PL249385B1 - Prolek-glikokoniugat pochodny gemcytabiny, jako związek o działaniu przeciwnowotworowym, sposób otrzymywania i zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest prolek - glikokoniugat pochodny gemcytabiny o wzorze 3 w postaci glikokoniugatu z kwasem glukurunowym i wzorze sumarycznym C₁₅H₁₉F₂N₃O₁₀, który składa się z pochodnej cytydyny (nukleozydu zbudowanego z D-rybozy połączonej wiązaniem  N-glikozydowym z zasadą pirymidynową - cytozyną), którą stanowi 2'-deoksy-2',2'-difluorocytydyna (gemcytabina), która połączona jest z kwasem D-glukuronowym za pomocą wiązania amidowego utworzonego pomiędzy grupą aminową gemcytabiny zlokalizowaną na pierścieniu cytozyny, a grupą karboksylową kwasu glukurunowego zlokalizowaną w jego strukturze na węglu C-6. Zgłoszenie zawiera też sposób otrzymywania pochodnej gemcytabiny o wzorze ogólnym 3, który polega na tym, że obejmuje następujące trzy etapy, w: I etapie prowadzi się reakcje otrzymywania kwasu 1,2,3,4-tetra-O-acetylo-D-glukuronowego o wzorze 1 będącego pochodną kwasu glukuronowego, w którym wszystkie grupy hydroksylowe (przy węglach C-1, C-2, C-3 i C-4) są przeprowadzone w grupy estrowe — octanowe (acetylowe), a w pozycji C-6 zlokalizowana jest grupa karboksylowa; gdzie prowadzi się reakcję, polegającą na tym, że kwas glukuronowy w ilości od 5 g do 20 g zawiesza się w bezwodniku octowym od 10 mL do 50 mL i dodaje od 1 do 10 kropli stężonego H₂SO₄, umieszcza w łaźni olejowej, proces prowadzi się w temperaturze od 55°C do 60°C, w czasie od 45 min do 2 h, korzystnie 1 h, po czym chłodzi do temperatury pokojowej, do tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej dodaje się od 50 mL do 100 mL H₂O, korzystnie 75 mL H₂O i miesza w czasie do 30 min, chłodzi, a wykrystalizowany osad odsącza pod próżnią, II etapie prowadzi się reakcję acetylowanego kwasu glukuronowego z Gem w obecności czynników kondensujących, polegającą na tym, że pochodną o wzorze 1, którą stanowi kwas 1,2,3,4-tetra-O-acetylo-D-glukuronowy w ilości od 49,5 mg do 100 mg rozpuszcza się w bezwodnym ACN w ilości od 5 mL do 10 mL umieszcza na mieszadle magnetycznym, po czym dodaje się gemcytabinę w ilości od 36 mg do 50 mg, HATU w ilości od 60 mg do 90 mg i DIPEA w ilości od 30 µL do 50 µL, reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej w czasie od 2 h do 4 h, mieszaninę zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem w zakresie od 190 mbar do 210 mbar na wyparce rotacyjnej, a surowy produkt oczyszcza za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym, III etapie pochodną o wzorze 2 koniugat gemcytabiny i kwasu 1,2,3,4-tetra-O-acetylo-D-glukuronowego połączony wiązaniem amidowym pomiędzy grupą aminową gemcytabiny, a karboksylową kwasu glukuronowego w ilości od 34,0 mg do 50 mg rozpuszcza się w MeOH w ilości od 2 mL do 5 mL i dodaje roztwór MeONa w MeOH w ilości od 0,55 mL do 0,8 mL, reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej w czasie od 2 h do 5 h, po czym neutralizuje, korzystnie Amberlitem (H), nośnik odsącza, a przesącz zatęża. Przedmiotem zgłoszenia jest również zastosowanie proleku - glikokoniugatu pochodnej gemcytabiny o wzorze ogólnym 3 oraz otrzymanego powyższym sposobem jako prolek synergiczny o działaniu przeciwnowotworowym, przeciwwirusowym.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest prolek - glikokoniugat pochodny gemcytabiny, jako związek o działaniu przeciwnowotworowym, sposób otrzymywania i zastosowanie. Nowy związek znajduje zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, weterynaryjnym, jako element innowacyjnej i selektywnej terapii przeciwnowotworowej, przeciwwirusowej.

