PL50093B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 30.IX.1965 50093 KI.UKD 6 a, 22/05 MKP C12d 'lS/oo Wspóltwórcy wynalazku: Mariji Miwa, Tatsuro Kagani Wlasciciel patentu: Toyo Boseki Kabushiki Kaisba, Osaka (Japonia), Ta- kada Chemical Industries Limited, Osaka (Japonia) Sposób otrzymywania kwasu rybonukleinowego z drozdzy Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania kwa¬ su rybonukleinowego z drozdzy.Kwas , rybonukleinowy nazywany dalej RNA wedlug danych np. z „The Niucleic Acids" R.Caryaffa i I. N. Dawidsoma (Akademie Press, iNew York, 1955) jest zwiazkiem organicznym uwaza¬ nym za spolimeryzowany nukleotyd, który sklada sie z kwasu fosforowego, cukru ( w postaci D — rybozy) i puryny albo pirymidyny. Zwiazek ten wystepuje w drozdzach, oraz w wszelkiego rodza¬ ju komórkach zarówno roslinnych ja!k i zwierze¬ cych.Poniewaz drozdze sa latwo dostepne oraz nale¬ za do mikroorganizmów szczególnie bogatych w RNA prowadzono juz badania nad ekstrakcja kwa¬ su rybonukleinowego z drozdzy (Gl Clark, G. B.Schryver. (Biochem. J.11.319 (1917) i A. M. Chem. 216 185 (1955). Jednak te znane sposoby byly pierwotnie opracowywane w celu studiów bioche¬ micznych nad rola, która jak przypuszczano, RNA odgrywa w zyciu i wskutek tego nie mozna ich dostosowac do celów przemyslowych na wielka skale.W zwiazku z niedawnym okryciem aktywnosci farmakologicznej RNA i jego niektórych pochod¬ nych, jak tez w zwiazku z zastosowaniem nukleo¬ tydu zasady 5'-puryny (wytwarzanego z RNA) w przemysle spozywczym, popyt na RNA wzrósl tak znacznie, ze dotychczas znane sposoby jego otrzymywania pozwalajace na wytwarzanie tylko 20 25 30 niewielkich ilosci RNA staly sie w skali przemy¬ slowej nieekonomiczne.Przedmiotem wynalazku jest przemyslowa meto¬ da otrzymywania kwasiu rybonukleinowego przez ekstrahowanie go z drozdzy.Wedlug wynalazku mleko drozdzowe zawieraja¬ ce dodatek lugu posiarczynowego, albo mleko droz¬ dzowe nie oddzielone jeszcze od brzeczki, otrzy¬ mywane przez hodowle drozdzy na pozywce zawie¬ rajacej lug posiarczynowy poddaje sie ogrzewaniu, nastepnie zas oddziela sie ciecz od stalej zawiesi¬ ny i z cieczy tej wyodrebnia kwas rybonukleinowy.Stwierdzono bowiem, ze, lug posiarczynowy, otrzmany jako produkt odpadkowy przy rotwa- rzeniu celulozy metoda siarczynowa, korzystnie, gdy jest rozcienczony, stanowi doskonaly srodek ekstrakcyjny przy wydobywaniu kwasu rybonu¬ kleinowego z drozdzy. Stwierdzono równiez, ze od¬ ciek podrozdzowy uzyskany' po oddzieleniu z brzeczki drozdzy, hodowanych na pozywce zawie¬ rajacej lug posiarczynowy, korzystnie po roz¬ cienczeniu, takze nadaje sie jako srodek ekstrak¬ cyjny do ekstrakcji kwasu rybonukleinowego z drozdzy.Poniewaz nie jest calkowicie zrozumialy mecha¬ nizm ekstrakcji kwasu rybbnuikleinowego z droz¬ dzy za pomoca lugu posiarczynowego lufo z wyzej wymienionego odcieku przyjeto, ze dzialanie ek¬ strakcyjne tyoh cieczy w stosunku do RNA jest wynikiem obecnosci pewnego skladnika (skladni- 5009350093 3 ków), przypuszczalnie Ugnosulfonianów. W zwiaz¬ ku z tym, gdy lug (posiarczynowy stosuje sie jako pozywke hodowlana w fermentacji drozdzy tylko pewna ilosc jego skladników (zwlaszcza cukry ule- gftjaca fermentacji) zostaje pobrana przez drozdze, 5 a sklad odcieku podrozdzowego, jezeli chodzi o zwiazki wykazujace zdolnosc ekstrahowania kwa¬ su rybcnukleinowego j$st zasadniczo taki sam jak ^ w lugu posiarczynowym nie poddanym fermen¬ tacji. 