Pierwszenstwo: Opublikowano: 23.XI.1966 (P 117 534) 2.XII.1965 dla zastrz. 1 i 2 Wielka Brytania 31.X.1969 r. 58303 KI. 6 a, 22/04 MKP C 12 d /(jl/f Twórca wynalazku: inz. Knud Aunstrup Wlasciciel patentu: Novo Terapeutisk Laboratorium A/S, Kopenhaga (Dania) Sposób otrzymywania enzymu scinajacego mleko Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania en¬ zymu scinajacego mleko.Przy produkcji sera konieczne jest scinanie mleka w celu oddzielenia kazeiny od serwatki.Dotychczas uzywa sie do tego enzym zwany pod¬ puszczka, który wydziela sie z zoladków cielecych.Ze wzgledu na proces dojrzewania sera szcze¬ gólne znaczenie dla uzyskania dobrych wydaj¬ nosci sera ma fakt niskiej aktywnosci proteoli¬ tycznej podpuszczki, która powoduje znikome roz¬ puszczanie sie kazeiny w procesie otrzymywania i dojrzewania sera.Podpuszczka cieleca nadaje sie dobrze do sci¬ nania mleka. Nalezy jednak przewidywac, ze za¬ potrzebowanie na ten enzym rychlo przekroczy mozliwosci produkcji podpuszczki z zoladków cie¬ lecych. Dlatego tez podejmowane sa wysilki w kierunku znalezienia enzymów odznaczajacych sie zdolnoscia scinania mleka, a równoczesnie niska zdolnoscia rozkladania bialka.Istnieje caly szereg mikroorganizmów, które wytwarzaja proteinazy scinajace mleko, jednak wiekszosc ich rozklada równiez w wysokim stop¬ niu bialko. Wplywa to nader ujemnie na wydaj¬ nosc sera, a równoczesnie prowadzi do powstawa¬ nia w czasie dojrzewania sera produktów rozkla¬ du kazeiny (peptydy), które odznaczaja sie gorz¬ kim smakiem. Dotyczy to na przyklad proteinaz wydzielonych z Bacillus subtilis i Aspergillus saitoi. 10 15 20 25 Enzym wyodrebniony z grzybka Mucor pusillus odznacza sie korzystniejszym stosunkiem zdolnos¬ ci scinania mleka i rozkladu 'bialka, jednakze ten mikroorganizm nadaje sie raczej do hodowli w warunkach powierzchniowych, gdyz w wyniku hodowli glebinowej otrzymuje sie go z niska wy¬ dajnoscia.Wedlug wynalazku, scinajacy mleko enzym mozna otrzymac tanio i z duza wydajnoscia przez hodowle grzybka Mucor miehei Cooney et Emer¬ son wzglednie jego naturalnych lub sztucznych odmian lub mutantów na odpowiednio dobranym podlozu.Wprawdzie wedlug wynalazku mozna stosowac zarówno hodowle glebinowa jak i powierzchniowa, ale korzystniejsze wyniki uzyskuje sie na ogól w warunkach glebinowych.Wspomniany wyzej nowy szczep Mucor wyizolo¬ wano z kompostu pobranego w Kopenhadze we wrzesniu 1965 r. W wyniku badan przeprowadzo¬ nych w Centraalbureau voor Schimmelculturen, Baarn, Holandia, okreslono przynaleznosc szczepu do grupy Mucor miehei Cooney et Emerson.Szczep zdeponowano we wspomnianej instytucji pod podanym wyzej numerem CBS.Morfologiczna charakterystyka nowego szczepu Mucor CBS 370,65 przedstawia sie nastepujaco: Strzepki: krótkie, wysokie na 2—3 mm, po¬ czatkowo biale, nastepnie mysio- 5830358303 szare do barwy ciemnej mysio- szarej; Sporangiofory: srednica 6—10 mikronów, rozga¬ lezione sympodialnie; Sporangia: kuliste o srednicy 25—60 mikro¬ nów, sicianki porosle krótkowlosa szczecinka; Kolumelie: od