Gemcytabina (Gem) należy do rodziny leków z rodziny analogów nukleozydowych [2]. Działa poprzez blokowanie tworzenia nowych fragmentów DNA, co powoduje śmierć komórki [2]. Gemcytabina, z markami takimi jak Gemzar [1], jest lekiem chemioterapeutycznym [2]. Znajduje ona zastosowanie w leczeniu nowotworów takich jak rak jąder [3], rak piersi, rak jajnika, niedrobnokomórkowy rak płuc, rak trzustki i rak pęcherza [2, 4]. Jest podawana we wlewie dożylnym [2]. Działa przeciwko rozwojowi nowotworu i hamuje replikację Orthohepevirus A, czynnika wywołującego wirusowe zapalenie wątroby typu E, poprzez regulację w górę sygnalizacji interferonowej [5]. Po podaniu ogólnoustrojowym Gem szybko metabolizuje do swojej nieaktywnej pochodnej urydyny 2',2'-difluorodeoksyurydyny (dFdU) w reakcji katalizowanej przez deaminazę deoksycytydynową, która jest enzymem obecnym w wysokich stężeniach zarówno w ludzkim osoczu, jak i wątrobie. Deaminacja zachodzi szybko w osoczu, na co wskazuje czas połowicznego rozkładu, t1/2 około 15 min. Ze względu na złożony profil farmakologiczny, istnieje potrzeba ciągłego podawania dożylnego Gem w celu osiągnięcia stężenia terapeutycznego. Zaobserwowano, że efekt terapeutyczny jest silnie uzależniony od częstotliwości podawania, a nie od dawki, a w niektórych przypadkach odpowiednią odpowiedź terapeutyczną uzyskano po codziennym podawaniu lub przedłużonej infuzji. Ze względu na wysoką dawkę, Gem wiąże się z poważnymi skutkami ubocznymi. Częste działania niepożądane obejmują zahamowanie czynności szpiku kostnego, problemy z wątrobą i nerkami, anemię, nudności, gorączkę, wysypkę, duszności, owrzodzenia jamy ustnej, biegunkę, neuropatię, wypadanie włosów [2]. Ze względu na hydrofilową naturę, Gem nie może przechodzić przez błony komórkowe poprzez dyfuzję bierną, dlatego niezbędna jest obecność białka uczestniczącego w transporcie aktywnym. Białka błonowe zaangażowane w transport nukleozydów biorą udział w transporcie Gem (najczęstszymi transporterami gemcytabiny są SLC29A1 SLC28A1 i SLC28A3). Niedobory w aktywności tych białek są głównymi przyczynami nabytej lekooporności na Gem, Lek ten jest użyteczny tylko wtedy, gdy podawany jest dożylnie. Przedmiotem badań były metody formulacji, tak aby można było go podawać doustnie, wydłużyć czas działania poprzez zahamowanie reakcji deaminacji. Zaproponowano systemy formulacji Gem z udziałem metod nanotechnolog ii, jednak wyniki te nie zostały skierowane do kolejnych etapów badań leków [6-8].

Gem jest jednym z najskuteczniejszych środków przeciwnowotworowych stosowanych klinicznie w leczeniu wielu różnych nowotworów. Po podaniu, w komórkach Gem jest aktywowana w wyniku reakcji fosforylacji, co prowadzi do apoptozy komórek. Jednak, jej wąskie parametry farmakokinetyczne i utrata aktywności terapeutycznej po podaniu ogólnoustrojowym z powodu szybkiego metabolizowania do nieaktywnego metabolitu stanowią główne ograniczenia, hamując w ten sposób jego skuteczność. Ponadto, w celu utrzymania stężenia terapeutycznego w organizmie, w praktyce klinicznej podaje się wielokrotne wlewy, co prowadzi do poważnych niedogodności. Dlatego, celowe jest opracowanie struktury proleku pochodnego Gem, który będzie odporny na reakcje deaminacji w płynie ustrojowym. Niedobory w aktywności białek odpowiedzialnych za transport nukleozydów są głównymi przyczynami nabytej oporności na Gem. Chcąc poprawić dystrybucję leku do komórek nowotworowych, konieczne jest opracowanie nowatorskiej strategii dostarczania Gem, co pozwoli ominąć problem zjawiska oporności, poprawić jego indeks terapeutyczny i umożliwić skuteczniejsze i bezpieczniejsze leczenie. Kierując się tymi przesłankami, opracowano proleki w formie glikokoniugatów oraz oceniono ich terapeutyczną przydatność w badaniach in vitro.

