Kwasy organiczne mozna wytwarzac za po- ^moca fermentacji aerobowej glucydów, w obec¬ nosci plesniowców. W celu uproszczenia w dal¬ szej czesci opisu bedzie omówiony przede wszystkim sposób otrzymywania kwasu cytry¬ nowego na drodze fermentacyjnej.Przy wytwarzaniu kwasu cytrynowego w obec¬ nosci plesniowców musza byc przestrzegane pewne podstawowe warunki, a mianowicie na¬ lezy zastosowac odpowiedni szczep, przestrzegac azeby pH bylo stosunkowo niskie, na ogól równe lub nizsze od 3,0 i azeby do plesni byla dopro¬ wadzona dostateczna ilosc tlenu. Poza tym na¬ lezy ograniczyc dawki niektórych skladników odzywczych, zwlaszcza kationów fosforu i zelaza.Pod slowem „skladniki odzywcze" rozumie sie tutaj kazda nie trujaca substancje, która moze brac udzial w czynnosciach biochemicznych or¬ ganizmu. Do nich naleza zwlaszcza azot, fosfor, magnez, potas przyswajalny, czynniki wzrostu, metale ciezkie takie jak cynk, zelazo, miedz, wi¬ taminy itd. oraz substancje, które biora udzial w budowie miceli lub katalizuja dodatnio lub ujemnie reakcje biochemiczne. Wiadomo, ze nie¬ które z tych skladników zwane' „skladnikami sladowymi,, moga dzialac w ilosciach znacznie nizszych od l_mg na litr srodowiska.Podczas fermentacji odróznia.sie dwa kolejne okresy. W czasie pierwszego okresu micela roz¬ wija sie kosztem czesci cukru, wytwarzajac przy tym stosunkowo malo kwasów. W czasie drugie¬ go okresu rozwój ten przebiega wolniej lub szybciej, przy czym równoczesnie z wiekszej czesci pozostalego cukru powstaja kwasy. Jezeli pH utrzymane jest w poblizu wartosci obojetnej tworzy sie wówczas przede wszystkim kwas gli- konowy, a przy pH miedzy 6,0 i 3,0 przede wszystkim kwas szczawiowy.Ciezar rozwinietej miceli zalezy glównie od zawartosci czynników odzywczych w srodowisku, od jej budowy i od pH. Dzieki temu wedlug Shu i Johnson'a (Ind. Eng. Chem. 1948 str. 1202) moz¬ na ograniczyc kielkowanie badz stosujac odpo¬ wiednia dawke kationów zelaza, badz odpowied¬ nia ilosc fosforu przyswajalnego. Jezeli ciezar jest zbyt niski, predkosc fermentacji jest nie¬ dostateczna; gdy zas jest zbyt wysoki, wówczas zuzywa sie stosunkowo duzo cukru na budowe miceli, w zwiazku z czym cukier ten nie moze byc juz przemieniony na kwas cytrynowy. *Poza tym przy zbyt wysokim ciezarze miceli w czasie fermentacji glebinowej srodowisko po-^ siada wysoka lepkosc, a dostep tlenu do organiz¬ mu jest utrudniony, w zwiazku z czym trzeba stosowac mieszadla; co jest bardzo uciazliwe ze wzgledów na koszt sily napedowej.Wskazane jest azeby ciezar miceli przeliczo¬ ny na suchy produkt, wynosil na ogól 5 — 25 g na litr srodowiska.Ilosc fosforu przyswajalnego przeliczona na fosforan jednopotasowy wynosi na ogól 0,02—2,5 g na litr srodowiska. Zawartosc kationów zelaza jest na ogól rózna i wynosi od 4 lub nawet 2 mg na litr srodowiska. Wedlug Shu i Johnson'a dla podobnego srodowiska zasobnego w skladniki odzywcze konstruktywne, ciezar miceli rozwi¬ nietej zmienia sie