PL249504B1

PL249504B1 - Panel RNA do zastosowania w predykcji wystąpienia padaczki u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym oraz sposób predykcji wystąpienia padaczki u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym

Info

Publication number: PL249504B1
Application number: PL440700A
Authority: PL
Inventors: Adria-Jaume Roura Canalda; Canalda Adria-Jaume Roura; Bartłomiej Gielniewski; Jacek Jaworski; Sergiusz Jóźwiak; Bożena Kamińska-Kaczmarek; Katarzyna Kotulska-Jóźwiak; Ewa Liszewska; Bartosz Wojtaś
Original assignee: Warszawski Uniwersytet Medyczny; Instytut Biologii Doświadczalnej Im. Marcelego Nenckiego Polskiej Akademii Nauk; Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie; Instytut Pomnik - Centrum Zdrowia Dziecka; Instytut Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka
Priority date: 2022-03-21
Filing date: 2022-03-21
Publication date: 2026-05-04
Also published as: PL440700A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest panel markerów RNA do predykcji wystąpienia padaczki, w szczególności padaczki lekoopornej, u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym, charakteryzujący się tym, że składa się z następujących markerów: GLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2. Kolejnym przedmiotem zgłoszenia jest sposób in vitro predykcji wystąpienia padaczki, w szczególności padaczki lekoopornej, u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym, obejmujący etapy: a) pomiar poziomu ekspresji co najmniej jednego markera; b) określenie ryzyka wystąpienia padaczki, w szczególności padaczki lekoopornej, w oparciu o poziom ekspresji co najmniej jednego markera, charakteryzujący się tym, że wspomniany co najmniej jeden marker stanowi marker RNA należący do panelu markerów predykcyjnych według zastrz. 1, który składa się z IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B IGLJ2, gdzie predykcja wystąpienia padaczki lekoopornej jest prowadzona w oparciu o obniżony poziom ekspresji wspomnianego co najmniej jednego markera w porównaniu z poziomem odniesienia, natomiast predykcja wystąpienia padaczki kontrolowanej lekami jest prowadzona w oparciu o podwyższony poziom ekspresji co najmniej jednego markera w porównaniu z poziomem odniesienia; przy czym w etapie a) pomiar poziomu ekspresji co najmniej jednego markera jest wykonywany przed wystąpieniem pierwszego napadu padaczkowego. Kolejnym przedmiotem zgłoszenia jest zastosowanie z panelu markerów według wynalazku, w predykcji wystąpienia padaczki, w szczególności padaczki lekoopornej, u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym przed wystąpieniem napadów padaczkowych według sposobu według wynalazku.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest panel RNA do zastosowania w predykcji wystąpienia padaczki u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym oraz sposób predykcji wystąpienia padaczki u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym.

Stwardnienie guzowate (SG) znane także jako Tuberous Sclerosis Complex (TSC) czy choroba Bourneville’a-Pringle’a, należy do tzw. chorób nerwowo-mięśniowych. SG jest powodowane przez mutację w genach TSC1 lub TSC2, które kodują ważne elementy kompleksu białkowego kontrolującego aktywność regulatora metabolizmu komórek - ssaczego celu dla rapamycyny (z ang. mammalian target of rapamycin, mTOR). Około 1 osoba na 6 tys. rodzi się z taką mutacją (szacuje się, iż obecnie liczba pacjentów na świecie wynosi około 1 min osób). Obraz kliniczny SG bywa bardzo zróżnicowany i może ono przebiegać w różny sposób nawet u osób z taką samą mutacją. Do najczęstszych objawów SG należą łagodne guzy mózgu (tzw. guzki korowe czy gwiaździaki podwyściółkowe olbrzymiokomórkowe), skóry czy nerek. Około 90% pacjentów cierpi na padaczkę, często lekooporną, pojawiającą się na bardzo wczesnych etapach życia. Leczenie SG jest leczeniem w dużej mierze objawowym i charakterystycznym dla poszczególnych symptomów. W przypadku leczenia padaczki, stosowane są leki i podejścia powszechnie używane w leczeniu padaczki dziecięcej. Najczęściej stosowanym lekiem jest wigabatryna, której skuteczność przy standardowym leczeniu w około 50% nie wystarczająca do uzyskania znaczącej poprawy. Konieczność włączenia kolejnych leków (zwykle jednego lub dwóch dodatkowych) definiuje padaczkę jako lekooporną oraz przedłuża proces leczenia, co w konsekwencji powoduje zagrożenie niepełnosprawnością intelektualną w przyszłości.

Możliwie jak najwcześniejsze zahamowanie padaczki jest, w przypadku SG, kluczowe dla zapobiegania temu zagrożeniu, co jest nie do przecenienia dla jakości życia zarówno pacjentów jak i ich opiekunów. Stwarza to potrzebę opracowania nowych metod diagnostycznych pozwalających przewidzieć rozwój padaczki lekoopornej u pacjentów z SG przed wystąpieniem pierwszych epizodów padaczkowych.

Obecnie brakuje markerów molekularnych pozwalających przewidywać czy padaczka, która występuje u 90% u pacjentów z SG, zareaguje na standardowe leczenie czy też będzie lekooporna.

Celem wynalazku było dostarczenie nowych markerów predykcyjnych pozwalających przewidzieć charakter padaczki (lekooporna vs. kontrolowana lekami) u pacjentów z SG, jeszcze przed wystąpieniem napadów klinicznych.

Przedmiotem wynalazku jest panel RNA składający się z następujących RNA: GLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2 do zastosowania w predykcji wystąpienia padaczki u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym, korzystnie padaczkę stanowi padaczka lekooporna.

