PL249351B1 - Zestaw i sposób do określania metodą łańcuchowej reakcji polimerazy układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615 - Google Patents
Zestaw i sposób do określania metodą łańcuchowej reakcji polimerazy układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615Info
- Publication number
- PL249351B1 PL249351B1 PL446345A PL44634523A PL249351B1 PL 249351 B1 PL249351 B1 PL 249351B1 PL 446345 A PL446345 A PL 446345A PL 44634523 A PL44634523 A PL 44634523A PL 249351 B1 PL249351 B1 PL 249351B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- locus
- covid
- kit
- risk
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest zestaw do badania obecności dwóch polimorfizmów genetycznych, których występowanie istotnie modyfikuje przebieg choroby COVID-19, oraz sposób określenia poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu COVID-19 u pacjenta.
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy dziedzin diagnostyki genetycznej i zdrowia publicznego, a w szczególności zestawu i sposobu do określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta, pozwalającego na badanie obecności dwóch polimorfizmów genetycznych, których występowanie istotnie modyfikuje przebieg choroby COVID-19. Zestaw według wynalazku zapewnia nowe narzędzie w ochronie populacji przed chorobą COVID-19.
Choroba COVID-19, wywoływana przez wirusa SARS-COV2 zebrała ogromne żniwo podczas pandemii w latach 2019-2021 z uwagi na niedostateczną liczbę stanowisk intensywnej opieki medycznej, brak możliwości skutecznego triażu, profilaktyki pierwotnej i odpowiednich leków.
W związku z tym, sposoby identyfikacji pacjentów o zwiększonej podatności na rozwinięcie infekcji wywołanej koronawirusem i sposoby diagnozy tych infekcji są przedmiotem dużego zainteresowania w dziedzinie, np. publikacja WO2022120130 A1 (Regeneron Pharmaceuticals Inc., US). W publikacji Pairo-Castineira, E. i in., “Genetic mechanisms of critical illness in COVID-19”, Nature (2021): 591(7848): 92-98, rozważa się wstępnie warianty genetyczne gospodarza związane z ciężkim przebiegiem COVID-19 do zastosowania w terapii, jednak badania te wymagają kontynuacji. Podobnie, w publikacji Ferreira, L.C. i in., “Genome-wide association studies of COVID-19: Connecting the dots”, Infection, Genetics and Evolution 106 (2022) 105379, podjęto próbę identyfikacji wariantów genetycznych związanych z podatnością na zakażenie COVID-19.
Obecnie dostępność profilaktyki pierwotnej w postaci szczepień ochronnych pozwala na redukcję liczby zachorowań na COVID-19 i ich ciężkości, jednak dodatkowe narządzie oceniające indywidualną, genetyczną podatność osób na ciężki przebieg choroby może być pomocne na etapie triażu chorych objawowych a także może być narzędziem pomocnym w typowaniu osób, które powinny być objęte ściślejszym nadzorem epidemiologicznym w postaci częstszych, regularnych szczepień.
Celem wynalazku jest zapewnienie zestawu nadającego się do badania predyspozycji do ciężkiego przebiegu COVID-19, w szczególności identyfikowania osób należących do grupy podwyższonego ryzyka ciężkiego przebiegu COVID-19.
Jako pacjenta do grupy podwyższonego ryzyka ciężkiego przebiegu COVID-19 uznaje się osobę, u której występuje co najmniej ok. 1,5-2-krotnie wyższe ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19 niż stwierdzone w populacji generalnej. U takich osób wskazane jest rygorystyczne stosowanie profilaktyki pierwotnej: szczepień ochronnych i zaleceń przeciwepidemicznych Ministerstwa Zdrowia.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zestaw do określania metodą łańcuchowej reakcji polimerazy układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615, charakteryzujący się tym, że zawiera startery przedstawione jako sekwencje oligonukleotydowe nr id.: 1, 2, 3 i 4.
Korzystnie zestaw według wynalazku zawiera dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 5 i 6.