prawie kulistych do owalnych o srednicy 20—40 mikronów; Sporangiospory: bezbarwne, prawie kuliste do eli¬ ptycznych, 3—5 X 4—6 mikronów; Zygospory: liczne, prawie kuliste, brodawko- wate, we wczesnych stadiach roz¬ woju zóltawe do czerwonawobra- zowych, czarnawe w stanie doj¬ rzalym, o srednicy 30—45 mikro¬ nów, wytwarzane przez grzybnie homotaliczna; Azygospory: obecne; Paczki: nie stwierdzono; wzrost: zachodzi w temperaturze 30— 55°C, a bardzo szybko w tempe¬ raturze 40°C.Nizej podane przyklady wyjasniaja blizej spo¬ sób wedlug wynalazku, przy czym przyklady I—IV dotycza hodowli szczepu Mucor miehei CBS 370,65 w warunkach glebinowych, przyklad V dotyczy hodowli tego szczepu w warunkach powierzchnio¬ wych, a przyklad VI omawia zdolnosc wytwa¬ rzania enzymu scinajacego mleko /przez inne szcze¬ py grzybka Mucor miehei w porównaniu z od¬ powiednia zdolnoscia szczep M.m. CBS 370,65.Przyklad I. Doswiadczenie w kolbach wstrzasanych.Zastosowano nastepujace podloze: skrobia ziemniaczana 40 g/litr maka sojowa 3'0 g/litr jeczmien mielony 100 g/litr weglan wapnia (CaC03) 5 g/litr olej sojowy 0,5 ml/litr Do 3 kolb Erlenmeyera o pojemnosci po 500 ml wlano po 100 ml podloza o powyzszym skladzie, po czym zaszczepiono je zawiesina sporów Mucor miehei Cooney et Emerson CBS 370,65. Nastepnie kolby umieszczono na wstrzasarce i wytrzasano je w ciagu 7 dni-w temperaturze 30°C. Nastepnie Odsaczono grzybnie i oznaczono aktywnosc przesa¬ czu metoda Kunitza (J. Gen. Physiol. 18 (1935) 459). Uzyskano nastepujace wyniki: Kolba I: 15800 jednostek podpuszczki Kunitza/litr Kolba II: 17700 jednostek podpuszczki Kunitza/litr Kolba III: 15700 jednostek podpuszczki Kunitza/litr Przyklad II. Doswiadczenie w skali pól- technicznej.W zbiorniku zaszczepowym przygotowano podlo¬ ze o skladzie: skrobia ziemniaczana 2 kg maka sojowa . 1,5 kg maka jeczmienna 5 kg amylaza bakteryjna Novo 5000 SKB 5 g weglan wapnia (CaC03) 500 g woda okolo 40 litrów Mieszanine podgrzano do temperatury okolo 70°C i utrzymywano w tej temperaturze w ciagu okolo 30 minut. Nastepnie ogrzano mieszanine do wrzenia i utrzymywano w ciagu 90 minut w tem¬ peraturze 120°C przez wprowadzenie zywej pary, az do uzyskania objetosci okolo 50 litrów po schlo¬ dzeniu. Po ochlodzeniu do temperatury 34°C pod- 5 loze zaszczepiono sporami pobranymi z kolby Fernbacha zawierajacej agar YPlPSS (Thermo- philic Fuingi Cooney amd Emerson, Londyn, 1964) o nastepujacym skladzie: ekstraktat drozdzowy 4 g 10 kwasny fosforan potasu (K2HP04) 1 g siarczan magnezu (MgS04 • 7H20) 0,5 g skrdbia rozpuszczalna 15 g agar 20 g woda 1000 ml 15 Zawartosc kolby Fernbacha zaszczepiono liofili¬ zowana kultura Mucor miehei Cooney et Emer¬ son CBS 370,65 i inkubowano w temperaturze 40°C w celu wytworzenia sporów. Po zaszczepieniu rozpoczeto mieszanie (240 obr/min) i napowietrza- 20 nie (60 litrów/min.). Fermentacje prowadzono w ciagu 48 godzin az do zaobserwowania dobrego wzrostu. Nastepnie przeniesiono zawartosc zbior¬ nika do glównego zbiornika fermentacyjnego, któ¬ ry zawieral podloze o