z 18 g na litr przy pH poczat¬ kowym 4,9 do 7 g na litr dla pH poczatkowego 1,7. Proponowano (wedlug patentu Stanów Zjed- -noczonych Ameryki nr 235f771) prowadzenie fer¬ mentacji w dwóch odrebnych srodowiskach, a mianowicie w okresie rozmnazania w srodo¬ wisku zawierajacym fosfor przyswajalny, a nas¬ tepnie po oddzieleniu i przemyciu miceli, w sro¬ dowisku zwanym „fermentacyjnym", pozbawio- "nyny fosforu przyswajalnego. Zaznaczono równo- Wczesnie, ze mozna stosowac to samo srodowisko w obydwu okresach pod warunkiem, ze dawka fosforu przyswajalnego bedzie dostatecznie nis¬ ka i zostanie przyswojona w calosci w okresie rozmnazania. \ Liczne patenty zalecaja ten drugi sposób po¬ stepowania. W przypadkach tych stosuje sie fos¬ foran jednopotasówy w ilosci na ogól nizszej od 0,150 g na litr srodowiska.Na* ogól srodowiska sa uprzednio zakwaszane, lecz srodowisko rozmnazania, którego pH po¬ czatkowe jest niskie staje sie odpowiednim tylko wtedy, gdy jest zasobne w skladniki odzywcze.'. Na ogól trzeba poswiecic dosc duzo cukru na utworzenie sie miceli, a dopiero w pózniejszym okresie nastepuje przemiana cukru na kwas cy¬ trynowy.Sposoby oparte na prowadzeniu fermentacji w dwóch fazach kolejnych, z oddzielaniem mi¬ celi, mozna stosowac w srodowisku fermenta¬ cyjnym stosunkowo ubogim w cukier, poniewaz micela powstaje tylko w pierwszej fazie. Wydaj¬ nosc jest wówczas mala. Nadto przeprowadzanie tych sposobów wymaga duzej ostroznosci, gdyz micelev nalezy oddzielac i przemywac aseptycz- nie. Gdy fermentacje prowadzi sie tylko w jed¬ nej fazie, trzeba stosowac srodowisko stosunko¬ wo zasobne w cukier, azeby wydajnosc byla za¬ dawalajaca.Zrozumiale jest, ze stosunkowo latwo mozna spelnic warunki odpowiednie dla fermentacji w osrodkach zawierajacych czysty cukier han¬ dlowy, lecz nastepuja komplikacje gdy stosuje sie osrodki melasowe. Melasa zawiera glówna czesc skladników odzywczych w ilosciach znacz¬ nie wyzszych od wyzej podanych. Ponadto, sila buforowa roztworów melasy zawsze jest stosun¬ kowo wysoka i zgodnie z tym co wyzej powie¬ dziano odnosnie ilosci cukru w roztworach i o wplywie pH, otrzymanie pH odpowiedniego dla wytworzenia kwasu cytrynowego nastepuje dopiero po dodaniu powaznej ilosci cukru, który zostaje zuzyty na potrzeby miceli, badz zamie¬ niony na kwasy inne niz kwas cytrynowy.Zaleca sie czestokroc uprzednie oczyszczanie melasy na wymiennikach jonowych. Postepo¬ wanie takie jest jednak uciazliwe i kosztowne.Zaleca sie równiez wstepne traktowanie wap¬ nem roztworów melasy w celu wytracenia mi¬ neralnego kwasu fosforowego.Zawartosc metali ciezkich, zwlaszcza kationów zelaza doprowadza sie do odpowiedniego pozio¬ mu, przez wstepne traktowanie roztworów me¬ lasy, rozpuszczalnym zelazocyJankiem lub innym odczynnikiem stracajacym albo tworzacym _zwiazki kompleksowe. Bez wzgledu na to czy osad zostal wytracony czy tez nie, melase pod¬ daje sie przed fermentacja filtrowaniu; moze sie wówczas okazac