Korzystnie zestaw według wynalazku zawiera dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 7 i 8.
Innym przedmiotem wynalazku jest sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta, charakteryzujący się tym, że w próbce DNA pobranej od pacjenta określa się układ alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615, przy czym przeprowadza się łańcuchową reakcję polimerazy z użyciem starterów o sekwencjach oligonukleotydowych nr id.: 1, 2, 3 i 4, przy czym:
- w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli GG w locus rs143334143 oraz układu alleli AT lub AA w locus rs74956615, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje podwyższone ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19,
- w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli AA lub AG w locus rs143334143 oraz układu alleli TT w rs74956615, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje obniżone ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19, natomiast
- w przypadku stwierdzenia występowania jednego z pozostałych układów uznaje się, że u badanego pacjenta występuje średnie populacyjne ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 5 lub 6.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 7 lub 8.
PL 249351 Β1
Szczegółowy opis wynalazku
Przeprowadzono badania profili genetycznych pacjentów należących do rasy kaukaskiej, u których stwierdzono różny przebieg C0VID-19. W badaniu uczestniczyły następujące grupy pacjentów, u których stwierdzono różny przebieg C0VID-19: grupa osób, które ciężko przechodziły chorobę C0VID-19, tj. wymagała hospitalizacji, grupa osób, które przechodziły zakażenie w sposób objawowy, ale nie wymagający hospitalizacji, bezobjawowy lub nie zaraziły mimo przebywania z osobą chorującą. W badaniu uczestniczyło łącznie 340 pacjentów. DNA pozyskiwano z krwi obwodowej i wykonywano pełne sekwencjonowanie całogenomowe WGS.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że w przypadku niektórych układów polimorfizmów w locus rs143334143 i rs74956615 obserwuje się statystycznie istotną korelację z odmiennym przebiegiem COVID-19 niż obserwowany w populacji generalnej. Obserwacje te zostały podsumowane w tabeli 1 poniżej.
Tabela 1. Wyniki badań związku pomiędzy różnymi układami alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615 a przebiegiem COVID-19, w szczególności ryzykiem ciężkiego przebiegu COVID-19
| rs14333414 3 | rs7495661 5 | Ryzyko ciężkiego przebiegu COVID19 | Ryzyko genetyczne (hazard ratio) | % populacji polskiej |
| GG | AA | Podwyższone | >1,4 | 0,0865% |
| GG | AT | Podwyższone | >1,4 | 5,882% |
| GG | TT | Populacyjne | 1 | 80,445% |
| GA | AA | Populacyjne | 1 | 0,013% |
| GA | AT | Populacyjne | 1 | 0,884% |
| GA | TT | Obniżone | <0,63 | 12,09% |
| AA | AA | Populacyjne | 1 | 0,0005% |
| AA | AT | Populacyjne | 1 | 0,034% |
| AA | TT | Obniżone | <0,63 | 0,465% |
Nieoczekiwanie stwierdzono, że w przypadku nosicieli układu alleli GG w locus rs143334143 oraz układu alleli AT lub AA w locus rs74956615 występuje podwyższone ryzyko ciężkiego przebiegu infekcji wirusem SARS-CoV-2 (HR>=1,4). Jednocześnie, nieoczekiwanie stwierdzono, że przypadku nosicieli układu alleli AA lub AG w locus rs143334143 oraz układu alleli TT w rs74956615 występuje obniżone (HR<1) ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19. Również nieoczekiwanie stwierdzono, że w przypadku pozostałych układów alleli ryzyko należy traktować jako populacyjne. Powyższych obserwacji nie należy stosować w stosunku do populacji ras innych niż kaukaska z uwagi na bardzo rzadkie występowania wrs74956615 allelu A. Następnie, w celu umożliwienia łatwego badania układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615, zaprojektowano zestaw starterów i sond pozwalających na identyfikację i amplifikację regionów flankujących polimorfizmy rs143334143 i rs74956615 metodą PCR w czasie rzeczywistym (qPCR).
