wody i popluczyny laczy z glównym przesaczem.Do przesaczu dodaje sie 5 g chlorku sodowego i 1320 ml acetonu. Powstaly osad oddziela sie przez dekantacje, przemywa trzykrotnie acetonem, rozpuszcza ponownie w 750 ml wody i dodaje 2 n roztworu wodorotlenku sodowego w celu uzyska- 6 nia wartosci pH = 6,2. Do roztworu dodaje sie na¬ stepnie 3 g octanu sodowego i rozciencza roztwór acetonem w ilosci równej 2,5-krotnej objetosci roz¬ tworu. Powstaly osad oddziela sie przez dekan- tacje, przemywa acetonem, suszy pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i miele. Uzyskuje sie 67 g pro¬ duktu. Przy pracy na skale przemyslowa traktowa¬ nie wymieniaczem zywicznym moze byc korzystnie prowadzone w kolumnie perkolacyjnej, w sposób zasadniczo jak opisany wyzej.Otrzymany produkt zawiera: 0,08% P, 0,2% S, 6,03% N, 9,34% grup CH3CO, 0,43% Na, 39,5% hek¬ sozamin, 29,5% heksez, 14,0% protein (folina) oraz 5,33% pochodnych kwasu neuraminowego. Nie za- 15 wiera on kwasów uronowych, jego pH w 1%-owym roztworze wynosi 6,2, a lepkosc w temperaturze 20°C wynosi 1,9189 cp.Przyklad VII. 100 g surowego glikoproteidu, otrzymanego w sposób opisany w przykladach 20 I—IV, miesza sie z 1 litrem wody, odwirowuje od czesci nierozpuszczonych i przesacz traktuje 100 ml zywicy Amberlite IR120, zakwaszonej 10% HC1.Po uplywie 30 minut odsacza sie zywice i przemy¬ wa osad 100 ml destylowanej wody, laczac poplu- 25 czyny z przesaczem/Przesacz traktuje sie nastep¬ nie 100 ml zywicy Amberlite I RA 410, aktywowa¬ nej 5% NaOH. Po uplywie 30 minut zywice odsa¬ cza sie i przemywa 150 ml destylowanej wody, kie¬ rujac popluczyny do przesaczu. Do przesaczu do- 30 daje sie 2 n roztwór NaOH w celu uzyskania war¬ tosci pH = 6,2.Nastepnie dodaje sie 5 g octanu sodowego oraz aceton w ilosci równej objetosci roztworu. Powsta¬ ly osad oddziela sie przez dekantacje, przemywa 35 acetonem, suszy pod zmniejszonym cisnieniem i miele. Otrzymuje sie 70 g produktu o skladzie: 0,04% P, 0,11% S, 0,27% Na, 9,93% grup acetylo- wych, 5,74% N, 40% heksozamin, 14,5% protein (fo¬ lina), 31% heksoz i 5,20% pochodnych kwasu neu- 40 raminowego. Produkt nie zawiera kwasów urono¬ wych, wartosc pH 1% roztworu = 6, a lepkosc w temperaturze 20°C wynosi 1,9004 cp.Przy pracy na skale techniczna, traktowanie zy¬ wicami moze byc prowadzone w odpowiednich ko- 45 lumnach perkolacyjnych, a poza tym proces pro- * wadzi sie zasadniczo w sposób wyzej opisany. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 50 1. Sposób otrzymywania glikopeptydu ze slu¬ zówki zoladka lub z dwunastnicy swin, znamienny tym, ze organ zwierzecy poddaje sie hydrolizie w srodowisku wodnym w temperaturze 50—100°C w 55 ciagu 10—45 minut, przy wartosci pH wynoszacej 1,5—10, po czym odsacza sie uboczne produkty, po¬ wstale podczas kwasnej hydrolizy lub ewentualnie wytracone kwasem po hydrolizie, przesacz poddaje sie enzymatycznej proteolizie za pomoca papainy 60 lub trypsyny. nastepnie traktuje srodkiem, w któ¬ rym produkt jest nierozpuszczalny, zwlaszcza ace¬ tonem lub nizszym alkanolem i oddziela produkt przez dekantacje, po czym ewentualnie w celu oczyszczenia rozpuszcza sie go w wodzie, odwiro- 65 wuje i poddaje dzialaniu kwasnego zywicznego7 wymieniacza jonów lub zasadowego wymieniacza jonów po uprzednim zobojetnieniu i wytraca po¬ nownie produkt i oddziela go, albo tez surowy pro¬ dukt rozpuszcza w wodzie, odwirowuje, doprowa¬ dza do wartosci pH = 6—7, poddaje dializie za po- 8 moca zdejonizowanej wody wodociagowej w ciagu 24 godzin, wytraca produkt ponownie i oddziela.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w celu wytracenia ubocznych produktów hydrolizy dodaje sie kwas trójchlorooctowy. WDA-l. Zam. 4474. Naklad 220 egz. PL