PL440802A1 - Pochodna kwasu usninowego, sposób otrzymywania tej pochodnej, medyczne zastosowanie w terapii nowotworów, zastosowanie in vitro odczynnika - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie dotyczy pochodnej kwasu usninowego stanowiącej związek (S)-7-acetylo-8,10-dihydroksy-2,3,9,10b-tetrametylo-2,10b-dihydro-4H-benzofuro[2,3-g]indazol-4-on, jej zastosowanie medyczne i in vitro. Zgłoszenie obejmuje również sposób otrzymywania pochodnej kwasu usninowego stanowiącego związek (S)-7-acetylo-8,10-dihydroksy-3,9,10b-trimetylo-2,10b-dihydro-4H-benzofuro[2,3-g]indazol-4-on.

Description

PL 440802 A1 2/18 Pochodna kwasu usninowego, sposób otrzymywania tej pochodnej, medyczne zastosowanie w terapii nowotworów, zastosowanie in vitro odczynnika Przedmiotem \vynalazku jest nowy zwiazek, pochodna kwasu usninowego otrzymana na drodze syntezy chemicznej. Wynalazek dotyczy równiez sposobu otrzymywania i zastosowanie medyczne tego zwiazku wobec nowotworów pochodzacych z róznych tkanek, zwlaszcza z gruczolu sutkowego, szyjki macicy i trzustki. Zwiazek stanowi równiez srodek do zastosowania jako srodek in vitro do badan laboratoryjnych do indukcji smierci lub wakuolizacji komórek i zaleznosci miedzy tym procesami w odpowiedzi komórek nowotworowych na potencjalny lek.

Choroby nowotworowe stanowia jedna z czolmvych przyczyn zgonów ludzi na calym swiecie, stad ciagle poszukuje sie skutecznych form zapobiegania im i ich leczenia. W dzialania te wpisuje sie opracowanie nowych leków opartych na strukturze znanych zwiazków pochodzenia naturalnego. Porosty sa bogatym zródlem substancji o potencjalnym dzialaniu przeciwnowotworowym.

Zespól naukowy wynalazku posiada dlugoletnie doswiadczenie w dziedzinie chorób nowotworowych i poszukiwaniu zwiazków naturalnych o oczekiwanym dzialaniu biologicznym. Obecnie koncentruje sie na badaniu kwasu usninowego UA, który wystepuje w postaci dwóch enancjomerów: kwas(+) usninowy oraz kwas(-) usninowy (róznica w polozeniu grupy metylowej w pozycji 9b) oraz jego syntetycznych pochodnych. UA wykazuje szereg interesujacych wlascivvosci, m.in. aktywnosc przeciwbakteryjna, przec1ww1rusowa, przeciwgrzybicza, a takze cytostatyczna i cytotoksyczna wzgledem komórek nowotworowych - zarówno w modelach in vitro, jak i in vivo, co opisano w lngolfsdottir K: Usnic acid.

Phytochemistry 2002, 61 (7):729-736; Araujo AA, de Melo MG, Rabelo TK, Nunes PS, Santos SL, Serafini MR, Santos MR, Quintans-Junior LJ, Gelain DP: Review of the biologi cal properties and toxicity of usnic acid. Natural Product Research 2015, 29(23):2167-2180; Galanty A, Pasko P, Podolak I: Enantioselective activity of usnic acid: a comprehensive review and future perspectives. Phytochemistry Reviews 2019, 18; Luzina OA, Salakhutdinov NF: Biological activity of usnic acid and its PL 440802 A1 3/18 derivatives: Part 2. Effects on higher organisms. Molecular and physicochemical aspects. Russian Journal of Bioorganic Chemistry 2016, 42:249-268.

Opisane w literaturze dzialanie cytotoksyczne UA objawia sie glównie przy stosunkowo wysokich jego stezeniach. Dla przykladu, wartosci IC 50 po 72- godzinnym traktowaniu (+)-UA komórek nowotworu jajnika (A2780), szyjki macicy (HeLa), piersi (MCF-7 i SKBR3), okreznicy (HT29), bialaczki (HL60 i Jurkat) wynosily od 49 µM (HL60) do 199 µM (SKBR3). Aby nieodwracalnie zahamowac zdolnosc do podzialów tych komórek (tzw klonogenicznosc) traktowano je 200 itM kwasem (+) usninowym przez 48 godzin - Backorova M, Jendzelovsky R, Keilo M, Backor M, Mikes J, Fedorocko P: Lichen secondary metabolites are responsible for induction of apoptosis in HT-29 and A2780 human cancer cell lines. Toxicology in vitro 2012, 26(3):462-468.