koniecznym dodanie ponowne pewnych skladników konstruktywnych takich jak cynk kation. Dawki niezbednych odczynni¬ ków okresla sie na drodze doswiadczalnej.Wszystkie te wstepne przygotowania pole¬ pszaja zdolnosc melasy do fermentacji cytryno¬ wej lecz nie zawsze usuwaja wszystkie trudnos¬ ci zachodzace podczas fermentacji niektórych melas.Trudnosc otrzymania wyników zadawalaja¬ cych przy stosowaniu niektórych melas, Jest scisle okreslona w pracy Martins'a i Waters-a ogloszonej w Ind. Eng. Chem. 1952 str. 2229. Dla melas pochodzacych z tej samej miejscowosci lecz z róznych lat badacze ci otrzymywali, przy jednakowym wstepnym sposobie przygotowy¬ wania (zelazocyjanek w ilosci uprzednio ustalo¬ nej) i przy tym samym sposobie fermentacji, wydajnosci kwasu cytrynowego wynoszace 9,9 — 70,7% w odniesieniu do uzytego cukru.Stwierdzono, ze trudnosci tych mozna w znacz- nym stopniu uniknac jezeli poczatkowo rozmna¬ zanie miceli, tworzacej grzybnie lub zarodniki kadziowe przeprowadza sie w srodowisku sto¬ sunkowo ubogim w melase (pierwszy okres), a nastepnie nie usuwajac miceli, odzywia sie — 2 —stopniowo grzybnie w odpowiednim momencie, a w kazdym przypadku kiedy jej pH jest bliskie wartosci 3,0 lub nizsze od 3,0, roztworami melasy stosunkowo silnymi w taki sposób, aby utrzy¬ mac pH bliskie 3,0 lub nizsze od 3,0 (drugi okres). Odzywianie to moze byc prowadzone W sposób ciagly lub okresowy.Latwo jest wiec regulowac w pierwszym okre¬ sie dawke róznych skladników odzywczych wplywajac poza tym na obfitosc grzybni w me¬ lasie. Poniewaz moc buforowa roztworu ubogie¬ go w melase jest stosunkowo slaba, to pH sro¬ dowiska obniza sie gwaltownie wskutek tworze¬ nia sie róznych kwasów. Gdy nastepnie grzyb¬ nie zasila sie roztworami zasobnymi w melase, wówczas z dodanego cukru otrzymuje sie z wy¬ soka wydajnoscia kwas cytrynowy.W istocie, niskie pH jest korzystne dla tej przemiany. Poza tym stwierdzono, ze gdy pH jest bliskie wartosci 3,0 lub nizsze od 3,0 wów¬ czas wplyw nadmiaru skladników odzywczych na wydajnosc przemiany cukru na kwas cytry¬ nowy, jest Silnie oslabiony. Rozwój miceli jest zahamowany i nie trzeba stosowac mieszania, które jest konieczne, jezeli w srodowisku znaj¬ duje sie nadmiar miceli.Nie mozna uniknac pewnego rozwoju miceli w czasie drugiego okresu, a to zmniejsza sred¬ nie stezenie melasy, które mozna by osiagnac przy koncu fermentacji. Ten spadek stezenia zalezy glównie od obfitosci skladników odzyw¬ czych dla grzybni znajdujacych sie w zasilajacej melasie o okreslonym skladzie. Wydajnosc kwasu cytrynowego uzyskiwana sposobem wedlug wy¬ nalazku4 jest zawsze o wiele wyzsza od wydaj- mosci otrzymywanej przy fermentacji prowadzo¬ nej w srodowisku nie zasilanym.Dwa doswiadczenia opisane ponizej jasno to wykazuja.Roztwór melasy z buraków zawierajacy 390 g melasy oraz 2,8 g zelazocyjanku potasowego na 1 litr przygotowuje sie w temperaturze zblizonej do temperatury wrzenia tego roztworu, a naste¬ pnie