10 Jako surowiec w sposobie wedlug wynalazku mozna stosowac drozdze suche lulb zywe komórki drozdzowe otrzymane na pozywce zawierajacej lug posiarczynowy, poniewaz jak juz wyzej podano od¬ ciek z brzeczki zawierajacej lug posiarczynowy 15 moze.byc stosowany do ekstrakcji kwasu rybonu¬ kleinowego. Lug posiarczynowy jako produkt od~ padowy stanowi bardzo tani surowiec. W sposo¬ bia wedlug wynalazku mozna stosowac lug po¬ siarczynowy otrzymany przy roztwarzaniu róznych 20 surowców drzewnych.Poniewaz sklad lugu posiarczynowego bywa rózny, w zaleznosci od rodzaju drewna, metody i warunków ^tasowanych w procesie roztiwarzahia, mozna przyjac, ze przecietny sklad lugu w pro- 25 centach wagowych Jest nastepujacy: sucha nielot¬ na pozostalosc 10—15%, lignosulfoniany okolo 5— —8°/o, ogólna zawartosc cukru okolo 2,5—4,5%, cu¬ kier fermentacyjny ofcpjp 1—3,3*/*, tfcr^a okolo 0,8—1,2%. Lug stanowi ciecz koloru cieihnobrazo- 30 v wego.Sposobem wedlug wynalazku mozna poddawac ekstrakcji drozdze otrzymane w znany sposób w srodowisku zawierajacym lug posiarczynowy.W procesie wytwarzania drozdzy, przy zastosowa- 35 niu lugu posiarczynowego postepuje s;e w sposób nastepujacy: Najpierw za pomoca pary odpedza sie z Jugu posiarczynowego .dwuttenek siarki, a jezeli to jest pozadane lug przepuszcza sie przes warstwe wap- 40 na palonego, w celu zmniejszenia jego kwasowosci.Po takiej obróbce lug posiarczynowy wprowadza sie do kadzi fermentacyjnej z amoniakiem i in¬ nymi pozywkami. Kadz fermentacyjna jest zaopa¬ trzona w specjalne urzadzenie do przewietrzania, 45 azeby pobudzic drozdze do normalnej aeroJbowej fermentacji i gwaltownego rozmnazania. Rozmno¬ zone drozdze wyladowuje sie z kadzi fermentacyj¬ nej razem z wyczerpana brzeczka (lub odciekiem) i doprowadza do wirówek, w których oddziela sie 50 zawiesine drozdzy zwana mlekiem drozdzowym od odcieku. Nastepnie mleko drozdzowe poddaje sie kilkakrotnie naprzemian odwirowaniu i prze¬ mywaniu woda, az do uzyskania czystego produk¬ tu, który sie suszy. Proces ten jest opisany bar- 55 dziej szczególowo w Industrial Engineerung Chemistr, 43 8 (1951).Dp ekstrakcji kwasu rybonukleinowego z droz¬ dzy,, mozna stosowac w sposobie wedlug wynalaz¬ ku równiez wywar otrzymany po fermentacyjnym 60 przerobie lugów posiarczynowych.Ponadto stwierdzono, ze do otrzymywania kwasu rybonukleinowego z drozdzy nadaja sie takze mle¬ ko drozdzowe z brzeczka lub mleko drozdzowe od¬ dzielone na wirówkach od brzeczki (odcieku) i 65 jeszcze nie oczyszczone na drodze przemywania.' Sklad mleka drozdzowego, stosowanego do ek¬ strakcji kwasu rybonukleinowego sposobem wedlug wynalazku, moze sie wahac w szerokich granicach lecz korzystnie jest, zeby stezene drozdzy wyno¬ silo 3—15% wagowych (w przeliczeniu na sucha pozostalosc), a stezenie stalych skladników za¬ wartych w Lucu poeiarczynoiwym bylo takie same przed przerobem tych lugów na drozdze i po prze¬ robie lugów 0,2—0,5% wagowo (w stosunku do suchej pozostalosci).Mleko drozdzowe stosowane do ekstrakcji kwa¬ su rybonukleinowego powinno wyfiazyiwac