Niekorzystne jest równiez to, ze zwiazek ten nie jest selektywny w stosunku do komórek nowotworowych i tak dla przykladu IC 5o dla komórek nowotworowych (MM98 i A431) wynosilo 23-72 ~tM, a dla prawidlowych keratynocytów (HaCaT) - bardzo podobnie, tj. 35-76 µM - Burlando B, Ranzato E, Volante A, Appendino G, Pollastro F, Verotta L: Antiproliferative effects on tumour cells and promotion of keratinocyte wound healing by different lichen compounds. Planta Medica 2009, 75(6):607-613. Jedynie odmienne wyniki opisano w Brisdelli F, Perilli M, Sellitri D, Piovano M, Garbarino JA, Nicoletti M, Bozzi A, Amicosante G, Celenza G: Cytotoxic activity and antioxidant ca paci ty of purified li chen metabolites: an in vitro study. Phytotherapy Research 2013, 27(3):431-437, gdzie opisano komórki traktowane kwasem (+) usninowym izolowanym z Cladonia lepidophora. Wartosci IC 511 , jakie wyznaczono w tej pracy dla komórek nowotworu piersi (MCF-7), szyjki macicy (HeLa) i okreznicy wynosily odpowiednio okolo 76, 24 i 18 µM, a dla prawidlowych embrionalnych fibroblastów myszy - powyzej 100 µM. Jednak szereg prac wskazuje na silne hepatotoksyczne dzialanie kwasu usninowego. Dla przykladu, w: Han D, Matsumaru K, Rettori D, Kaplowitz N: Usnic acid-induced necrosis of cultured mouse hepatocytes: inhibition of mitochondria! function and oxidative stress. Biochemical Pharmacology 2004, 67(3):439-451, traktowanie hepatocytów PL 440802 A1 4/18 mysich kwasem usmnowym juz w stezeniu 5 µM spowodowalo smierc 98~o komórek. Opisano tez w: Da Silva Santos NP, Nascimento SC, Wanderley MS, Pontes-Filho NT, da Silva JF, de Castro CM, Pereira EC, da Silva NH, Honda NK, Santos-Magalhaes NS: Nanoencapsulation of usnic acid: An attempt to improve antitumour activity and reduce hepatotoxicity. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2006, 64(2): 154-160, uszkodzenie watroby (rejony nekrotyczne w tych organach, podwyzszony poziom transaminaz we krwi) u myszy, którym podano dootrzewnowo kwas usninowy w dawce 15 mg/kg/dzien przez 15 dni.

Z opisu P.436476 znany jest (S)-7-acetylo-8, 1 0-dihydroksy-3, 9, lOb­ trimetylo-2, 1 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3-g]indazol-4-on) pochodna kwasu usninowego, sposób otrzymywania pochodnej kwasu usninowego i medyczne wykorzystanie pochodnej kwasu usninowego w terapii nowotworów oraz zastosowanie do indukcji stresu zwiazanego z retikulum endoplazmatycznym, ale jest to jednak inna pochodna niz wskazana w obecnym wynalazku.

Wynalazek obejmuje nowy zwiazek - pochodna kwasu usmnowego UA, nazywa dalej jako 9 i tak pokazana tak na schemacie jak i pokazana osobno jako wzór 1, zastosowanie medyczne i jako odczynnik in vitro oraz sposób otrzymania - synteza gdzie co istotne zamiast hydratu hydrazyny dodaje sie metylohydrazyne Na wzorze na schemacie 1 pokazano sposób otrzymania - pokazano równiez kwas usmnowy. Pochodna 9 to syntetyczny zwiazek [(S)-7-acetylo-8,10-dihydroksy- 2,3, 9, I 0b-tetrametylo-2, I 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3-g]indazol-4-on]. który wykazuje antyproliferacyjne dzialanie wobec komórek nowotworowych róznego pochodzenia, zwlaszcza komórek nowotworu piersi, szyjki macicy i trzustki.