Korzystnie panel do zastosowania według wynalazku jest rozszerzony o jeden lub więcej RNA wybranych z: IGHV5-51, RRP7A i IGKV1-16, KTI12, HRAS.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro predykcji wystąpienia padaczki u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym, w szczególności padaczki lekoopornej, obejmujący etapy:

a) Pomiar poziomu ekspresji co najmniej jednego RNA;

b) Określenie, w oparciu o poziom ekspresji co najmniej jednego RNA, ryzyka wystąpienia padaczki, w szczególności padaczki lekoopornej, charakteryzujący się tym, że wspomniany co najmniej jeden RNA należy do panelu predykcyjnych RNA do zastosowania według wynalazku, który składa się z IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2, gdzie predykcja wystąpienia padaczki lekoopornej jest prowadzona w oparciu o obniżony poziom ekspresji wspomnianego co najmniej jednego RNA w porównaniu z poziomem odniesienia, natomiast predykcja wystąpienia padaczki kontrolowanej lekami jest prowadzona w oparciu o podwyższony poziom ekspresji co najmniej jednego RNA w porównaniu z poziomem odniesienia; poziom odniesienia stanowi poziom ekspresji danego RNA u dziewczynek w zbliżonym lub tym samym wieku ze stwardnieniem guzowatym, w momencie pobrania materiału, u których padaczka, która rozwinęła się w przyszłości była kontrolowana lekami lub/i u dziewczynek bez stwardnienia guzowatego i w zbliżonym lub tym samym wieku, co badana pacjentka; przy czym materiałem do badań jest krew obwodowa a w etapie a) pomiar poziomu ekspresji co najmniej jednego RNA jest wykonywany przed wystąpieniem pierwszego napadu padaczkowego.

Korzystnie pomiar wykonuje się za pomocą qRT-PCR, ddPCR lub celowanego sekwencjonowania RNA metodą NGS.

Korzystnie co najmniej jeden RNA z panelu predykcyjnego jest analizowany łącznie z jednym lub więcej następujących RNA: IGHV5-51, RRP7A, IGKV1-16, KTI12, HRAS.

Korzystnie pomiar poziomu ekspresji oraz określenie ryzyka wystąpienia padaczki, w szczególności padaczki lekoopornej, w sposobie według wynalazku prowadzi się w oparciu o siedem następujących RNA: HRAS, RRP7A, TNFRSF13B, KTI12, IGKV4-1, IGHV6-1, IGLV1-40.

Wynalazek dostarcza następujących korzyści:

• pozwoli lekarzom prowadzącym na lepsze monitorowanie progresu choroby w celu wytypowania dziewczynek z SG najbardziej zagrożonych ciężkim przebiegiem padaczki;

• umożliwi wcześniejsze włączenie leczenia więcej niż jednym lekiem przeciwpadaczkowym, co skróci znacząco czas potrzebny do zablokowania procesu chorobowego, a tym samym zmniejszy ryzyko zagrożenia niepełnosprawnością intelektualną pacjenta w przyszłości.

• panel według wynalazku może zostać wykorzystany do wczesnej diagnozy zagrożenia padaczką lekooporną w innych padaczkach dziecięcych.

Szczegółowy opis wynalazku:

Opisy wykonań wynalazku w niniejszym zgłoszeniu są podane w formie przykładu i nie mają na celu ograniczenia zakresu wynalazku. Opisane wykonania obejmują różne cechy, z których nie wszystkie są wymagane we wszystkich wykonaniach wynalazku. Niektóre wykonania wykorzystują tylko niektóre z cech lub możliwe kombinacje cech. Opisane warianty wykonań wynalazku oraz wykonania wynalazku obejmujące różne kombinacje cech wymienionych w opisanych wykonaniach, przyjdą na myśl znawcom w dziedzinie. Natomiast zakres wynalazku jest ograniczony jedynie przez zastrzeżenia.

Ponadto w rozumieniu niniejszego opisu frazę „w wykonaniu” oraz „w niektórych wykonaniach” należy rozumieć jako w jednym lub więcej wykonań. Ponadto cechy występujące w poszczególnych wykonaniach mogą być ze sobą łączone.

W pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy panelu RNA składającego się z następujących RNA: GLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2 do zastosowania w predykcji wystąpienia padaczki u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym, w szczególności padaczki lekoopornej.

Przy czym, w rozumieniu wynalazku RNA do predykcji zwane również RNA predykcyjnym definiowane jest jako zmiana/zmiany w poziomie RNA następujące przed wystąpieniem padaczki lekoopornej na poziomie klinicznym. A zatem analiza z wykorzystaniem RNA predykcyjnych do zastosowania według wynalazku musi nastąpić przed wystąpieniem napadów klinicznych (tj. próbka materiału od pacjenta musi zostać pobrana przed wystąpieniem pierwszego napadu padaczkowego).

Skuteczność RNA do zastosowania według wynalazku została potwierdzona eksperymentalnie. Do badania rekrutowano pacjentów ze stwardnieniem guzowatym (dalej jako SG), u których nie wystąpiły jeszcze napady drgawkowe, którą stanowili pacjenci w wieku do 24 miesięcy (w większości dzieci w 1 roku życia). Pacjentom pobierano krew do analiz przy pierwszej wizycie (punkt E0 na 30 do 150 dni do wystąpienia napadów klinicznych). Pacjentów monitorowano pod kątem obrazu klinicznego i sposobu leczenia przez maksymalnie 548 dni od momentu wystąpienia napadów klinicznych, po czym przypisano ich do grupy odpowiadającej na leki (E0R) - padaczka odpowiadająca na leki lub opornej na leczenie (E0N) - padaczka lekooporna.

Nieoczekiwanie twórcy wynalazku wykazali, że u dziewczynek z SG, u których rozwinęła się padaczka lekooporna, przed wystąpieniem pierwszych napadów padaczkowych występuje obniżony poziom RNA panelu markerów składającego się z IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2, względem poziomu odniesienia, tj. względem dziewczynek w zbliżonym lub tym samym wieku z SG, w momencie pobrania materiału, u których padaczka, która rozwinęła się w przyszłości była kontrolowana lekami lub/i względem dziewczynek bez SG i w zbliżonym lub tym samym wieku, co badana pacjentka.

Natomiast u dziewczynek z SG, u których rozwinęła się padaczka kontrolowana lekami, przed wystąpieniem pierwszych napadów padaczkowych, występuje podwyższony poziom ekspresji markerów z panelu IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2, względem poziomu odniesienia, tj. względem dziewczynek bez SG i w zbliżonym lub tym samym wieku.

Przy czym, RNA do zastosowania według wynalazku są specyficzne dla osób płci żeńskiej.