pH = = 4—9, korzystnie 5—7,5. Wartosc pH mleka moz¬ na dowolnie regulowac, na przyklad przez doda¬ wanie alkaliów, np. wodorotlenku sodowego. Jeze¬ li wartosc pH jest nizsza od 4 lub wyzsza od 9, ekstrahowany kwas rybonukleinowy wykazuje tendencje do depolimeryzacji.W procesie ekstrakcji kwasu rybonukleinowego korzystne jest mieszanie * ogrzewanie mleka droz¬ dzowego. Czas i temperatura ogrzewania musza byc rózne, w zaleznosci od rodzaju drozdzy, poza¬ danej wydajnosci i ilosci mleka poddawanego ob¬ róbce. Na ogol ogrzewanie prowadzi sie w tem¬ peraturze 90—120°C (cisnienie atmosferyczne) w ciagu 30—300 minut. Na ogól im wyzsza jest tem¬ peratura, tym krótszy czas ogrzewani.a Najkorzyst¬ niej jest ogrzewac mleko do temperatury wrzenia (Okolo 100°C) w ciagu 50—200 minut.Podczas ogrzewania kwas rybonukleinowy znaj¬ dujacy sie w drozdzach, przechodzi do fazy ciek¬ lej. Mleko drozdzowe po obróbce cieplnej przesy¬ la sie nastepnie na przyklad na wirówki lub prasy filtracyjne w celu oddzielenia substancji stalej od cieczy, z której z kolei wyosobnia sie wyekstraho¬ wany kwas rybonukleinowy.Wydzielenie kwasu rybonukleinowego z cieczy prowadzi sie korzystnie przez jej zakwaszenie do wartosci pH = 1,5—3,5 kwasem np. kwasem sol¬ nym, siarkowym, fosforowym itp. organicznym kwasem karboksylowym, takim jak kwas octowy, kwas moinochlorooctowy itp. i kwasem takim jak organiczny kwas sulfonowy zwlaszcza benzenosul- fonowy, toluenosulfonowy i ligninosulfonowy.Przez zakwaszenie opisanej cieczy wytraca sie kwas rybonukleinowy w postaci osadu, który od¬ sacza sie lub odwirowuje.Sposób wedlug wynalazku pozwala na wyekstra¬ howanie z dobra wydajnoscia kwasu rybonukleino¬ wego z drozdzy. Na przyklad jezeli stosuje sie zywe drozdze, otrzymane w wyniku aerobowej ciaglej fermentacji drozdzy w srodowisku zawiera¬ jacym lug posiarczynowy i pobrane z kadzi fer¬ mentacyjnej podczas staidium wzrostu, otrzymuje- sie surowy kwas ryfbonukleinowy (zawartosc or¬ ganicznego fosforu 8%) z wydajnoscia 4—6% w stosunku do masy drozdzy.Tak otrzymany surowy kwas rybonukleinowy mozna stosowac bez oczyszczania do celów prze¬ myslowych np. mozna go w znany sposób hydro- Mzowac do ryboniukleotydu, uzytecznego w prze¬ mysle spozywczym. Mozna takze surowy kwas ry¬ bonukleinowy oczyszczac w znany sposób, np. me-5 tocla Sevag a (M. G. Sevag i inni, Journal of Biolo- gical Chemisty 124 425 (1938)).Sposobem wedlug wynalazku mozna traktowac drozdze zarówno suszone jak i zywe. Odpowiedni- md rodzajami drozdzy sa np. Hansenaila anomala, 5 Endomyces vernalis, Sacharomyces cerevisiac, Candina tropicalis, Torulopsis utilis, Mycotyryla jajponica, itp. sposród których torulopsis utilis sa korzystne wskutek ich wysokiej zdolnosci rozmna¬ zania. 10 Nastepujace przyklady wyjasniaja blizej sposób , wedlug wynalazku. Podane w przykladach procen¬ ty oznaczaja procenty wagowe.Przyklad I. Po wstepnym traktowaniu jak 15 odjpedzanie dwutlenku siarki zalkalizowany wap¬ nem powanzelny lug posiarczynowy z roztwarzania drewna sosnowego, zawierajacy 12,7% nielotnego produktu stalego (7,8% lignosulfonianów, 4,3% ogólnej zawartosci cukru, 3,2% fermentujacego cu- 20 kra wprowadzono wraz z mala iloscia materialu pozywkowego (chlorek potasu, fosforan