Pochodna wedlug wynalazku ma dzialanie antyproliferacyjne oraz hamuje migracje komórek nowotworowych (ma potencjalne dzialanie antymetastatyczne).

Co do zastosowania tej pochodnej do celów badawczych, laboratoryjnych- jako odczynnik podawany in vitro pochodna ta ze wzgledu na to, ze indukuje in vitro smierc komórek, czemu moze towarzyszyc wakuolizacja cytoplazmy- umozliwia zastosowanie tego odczynnika do badania zwiazku miedzy tymi procesami - smierci/wokalizacji i ich roli w dzialaniu antynowotworowym potencjalnych leków. PL 440802 A1 /18 OH o Wzór l Wynalazek pokazano na wzorze, schemacie, jak i w przykladzie. Na fig. 1-2 pokazano potwierdzenie otrzymania zwiazku, zas na fig. 3 pokazano wykresy potwierdzajace aktywnosci zwiazku wedlug wynalazku, na fig. 4-7 pokazano wyniki badan biologicznych opisanych bada11 potwierdzajacych aktywnosci zwiazku wedlug wynalazku.

Przyklad (+)-Usnic acid, 1 NH 2NHMe EtOH 80 °C, 3 h 3a, 47% Schemat 1 Sposób otrzymywania nowego zwiazku 9 - schemat 1 : o 9, 13% 10, 33% - zawiesine (+)-kwasu usninowego (1, 1.00 g, 2,90 mmol) w bezwodnym etanolu (20 mL) ogrzano do 80 °C do rozpuszczenia zwiazku. - do roztworu dodano metylohydrazyne (169 µL, 3.20 mmol, 1, 1 równowaznik) i ogrzewano do 80 °C przez 3 godziny - po ochlodzeniu usunieto rozpuszczalnik z wykorzystaniem wyparki PL 440802 A1 6/18 - uzyskany osad byl oczyszczony za pomoca chromatografii kolumnowej typu flash, gdzie faze ruchoma stanowil gradient octanu etylu w heksanie (3: I - I: I), uzyskujac 3 frakcje. Podczas tej chromatografii uzyskano (rozdzielono) 3 frakcje i w kazdej byl inny zwiazek (ze schematu 1 ), zidentyfikowany za pomoca spektroskopii NMR.

Koncentracja frakcji 1 (R1 = 0.16 (1:1 EtOAc/heksan)) wylonila zwiazek 3a (R)-8- acetylo-5, 7-dihydroksy-1,3,4a,6-tetrametylo-1,4a-dihydro-4H-benzofuro[3,2- .fJindazol-4-on, jako zólte cialo stale (474 mg, 46%). Rr = 0.16 (1:1 EtOAc/heksan). 1 H NMR (300 MHz, CDCl,) 6 13.28 (s, lH), 11.16 (s, lH), 6.11 (lH, s), 3.82 (s, 3H), 2.64 (s, 3H), 2.46 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.69 (s, 3H) 13 C NMR (75 MHz, CDCI,) 6 200.5, 195.6, 172.6, 163.6, 157.8, 156.4, 150.5, 149.0, 110.0, 108.3, 104.2, 101.6, 87.8, 60.2, 36.1, 31.3, 30.6, 13.2, 7.6. LRMS (-EST): 111 1 z 353 (100%, [M Hr). HRMS (TOF EST, +ve) 364.0792 [l\HHt (obliczono dla C 18H 15NaNO(,, 364.0797). HPLC: 98.85%, RT: 28.60 min.

Koncentracja frakcji 2 (Rt = 0.33 (1: 1 EtOAc/heksan)) wylonila zwiazek 9: (S)-7- acetylo-8, l 0-dihydroksy-2,3,9, l 0b-tetrametylo-2, l 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3- g]indazol-4-on, jako zólte cialo stale ( 138 mg, 13%). 1 H Nl\lR (400 MHz, CDCh) o 13.31 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 5.93 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 2.71 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 1.69 (s, 3H). 13 C Nl\IR (101 J\;IHz, CDCh) o 201.0, 182.9, 180.7, 163.4, 156.6, 156.4, 155.5, 142.1, 112.6, 108.6, 105.9, 105.5, 102.2, 45.5, 36.2, 33.6, 31.5, .6, 7.6. LRMS (+ESI): m1z 731 (100%, [2M+Nat), 393 (30%, [M+Nar). HRlWS (TOF ESI, +ve) 355.1297 [M+Ht (obliczono dla C19H19N2Os, 355.1294). HPLC: 99.07%, RT: 28.93 min.