skladzie: 25 skrobia ziemniaczana 8 kg maka sojowa 6 kg jeczmien mielony 20 kg amylaza bakteryjna Novo 5000 SKB 25 g weglan wapnia(CaC03) 2 kg 30 Podloze podgrzano do wrzenia i wysterylizowa- no zywa para tak jak poprzednio podloze w zbior¬ niku zaszczepowym, z tym, ze koncowa objetosc wynosila tutaj okolo 200 litrów.Po zaszczepieniu rozpoczeto mieszanie (400 obr./ 35 min.) i napowietrzanie (0,2 ms/min.) dodajac w ra¬ zie potrzeby olej sojowy jako srodek przeciwpie- niacy. W czasie fermentacji wartosc pH roztworu byla stala i wynosila 6,5. Po 129 godzinach fer¬ mentacji ciecz kulturowa zawierala scinajacy mle- 40 ko enzym w ilosci 2580 jednostek podpuszczki Kunitza na litr.Przyklad III. Dodatkowe doswiadczenia w kolbach wstrzasanych.Do doswiadczen posluzono sie kolbami Erlen- 45 meyera o pojemnosci po 500 ml, z których kazda zawierala 100 ml podloza o skladzie podanym w tablicy. Kolby szczepiono w temperaturze 30°C i wstrzasano na wstrzasarce obrotowej (240 obr./ min.) w okresach czasu podanych w tablicy.' 50 Materialem szczepiacym byla zawiesina sporów uzyskana przez hodowle szczepu Mucor miehei Cooney et Emerson CBS 370,65 na agarze YPPSS w temperaturze 40°C w ciagu 2—3 dni i wylugo¬ wanie sporów sterylizowana woda. Uzyty do tego 55 celu agar YPPSS mial ten sam sklad co powyzej.Aktywnosc enzymu scinajacego mleko oznaczono metoda Kunitza i wyrazono w jednostkach pod¬ puszczki Kunitza.Skladniki podloza podano w tablicy w gramach/ 60 litr. W kazdym podlozu skrobie rozkladano przed sterylizacja przy uzyciu amylazy bakteryjnej.W doswiadczeniach prowadzonych na skale pól- techniczna uzyskuje sie wydajnosci tego samego rzedu co w powyzszych doswiadczeniach w kol- 65 bach wstrzasanych.58303 Tablica Podloze nr Maka ziemniaczana Maka sojowa Jeczmien mielony Kukurydza mielona Kielki kukurydziane mielone Maka zóltego groszku Maka ryzowa Soludry Na2S04 CaC03 KH2P04 Aktywnosc enzymu (jedn. podpuszczki Kunitza/ml) Po 6 dniach inkub. po 7 po 8 pH po 6 dniach inkub. 7 8 „ „ 95 40 30 100 1 5 3 13,5 15,4 17,2 6,1 6,9 7,0 97 40 30 100 1 5 3 9,7 10,7 14,6 6,1 7,1 7,2 05 30 100 40 1 5 3 11,5 11,9 13,8 7,0 6,8 7,5 25 40 30 100 1 5 3 13,6 19,2 21,2 6,1 6,5 6,9 26 40 30 50 50 1 5 3 13,6 17,8 18,2 6,0 6,7 6,8 55 ^ 40 30 100 1 5 3 12,0 13,2 14,6 6,2 6,8 6,9 62 40 20 100 10 1 5 * 3 2,6 13,3 12,9 6,1 6,0 6,7 63 40 20 100 10 1 5 3 7,1 14,8 16,7 6,2 6,4 6,2 64 40 1 20 100 10 1 5 3 4,9 14,0 15,4 5,9 6,3 6,3 Przyklad IV. W celu dalszego zilustrowania wynalazku otrzymano enzym scinajacy mleko raz przy uzyciu Mucor pusillus (dostarczanego przez Centraalbureaiu voor Schimmelculturen, Baarn, Holandia), a nastepnie przy uzyciu szczepu Mucor miehei CBS 370,65. W pierwszym wypadku otrzy¬ mano enzym w ilosci 300 jednostek podpuszczki Kunitza/litr (podloze nr 95 podane w tablicy w przykladzie HI), w drugim natomiast w ilosci okolo 10000 jednostek podpuszczki Kunitza/litr lub nawet znacznie wiecej. Przy uzyciu podloza za¬ wierajacego 10% mleka chudego, 1% glukozy, 0,1% ekstraktu drozdzowego i 0,005 M AaC12 uzyskano