dwuamono- wy i amoniak), do kadzi fermentacyjnej pracuja¬ cej metoda ciagla (zmodyfikowany typ kadzi fer¬ mentacyjnej Waldhofa). Wartosc pH brzeczki wy- 25 nosila okolo 5,0. Na wymienionej jpozywce hodowa¬ no drozdze Torulupsis utilis w ciagu 6 godzin "w temperaturze 33°C przy przewietrzeniu. Nastepnie rozmnozone drozdze wraz z brzeczka podrozdzowa spuszczono z kadzi fermentacyjnej i naprzemian 30 poddawano odwirowaniai i przemywaniu woda. Te kolejne operacje powtarzano dwukrotnie, w celu otrzymania mleka drozdzowego o stezeniu drozdzy 11,5% w przeliczeniu na sucha pozostalosc i od¬ cieku zawierajacego 2% stalych skladników (wy- 35 suszona stala pozostalosc). 1 kg mleka drozdzowego doprowadzono do war¬ tosci pH = 7, za pomoca wodorotlenku sodowego i mieszajac ogrzewano do wrzenia w autoklawie z nierdzewnej stali, w ciagu 90 minut. Nastepnie 40 mleko oziebiono do temperatury 5°C i przesaczono w prasie filtracyjnej. Przesacz zawierajacy kwas rybomukleinowy doprowadzono do wartosci pH = = 30 za pomoca rozcienczonego kwasu solnego.Wytracony wyekstrahowany kwas rybonukleino- 45 wy oddzielono przez odwirowanie, przemyto woda i wysuszono w prózni. Otrzymano 6,3 g surowego sproszkowanego kwasu rybonukleinowego. Surowy kwas ryboniukleinowy zawieral 8% organicznego fosforu, wedlug kolorymetrycznego oznaczenia fos- 50 foranu metoda Allen'a (R. Y. L. Allen Biochem. I.(London) 34 858 (1940)). co odpowiada wydajnosci 5,5% w stosunku do drozdzy.Surowy kwas nukleinowy oczyszcza sie metoda Seveg'a (wedlug danych J-Biol. Chem. 124 425 55 *(1938) M. G. Seveg i inni) i otrzymany czysty kwas nukleinowy hydrolizuje kwasem solnym.Chromatografia bibulowa otrzymanego riukleotydu wykazala, ze w stosunku do czystego kwasu nukley, inowego, zawieral on 57% puryny, która mole byc 60 stosowana jako produkt wyjsciowy w produkcji kwasu 5-inozynowego i kwasu 5-guanyflowego.Przyklad II. Na pozywce hodowlanej, za¬ wierajacej lug posiarczynowy z roztwarzania drew- 65 • na bukowego, zalkalizowany waprwm q zawar¬ tosci nielotnego produktu stalego 13,0% (lignosul- foniany 5,7%, ogóJem cukru 3,6°/t) hodowano droz¬ dze typu Torula w warunkach aerobowych w taki sam sposób jak w przykladzie I. Rozmnozone droz¬ dze z odciekiem odwirowano i przemyto woda w celu utworzenia mleka drozdzowego, zawierajacego 10,5% suchej pozostalosci i odcieku zawierajacego 4,3°/o suchej pozostalosci. 1 kg tego mleka doprowadzono do wartosci pH =* 6,5 i ekstrakcje prowadzono w autoklawie w ciagu 70 minut, w temperaturze 100°C. Po tym traktowaniu usunieto komórki drozdzowe i pozo¬ stala ciecz doprowadzono do wartosci pH « 2,0 za pomoca rozcienczonego kwasu solnego. Wytra¬ cony kwas rybonukleinowy odwirowano* przemyto woda i wysuszono. Otrzymano w postaci proszku surowy kwas nukleinowy (zawartosc fosforu 8,0°/©) w ilosci 5,7 g, co odipowiada okolo 5,5% uzytych drozdzy.Przyklad III. Suche drozdze Tonula wyhodo¬ wano na pozywce hodowlanej, zawierajacej lug posiarczynowy, jak w przykladzie I, dodano do roz-. tworu zawierajacego 2% substancji stalej i otrzy¬ manego przez rozcienczenie 6,3-krotnie lugu po¬ siarczynowego, stosowanego w przykladzie I, tak ze otrzymano mleko drozdzowe, zawierajace 5% drozdzy. 