Koncentracja frakcji 3 (Rr= 0.10 (1 :1 EtOAc/heksan)) wylonila zwiazek 10 G\')-7- acetylo-8, 1 0-dihydroksy-1,3, 9, 1 0b-tetrametylo-1, 1 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3- g]indazol-4-on jako zólte cialo stale (338 mg, 33%). 1 H NMR (400 MHz, CDCh) o 13.52 (s, lH), 6.00 (s, lH), 4.21 (s, 3H), 2.75 (s, 3H), 2.52 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 1.82 (s, 3H), nie obserwowano jednego sygnalu OH. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) o 13.47 (s, lH), 10.79 (br. s, lH), 6.05 (s, lH), 4.17 (s, 3H), 2.69 (s, 3H), 2.36 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.77 (s, 3H). 13 C NMR (CDCh, 101MHz)8201.6, 182.2, 178.0, 162.9, 158.4, 155.2, 148.7, 146.9, 115.7, 106.5, 106.1, 104.8, 102.6, 47.4, 40.3, 31.9, 30.8, 13.4, 7.3. LRMS (+ESI): m/z 731 (100%, [2M+Nat), 393 (25%, [M+Nat). HRMS PL 440802 A1 7/18 (TOF ESI, +ve) 355.1295 [M+Ht (obliczono dla C19H19N2Os, 355.1294). HPLC: 98.98%, RT: 2241 min.

Widma 1 H NMR oraz 13 C NMR zarejestrowano za pomoca spektrometru Bruker 300. Widma zwiazku 9 pokazano na fig. 1 i fig. 2. Przesuniecia chemiczne (8) podano w czesciach na milion (ppm), a jako wzorca wewnetrznego przy O ppm uzyto tetrametylosilanu (TMS). Wszystkie stale sprzezenia (J) podano w hercach, multipletowosc sygnalów okreslano nastepujaco: s (singlet), d (dublet), dd (dublet dubletów), t (tryplet), dt (dublet trypletów), q (kwartet), m (multiplet).

Identyfikacja otrzymanego zwiazku: 9 [(S)-7-acetylo-8, 1 0-dihydroksy-2,3, 9, 1 0b-tetrametylo-2, 1 Ob-dihydro-4H­ benzofuro[2,3-g]indazol-4-on], Wlasciwosci: zólte cialo stale, o widmie: 1 H Nl\IR (400 MHz, CDCU o 13.31 (s, lH), 9.78 (s, lH), 5.93 (s, lH), 3.85 (s, 3H), 2.71 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 1.69 (s, 3H). 1 °C NMR (101 MHz, CDCh) o 201.0, 182.9, 180.7, 163.4, 156.6, 156.4, 155.5, 1-1-2.L 112.6, 108.6, 105.9, 105.5, 102.2, 45.5, 36.2, 33.6, 31.5, 10.6, 7.6. LRMS (+ESI): m z 731 (100%, [2M+Nan, 393 (30%, [M+Nat). HRMS (TOF ESI, +H.:) 355.1297 [M+Hr (obliczono dla C19H 19N 2O5 , 355.1294) Badania aktywnosci biologicznej zwiazku bedacego przedmiotem wynalazku.

Przetestowano dzialanie antyproliferacyjne substancji 9 na liniach nowotworowych pochodzacych z nowotworów gruczolu sutkowego (linie MCF-7, MDA MB 231 rózniace sie statusem receptorów dla estrogenu i czynników wzrostu), szyjki macicy (linia HeLa) i trzustki (linia MIA PaCa-2) oraz prawidlowych fibroblastó,Y skóry (HDFa).

Testy cytotoksycznosci MTT komórek traktowanych zwiazkiem 9 wykazaly, ze hamuje on zywotnosc badanych linii komórek nowotworowych w sposób zalezny od uzytego stezenia. Jednoczesnie prawidlowe komórki byly znacznie bardziej oporne na testowany zwiazek, co pokazano na fig. 3 i w Tabeli 1.