nastepujace wyniki: Mucor pusillus: 900 jednostek podpuszczki K./litr Mucor miehei CBS 370,65: 5500 jednostek pod¬ puszczki K./litr Przyklad V. Hodowla w warunkach po¬ wierzchniowych.W Kolbie Erlenmeyera o pojemnosci 500 ml u- mieszczono 25 g mieszaniny otrab pszenicznych z woda (1:1) i poddano sterylizacji. Sterylizacje kolby z zawartoscia wykonano przez ogrzewanie 30 35 w temperaturze 120°C w ciagu 45 minut. Nastep¬ nie ochlodzono kolby do temperatury 40°C i za¬ szczepiono sporami Mucor miehei Cooney et Emer¬ son, szczep CBS 370,65 w sposób opisany wyzej.Kolby inkuibowano w ciagu 3 dni w temperaturze 40°C. Nastepnie otreby ekstrahowano 200 ml wo¬ dy i w otrzymanym ekstrakcie oznaczono aktyw¬ nosc enzymu scinajacego mleko. Aktywnosc ta wynosila 4500 jednostek podpuszczki Kunitza/litr.. Przyklad VI. W jednakowych warunkach i na takiej samej pozywce prowadzono hodowle nastepujacych 4 szczepów Mucor miehei Cooney et Emerson: CBS 370,65, CBS 182,67, A 21 i ATCC 16457. Po wyhodowaniu w kolbach na wstrza- sarce oznaczono w poszczególnych próbach aktyw¬ nosc podpuszczki w jednostkach NOVO-Soxhlet i ogólna aktywnosc proteolityczna w jednostkach Ansona na litr. Oznaczono równiez stosunek po¬ miedzy aktywnoscia podpuszczki i ogólna aktyw¬ noscia proteolityczna dla 4 róznych wartosci pH srodowiska. Wyniki prób podano w ponizszym ze¬ stawieniu.Wartosc pH 4,5 5,0 5,5 6,0 Mucor miehei CBS 370,65 NOVO Soxhlet 1913 1913 2020 2020 An- son 2,2 6,0 7,4 5,5 Sto¬ sunek 870 319 273 367 Mucor miehei CBS 182,67 NOVO Soxhlet 1875 1875 1875 1875 An- son 2,9 6,5 7,5 4,2 Sto¬ sunek 660 280 250 446 Mucor miehei A 21 NOVO Soxhlet 1050 1050 1050 1050 An- son 1,5 2,9 4,4 3,2 Sto¬ sunek 700 o 362 239 328 Mucor miehei ATCC 16457 NOVO Soxhlet 1630 1630 13'20 1320 An- son 1,9 5,3 5,5 3,9 Sto¬ sunek 850 308 240 3387 Z zestawienia tego wynika, ze nie tylko szczep CBS 370,65 ale i inne szczepy Mucor miehei Cooney et Emerson wytwarzaja enzym o podobnie korzystnym stosunku pomiedzy aktywnoscia pod¬ puszczki i ogólna aktywnoscia proteolityczna.W celu porównania wlasciwosci scinania mleka przez enzym otrzymywany sposobem wedlug wy¬ nalazku z odpowiednimi wlasciwosciami podpuszcz¬ ki cielecej, oznaczono aktywnosc enzymu i pod¬ puszczki wzgledem kazeinianu sodu w srodowisku o wartosci pH = 6,3 i o temperaturze 37°C. Spo¬ rzadzono roztwory obu badanych substancji, za¬ wierajace takie same ilosci jednostek podpuszczki Kunitza/litr i po straceniu kwasem trójchloro- octowym, zmierzono ich gestosc optyczna przy dlugosci fali 280 milimikronów. Gestosc optyczna kazeinianu wynoszaca 0,136 nie ulega zmianie, gdyz po traktowaniu go podpuszczka w ciagu 3 go¬ dzin wynosi 0,137 podczas gdy gestosc optyczna kazeinianu potraktowanego enzymem wytworzo¬ nym sposobem wedlug wynalazku wzrasta w tym czasie do 0,265, a wiec o wielkosc, która nie ma 8 praktycznego znaczenia w technice przy wytwa¬ rzaniu sera.Enzyim scinajacy mleko, otrzymany wedlug wy¬ nalazku, zastosowano do produkcji sera i uzyska- 5 no z duza wydajnoscia produkt o dobrym smaku. PL