Koniugacja środków przeciwrakowych z cząsteczkami, które umożliwiają preferencyjne dostarczanie do komórek rakowych, jest dobrze znana z kilku koniugatów wykazujących skuteczność kliniczną. Jedno podejście obejmuje sprzęganie ustalonego leku z małą cząsteczką ukierunkowaną na specyficzny marker nowotworowy. Do takich receptorów zaliczane są białka GLUT odpowiedzialne za transport cukrów do komórek poprzez błonę komórkową. Z uwagi na nadekspresje w komórkach nowotworowych, białka GLUT stały się atrakcyjnym celem do badań nad nowotworami. Ponadto, enzymy glikolityczne, a także zależny od insuliny transporter glukozy GLUT-1, ulegają znacznej nadekspresji w nowotworach ludzkich [9-14], co doprowadziło do opracowania nowych podejść do diagnostyki nowotworowej opracowania możliwości terapeutycznych ukierunkowanych na te choroby [15].

Od wczesnych lat 90-tych, w literaturze chemicznej opisano analogi różnych środków terapeutycznych sprzężonych z monosacharydami, zaprojektowanych w celu poprawy rozpuszczalności w wodzie, stabilności w surowicy i ukierunkowania ich aglikonów.

Obecnie badane glikokoniugaty, co do których wykazano, że są transportowane przez receptor GLUT-1, są ograniczone do koniugatów zawierających resztę glukozy. GLUT stał się atrakcyjnym celem badań nad rakiem w zakresie chemii medycznej, co doprowadziło do opracowania nowych możliwości w diagnostyce i terapii nowotworów.

Duża część znanych koniugatów glukozy jest skoniugowana ze środkiem przeciwnowotworowym przez atom tlenu w pozycji anomerycznej (z nienaruszonym tlenem przy węglu C-1 i zablokowanym w pozycji ekwatorialnej (β-D)). Wykazano również, że rozpoznawanie glukozy przez transporter jest silnie zależne od C-1-OH jako akceptora wodoru. Podstawienie grupy C-1-OH zmniejsza szybkość transportu z udziałem białek GLUT, natomiast podstawienie grupy C-6-OH zwiększa powinowactwo cukru do białek GLUT.

Poszukując analogów glukokoniugatów, zwróciliśmy uwagę na koniugaty, w których ligandem wykazującym powinowactwo do receptorów GLUT jest kwas glukuronowy. Nie są nam znane glikokoniugaty pochodne Gem, w których molekuła kwasu glukuronowego jest związana z Gem wiązaniem amidowym.

Podczas prowadzonych prac badawczych nad opracowaniem nowego związku oraz metody jego otrzymywania stwierdzono nieoczekiwanie, że otrzymane proleki wykazują aktywność in vitro, hamując proliferację komórek nowotworowych.

Istotą zgłoszenia jest nowy związek o działaniu przeciwnowotworowym o wzorze ogólnym 3 w postaci glikokoniugatu z kwasem glukurunowym i wzorze sumarycznym C15H19F2N3O10, który składa się z pochodnej cytydyny (nukleozydu zbudowanego z D-rybozy połączonej wiązaniem N-glikozydowym z zasadą pirymidynową - cytozyną), którą stanowi 2’-deoksy-2’,2’-difluorocytydyna (gemcytabina), która połączona jest z kwasem D-glukuronowym za pomocą wiązania amidowego utworzonego pomiędzy grupą aminową gemcytabiny zlokalizowaną na pierścieniu cytozyny a grupą karboksylową kwasu glukurunowego zlokalizowaną w jego strukturze w pozycji C-6.

Sposób otrzymywania pochodnej gemcytabiny o wzorze ogólnym 3, polega na tym, że obejmuje następujące trzy etapy:

w I etapie prowadzi się reakcje otrzymywania kwasu 1,2,3,4-tetra- O -acetylo-D-glukuronowego o wzorze 1 będącego pochodną kwasu glukuronowego, w którym wszystkie grupy hydroksylowe (przy węglach C-1, C-2, C-3 i C-4) są przeprowadzone w grupy estrowe - octanowe (acetylowe) a w pozycji C-6 zlokalizowana jest grupa karboksylowa; gdzie prowadzi się reakcję, polegającą na tym, że kwas glukuronowy w ilości od 5 g do 20 g zawiesza się w bezwodniku octowym od 10 mL do 50 mL i dodaje od 1 do 10 kropli stężonego H2SO4, umieszcza w łaźni olejowej, proces prowadzi się w temperaturze od 55°C do 60°C, w czasie od 45 min. do 2 h, korzystnie 1 h, po czym chłodzi do temperatury pokojowej, do tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej dodaje się od 50 mL do 100 mL H2O, korzystnie 75 mL H2O i miesza w czasie do 30 min, chłodzi, a wykrystalizowany osad odsącza pod próżnią, w II etapie prowadzi się reakcję acetylowanego kwasu glukuronowego z Gem w obecności czynników kondensujacych, polegającą na tym, że pochodną o wzorze 1, którą stanowi kwas 1,2,3,4-tetra-O -acetylo-D-glukuronowy w ilości od 49,5 mg do 100 mg rozpuszcza się w bezwodnym ACN w ilości od 5 mL do 10 mL umieszcza na mieszadle magnetycznym, po czym dodaje się gemcytabinę w ilości od 36 mg do 50 mg, HATU w ilości od 60 mg do 90 mg i DIPEA w ilości od 30 pL do 50 pL, reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej w czasie od 2 h do 4 h, mieszaninę zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem w zakresie od 190 mbar do 210 mbar na wyparce rotacyjnej, a surowy produkt oczyszcza za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym, w III etapie pochodną o wzorze 2 koniugat gemcytabiny i kwasu 1,2,3,4-tetra-O-acetylo-D-glukuronowego połączony wiązaniem amidowym pomiędzy grupą aminową gemcytabiny a karboksylową kwasu glukuronowego w ilości od 34,0 mg do 50 mg rozpuszcza się w MeOH w ilości od 2 mL do 5 mL i dodaje roztwór MeONa w MeOH w ilości od 0,55 mL do 0,8 mL, reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej w czasie od 2 h do 5 h, po czym neutralizuje, korzystnie Amberlitem (H), nośnik odsącza, a przesącz zatęża.

Prolek - glikokoniugat pochodny gemcytabiny o wzorze ogólnym 3, określony w zastrz. 1 oraz otrzymany sposobem określonym w zastrz. 2 do zastosowania jako prolek synergiczny o działaniu przeciwnowotworowym .

PL 249385 Β1

Związek o wzorze 1 według wynalazku otrzymuje się w reakcji kondensacji z udziałem grupy karboksylowej kwasu glukuronowego i grupy aminowej Gem z utworzeniem wiązania amidowego. Jako podjednostki strukturalne, związek ten zawiera Gem i jednostkę monosacharydową o strukturze piranozowej połączone wiązaniem amidowym, które w wyniku hydrolizy wiązania katalizowanej przez enzymy hydrolityczne aktywne w komórce nowotworowej uwalniają się i wykazują synergiczne działanie hamujące proliferację komórek nowotworowych.

Związek o wzorze 1 stanowi prolek mający zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej ze względu na to, że posiada wiele nieoczekiwanych zalet, takich jak selektywność, biodostępność i wysoka skuteczność wynikająca z aktywności synergistycznej elementów jego struktury. Podstawienie grupy aminowej nukleozydu blokuje reakcję deaminacji i tym samym wydłuża aktywność i pozwala na formulację leku w postaci doustnej. Aktywność koniugatu Gem z kwasem glukuronowym według wynalazku jest silniejsza niż działanie niezmodyfikowanego Gem. Ponadto związek według wynalazku zapewnia mechanizm selektywnego dostarczania czynnika cytotoksycznego do komórek nowotworowych wykazujących zwiększone zużycie glukozy i nasilenie procesów glikolizy aerobowej. Jest skuteczny w odniesieniu do komórek nowotworowych o obniżonej aktywności białek transportujących nukleozydy, ponieważ z uwagi na wprowadzenie jednostki cukrowej może być przenoszony z udziałem białek GLUT, odpowiedzialnych za dystrybucję monosacharydów. Prolek według wynalazku o ukierunkowanym wprowadzaniu do komórek nowotworowych posiada następujące elementy strukturalne:

Prolek zawiera cząsteczkę kwasu glukuronowego połączoną wiązaniem amidowym z Gem, a pierścień cukrowy posiada strukturę piranozową, i jest mieszaniną równowagową form o konfiguracji α-, β- przy czym dominuje stereoizomer β-D transportowany przez białko GLUT-1.