Wykresy przedstawiaja zywotnosci komórek (szacowanych wzgledem kontroli, która stanowi 100%) wybranych linii nowotworowych w zaleznosci od stezenia 9 i czasu ekspozycji. Komórki nowotworowe byly traktowane pochodna 9 w stezeniu 100, PL 440802 A1 8/18 250, 500, 1000, 2500 i 5000 ng/ml przez 24 lub 48 godzin. Komórki HeLa traktowano tez kwasem usninowym (UA) w podobnych stezeniach, aby porównac jego efektywnosc w stosunku do nowej pochodnej 9. Nastepnie do pozywki dodano roztworu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego (MTT) do stezenia koncowego 1 mg/ml i inkubowano przez 3 godziny. Zwiazek ten jest metabolizowany do formazanu jedynie przez aktywne metabolicznie, zywe komórki.

Po zakonczeniu inkubacji pozywke usuwano, a powstale na dnie dolków krysztaly formazanu rozpuszczano w 100% DMSO. Absorbancje powstalego roztworu mierzono spektrofotometrycznie w czytniku plytek wielodolkowych przy fali o dlugosci 570 nm oraz fali o dlugosci 660 nm, sluzacej jako referencja.

Wartosci IC 50 (absolutnego) dla wszystkich testowanych linii zestawiono w Tabeli 1. Warto podkreslic, ze w badanym zakresie steze11 nie ustalono wartosci IC 50 w przypadku strukturalnie podobnego kwasu usninowego, co wskazuje na duzo silniejsze dzialanie cytotoksyczne zwiazku 9.

Tabela I. Wartosci IC 50 [pg/ml] dla zwiazku 9 po 24 i 48 godzinach ekspozycji wzgledem linii komórek nowotworowych róznego pochodzenia oraz zdrowych komórek ludzkich. Wartosci te byly wyznaczone na podstawie wyników testów MTT w programie GraphPad Prism.

Pochodzenie Linia komórkowa ICso po 24 godz. ICso po 48 godz.

Komórki nowotworowe Gruczol piersiowy MCF-7 1.25 0.35 MDAMB231 1,06 0,28 Szyjka macicy HeLa 0,32 0,04 Trzustka MiaPaCa-2 1,14 0,55 Komórki prawidlowe Skóra HDFa 2,45 0.75 PL 440802 A1 9/18 Analiza mortologii komórek traktowanych pochodna 9 wskazuje, ze powoduje on ich smierc, najprawdopodobniej na drodze apoptozy (komórki sie kurcza, zawartosc mocno kondensuje, ubywa ich z czasem, szczególnie przy wyzszych stezeniach testowanego zwiazku). Widoczna jest tez w niektórych warunkach wakuolizacja cytoplazmy, co wskazuje, ze mechanizm dzialania badanego zwiazku moze byc zwiazany z indukcja stresu retikulum endoplazmatyczne (ER). Zmiany w morfologii komórek nowotworowych pod wplywem zwiazku 9 sa pokazane na fig. 4 (komórki Hela) i fig. 5 (komórki Mia PaCa-2).

Na fig. 4 pokazano motfologie komórek nowotworu szyjki macicy linii HeLa zarejestrowana w mikroskopie swietlnym (powiekszenie x 100). Komórki byly traktowane DMSO (kontrola) lub zwiazkiem 9 w stezeniu O, 1; 0,25 lub 0,5 µg/ml przez 24, 48 lub 72 godziny.

Na fig. 5 pokazano mortologie komórek nowotworu trzustki linii MIA PaCa-2 zarejestrowana w mikroskopie swietlnym (powiekszenie x I 00). Komórki byly traktowane DMSO (kontrola) lub zwiazkiem 9 w stezeniu O, 1; 1 lub 2,5 ~tg/ml przez 24 lub 48 godzin.

Zwiazek 9, oprócz antyproliferacyjnej aktywnosci znacznie hamuje potencjal migracyjny komórek nowotworu szyjki macicy i nowotworu trzustki. Na fig. 6 pokazane sa zdjecia komórek w momencie rozpoczynania eksperymentu (O godz.) - z lewej strony oraz stan po 24 lub/i 48 godzinach eksperymentu - zdjecia z prawej stronv. Kontrole stanowilv komórki traktowane DMSO. Przedstawiono reprezentatywne wyniki z trzech niezaleznych powtórzen.