Uzyskany test pozwala na przeprowadzenie genotypowania metodą PCR, zwłaszcza w czasie rzeczywistym (qPCR), w co najwyżej dwóch zamkniętych probówkach z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanych sond molekularnych typu TaqMan. W przykładzie wykonania wynalazku, sondy TaqMan zostały optymalnie wyznakowane dwoma różnymi uniwersalnymi barwnikami fluorescencyjnymi o odmiennych spektrach emisji światła fluorescencyjnego, co umożliwia wykonywanie testów w większości dostępnych na rynku aparatów do reakcji PCR, a nie tylko w urządzeniach przeznaczonych do testu danego producenta. Korzystne jest zastosowanie sond typu MGB o zwiększonym powinowactwie do DNA, które wyklucza ryzyko błędu genotypowania, zwiększając jednocześnie specyficzną emisję światła przez sondę.
W korzystnym przykładzie realizacji, sposób jest oparty na stosowaniu technologii genotypowania w punkcie końcowym metodą qPCR (ang. endpoint genotyping) dwóch polimorfizmów o znamiennym wpływie na odporność populacyjną na COVID-19: rs143334143 oraz rs74956615. Do rozróżnienia alleli używane są dwie sondy typu TaqMan MGB w reakcji multipleks. Jedna sonda jest komplementarna w pełni do sekwencji allelu wariantu częstego (A), druga do sekwencji wariantu rzadkiego (B). Każda sonda jest wyznakowana na końcu 5' odróżniającym fluorochromem - w realizacji wynalazku jest to FAM lub VIC oraz na końcu 3’ wygaszaczem, przykładowo NFQ. W fazie wydłużania reakcji PCR idealnie dopasowana sonda jest rozcinana przez polimerazę DNATaq, która ma aktywność 5'^3' egzonukleazy. Uwalniany jest fluorochrom, co powoduje emisję fluorescencji. Sonda, która nie jest idealnie dopasowana, w niewielkim jedynie stopniu zostanie rozcięta przez polimerazę. Z tego względu fluorochrom zostanie uwolniony w dużo mniejszym stopniu.
Wygenerowany sygnał fluorescencyjny (VIC lub FAM) jest odczytywany w ostatnim cyklu reakcji PCR (punkt końcowy) i bezpośrednio wskazuje na układ alleli (AA, AB, BB) bez konieczności wykonywania długich i pracochłonnych etapów po reakcji PCR, które zwiększają ryzyko kontaminacji.
Technologia genotypowania w punkcie końcowym metodą qPCR cechuje się prostotą użycia i łatwością interpretacji uzyskanych wyników, dużą przepustowością (do 192 próbek jednoczasowo), możliwością wykonania przy pomocy ogólnie dostępnych urządzeń laboratoryjnych (termocykler qPCR) na różnej jakości DNA pobranym zarówno z wymazu jak i z krwi obwodowej. Wykonanie testu dla obu polimorfizmów odbywa się w tych samych warunkach reakcji i może być przeprowadzone jednoczasowo co jest ważne przy zastosowaniu testu skriningowo na dużych populacjach.
Przedmiot wynalazku w przykładzie wykonania uwidoczniono na Fig. 1 i 2, gdzie przedstawiono wyniki uzyskane w przykładzie realizacji testu z wykorzystaniem reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla polimorfizmu rs143334143, z zastosowaniem próbki kontrolnej homozygotycznej GG, próbki kontrolnej heterozygotycznej GA, próbki kontrolnej homozygotycznej AA oraz próbki bez matrycy (NTC). Zastosowano kanały detekcji 465 nm oraz 540 nm. Na Fig. 1 pokazano kinetykę reakcji PCR z różnicami w profilach fluorescencji dla zastosowanych sond, natomiast na Fig. 2 przedstawiono interpretację danych pochodzących ze stosunku poziomu fluorescencji dla obu sond, które są wyznacznikiem danego genotypu.