W proleku według wynalazku kwas glukuronowy pełni funkcję liganda oddziałującego z białkami przenoszącymi cukier do komórki nowotworowej. Koncepcję syntezy pochodnych, analogów koniugatów D-glukozy oparto na tzw. efekcie Warburga, który wskazuje, że komórki nowotworowe metabolizują wielokrotnie większe ilości cukru w porównaniu z pozostałymi komórkami gospodarza. Wpływa to korzystnie na biodostępność silnie polarnego związku jakim jest Gem. Komórki nowotworowe wykazują nadekspresję białek GLUT przenoszących cukier, co powoduje, że koniugaty są w sposób ukierunkowany transportowane i przenoszone do komórek nowotworowych.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że koniugat zmniejsza szybkość proliferacji komórek nowotworowych, wobec tego po uwolnieniu w komórce nowotworowej zwiększa się cytotoksyczność proleku. Aby proces ten mógł być pierwszym etapem metabolizmu proleku, kwas glukuronowy połączono z Gem wiązaniem amidowym, ulegającym procesom hydrolizy katalizowanym przez enzymy. Wybrano Gem jako farmakofor z uwagi na dobrze udokumentowane właściwości przeciwnowotworowe.

Tak zaprojektowany i syntezowany prolek posiada w swojej strukturze jednostki, które wykazują synergiczne działanie przeciwnowotworowe, i pozwala na uwalnianie w procesie metabolizmu kwasu glukuronowego oraz Gem.

Sposób otrzymywania nowego związku według wynalazku przebiega w trzech etapach: Etap I: Synteza kwasu 1,2,3,4-tetra-O-acetylo-D-Glukuronoweqo (Wzór 1)

Wzór 1

Kwas glukuronowy (10 g, 0,051 mol) zawieszono w bezwodniku octowym (25 mL, 0,265 mol) i wkroplono 3 krople stężonego H2SO4, a następnie umieszczono w łaźni olejowej. Reakcję prowadzono w temperaturze 60°C przez 1 h. Po tym czasie kolbę ochłodzono do temperatury pokojowej. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 75 mL H2O i dalej mieszano przez 30 min. Wstawiono do lodówki na noc. Wykrystalizowany biały osad odsączono pod próżnią (Tt = 91 °C, lit. 91-93°C [16]). ¹H NMR (600 MHz, DMSO-de): δ 1.96 (s, 3H, OAc), 1.97 (s, 3H, OAc), 2.00 (s, 3H, OAc), 2.07 (s, 3H, OAc), 3.40 (bs, 1H, OH), 4.51 (d, J=10.2 Hz, 1H, H-5). 4.94 (dd, J= 8.4 Hz, 9.6 Hz, 1H, H-2), 5.04 (t, J = 9.6 Hz, 1 Η, H-3/4), 5.46 (t, J = 9.6 Hz, 1 Η, H-3/4) 5.99 (d, J = 7.8 Hz, 1 Η, H-1). ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-de): <520.3, 20.4, 20.5, 68.8, 69.9, 71.2, 71.6, 90.6, 168.0, 168.8, 169.1, 169.5.

PL 249385 Β1

Etap II: Synteza glikokoniugatu o wzorze 2. Kondensacja Gem i kwasu 1,2,3,4-tetra-O-acetylo-D-Glukuronowego (Wzór 1)

OAc

Wzór 1

Pochodną o wzorze 1 (50 mg, 0,138 mmol) rozpuszczono w bezwodnym ACN (5 mL) i umieszczono na mieszadle magnetycznym. Do mieszaniny reakcyjnej dodano gemcytabinę (36,3 mg, 0,138 mmol), HATU (63,1 mg, 0,166 mmol) i DIPEA (36 pL, 0,207 mmol). Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 2 h. Po zaobserwowaniu całkowitego przereagowania substratu cukrowego (analiza TLC) zawartość kolby zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem 200 mbar. Surowy produkt oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (elucja CHCL), otrzymując żółtawy krzepnący olej. ¹H NMR (600 MHz, MeOD): δ 1.96 (s, 3H, OAc), 1.97 (s, 3H, OAc), 2.00 (s, 3H, OAc), 2.07 (s, 3H, OAc), 3.27 (bs, 1H, NH), 3.73 (m, 2H, H-5’), 3.94 (m, 1H, H-47H-3’), 4.27 (m, 1H, H-47H-3’), 4.34 (d, J= 10.2 Hz, 1H, H-5), 5.14 (m, 1H, H-2), 5.29 (t, J= 9.6 Hz, 1H, H-4), 5.41 (t, J=9.6 Hz, 1H, H-3), 5.91 (d, J= 7.8 Hz, 1H, H-1), 6.23 (dd, J = 6.6 Hz, 7.2Hz, 1H, H-1), 7.32 (d, J= 7.8 Hz, 1H, Ar), 8.36 (d, J= 7.8 Hz, 1H, Ar). ¹³C NMR (150 MHz, MeOD): δ 20.4, 20.5, 55.8, 60.3, 70.2, 71.4, 73.2, 75.0, 82.9, 92.8, 98.3, 123.9, 146.7, 157.2, 164.2, 168.3, 170.4, 171.0, 171.2, 171.4.