1 kg tego mileka doprowadzonego do wartosci pH = 6,5 ogrzewano w ciagu 120 minut do tempe¬ ratury 100°C podczas mieszania i przesaczono.Z przesaczu otrzymano 2,4 g (wydajnosc 4,8°/o w stosunku do drozdzy) suirowego kwasu nukleino¬ wego (zawartosc fosforu organicznego 7,3%).Surowy kwas nukleinowy oczyszczono w taki sam sposób' jak w przykladzie I, po czym hyidro- lizowano. Chromatografia bibulowa otrzymanego nukleotydu wykazala, ze zawiera on 56% nukleo- tydów adeniny i guaniny.Przyklad IV. Przyklad ten wyjasnia ek¬ strakcje kwasu rybonukleinowego z drozdzy wy¬ hodowanych w srodowisku odmiennym od srodo¬ wiska zawierajacego lug posiarczynowy.Drozdze piekarniane hodowano na melasie we wstrzasanym naczyniu fermentacyjnym.Do autoklawu wprowadzono rozcienczony lug posiarczynowy z roztwarzania drewna bukowego, zawierajacy 3,3% stalej substancji, to znaczy roz¬ twór otrzymany przez 4-krotne 'rozcienczenie lju- g;u ^siarczynowego, stosowany w przykladzie II.Do tego roztworu dodano drozdze piekarniane, do uzyskania mleka drozdzowego o wartosci pH = 6,5 zawierajacego 8% drozdzy, Mleko drozdzowe ogrze¬ wano do temperatury 110°C w, oiagu 100 minut podczas mieszalnia. Po oziebieniu mleko odsaczo¬ no i przesacz doprowadzono do wartosci pH = 2,5 za pomoca kwasiu octowego i odwirowano w celu oddzielenia wytraconego kwasu' rybonukleinowego.Otrzymano 0,22 czesci (wydajnosc 2,7% w stosun¬ ku do drozdzy) surowego kwasu nukleinowego (fosforan organiczny = 7,1%).Przyklad V. Powtórzono postepowanie z przykladu IV, z wyjatkiem tego, ze stosowano50093 drozdze piwowarskie lub drozdze ze sfermentowa¬ nego ryzu wyhodowane w srodowisku odmiennym od srodowiska zawierajacego lug posiarczynowy.Zawiesine wodna tych drozdzy ekstrahowano lu¬ gami posiarczynowymi otrzymanymi z miazgi ce¬ lulozowej. W zadnym przypadku nie wyekstraho¬ wano kwasu ryibonukleinowego z drozdzy z dobra wydajnoscia. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenia patentowe Sposób otrzymywania kwasu rybonukleinowe- go z drozdzy, znamienny tym, ze rozcienczone mleko drozdzowe otrzymane z drozdzy wyhodo¬ wanych na pozywce zawierajacej lug posiarczy¬ nowy doprowadza sie ido pH = 4—9, korzyst¬ nie 5—7,5 nastepnie ogrzewa najkorzystniej do temperatury 90—120°C, przy czym kwas rybo- nukleinowy przechodzi do fazy cieklej, a uzys¬ kany roztwór kwasu ryboinukleinowego oddzie¬ la sie od drozdzy przez odsaczenie lub odwiro- 10 15 20 8 wanie, po czym zakwasza do uzyskania wartos¬ ci pH = 1,3—3,5 w celu wytracenia kwasu. Sposób wedlug zastrz. 1,, znamienny tym, ze jako mleko drozdzowe stosuj-e sie zawiesine za¬ wierajaca w przeliczeniu na sucha pozostalosc 3—15% drozdzy i 0,2—5% # stalych skladnikowy lugu posiarczynowego, wystepujacych w nie¬ zmiennej ilosci przed i po zdrozdzowaniu tych lugów. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ja¬ ko rozcienczone mleko drozdzowe stosuje sie zawiesine drozdzy nie oddzielona od odcieku. Odmiana sposobu wedlug zastrz. 1, znamienna tym, ze jako mleko drozdzowe, stosuje sie za¬ wiesine otrzymana przez zmieszanie suchych drozdzy z lugiem posiarczynowym. Sposób wedlug zastrz. 1—4, znamienny tym, ze jako drozdze stosuje sie Torulopsis utilis. Dokonano jednej poprawki [B/8L IO 'tKA, fetfe^. ^'^n,,.'!01 Z.G. ,,Ruch" W-wa. zam. 883-65 naklad 220 egz. PL