Przy czym, w rozumieniu wynalazku RNA panelu do zastosowania według wynalazku stanowią mRNA.

W korzystnym wykonaniu panel do zastosowania według wynalazku jest rozszerzony o jeden lub więcej RNA wybranych z: IGHV5-51, RRP7A i IGKV1-16, KTI12, HRAS.

W niektórych wykonaniach kwalifikacja pacjentki z SG jako osoby, która w przyszłości odpowie lub nie odpowie na leczenie padaczki, opiera się o wartość poziomu jednego lub więcej RNA z panelu RNA predykcyjnych wynalazku, gdzie poziom jednego lub więcej RNA z panelu musi być zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto, poziomy nie powinny przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

W niektórych wykonaniach jako RNA predykcyjny może być wykorzystywany jeden, dwa, trzy, cztery, pięć lub więcej RNA z panelu do zastosowania według wynalazku.

W jednym wykonaniu do predykcji może być wykorzystane siedem następujących RNA: HRAS, RRP7A, TNFRSF13B, KTI12, IGKV4-1, IGHV6-1, IGLV1-40.

W innym korzystnym wykonaniu wykorzystywane są wszystkie RNA predykcyjne z panelu do zastosowania według wynalazku.

W niektórych wykonaniach pomiar poziomu jednego lub więcej RNA predykcyjnych z panelu RNA do zastosowania według wynalazku wykonywany jest in vitro za pomocą qRT-PCR, ddPCR lub celowanego sekwencjonowania RNA metodą NGS (tj. sekwencjonowanie metodą nowej generacji, z ang. Next Generation Sequencing, NGS).

W niektórych wykonaniach pomiar poziomu jednego lub więcej RNA predykcyjnych z panelu RNA do zastosowania według wynalazku wykrywany jest in vitro przykładowo za pomocą testów radioaktywnych, Southern blot, Northern blot, hybrydyzacji in situ, spektrometrii mas, RT-PCR, PCR, ich kombinacji lub innych technik znanych w dziedzinie.

W korzystnym wykonaniu materiałem wyjściowym do oznaczania jednego lub większej liczby RNA predykcyjnych z panelu do zastosowania według wynalazku jest krew obwodowa pacjenta, pobrana przed wystąpieniem napadów klinicznych.

W drugim aspekcie wynalazek dotyczy sposobu in vitro predykcji wystąpienia padaczki u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym, w szczególności padaczki lekoopornej. Sposób według wynalazku obejmuje:

a) Pomiar poziomu ekspresji co najmniej jednego RNA, który stanowi RNA należący do panelu RNA predykcyjnych do zastosowania według wynalazku, który składa się z IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15,

TNFRSF13B, IGLJ2;

b) Określenie, w oparciu o poziom ekspresji co najmniej jednego RNA, ryzyka wystąpienia padaczki, w szczególności padaczki lekoopornej, gdzie obniżony poziom ekspresji wspomnianego co najmniej jednego RNA w porównaniu z poziomem odniesienia wskazuje na ryzyko wystąpienia padaczki lekoopornej. Przy czym, w etapie a) pomiar poziomu ekspresji co najmniej jednego RNA jest wykonywany przed wystąpieniem pierwszego napadu padaczkowego. Podobnie materiał przeznaczony do analiz musi zostać pobrany od pacjentki przed wystąpieniem napadów klinicznych.

Wykazano, że u dziewczynek z SG, u których rozwinie się padaczka lekooporną, przed wystąpieniem pierwszych napadów padaczkowych występuje obniżony poziom RNA predykcyjnych z panelu do zastosowania według wynalazku: tj. IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGHV5-51, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, RRP7A, TNFRSF13B, IGLJ2. Obniżony poziom tych RNA jest mierzony względem poziomu odniesienia. W niektórych wykonaniach poziom odniesienia tj. względem dziewczynek w zbliżonym lub tym samym wieku z SG oraz występującą padaczką, u których padaczka była kontrolowana lekami lub/i względem dziewczynek bez SG i w zbliżonym lub tym samym wieku, co badana pacjentka. Natomiast u dziewczynek z SG, u których rozwinie się padaczka kontrolowana lekami, przed wystąpieniem pierwszych napadów padaczkowych, występuje podwyższony poziom ekspresji RNA z panelu IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2 względem poziomu odniesienia, tj. względem dziewczynek bez SG i w zbliżonym lub tym samym wieku.

W niektórych wykonaniach RNA panelu do zastosowania według wynalazku stanowią mRNA.

W jednym wykonaniu pomiar poziomu ekspresji oraz określenie ryzyka wystąpienia padaczki, w tym padaczki lekoopornej, prowadzi się w oparciu o dwa RNA wybrane z panelu RNA predykcyjnych do zastosowania według wynalazku. W innym wykonaniu pomiar poziomu ekspresji oraz określenie ryzyka wystąpienia padaczki, w tym padaczki lekoopornej, prowadzi się w oparciu o trzy RNA wybrane z panelu RNA predykcyjnych do zastosowania według wynalazku.

W korzystnym wykonaniu wykorzystywane są wszystkie RNA predykcyjne z panelu do zastosowania według wynalazku.

W korzystnym wykonaniu panel do zastosowania według wynalazku jest rozszerzony o jeden lub więcej RNA wybranych z: IGHV5-51, RRP7A i IGKV1-16, KTI12, HRAS. Co w rozumieniu wynalazku oznacza, że pomiar i predykcja są wykonywane w oparciu o jeden lub więcej RNA z panelu obejmującego IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2, oraz w oparciu o jeden lub więcej RNA z grupy obejmującej IGHV5-51, RRP7A, IGKV1-16, KTI12, HRAS.

W niektórych wykonaniach kwalifikacja pacjentki z SG jako osoby, która w przyszłości odpowie lub nie odpowie na leczenie padaczki, opiera się o wartość poziomu jednego lub więcej RNA z panelu RNA predykcyjnych do zastosowania według wynalazku, gdzie poziom jednego lub więcej RNA z panelu do zastosowania według wynalazku musi być zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto, poziomy nie powinny przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

W niektórych wykonaniach w sposobie według wynalazku do predykcji wystąpienia padaczki (tj. zarówno padaczki kontrolowanej lekami jak i padaczki lekoopornej) może być wykorzystywany jeden, dwa, trzy, cztery, pięć, sześć, siedem lub więcej RNA wybranych z IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGHV5-51, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, RRP7A,

TNFRSF13B, IGLJ2, KTI12, HRAS, IGKV1-16.