filtruje. Otrzymany roztwór macierzysty odpowiednio rozcienczony stosuje sie w nizej przytoczonych przykladach.Przyklad I: Do 9,6 1 roztworu, zawiera¬ jacego 180 g melasy/litr, traktowanego zelazocy- jankiem potasowym dodaje sie na 1 litr roz¬ tworu 0,030 g fosforanu jednopotasowego i 0,3 g siedmiowodnego siarczanu magnezowego. Ca^ losc sterylizuje sie i umieszcza w kadzi zaopa¬ trzonej w mieszadlo mechaniczne i w belkotke powietrzna. Wszystkie czesci urzadzenia sty¬ kajace sie z ciecza winny byc odporne na dzia¬ lanie kwasów powstajacych w czasie fermen¬ tacji. Nastepnie wysiewa sie spory Aspergillus Wentii, pochodzace z kultury galaretowatej szczepu dobrze wytwarzajacego kwas cytrynowy i napowietrza wyjalowionym i nasyconym wil¬ gocia powietrzem w temperaturze 32°C przy ciaglym mieszaniu.Powietrze przepuszcza sie w ilosci 1000 l/h.Wartosc pH srodowiska wynoszaca poczatkowo 6,05 spada czwartego dnia do 3,05. W tym mo¬ mencie wolna kwasowosc, wyrazona w jedno- wodnym kwasie - cytrynowym oznaczona przez miareczkowanie wynosi 31,5 g na 1 1 cieczy, lecz rzeczywista ilosc kwasu cytrynowego jest mi¬ nimalna. W szóstym dniu fermentacji cukier jest juz nieobecny, a kwasowosc ustala sie na 46,2 g/l. Zawartosc kwasu cytrynowego ozna¬ czonego przez miareczkowanie wynosi 13,1 g/1, co stanowi 28Vo kwasowosci ogólnej. Tworzy sife 7,3 kg kwasu cytrynowego ze 100 kg melas^ a wiec uzyskano wydajnosc wynoszaca i4,6*/« w stosunku do zuzytego cukru.Przyklad II. Do kadzi opisanej w przy¬ kladzie I wprowadza sie 6 litrów wyjalowionego roztworu, zawierajacego w 1 litrze 50 g melasy traktowanej zelazocyJankiem potasowym, 0,050 g fosforanu jednopotasowego i 0,5 g siedmiowod¬ nego siarczanu magnezowego. Nastepnie wysie~ wa sie te. sama ilosc spor i napowietrza sie ta sama iloscia powietrza wyjalowionego i nawil¬ zonego, jak w przykladzie pierwszym, utrzymu¬ jac temperature 32°C.Po 36 godzinach kiedy wolna kwasowosc wy¬ nosi 9,1 g/l jednowodnego kwasu cytrynowego, a pH równa sie 2,9, zawartosc kadzi zasila sie wyjalowionym roztworem, zawierajacym 390 g/l melasy traktowanej zelazocyJankiem potasowym bez soli odzywczych, przy czym predkosc zasi¬ lania reguluje sie tak, aby pH roztworu wyno¬ silo 2,5 — 2,9. W omawianym przykladzie dodaje sie 3,6 litra roztworu, w ciagu czterech dni.Dziewiatego dnia cukier jest nieobecny, a kwa¬ sowosc ustala sie na niezmiennym poziomie.Wolna kwasowosc wyrazona w jednowodnym kwasie cytrynowym (oznaczona przez miarecz¬ kowanie) wynosi 78 g/l a rzeczywista zawartosc kwasu cytrynowego 69,2 g/l, co stanowi 88,5% kwasowosci ogólnej. Ze 100 kg zuzytego cukru otrzymuje sie wiec 77,7 kg kwasu cytrynowego.Przyklad II ilustruje najprostrze wykonanie sposobu wedlug wynalazku. Jasne jest, ze w gra¬ nicach wynalazku; mozna zmieniac ilosc doda¬ wanych soli odzywczych zarówno do grzybni jak i do roztworów zasilajacych oraz ze melasy mo¬ ga byc poddawane róznej obróbce polepszajacej jej wlasciwosci (za pomoca