Etap III: Synteza glikokoniugatu o wzorze 3. Amid kwasu D-glukuronowego i Gemcytabiny

OH F

Pochodną o wzorze 2 (34.7 mg, 0.057 mmol) rozpuszczono w MeOH (2 mL) i wkroplono 1M roztwór MeONa w MeOH (0,5 mL). Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez 2 h. Po zaobserwowaniu całkowitego przereagowania substratu mieszaninę reakcyjną zneutralizowano Amberlitem (H), następnie nośnik odsączono, a przesącz zatężono na wyparce, otrzymując bezbarwny krzepnący olej. ¹H NMR (600 MHz, MeOD): <5 3.42 (bs, 1H,‘NH), 3.66 (m, 2H, H-5'), 3.96 (m, 1H, H-47H-3’), 4.25 (m, 1H, H-47H-3’), 2.99 (m, 1H, H-2). 3.28 (m, 1H, H-3), 3.52 (m, 1H, H-4), 4.02 (d, J = 9.6 Hz, 1H, H-5), 4.61 (d, J= 8.2 Hz, 1H, H-1), 6.18 (dd, J= 6.6 Hz, 7.2 Hz, 1H, H-1'), 7.29 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Ar), 8.39 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Ar), ¹³C NMR (150 MHz, MeOD): <554.1,60.8, 72.1,74.8, 75.1,76.5, 83.5, 92.8, 97,6, 124.7, 148.2, 156.4, 169.5.

Badania aktywności biologicznej

Wykorzystane linie komórkowe:

Ludzkie:

• A253 - rak płaskonabłonkowy gruczołu ślinowego • BEAS-2B - prawidłowe ludzkie komórki nabłonka oskrzeli.

• FaDU - rak płaskonabłonkowy gardła dolnego • BxP3 - rak trzustki • ASPC1 - rak trzustki • T24 - rak pęcherza moczowego

Mysie:

• B16F10 - mysi czerniak • 4T1 - mysi raka sutka • bEDN.3 - prawidłowe komórki śródbłonka mysiego mózgu.

PL 249385 Β1

Metodyka

Komórki wysiewano na 96-dołkową płytkę hodowlaną (8x10⁴ komórek/dołek). Po osiągnięciu przez komórki 100% konfluencji z płytek usuwano pożywkę hodowlaną i zastępowano ją świeżą z dodatkiem poszczególnych związków w stężeniach 25, 50,100, 150 i 200 μΜ w ilości 200 pL na dołek. Kontrolę stanowiły komórki hodowane w samej pożywce hodowlanej. Komórki inkubowano z poszczególnymi związkami przez 24 oraz 48 h. Po inkubacji medium hodowlane zastępowano roztworem sulfidu metylowo-p-tolilowego (MTS) w pożywce hodowlanej (1 :5) i pozostawiano w hodowli na 3 h. Następnie ilość wytworzonego formazanu badano spektrofotometrycznie. Absorbancję mierzono na spektrofotometrze Infinite 200Pro firmy Tecan przy użyciu programu „i-Control”. Pomiar absorbancji wykonano przy długości fali - 565 nm.

Wyniki badań na wybranych liniach komórkowych

Tabela 1 Wyniki badań proleku o wzorze 3 na komórkach mysich: mysiego czerniaka (B16F10), mysiego raka sutka (4T1), prawidłowych komórkach śródbłonka mysiego mózgu (bEDN.3). % przeżywalności liczony w stosunku do komórek kontrolnych nietraktowanych

Linia komórkowa	25μΜ przeżywalność %	50μΜ przeżywalność %	100μΜ przeżywalność %	200μΜ przeżywalność %
B16F10/ Gem	30/35	30/35	30/35	30/32
4T1/Gem	42/50	42/45	42/40	30/30
bEDN.3/Gem	35/38	35/35	38/32	23/30

Tabela 2

Wyniki badań proleku o wzorze 3 na komórkach ludzkich: raka płaskonabłonkowego gruczołu ślinowego (A253). prawidłowych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (BEAS-2B), raka płaskonabłonkowego gardła dolnego (FaDU)