W jednym korzystnym wykonaniu pomiar poziomu ekspresji oraz określenie ryzyka (tj. predykcja) wystąpienia padaczki, w szczególności padaczki lekoopornej, jest prowadzone w oparciu o siedem następujących RNA: HRAS, RRP7A, TNFRSF13B, KTI12, IGKV4-1, IGHV6-1, IGLV1-40.

W niektórych wykonaniach materiałem wyjściowym do realizacji sposobu in vitro według wynalazku jest krew obwodowa, pobrana od pacjentek, u których jeszcze nie wystąpiły objawy kliniczne padaczki.

W niektórych wykonaniach w etapie a) sposobu według wynalazku pomiar jednego lub więcej RNA predykcyjnych z panelu do zastosowania według wynalazku wykonuje się za pomocą qRT-PCR, ddPCR lub celowanego sekwencjonowania RNA metodą NGS.

W innych wykonaniach w etapie a) sposobu według wynalazku pomiar jednego lub więcej RNA predykcyjnych z panelu do zastosowania według wynalazku wykrywany jest in vitro przykładowo za pomocą Southern blot, Northern blot, hybrydyzacji in situ, spektrometrii mas, RT-PCR, PCR, ich kombinacji lub innych technik znanych w dziedzinie.

Wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania i na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia wykres typu „volcano plot” przedstawiający RNA ulegające różnicowej ekspresji w grupach pacjentek E0R i E0N; fig. 2 przedstawia porównanie ekspresji IGLV1-40 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 3 przedstawia porównanie ekspresji IGVK4-1 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 4 przedstawia porównanie ekspresji IGLC7 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 5 przedstawia porównanie ekspresji IGLV3-19 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 6 przedstawia porównanie ekspresji IGHV4-34 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 7 przedstawia porównanie ekspresji IGHV5-51 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 8 przedstawia porównanie ekspresji IGKV1-39 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 9 przedstawia porównanie ekspresji IGHV6-1 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 10 przedstawia porównanie ekspresji IGHV1-3 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 11 przedstawia porównanie ekspresji IGHV3-53 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 12 przedstawia porównanie ekspresji IGKV3-15 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 13 przedstawia porównanie ekspresji RRP7A w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 14 przedstawia porównanie ekspresji TNFRSF13B w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 15 przedstawia porównanie ekspresji IGLJ2 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 16 przedstawia porównanie ekspresji KTI12 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 17 przedstawia porównanie ekspresji HRAS w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0; fig. 18 przedstawia porównanie ekspresji IGKV1-16 w grupach pacjentek E0R i E0N względem grupy E0.

Poniższe przykłady wykonania służą do celów ilustracyjnych i nie stanowią jakiegokolwiek ograniczenia niniejszego wynalazku.

Przykład 1.

Potwierdzenie właściwości panelu RNA predykcyjnych według wynalazku

W niniejszym przykładzie przedstawiono metodykę wykorzystaną do potwierdzenia zasadności wyboru RNA z panelu składającego się z GLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2, a także RNA z grupy obejmującej: IGHV5-51, RRP7A, IGKV1-16, KTI12, HRAS jako markerów predykcyjnych wystąpienia padaczki lekoopornej lub kontrolowanej lekami.

Materiały i metody

Pacjenci i badanie kliniczne

Do badania rekrutowano pacjentów ze stwardnieniem guzowatym (dalej jako SG), u których nie wystąpiły jeszcze napady drgawkowe, którą stanowili pacjenci w wieku do 24 miesięcy (w większości dzieci w 1 roku życia) (n=21) oraz osoby bez SG w podobnym przedziale wiekowym (n = 8). Pacjentom pobierano krew do analiz przy pierwszej wizycie (punkt E0 na 30 do 150 dni do wystąpienia napadów klinicznych). Pacjentów monitorowano pod kątem obrazu klinicznego i sposobu leczenia przez maksymalnie 548 dni od momentu wystąpienia napadów klinicznych, po czym przypisano ich do grupy odpowiadającej na leki (E0R) - padaczka odpowiadająca na leki lub opornej na leczenie (E0N) - padaczka lekooporna. Do grupy E0R zakwalifikowano 15 pacjentów (w tym 8 dziewczynek) zaś do E0N 6 (w tym 4 dziewczynki). Dodatkowo przebadano grupę osób kontrolnych C0 (8 osób; 5 dziewczynek i 3 chłopców) w podobnym wieku, ale bez diagnozy SG.

Izolacja RNA

Materiał wyjściowy do izolacji RNA stanowiła całkowita krew obwodowa. Krew nie była pobierana na czczo lub o konkretnej godzinie. 2,5 ml pobierano bezpośrednio do probówek Qiagen Paxgene RNA Tubes (Qiagen; nr kat. 762165). Izolacji RNA dokonywano przy użyciu zestawu PAXgene Blood RNA Kit (50) (Qiagene) nr kat: 762164). Jakość RNA do RNAseq sprawdzano określając RIN (ang. RNA integrity number). Parametr ten wyznaczany był przy użyciu urządzenia Agilent 2100 Bioanalyzer i dedykowanych dla niego zestawów odczynników Agilent RNA 6000 Nano Kit. Biblioteki przygotowywano z tych próbek, których RIN określono jako większy od 7 (w skali 0-10).

Przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania mRNA z deplecją rRNA

Procedura przygotowania bibliotek do sekwencjonowania RNA po deplecji rybosomalnej wykonana została przy użyciu zestawu NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit oraz NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (NEB Ltd) zgodnie z instrukcjami producenta. Metoda deplecji rRNA z puli całkowitego RNA opiera się na RNAzie H, która pozbywa się rRNA mitochondrialnego oraz cytoplazmatycznego. Jako materiał wyjściowy w procedurze stosowano 500 ng całkowitego RNA.