Potencjal migracyjny badano za pomoca techniki „zarastania rany". Na plytce pokrytej komórkami HeLa lub MIA PaCa-2 (95% konfluencji) wykonano ryse tipsem i po odplukaniu usunietych komórek, przyklejone do plytki komórki traktowano DMSO (kontrola) lub zwiazkiem 9 w stezeniu 0,25 i 0,5 µg/ml przez 48 godzin (HeLa) lub 0,5; 1 i 1,5 µg/ml przez 24 lub 48 godzin (MIA PaCa-2). Zdjecia wykonano na poczatku eksperymentu oraz po ekspozycji na badany zwiazek.

Liniami zaznaczono granice wystepowania komórek. Widoczne jest, ze pochodna 9, w przeciwienstwie do DMSO, hamuje migracje komórek nowotworowych. PL 440802 A1 /18 Zastrzezenia patentowe 1. Pochodna kwasu usninowego stanowiaca zwiazek (S)-7-acetylo-8, 10-dihydroksy- 2,3,9, I 0b-tetrametylo-2, I 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3-g]indazol-4-on pokazana we wzorze 1: OH o ,., Sposób otrzymywania pochodnej kwasu usninowego stanowiacego zwiazek [(.S)-7- acetylo-8, I 0-dihydroksy-2,3,9, I 0b-tetrametylo-2, I 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3- g]indazol-4-on]pokazanej we wzorze 1: OH o polegajacy na tym, ze do zawiesiny (+)-kwasu usninowego w rozpuszczalniku ogrzanej do 80 °C dodaje sie metylohydrazyne mieszajac, nastepnie usuwa sie rozpuszczalnik, a osad produkt oczyszcza sie zwlaszcza za pomoca chromatografii kolumnowej PL 440802 A1 11/18 3. Pochodna kwasu usninowego stanowiaca zwiazek (S)-7-acetylo-8,lO-dihydroksy- 2,3, 9, 1 0b-tetrametylo-2, 1 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3-g]indazol-4-on, pokazana na wzorze 1: OH o do zastosowania jako lek w terapii nowotworowej. 4. Pochodna kwasu usninowego stanowiaca zwiazek (S)-7-acetylo-8,1 0-dihydroksy- 2,3,9, l 0b-tetrametylo-2, l 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3-g ]indazol-4-on, pokazana na wzorze 1: OH o HO do zastosowania jako odczynnik in vitro. PL 440802 A1 12/18 ~==========uuuu~M fl(ppm) fig. 1 ill i PL 440802 A1 13/18 ~ (JC N g ~ ~ ~ § ~ ;,o i ie~ g ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 8& I o z z- a -201.0 -182.9 -180.7 -163.4 L 156.6 156.4 \.155_5 -142.1 -112.6 ./108.6 ,-105.9 ------105.5 ~102.2 -45.5 -36.2 -33.6 ~31.5 -10.6 -7.6 PL 440802 A1 14/18 150 150 Hela+ 9 100 100 50 50 o ....I....L,.L-J.i,'L.l.µ...L,-.1..-L,-.1..-L,-.I..-L,-.I..-L,-.I..-L,-.I..-L,-.I..-L.,.L-L,...__ o .......... ~IL. -..f:if:,,P<;:,~f:if:i~f:if:i;lf,~(l)~t.,,§>~(l)~.._(l)~,,e!~ng/ml ,_r;f> .f tl<>,_#' ,tf .fl' ,_<><>,I'#~ ,tf .l'ngiml 24 48 godz_ 24 48godz_ 150 MCF-7 + 9 150 MDA MB 231 + 9 100 100 0 0~---~L ,_t;f> '1,4P #' ,_#' ,,,4><> .;> .. ~ ,f #' ,_# ,,,# #' ng/ml ,_r;f> .f #',_#''I,#.;> ._,.<> ,.,.P # ~ ,.# #'ng/ml 24 48 godz_ 24 48godz_ 150 150 Mia PaCa-2 + 9 100 100 O-'--'\~..,_.,IL-'l,..._..~ ~~.,._.,P--"'1~!11--"1~ o .......... --11... ,_t;f> .f #' ,_#' ,.# ? $' ,I' #~,I'#' ng/ml ,_,f> ,,,# tl<>,_#,.,,#'#' # ,l' #..,#,tl'#' ng/ml 24 48 godz_ 24 48godz_ fig. 3 PL 440802 A1 /18 <( ...J o Il'.'.'.