Przedmiot wynalazku w przykładzie wykonania uwidoczniono na Fig. 3 i 4, gdzie przedstawiono wyniki uzyskane w przykładzie realizacji testu z wykorzystaniem reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla polimorfizmu rs74956615, z zastosowaniem próbki kontrolnej homozygotycznej TT, próbki kontrolnej heterozygotycznej TA, próbki kontrolnej homozygotycznej AA oraz próbki bez matrycy (NTC). Zastosowano kanały detekcji 465 nm oraz 540 nm. Na Fig. 3 pokazano kinetykę reakcji PCR z różnicami w profilach fluorescencji dla zastosowanych sond, natomiast na Fig. 4 przedstawiono interpretację danych pochodzących ze stosunku poziomu fluorescencji dla obu sond, które są wyznacznikiem danego genotypu.
Poniżej podano przykład realizacji wynalazku.
Przykład realizacji wynalazku
W niniejszej realizacji wykonywanie genotypowania dla polimorfizmu rs143334143 i rs74956615 w testowej próbce od probanta wobec próbek kontrolnych zawierających każdy z 3 genotypów oraz kontroli bez matrycy (NTC) odbywa się według poniższego protokołu.
DNA od probantów został wyizolowany z krwi obwodowej, wymazu z nabłonka jamy ustnej lub zestawu opartego na ślinie (spit. kit), z zastrzeżeniem otrzymania minimalnie 50 ng genomowego DNA.
Do każdorazowego oznaczenia korzystnie stosowano po 3 próbki kontrolne dla poszczególnych genotypów i jedną próbkę bez matrycy (NTC). W niniejszej realizacji, próbki kontrolne genotypów korzystnie wskazują na poprawność przeprowadzonej reakcji (prawidłowe działanie odczynników, po
PL 249351 Β1 prawny profil termiczny urządzenia, brak inhibicji reakcji). Próbka kontrolna NTC pozwala na weryfikację, czy w trakcie przygotowywania reakcji amplifikacji nie doszło do kontaminacji eluatu odczynników materiałem biologicznym pochodzenia ludzkiego lub zamplifikowanym produktem PCR. Jeśli dla próbki kontrolnej NTC zostanie wykryty sygnał pozytywny w przynajmniej jednym z dwóch kanałów detekcji, oznacza to, iż doszło do zanieczyszczenia odczynników.
1. Sekwencje zastosowanych starterów, sond i kontroli według wynalazku:
a) sekwencje oligonukleotydowe startera dla polimorfizmu rs143334143: sekwencje nr id. 1 i 2,
b) sekwencje oligonukleotydowe startera dla polimorfizmu rs74956615: sekwencja nr id. 3 i 4,
c) sekwencje oligonukleotydowe sond: sekwencja nr id. 5, 6, 7, 8.
2. Zastosowane stężenia starterów i sond według wynalazku:
a) Stężenia końcowe koncentratu starterów i sond dla polimorfizmu rs143334143: 100 μΜ
b) Stężenia końcowe koncentratu starterów i sond dla polimorfizmu rs74956615: 100 μΜ
Przygotowano odpowiednie ilości starterów i sond w podanych wyżej stężeniach. Wszystkie składniki przed przygotowaniem mieszaniny zworteksowano i żwirowano. Następnie przygotowano mieszaniny koncentratów sond i starterów i podzielono na porcje o odpowiednich ilościach do probówek.
3. Zastosowane kontrole dodatnie według wynalazku
a) Kontrole dodatnie dla polimorfizmu rs143334143:
| Kontrola | Oznaczenie | Genotyp |
| K1A | rs143334143 | GG |
| K1B | rs143334143 | GA |
| K1C | rs143334143 | AA |
b) Kontrole dodatnie dla polimorfizmu rs74956615:
| Kontrola | Oznaczenie | Genotyp |
| K2A | rs74956615 | TT |
| K2B | rs74956615 | TA |
| K2C | rs74956615 | AA |
4. Opis zestawu do genotypowania
Mastermix wykorzystany w teście zawiera polimerazę Taq blokowaną przeciwciałem monoklonalnym oraz inne składniki wymagane w reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Mastermix jest stabilny w temperaturze 4 stopni C, co czyni go łatwym w transporcie i przechowywaniu przed użyciem. W skład zestawu wchodzą również: 2 mieszaniny sond i starterów, • 2 zestawy po 3 dodatnie próbki kontrolne dla poszczególnych genotypów • woda dejonizowana do PCR.