Kolejnym krokiem po deplecji rRNA jest fragmentacja termiczna materiału. W następnym etapie RNA przepisywane jest na cDNA, syntetyzowana jest kolejno pierwsza i druga nić cDNA. Pierwsza nić cDNA uzyskiwana jest z użyciem starterów przyłączających się losowo do wszystkich regionów RNA (ang. random primers). W ten sposób uzyskiwana jest przejściowa struktura hybrydowa cDNA-RNA, która następnie przekształcana jest w dwuniciowe cDNA z jednoczesnym włączeniem dUTP do drugiej nici cDNA. Specyficzność nici uzyskiwana jest w czasie syntezy komplementarnego łańcucha nici.

Uzyskane dwuniciowe cDNA oczyszczano z użyciem kulek magnetycznych AMPure XP. Po usunięciu alkoholu i wysuszeniu kulek w temperaturze pokojowej, zawieszano je w mieszaninie reakcyjnej do ligacji. Na tym etapie dochodzi do ligacji sekwencji adaptorowych, które przez wzgląd na swoją strukturę pętli muszą następnie zostać przecięte przez przeznaczony do tego enzym USER (NEB, Ipswich, MA, USA), aby umożliwić zajście procesu końcowej amplifikacji biblioteki. Aby uzyskać satysfakcjonujące stężenia biblioteki przeprowadzano 10 cykli reakcji PCR (ilość cykli PCR zależna jest od wejściowej ilości RNA) zgodnie z protokołem zawartym w tabeli. Co istotne druga syntetyzowana nić DNA zawierająca dUTP nie jest amplifikowana, ponieważ polimeraza jest specyficzna tylko dla nukleotydów występujących w DNA. W konsekwencji sprawia to, że odczyty pochodzące bezpośrednio z transkryptów są zawsze niciowo-zgodne z odczytem R2 pochodzącym z sekwencjonowania typu paired-end.

PL 249504 Β1

Tabela 1. Parametry reakcji PCR używane dla końcowej amplifikacji biblioteki uzyskanej z wykorzystaniem zestawu NEBNext rRNA Depletion Kit.

Nazwa etapu	Temperatura	Czas trwania \|
Etap I	98°C	30 sec j
Etap II (6-16 cykli)	98°C	15 sec \|
65°C	75 sec j
Etap III	65°C	5 min
Przechowywanie	4°C ____________ ___\|

Po zakończeniu PCR do mieszaniny reakcyjnej dodawano kulki AMPure XP w stosunku 1:1, jak opisano powyżej. DNA biblioteki odzyskiwano następnie z kulek AMPure XP eluując 10mM roztworem Tris-HCI.

Końcowe stężenie uzyskanej biblioteki oraz jej czystość wyrażoną w postaci wartości A260/280 (zakres prawidłowych wartości parametru 1,8-2,2) mierzono za pomocą urządzenia Nanodrop (Thermo Scientific), a także z wykorzystaniem urządzenia Ouantus Fluorometeri dedykowanego dla niego zestawu odczynników OuantiFluordsDNA System (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Oceny jakości biblioteki dokonywano przy użyciu urządzenia Agilent 2100 Bioanalyzer i dedykowanego dla niego zestawu odczynników Agilent High Sensitivity DNA Kit. Biblioteki sekwencjonowano na urządzeniu HiSeq1500 (lllumina, San Diego, USA) w trybie Rapid Run paired-end (2x76 cykli).

Końcowe stężenie uzyskanej biblioteki oraz jej czystość wyrażoną w postaci wartości A260/280 (zakres prawidłowych wartości parametru 1,8-2,2) mierzono za pomocą urządzenia Nanodrop (Thermo Scientific), a także z wykorzystaniem urządzenia Ouantus Fluorometer i dedykowanego dla niego zestawu odczynników OuantiFluordsDNA System (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Oceny jakości biblioteki dokonywano przy użyciu urządzenia Agilent 2100 Bioanalyzer i dedykowanego dla niego zestawu odczynników Agilent High Sensitivity DNA Kit. Biblioteki sekwencjonowano na urządzeniu HiSeq1500 (lllumina, San Diego, USA) w trybie Rapid Run paired-end (2x76 cykli).

Analiza drugorzędowa/trzeciorzędowa wyników sekwencjonowania RN A

W pierwszej kolejności usunięto z plików FASTO sekwencje adapterów specyficznych dla lllumina, niskiej jakości zasady 5' i 3' oraz krótkie odczyty przy użyciu programu Trimmomatic (wersja 0.36) z opcjami domyślnymi. Następnie odczyty sekwencjonowania RNA dopasowano do referencyjnej sekwencji genomu ludzkiego (hg38) za pomocą programu STAR mapper (wersja 2.6.1 b), z włączoną opcją twopassMode Basic w celu zwiększenia możliwości mapowania odczytów do identyfikacji nowych połączeń. Następnie do identyfikacji i oznaczania zduplikowanych odczytów użyto Picard Tools (wersja 2.17.1). Korzystając z oprogramowania featureCounts (wersja 1.5.3), uzyskane w ten sposób zmapowane odczyty RNAseq były sumowane i liczone według genów w trybie sparowanym (-p) i w trybie z odwrotną nicią (-s 2), a pod uwagę brano tylko odczyty o wartości MAPQ 3 lub wyższej. Z dalszych analiz usunięto próbki, w których liczba sparowanych odczytów była mniejsza niż 10 milionów.

Następnie geny o niskiej ekspresji zostały wstępnie odfiltrowane (liczba „surowych” zliczeń fragmentów zmapowanych danego genu, co najmniej 20 we wszystkich analizowanych zestawach danych), a wynikowy zestaw danych RNA-seq znormalizowano przy użyciu metody warunkowej normalizacji kwantyli (wersja 1.32.0), a następnie przeprowadzono analizę genów ulegających różnicowej ekspresji wykorzystując DESeq2 (wersja 1.24.0). W pierwszej próbie zidentyfikowania genów o różnicowej ekspresji wykorzystano funkcję DESeqDataSetFromMatrix w celu skorygowania efektu płci; okazało się jednak, że na wynik nadal w dużym stopniu wpływała płeć, a nie odpowiedź na leczenie. W związku z tym podzielono dane według płci i przeprowadzono dwie oddzielne analizy ekspresji różnicowej dla mężczyzn i kobiet.