I­ z o ~ fig. 4 PL 440802 A1 16/18 <( ....J ~ I­ z o ~ E - O) ::i. ...... ó E - O) :i ...... fig. 5 PL 440802 A1 17/18 A B E O) ::1.

LO ~ o o Hela ),, I fig. 6 48 godz.

I I' llHt f,, :.!i11J;t!, . .... , •m.,.,. lll lii~ . "' ''I'. !:J PL 440802 A1 18/18 al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI ZGLOSZENIA NR P.440802 Klasyfikacja zgloszenia: C07D 491/02 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: C07O491, A61P35 Bazy komputerowe, w których prowadzono poszukiwania: bazy UPRP, espacenet, WP!, PubChem, EPODOC, Google Patents, Google Scholar, STNext Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie dokumentu do zastrz.

A Guzow-Krzeminska B. et al. .,Usnic Acid Derivatives as Cytotoxic Agents 1-4 Against Cancer Cel Is and the Mechanisms of Their Activity" Current Pharmacology Reports (2019) 5:429-439; https://doi.org/10.1007/s40495-019-00202-8 1-4 A PL436476A 1, Uniwersytet Gdanski, Gdansk, Polska, The Australian National University, Canberra, Australia, Gdanski Uniwersytet Medyczny, Gdansk, Polska; 2021-08-09 A CN110845457 A, CHINA PHARMACEUTICAL UNIVERSITY [CN], 2020-02-28 1-4 A PYRCZAK-FELCZYKOWSKA A. ET AL. "SYNTHESIS OF USNIC ACID 1-4 DERIVATIVES AND EVALUATION OF THEIR ANTIPROLIFERATIVE ACTIVITY AGAINST CANCER CELLS" J. NAT. PROD. 2019, 82, 1768-1778, DOI: 10.1021/ACS.JNATPROD.8B00980 D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stano\\'iacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument. który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszehstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia claty publikacji innego L')'tcnvanego doku1nentu lub z innego szczególnego pcnvoclu, O - dokument odnoszaty sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie. wystawienie lub ujawnienie w inny sposób. r - dokument opublikowany przed data zgloszenia. ale pózniej niz zastrzegana data pierwsze11stwa, T - dokument pózniejszy. opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszefotwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem. ale cytowany w celu zrozumienia rnsad lub teorii lezacych u podstaw \\ynal8zku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za no\\Y lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, y dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany ,rynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom ,\ynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej.

Sprawozdanie wykonali-a: Justyna Kowalczyk ekspert data 04.11.2022r. /-podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym-/ Pismo wydane w formie dokumentu elektroniczne_go Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z 2022-03-30

Claims (4)

Zastrzezenia patentowe

1. Pochodna kwasu usninowego stanowiaca zwiazek (S)-7-acetylo-8, 10-dihydroksy-

2,3,9, I 0b-tetrametylo-2, I 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3-g]indazol-4-on pokazana we wzorze 1: OH o ,., Sposób otrzymywania pochodnej kwasu usninowego stanowiacego zwiazek [(.S)-7- acetylo-8, I 0-dihydroksy-2,3,9, I 0b-tetrametylo-2, I 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3- g]indazol-4-on]pokazanej we wzorze 1: OH o polegajacy na tym, ze do zawiesiny (+)-kwasu usninowego w rozpuszczalniku ogrzanej do 80 °C dodaje sie metylohydrazyne mieszajac, nastepnie usuwa sie rozpuszczalnik, a osad produkt oczyszcza sie zwlaszcza za pomoca chromatografii kolumnowej1/18

3. Pochodna kwasu usninowego stanowiaca zwiazek (S)-7-acetylo-8,lO-dihydroksy- 2,3, 9, 1 0b-tetrametylo-2, 1 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3-g]indazol-4-on, pokazana na wzorze 1: OH o do zastosowania jako lek w terapii nowotworowej.