Wszystkie składniki testu należy przechowywać w +4°C w ciemnym miejscu do czasu pierwszego użycia. Po rozcieńczeniu koncentratów starterów należy je przenieść do temperatury -20°C. Transport odczynników odbywa się +4°C, co redukuje koszt dostawy eliminując konieczność mrożenia zestawu.
5. Protokół testu:
a) Przygotowanie próbek DNA • Stężenie DNA do testu powinno być w zakresie 5-50 ng/μΙ.
• W przypadku próbek bardziej stężonych należy rozcieńczyć je wodą (załączona w zestawie) do stężenia 5-50 ng/μΙ.
b) Przygotowanie odczynników • Przed pierwszym użyciem testu do odczynnika PC1 i PC2 dodać po 247,5 μΙ wody DEPC (w zestawie) w celu otrzymania stężeń roboczych.
• Reagenty dokładnie zmieszać poprzez pipetowanie lub worteksowanie.
PL 249351 Β1 • Po wymieszaniu odczynniki żwirować krótko by zapobiec osadzeniu się kropli na zakrętce lub ściankach.
c) Przygotowanie reakcji PCR • Badanie składa się z 2 reakcji PCR, osobno z użyciem odczynników MX, PC1, K1 A, K1B, K1C (oznaczenie rs143334143) oraz osobno odczynników MX, PC2, K2A, K2B, K2C (oznaczenie rs74956615).
Sposób przygotowania reakcji:
| Reagent | Reakcja 1 | Reakcja 2 |
| MX | 10 pl | 10 μΙ |
| PC1 | 5 μΙ | - |
| PC2 | - | 5 μΙ |
| K1A, K1B, K1C lub próbka badana | 5 μΙ | - |
| K2A, K2B, K2C lub próbka badana | - | 5 μΙ |
| Objętość końcowa | 20 μΙ | 20 μί |
• Przygotowane reakcje, pipetowane na płytkę 96-dołkową wstawić do termocyklera PCR. Możliwe jest wykonanie wspólnej reakcji dla obu mieszanin 1 i 2 na jednej płytce reakcyjnej, pod warunkiem przygotowania do 48 reakcji.
Profil reakcji PCR jest identyczny dla obu polimorfizmów:
| Tryb | Temp. | Czas | Liczba cykli | Pomiar fluorescencji |
| Aktywacja polimerazy | 95 | 5 minut | 1 | Brak |
| Denaturacja | 95 | 15 sekund | 45 | Brak |
| Annealing i elongacja | 59 | 60 sekund | FAM, VIC/HEX (nieobligatoryjnie) | |
| Genotypowanie | 37 | 30 sekund | 1 | FAM, VIC/HEX |
6. Oznaczenie genotypów • Oznaczenie genotypów dla każdego z polimorfizmów następuje na podstawie 3 kontroli reakcji o określonych genotypach, dołączonych do zestawu.
• Kontrole należy każdorazowo uwzględniać w oznaczeniu, podobnie jak kontrolę bez matrycy (NTC). Kontrole te wyznaczają klastry, wokół których grupować się będą sygnały dla prób badanych.