Przeprowadzono standardowe analizy ekspresji różnicowej przy użyciu funkcji DESeq, z grupą „osób niereagujących na leczenie” jako odniesieniem i porównano z grupą „osób reagujących na leczenie”, biorąc pod uwagę pacjentów z grupy kontrolnej. Do przekształcenia danych ze względów wizualizacyjnych wykorzystano funkcję transformacji stabilizującej wariancję (vst) w DESeq2. Wybrano tylko geny istotne statystycznie (q-value < 0,1), a testowanie wielokrotne kontrolowano za pomocą metody Bonferroniego-Hochberga (BH). Oprócz stopnia istotności, potencjalne biomarkery wybierano na podstawie dwóch czynników: 1) rozkładu znormalizowanych liczebności, w którym poszukiwano małej wewnątrzgrupowej zmienności ekspresji, oraz 2) wielokrotności zmiany między porównywanymi grupami (>log2 FC).

W tym nieograniczającym przykładzie wykonania metodą pomiaru ilości RNA predykcyjnych z panelu według wynalazku było sekwencjonowanie. Natomiast w rozumieniu wynalazku można stosować także inne metody znane znawcy w dziedzinie, np. za pomocą qRT-PCR lub ddPCR.

Uzyskane wyniki:

Analiza danych przeprowadzona bez podziału na płeć nie wykazała istotnych statystycznie różnic w poziomie ekspresji genów w punkcie E0 pomiędzy pacjentami, u których wystąpiły następnie napady padaczki lekoopornej (E0N) w porównaniu do tych u których napady padaczkowe odpowiadały na leczenie (E0R). Analiza z podziałem na płeć nie wskazała RNA o różnicowej ekspresji wśród chłopców. Stwierdzono natomiast istotnie statystycznie rożną ekspresję 47 RNA u dziewczynek z SG, co przedstawiono na Fig. 1.

Uzyskany wynik potwierdza, że panel RNA predykcyjnych według wynalazku jest specyficzny dla płci żeńskiej.

Spośród wszystkich badanych genów biorąc pod uwagę kryteria omówione powyżej wytypowano następujące RNA jako potencjalne biomarkery predykcyjne padaczki, w tym padaczki lekoopornej: IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGHV5-51, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, RRP7A, TNFRSF13B, IGLJ2, KTI12, HRAS, IGKV1-16). Szczegółowe wyniki w postaci normalizowanych zliczeń fragmentów zmapowanych danego RNA, wraz z istotnością statystyczną (Adj.p) i interpretacją przedstawiono na fig. 2-18 i omówiono poniżej,

IGLV1-40 RNA

Jak wskazano na fig. 2, Poziom mRNA IGLV1 -40 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Niski poziom mRNA IGLV1-40 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do wczesnego rozszerzenia leczenia standardowego (np. wigabatryną w przypadku SG) o podejścia terapeutyczne stosowane w przypadku padaczki lekoopornej (zwanego dalej leczeniem agresywnym). W przypadkach lekoopornej padaczki związanej ze stwardnieniem guzowatym możliwe jest dodatkowe stosowanie dodatkowych leków przeciwpadaczkowych, a także inhibitorów mTOR, kanabidiolu, diety ketogennej oraz leczenia operacyjnego.

Natomiast poziom mRNA IGLV1-40 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy w grupie E0R niż z grupie C0, co wskazuje również na przydatność tego RNA również w predykcji padaczki kontrolowanej lekami.

Przy czym, w tym nieograniczającym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGLV1-40 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGVK4-1 RNA

Jak wskazano na fig. 3, poziom mRNA IGVK4-1 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Niski poziom mRNA IGVK4-1 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego.

Natomiast poziom mRNA IGVK4-1 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy w grupie E0R niż z grupie C0, co wskazuje również na przydatność tego RNA również w predykcji padaczki kontrolowanej lekami.

Klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGVK4-1 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGLC7 RNA

Jak wskazano na fig. 4, poziom mRNA IGLC-7 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Niski poziom mRNA IGLC-7 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego.

Natomiast poziom mRNA IGLC-7 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy w grupie E0R niż z grupie C0, co wskazuje również na przydatność tego RNA również w predykcji padaczki kontrolowanej lekami.

W tym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGLC-7 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGLV3-19 RNA

Jak wskazano na fig. 5, poziom mRNA IGLV3-19 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Z kolei osoby z grupy E0R mają poziom znacznie wyższy niż w grupie C0. Niski poziom mRNA IGLV3-19 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego, podczas gdy wysoki leczenia standardowego.

Natomiast poziom mRNA IGLV3-19 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy w grupie E0R niż z grupie C0, co wskazuje również na przydatność tego RNA również w predykcji padaczki kontrolowanej lekami.

W tym nieograniczającym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGLV3-19 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGHV4-34 RNA

Jak wskazano na fig. 6, poziom mRNA IGHV4-34 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Niski poziom mRNA IGHV4-34 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego.

Natomiast poziom mRNA IGHV4-34 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy w grupie E0R niż z grupie C0, co wskazuje również na przydatność tego RNA również w predykcji padaczki kontrolowanej lekami.

W tym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości RNA zakłada, że poziom mRNA IGHV4-34 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGHV5-51 RNA

Jak wskazano na fig. 7, poziom mRNA IGHV5-51 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Z kolei, osoby z grupy E0R mają poziom znacznie wyższy niż w grupie C0. Niski poziom mRNA IGHV5-51 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego, podczas gdy wysoki poziom jest wskazaniem do włączenia leczenia standardowego.

W tym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy predykcyjnego wystąpienia padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGHV5-51 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGKV1-39 RNA

Jak wskazano na fig. 8, poziom mRNA IGKV1-39 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Z kolei, osoby z grupy E0R mają poziom znacznie wyższy niż w grupie C0. Niski poziom mRNA IGKV1-39 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego, podczas gdy wysoki poziom jest wskazaniem do włączenia leczenia standardowego.

W tym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGKV1-39 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGHV6-1 RNA

Jak wskazano na fig. 9, poziom mRNA IGHV6-1 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Niski poziom mRNA IGHV6-1 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego. Natomiast poziom mRNA IGHV6-1 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy w grupie E0R niż z grupie C0, co wskazuje również na przydatność tego RNA również w predykcji padaczki kontrolowanej lekami.