4. Pochodna kwasu usninowego stanowiaca zwiazek (S)-7-acetylo-8,1 0-dihydroksy- 2,3,9, l 0b-tetrametylo-2, l 0b-dihydro-4H-benzofuro[2,3-g ]indazol-4-on, pokazana na wzorze 1: OH o HO do zastosowania jako odczynnik in vitro.2/18 ~==========uuuu~M fl(ppm) fig. 1 ill i3/18 ~ (JC N g ~ ~ ~ § ~ ;,o i ie~ g ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 8& I o z z- a -201.0 -182.9 -180.7 -163.4 L 156.6 156.4 \.155_5 -142.1 -112.6 ./108.6 ,-105.9 ------105.5 ~102.2 -45.5 -36.2 -33.6 ~31.5 -10.6 -7.64/18 150 150 Hela+ 9 100 100 50 50 o ....I....L,.L-J.i,'L.l.µ...L,-.1..-L,-.1..-L,-.I..-L,-.I..-L,-.I..-L,-.I..-L,-.I..-L.,.L-L,...__ o .......... ~IL. -..f:if:,,P<;:,~f:if:i~f:if:i;lf,~(l)~t.,,§>~(l)~.._(l)~,,e!~ng/ml ,_r;f> .f tl<>,_#' ,tf .fl' ,_<><>,I'#~ ,tf .l'ngiml 24 48 godz_ 24 48godz_ 150 MCF-7 + 9 150 MDA MB 231 + 9 100 100 0 0~---~L ,_t;f> '1,4P #' ,_#' ,,,4><> .;> .. ~ ,f #' ,_# ,,,# #' ng/ml ,_r;f> .f #',_#''I,#.;> ._,.<> ,.,.P # ~ ,.# #'ng/ml 24 48 godz_ 24 48godz_ 150 150 Mia PaCa-2 + 9 100 100 O-'--'\~..,_.,IL-'l,..._..~ ~~.,._.,P--"'1~!11--"1~ o .......... --11... ,_t;f> .f #' ,_#' ,.# ? $' ,I' #~,I'#' ng/ml ,_,f> ,,,# tl<>,_#,.,,#'#' # ,l' #..,#,tl'#' ng/ml 24 48 godz_ 24 48godz_ fig. 35/18 <( ...J o Il'.'.'. I­ z o ~ fig. 46/18 <( ....J ~ I­ z o ~ E - O) ::i. ...... ó E - O) :i ...... fig. 57/18 A B E O) ::1. LO ~ o o Hela ),, I fig. 6 48 godz. I I' llHt f,, :.!i11J;t!, . .... , •m.,.,. lll lii~ . "' ''I'. !:J8/18 al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI ZGLOSZENIA NR P.440802 Klasyfikacja zgloszenia: C07D 491/02 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: C07O491, A61P35 Bazy komputerowe, w których prowadzono poszukiwania: bazy UPRP, espacenet, WP!, PubChem, EPODOC, Google Patents, Google Scholar, STNext Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie dokumentu do zastrz. A Guzow-Krzeminska B. et al. .,Usnic Acid Derivatives as Cytotoxic Agents 1-4 Against Cancer Cel Is and the Mechanisms of Their Activity" Current Pharmacology Reports (2019) 5:429-439; https://doi.org/10.1007/s40495-019-00202-8 1-4 A PL436476A 1, Uniwersytet Gdanski, Gdansk, Polska, The Australian National University, Canberra, Australia, Gdanski Uniwersytet Medyczny, Gdansk, Polska; 2021-08-09 A CN110845457 A, CHINA PHARMACEUTICAL UNIVERSITY [CN], 2020-02-28 1-4 A PYRCZAK-FELCZYKOWSKA A. ET AL. "SYNTHESIS OF USNIC ACID 1-4 DERIVATIVES AND EVALUATION OF THEIR ANTIPROLIFERATIVE ACTIVITY AGAINST CANCER CELLS" J. NAT. PROD. 2019, 82, 1768-1778, DOI: 10.1021/ACS.JNATPROD.8B00980 D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stano\\'iacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument. który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszehstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia claty publikacji innego L')'tcnvanego doku1nentu lub z innego szczególnego pcnvoclu, O - dokument odnoszaty sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie. wystawienie lub ujawnienie w inny sposób. r - dokument opublikowany przed data zgloszenia. ale pózniej niz zastrzegana data pierwsze11stwa, T - dokument pózniejszy. opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszefotwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem. ale cytowany w celu zrozumienia rnsad lub teorii lezacych u podstaw \\ynal8zku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za no\\Y lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, y dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany ,rynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom ,\ynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Justyna Kowalczyk ekspert data 04.11.2022r. /-podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym-/ Pismo wydane w formie dokumentu elektroniczne_go Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z 2022-03-30