Linia komórkowa	25 μΜ przeżywalność %	50μΜ przeżywalność %	100μΜ przeżywalność %	200μΜ przeżywalność %
A 253/ Gem	56/62	50/60	42/58	40/52
BEAS 2B/ Gem	50/50	50/50	45/45	38/42
FaDu/Gem	50/61	42/59	42/58	42/50

Tabela 3

Wyniki badań proleku o wzorze 3 na komórkach ludzkich: raka trzustki (BxP3, ASPC1), raka pęcherza moczowego (T24)

Linia komórkowa	1 μΜ przeżywalność %	10 μΜ przeżywalność %	50 μΜ przeżywalność %
BxP3/ Gem	41/43	40/ 42	37/36
ASPCl/Gem	67/70	65/ 65	64/63
T24	22/20	20/20	18/17

Literatura

1. „Gemcitabine International Brands”, Drugs.com. Archived from the original on 25 May 2014. Retrieved 6 May 2017.

2. „Gemcitabine Hydrochloride”. The American Society of Health-System Pharmacists. Archived from the original on 2 February 2017. Retrieved 8 December 2016.

3. „Drug Formulary/Drugs/gemcitabine - Provider Monograph”, Cancer Care Ontario. Retrieved 6 December 2020.

4. National Cancer Institute (2006-10-05). „FDA Approval for Gemcitabine Hydrochloride”. National Cancer Institute. Archived from the original on 5 April 2017. Retrieved 22 April 2017.

5. Li Y., Li P., Li Y., Zhang R., Yu P., Ma Z., Kainov D.E., de Man R.A., Peppelenbosch M.P., Pan Q. „Drug screening identified gemcitabine inhibiting hepatitis E virus by inducing interferon-like response via activation of STAT1 phosphorylation”. Antiviral Research. 2020, 184, 104967.

doi: 10.1016/j.antiviral.2020.104967.

6. Dyawanapelly S., Kumar A., Chourasia M.K. „Lessons Learned from Gemcitabine: Impact of Therapeutic Carrier Systems and Gemcitabine’s Drug Conjugates on Cancer Therapy”. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 2017, 34 (1), 63-96; doi: 10.1615/CritRevTherDrugCarrierSyst.2017017912.

7. Birhanu G., Javar H.A., Seyedjafari E., Zandi-Karimi A. „Nanotechnology for delivery of gemcitabine to treat pancreatic cancer”. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2017, 88, 635-643. doi: 10.1016/j.biopha.2017.01.071.

8. Dubey R.D., Saneja A., Gupta P.K., Gupta P.N. „Recent advances in drug delivery strategies for improved therapeutic efficacy of gemcitabine”. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2016, 93,147-62. doi: 10.1016/j.ejps.2016.08.021.

9. Altenberg B., Greulich K.O. „Genes of glycolysis are ubiquitously overexpressed in 24 cancer classes”. Genomics. 2004, 84(6), 1014-20. doi: 10.1016/j.ygeno.2004.08.010.

10. Medina R.A., Owen G.I. „Glucose transporters: expression, regulation and cancer”. Biol Res. 2002, 35(1), 9-26. doi: 10.4067/s0716-97602002000100004.

11. Ohba S., Fujii H., Ito S., Fujimaki M., Matsumoto F., Furukawa M., Yokoyama J., Kusunoki T., Ikeda K., Hino O. „Overexpression of GLUT-1 in the invasion front is associated with depth of oral squamous cell carcinoma and prognosis”. J Oral Pathol Med. 2010, 39(1), 74-8.

doi: 10.1111/j.1600-0714.2009.00814.

12. Kunkel M., Moergel M., Stockinger M., Jeong J.H., Fritz G., Lehr H.A., Whiteside T.L. „Overexpression of GLUT-1 is associated with resistance to radiotherapy and adverse prognosis in squamous cell carcinoma of the oral cavity”. Oral Oncol 2007, 43(8), 796-803. doi: 10.1016/j.oraloncology.2006.10.009.

13. Koukourakis M.I., Giatromanolaki A., Sivridis E., Gatter K.C., Trarbach T., Folprecht G., Shi M.M., Lebwohl D., Jalava T., Laurent D., Meinhardt G., Harris A.L. „Prognostic and Predictive Role of Lactate Dehydrogenase 5 Expression in Colorectal Cancer Patients Treated with PTK787/ZK 222584 (Vatalanib) Antiangiogenic Therapy”. Clin Cancer Res. 2011, 17(14), 4892-4900.

doi: 10.1158/1078-0432.CCR-10-2918.