W tym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGHV6-1 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGHV1-3 RNA

Jak wskazano na fig. 10, poziom mRNA IGHV1-3 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Niski poziom mRNA IGHV1-3 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego.

Natomiast poziom mRNA IGHV1-3 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy w grupie E0R niż z grupie C0, co wskazuje również na przydatność tego RNA również w predykcji padaczki kontrolowanej lekami. W tym nieograniczającym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGHV1-3 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGHV3-53 RNA

Jak wskazano na fig. 11, poziom mRNA IGHV3-53 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Z kolei, osoby z grupy E0R mają poziom znacznie wyższy niż w grupie C0. Niski poziom mRNA IGHV3-53 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego, podczas gdy wysoki poziom jest wskazaniem do włączenia leczenia standardowego.

W tym nieograniczającym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGHV3-53 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGKV3-15 RNA

Jak wskazano na fig. 12, poziom mRNA IGKV3-15 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Z kolei, osoby z grupy E0R mają poziom znacznie wyższy niż w grupie C0. Niski poziom mRNA IGKV3-15 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego, podczas gdy wysoki poziom jest wskazaniem do włączenia leczenia standardowego.

W tym nieograniczającym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGKV3-15 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

RRP7A RNA

Jak wskazano na fig. 13, poziom mRNA RRP7A we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną padaczkę kontrolowaną lekami (E0R) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady lekooporne (E0N) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Wysoki poziom mRNA RRP7A we krwi może korelować z niższym prawdopodobieństwem wystąpienia padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do zastosowania leczenia standardowego.

W tym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA RRP7A jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

TNFRSF13B RNA

Jak wskazano na fig. 14, poziom mRNA TNFRSF13B we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Niski poziom mRNA TNFRSF13B we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego.

Natomiast poziom mRNA TNFRSF13B we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy w grupie E0R niż z grupie C0, co wskazuje również na przydatność tego RNA również w predykcji padaczki kontrolowanej lekami.

W tym nieograniczonym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA TNFRSF13B jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGLJ2 RNA

Jak przedstawiono na fig. 15, poziom mRNA IGLJ-2 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Niski poziom mRNA IGLJ-2 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego.

Natomiast poziom mRNA IGLJ-2 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy w grupie E0R niż z grupie C0, co wskazuje również na przydatność tego RNA również w predykcji padaczki kontrolowanej lekami.

W tym nieograniczonym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGLJ-2 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

KTI12 RNA

Jak przedstawiono na fig. 16, poziom mRNA KTI12 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Niski poziom mRNA KTI12 we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia agresywnego leczenia. Z kolei, w przypadku pacjentek z wysokim poziomem (E0R), względem grupy kontrolnej (C0), jak i z napadami opornymi (E0N), wskazaniem byłoby łagodniejsze leczenie standardowe.

W tym nieograniczonym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA KTI12 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

HRAS RNA

Jak wskazano na fig. 17, poziom mRNA HRAS we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest niższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną lekooporną padaczkę (E0N) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady kontrolowane lekami (E0R) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Niski poziom mRNA HRAS we krwi może korelować z wystąpieniem padaczki lekoopornej i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia leczenia agresywnego.

Natomiast poziom mRNA HRAS we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy w grupie E0R niż z grupie C0, co wskazuje również na przydatność tego RNA również w predykcji padaczki kontrolowanej lekami.

W tym nieograniczającym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA HRAS jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

IGKV1-16 RNA

Jak wskazano na fig. 18, poziom mRNA IGKV1-16 we krwi pacjentek z SG pobranej przed wystąpieniem napadów klinicznych jest wyższy u tych osób, które w przyszłości rozwiną padaczkę kontrolowaną lekami (E0R) w porównaniu do pacjentek, które rozwiną napady lekooporne (E0N) lub osób zdrowych (C0) rozumianych jako osoby bez SG i bez padaczki. Wysoki poziom mRNA IGKV1-16 we krwi może korelować z wystąpieniem łagodniejszej formy padaczki i tym samym potencjalnie być wskazaniem do włączenia łagodniejszego leczenia standardowego.

W tym nieograniczającym przykładzie wykonania klasyfikacja dziewczynek z SG w wieku do 24 miesięcy do grupy zagrożonej wystąpieniem padaczki lekoopornej lub padaczki kontrolowanej lekami na podstawie ekspresji/ilości danego RNA zakłada, że poziom mRNA IGKV1-16 jest zbliżony do mediany w danej grupie. Ponadto jego poziom nie powinien przekraczać trzeciego kwartyla ani spadać poniżej pierwszego kwantyla.

Przedmiotowa analiza wykazała przydatność wszystkich RNA predykcyjnych z panelu według wynalazku w predykcji wystąpienia padaczki (w tym padaczki lekoopornej i padaczki kontrolowanej lekami) u pacjentek z SG w wieku do 24 miesięcy jeszcze przed wystąpieniem pierwszych napadów klinicznych. A zatem należy uznać, że panel RNA według wynalazku znajdzie szerokie zastosowanie w medycynie.

Zastosowanie panelu RNA predykcyjnych według wynalazku pozwoli lekarzom prowadzącym na lepsze monitorowanie progresu choroby w celu wytypowania dziewczynek z SG najbardziej zagrożonych ciężkim przebiegiem padaczki. Umożliwiałoby to wcześniejsze włączenie leczenia więcej niż jed nym lekiem przeciwpadaczkowym, co skróci znacząco czas potrzebny do zablokowania procesu chorobowego. Ponadto, panel RNA predykcyjnych według wynalazku może być również przydatny do wczesnej diagnozy zagrożenia padaczką lekooporną w innych padaczkach dziecięcych.

Przykład 2.

W tym przykładzie wykonania predykcję wystąpienia padaczki lekoopornej przeprowadzono w oparciu o siedem następujących RNA predykcyjnych: HRAS, RRP7A, TNFRSF13B, KTI12, IGKV4-1, IGHV6-1, IGLV1-40. Pacjentki stanowiły dziewczynki w wieku do 24 miesięcy.