wymienników jono- — 3 —wych wapna, zelazocyjanku lub kazdego innego odczynnika powodujacego stracanie lub tworze¬ nie kompleksów takich jak fitany) oraz ze mozna stosowac do przygotowania grzybni i roztworów odzywczych dwie lub wiecej melas róznego po¬ chodzenia, róznie obrabianych.Mozna równiez stosowac szczep plesni inny anizeli Aspergillus Niger, na przyklad szczep selekcjonowany Aspergillus Wentii. Równiez me¬ lasy z trzciny cukrowej zwane „black strap" lub „high test" moga byc stosowane zamiast melas z buraków.Jedna z istotnych charakterystycznych cech sposobu wedlug wynalazku jest przeprowadza¬ nie okresu rozmnazania lub rozwijania w sro¬ dowisku, którego wskaznik buforowy jest slaby.Wskaznik ten okresla sie iloscia gramów czyste¬ go kwasu solnego (HC1) niezbednego do obnize¬ nia pH jednego litra srodowiska z 6,0 do 3,0.W drugim przykladzie opisanym powyzej wskaz¬ nik buforowy wynosi 1,53. Moze sie on zmieniac w granicach 0,07 — 6,0 lecz najlepiej powinien byc nizszy od 3,0.Mozna wiec, nie wychodzac poza granice wy¬ nalazku, przygotowac grzybnie z mieszaniny melasy i cukru oczyszczonego handlowego, co zmniejszy wskaznik buforowy albo nawet z sa¬ mego cukru.W czasie pierwszego okresu mozna równiez dodawac do srodowiska kwasy nie hamujac przy tym czynnosci biochemicznych. Szczególnie ko¬ rzystne jest dodawanie kwasu cytrynowego, przede wszystkim w postaci lugów macierzy¬ stych nie dajacych sie krystalizowac, pochodza¬ cych z produkcji kwasu cytrynowego.Kiedy pod koniec drugiego okresu melasa osiagnie pozadana koncentracje i gdy fermenta¬ cja jest calkowicie lub prawie zakonczona, wów¬ czas mozna czesc brzeczki sfermentowanej od¬ prowadzic i zastapic ja w czasie trzeciego okre¬ su fermentacji, równa objetoscia roztworu me¬ lasy o takiej samej sredniej koncentracji, utrzy¬ mujac przy tym stale pH w poblizu 3,0 lub po¬ nizej tej wartosci. Czynnosci te moga byc do¬ konywane sposobem ciaglym lub okresowym przez pewien okres czasu, który zmienia sie za¬ leznie od rodzaju melasy. Czas ten zalezy przede ws/zystkim od ilosci skladników odzywczych w melasie i od sily mieszania. W rzeczywistosci ilosc skladników odzywczych wyznacza ciezar miceli, który osiaga gdy stan równowagi jest ustalony. Do niektórych melas, w których brak jest substancji odzywczych, nalezy te substancje dodawac.Równiez moze okazac sie korzystne zasilanie brzeczki w czasie trzeciego okresu za pomoca| Wzór jednoraz. CWD, zam. PL/Ker Cz mieszaniny melasy z handlowym cukrem oczy¬ szczonym.W czasie tego trzeciego okresu fermentacji wprowadzony cukier przemienia sie z wysoka wydajnoscia na kwas cytrynowy, co polepsza w sposób bardzo widoczny srednia wydajnosc z trzech okresów i pozwala na lepsze zuzytko¬ wanie materialu fermentacyjnego.Sposób wedlug wynalazku stosuje sie równiez do wytwarzania innych kwasów organicznych, które sie tworza przede wszystkich w srodo¬ wisku, którego pH jest stosunkowo niskie, zwlaszcza kwasu itakonowego. PL