14. Gong L., Cui Z., Chen P., Han H., Peng J., Leng X. „Reduced survival of patients with hepatocellular carcinoma expressing hexokinase II” Med Oncol. 2012, 29(2), 909-14. doi: 10.1007/s 12032-011-9841-z.

15. Calvaresi E. C. and Hergenrother P. J. „Glucose conjugation for the specific targeting and treatment of cancer”. Chem. Sci., 2013, 4, 2319-2333. doi: 10.1039/C3SC22205E.

16. Bergeon J.A., Chan Y.-N., Charles B.G., Toth I. „Oral absorption enhancement of dipeptide L-Glu-L-Trp-OH by lipid and glycosyl conjugation”. Peptide Science. 2008, 90(5), 633-643., doi:10.1002/bip.21003.

Claims (3)

1. Prolek - glikokoniugat pochodny gemcytabiny o wzorze ogólnym 3 w postaci glikokoniugatu z kwasem glukurunowym i wzorze sumarycznym C15H19F2N3O10, który składa się z pochodnej cytydyny (nukleozydu zbudowanego z D-rybozy połączonej wiązaniem N-glikozydowym z zasadą pirymidynową - cytozyną), którą stanowi 2'-deoksy-2',2'-difluorocytydyna (gemcytabina), która połączona jest z kwasem D-glukuronowym za pomocą wiązania amidowego utworzonego pomiędzy grupą aminową gemcytabiny zlokalizowaną na pierścieniu cytozyny a grupą karboksylową kwasu glukurunowego zlokalizowaną w jego strukturze w pozycji C-6.

2. Sposób otrzymywania pochodnej gemcytabiny o wzorze ogólnym 3, znamienny tym, że obejmuje następujące trzy etapy:

w I etapie prowadzi się reakcje otrzymywania kwasu 1,2,3,4-tetra-O-acetylo-D-glukuronowego o wzorze 1 będącego pochodną kwasu glukuronowego, w którym wszystkie grupy hydroksylowe (przy węglach C-1, C-2, C-3 i C-4) są przeprowadzone w grupy estrowe - octanowe (acetylowe) a w pozycji C-6 zlokalizowana jest grupa karboksylowa: gdzie prowadzi się reakcję, polegającą na tym, że kwas glukuronowy w ilości od 5 g do 20 g zawiesza się w bezwodniku octowym od 10 mL do 50 mL i dodaje od 1 do 10 kropli stężonego H2SO4, umieszcza w łaźni olejowej, proces prowadzi się w temperaturze od 55°C do 60°C, w czasie od 45 min. do 2 h, korzystnie 1 h, po czym chłodzi do temperatury pokojowej, do tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej dodaje się od 50 mL do 100 mL H2O, korzystnie 75 mL H2O i miesza w czasie do 30 min, chłodzi, a wykrystalizowany osad odsącza pod próżnią, w II etapie prowadzi się reakcję acetylowanego kwasu glukuronowego z Gem w obecności czynników kondensujących, polegającą na tym, że pochodną o wzorze 1, którą stanowi kwas 1,2,3,4-tetra-O-acetylo-D-glukuronowy w ilości od 49,5 mg do 100 mg rozpuszcza się w bezwodnym ACN w ilości od 5 mL do 10 mL umieszcza na mieszadle magnetycznym, po czym dodaje się gemcytabinę w ilości od 36 mg do 50 mg, HATU w ilości od 60 mg do 90 mg i DIPEA w ilości od 30 pL do 50 pL, reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej w czasie od 2 h do 4 h, mieszaninę zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem w zakresie od 190 mbar do 210 mbar na wyparce rotacyjnej, a surowy produkt oczyszcza za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym, w III etapie pochodną o wzorze 2 koniugat gemcytabiny i kwasu 1,2,3,4-tetra-O -acetylo-D-glukuronowego połączony wiązaniem amidowym pomiędzy grupą aminową gemcytabiny a karboksylową kwasu glukuronowego w ilości od 34,0 mg do 50 mg rozpuszcza się w MeOH w ilości od 2 mL do 5 mL i dodaje roztwór MeONa w MeOH w ilości od 0,55 mL do 0,8 mL, reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej w czasie od 2 h do 5 h, po czym neutralizuje, korzystnie Amberlitem (H), nośnik odsącza, a przesącz zatęża.

3. Prolek - glikokoniugat pochodny gemcytabiny o wzorze ogólnym 3, określony w zastrz. 1 oraz otrzymany sposobem określonym w zastrz. 2 do zastosowania jako prolek synergiczny o działaniu przeciwnowotworowym.