Pobór materiału od pacjentek, izolację RNA z krwi obwodowej oraz sekwencjonowanie przeprowadzono jak w przykładzie 1. W tym przykładzie wykonania pomiar ekspresji RNA predykcyjnych HRAS, RRP7A, TNFRSF13B, KTI12, IGKV4-1, IGHV6-1, IGLV1-40 z panelu według wynalazku wykonano za pomocą sekwencjonowania RNA metodą NGS, natomiast w rozumieniu wynalazku pomiar ekspresji RNA predykcyjnych można wykonać również inną znaną w dziedzinie techniką, np. za pomocą qRT-PCR lub ddPCR. Następnie określono ryzyko wystąpienia padaczki lekoopornej u pacjentek w oparciu o poziom wszystkich siedmiu RNA predykcyjnych (tj. HRAS, RRP7A, TNFRSF13B, KTI12, IGKV4-1, IGHV6-1, IGLV1-40) wobec poziomu odniesienia, którym był poziom ekspresji każdego z tych RNA w krwi dziewczynek w zbliżonym wieku bez SG i napadów padaczkowych.

W tym przykładzie wykonania RNA predykcyjne z panelu według wynalazku wykazały zmniejszony poziom ekspresji względem poziomu odniesienia, co pozwoliło na postawienie następujących wniosków: znaczące obniżenie poziomu ekspresji RNA TNFRSF13B, IGKV4-1, IGHV6-1, IGLV1-40 pozwala na zakwalifikowanie badanych dziewczynek jako osoby, u których rozwinie się padaczka lekooporna. Dodatkowo brak podważonego poziomu RNA KTI12, HRAS, RRP7A (względem poziomu odniesienia) pozwala na wykluczenie, że padaczka będzie padaczką kontrolowaną lekami. Uzyskane wyniki potwierdziły skuteczność panelu RNA predykcyjnych obejmującego: HRAS, RRP7A, TNFRSF13B, KTI12, IGKV4-1, IGHV6-1, IGLV1-40 w ocenie predykcji padaczki lekoopornej.

Przykład 3.

W tym przykładzie wykonania predykcję wystąpienia padaczki lekoopornej u dziewczynki z SG w wieku do 24 miesięcy przeprowadzono w oparciu o następujące RNA predykcyjne GLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2, KTI12, HRAS, IGHV5-51, IGKV1-16.

Pobór materiału od pacjentek, izolację RNA z krwi obwodowej oraz sekwencjonowanie przeprowadzono jak w przykładzie 1. Następnie określono ryzyko wystąpienia padaczki lekoopornej u pacjentek w oparciu o poziom RNA predykcyjnych wobec poziomu odniesienia, którym był poziom ekspresji każdego z tych RNA w krwi dziewczynek w zbliżonym wieku bez SG i napadów padaczkowych.

W tym przykładzie wykonania, RNA predykcyjne z panelu według wynalazku wykazały zmieniony poziom ekspresji względem poziomu odniesienia, co pozwoliło na zakwalifikowanie badanych dziewczynek jako osoby, u których rozwinie się padaczka lekooporną ze względu na:

• znacząco obniżony poziom ekspresji RNA GLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2, IGHV5-51 względem poziomu odniesienia, • brak podwyższonej ekspresji RNA KTI12, HRAS, IGKV1-16 względem poziomu odniesienia.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Panel RNA składający się z następujących RNA: GLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2 do zastosowania w predykcji wystąpienia padaczki u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym, korzystnie padaczkę stanowi padaczka lekooporna.
2. Panel do zastosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że jest rozszerzony o jeden lub więcej RNA wybranych z: IGHV5-51, RRP7A, IGKV1-16, KTI12, HRAS.
3. Sposób in vitro predykcji wystąpienia padaczki u dziewczynek w wieku do 24 miesięcy ze stwardnieniem guzowatym, w szczególności padaczki lekoopornej, obejmujący etapy: a) Pomiar poziomu ekspresji co najmniej jednego RNA;

b) Określenie, w oparciu o poziom ekspresji co najmniej jednego RNA, ryzyka wystąpienia padaczki, w szczególności padaczki lekoopornej, znamienny tym, że wspomniany co najmniej jeden RNA należy do panelu predykcyjnych RNA do zastosowania określonego w zastrz. 1, który składa się z IGLV1-40, IGVK4-1, IGLC7, IGLV3-19, IGHV4-34, IGKV1-39, IGHV6-1, IGHV1-3, IGHV3-53, IGKV3-15, TNFRSF13B, IGLJ2, gdzie predykcja wystąpienia padaczki lekoopornej jest prowadzona w oparciu o obniżony poziom ekspresji wspomnianego co najmniej jednego RNA w porównaniu z poziomem odniesienia, natomiast predykcja wystąpienia padaczki kontrolowanej lekami jest prowadzona w oparciu o podwyższony poziom ekspresji co najmniej jednego RNA w porównaniu z poziomem odniesienia; poziom odniesienia stanowi poziom ekspresji danego RNA u dziewczynek w zbliżonym lub tym samym wieku ze stwardnieniem guzowatym, w momencie pobrania materiału, u których padaczka, która rozwinęła się w przyszłości była kontrolowana lekami lub/i u dziewczynek bez stwardnienia guzowatego i w zbliżonym lub tym samym wieku, co badana pacjentka; przy czym materiałem do badań jest krew obwodowa, a w etapie a) pomiar poziomu ekspresji co najmniej jednego RNA jest wykonywany przed wystąpieniem pierwszego napadu padaczkowego.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że pomiar wykonuje się za pomocą qRT-PCR, ddPCR lub celowanego sekwencjonowania RNA metodą NGS.
5. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz. od 3 do 4, znamienny tym, że co najmniej jeden RNA z panelu predykcyjnego jest analizowany łącznie z jednym lub więcej następujących RNA: IGHV5-51, RRP7A, IGKV1-16, KTI12, HRAS.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że pomiar poziomu ekspresji oraz określenie ryzyka wystąpienia padaczki, w szczególności padaczki lekoopornej, prowadzi się w oparciu o siedem następujących RNA: HRAS, RRP7A, TNFRSF13B, KTI12, IGKV4-1, IGHV6-1, IGLV1-40