PL 249351 Β1
Genotypy w kontrolach reakcji przedstawiono w poniższej tabeli.
| Kontrola | Oznaczenie | Genotyp |
| K1A | rs143334143 | GG |
| K1B | rs143334143 | GA |
| K1C | rs143334143 | AA |
| K2A | rs74956615 | TT |
| K2B | rs74956615 | TA |
| K2C | rs74956615 | AA |
7. Oznaczenie genotypów dla polimorfizmu rs143334143
Homozygoty allelu dominującego (GG) oraz kontrola K1A grupują się w lewym górnym rogu (kolor zielony), heterozygoty (GA) oraz kontrola K1B pośrodku wykresu (kolor czerwony), homozygoty allelu rzadszego (AA) oraz kontrola K1C po prawej u dołu (kolor niebieski). Reakcje bez matrycy lub z niedostateczną ilością DNA grupują się w blisko lewego dolnego rogu (Figura 2).
8. Oznaczenie genotypów dla polimorfizmu rs74956615
Homozygoty allelu dominującego (TT) oraz kontrola K2A grupują się w lewym górnym rogu (kolor zielony), heterozygoty (TA) oraz kontrola K2B pośrodku wykresu (kolor czerwony), homozygoty allelu rzadszego (AA) oraz kontrola K2C po prawej u dołu (kolor niebieski). Reakcje bez matrycy lub z niedostateczną ilością DNA grupują się w blisko lewego dolnego rogu (Figura 4).
9. Interpretacja wyników testu
Uznaje się, że test został przeprowadzony poprawnie, gdy:
• kontrola bez matrycy nie wykazuje amplifikacji PCR oraz • wszystkie próbki kontrolne (K1A, K1B, K1C, K2A, K2B, K2C) wskazują poprawny genotyp zgodny z ulotką testu oraz • wyniki dla próbki badanej można przyporządkować do jednego z 3 genotypów opisanych w p. 7-8.
W przypadku niejednoznacznego wyniku testu musi być on wykonany ponownie z zastosowaniem nowej próbki DNA.
W celu ustalenia poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu C0VID-19 należy skorzystać z korelacji ujawnionych w tabeli 1.
W szczególności, w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli GG w/ocus rs143334143 oraz układu alleli AT lub AA w locus rs74956615, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje podwyższone ryzyko ciężkiego przebiegu C0VID-19. Natomiast w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli AA lub AG w locus rs143334143 oraz układu alleli TT w rs74956615, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje obniżone ryzyko ciężkiego przebiegu C0VID-19. Ponadto, w przypadku stwierdzenia występowania jednego z pozostałych układów, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje średnie populacyjne ryzyko ciężkiego przebiegu C0VID-19. Niniejszy przykład wykonania nie jest przykładem ograniczającym zakres wynalazku. Test został zwalidowany dla termocyklerów: Roche LightCycler480, Cobas Z480 oraz Βίο-Rad CFX96.
Po zaprojektowaniu testu i opracowaniu warunków reakcji qPCR skuteczność testu potwierdzono w badaniu walidacyjnym na 50 próbkach DNA. Genotypowanie w punkcie końcowym metodą qPCR wykonano na uprzednio zsekwencjonowanych próbkach klinicznych, wcześniej przebadanych metodą sekwencjonowania całogenomowego WGS uzyskując 100% zgodność genotypów z metodą ortogonalną.
PL 249351 Β1
Wykaz sekwencji
Sekwencja nr id. 1
Opis startera: rs143334143_F
Sekwencja: 5’-CGGGCCTTGAAGGAATCAGA-3’
Sekwencja nr id. 2
Opis startera: rs143334143_R
Sekwencja: 5’-CCTCCCGTGAAGATACAGAGACT-3'
Sekwencja nr id. 3
Opis startera: rs74956615_F
Sekwencja: 5'-GGCGAAACCCTGTCTCTACT-3'
Sekwencja nr id. 4
Opis startera: rs74956615_R
Sekwencja: 5’-CCCTTGTTTTCTCCCAGTTCC-3’
Sekwencja nr id. 5
Opis sondy: rs143334143_A
Sekwencja: 5’-VIC-AAGTCAGTTGTCAAAGTT-NFQ-3’
Sekwencja nr id. 6
Opis sondy: rs143334143_B
Sekwencja: 5’-6FAM-AGTCAGTTGACAAAGTT-NFQ-3’
Sekwencja nr id. 7
Opis sondy: rs74956615_A
Sekwencja: 5’-VIC-TGAGCTGAGACTGTGCCATT-NFQ-3’
Sekwencja nr id. 8
Opis sondy: rs74956615_B
Sekwencja: 5’-6FAM-TGAGCCGAGACTGTGCCATT-NFQ-3’
Claims (6)
1. Zestaw do określania metodą łańcuchowej reakcji polimerazy układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615, znamienny tym, że zawiera startery przedstawione jako sekwencje oligonukleotydowe nr id.: 1, 2, 3 i 4.
2. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 5 i 6.
3. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 7 i 8.
4. Sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta, znamienny tym, że w próbce DNA pobranej od pacjenta określa się układ alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615, przy czym przeprowadza się łańcuchową reakcję polimerazy z użyciem starterów o sekwencjach oligonukleotydowych nr id.: 1, 2, 3 i 4, przy czym:
- w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli GG w locus rs143334143 oraz układu alleli AT lub AA w locus rs74956615, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje podwyższone ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19,
- w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli AA lub AG w locus rs143334143 oraz układu alleli TT w rs74956615, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje obniżone ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19, natomiast
- w przypadku stwierdzenia występowania jednego z pozostałych układów uznaje się, że u badanego pacjenta występuje średnie populacyjne ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 5 lub 6.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się dodatkowo sondę oligonukleotydową o sekwencji wybranej spośród sekwencji nr id.: 7 lub 8.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL446345A PL249351B1 (pl) | 2023-10-10 | 2023-10-10 | Zestaw i sposób do określania metodą łańcuchowej reakcji polimerazy układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615 |
| PCT/PL2024/050074 WO2025080150A1 (en) | 2023-10-10 | 2024-10-10 | Kit and method for determining by polymerase chain reaction the allele configuration at the rs143334143 locus and at the rs74956615 locus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL446345A PL249351B1 (pl) | 2023-10-10 | 2023-10-10 | Zestaw i sposób do określania metodą łańcuchowej reakcji polimerazy układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL446345A1 PL446345A1 (pl) | 2024-06-17 |
| PL249351B1 true PL249351B1 (pl) | 2026-03-30 |
Family
ID=91539530
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL446345A PL249351B1 (pl) | 2023-10-10 | 2023-10-10 | Zestaw i sposób do określania metodą łańcuchowej reakcji polimerazy układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL249351B1 (pl) |
| WO (1) | WO2025080150A1 (pl) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022120130A1 (en) * | 2020-12-03 | 2022-06-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying subjects having an increased risk of developing a coronavirus infection and treatment thereof |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4158067A4 (en) * | 2020-05-27 | 2024-09-25 | Genetic Technologies Limited | Methods of assessing risk of developing a severe response to coronavirus infection |
-
2023
- 2023-10-10 PL PL446345A patent/PL249351B1/pl unknown
-
2024
- 2024-10-10 WO PCT/PL2024/050074 patent/WO2025080150A1/en active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022120130A1 (en) * | 2020-12-03 | 2022-06-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying subjects having an increased risk of developing a coronavirus infection and treatment thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FERREIRA, L.C. I IN.: "Infection, Genetics and Evolution 106 (2022) 105379", "GENOME-WIDE ASSOCIATION STUDIES OF COVID-19: CONNECTING THE DOTS" * |
| PAIRO-CASTINEIRA, E. I IN.: "Nature (2021): 591(7848): 92-98", "GENETIC MECHANISMS OF CRITICAL ILLNESS IN COVID-19" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL446345A1 (pl) | 2024-06-17 |
| WO2025080150A1 (en) | 2025-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6177249B1 (en) | Method for nucleic acid analysis using fluorescence resonance energy transfer | |
| de Kok et al. | Rapid genotyping of single nucleotide polymorphisms using novel minor groove binding DNA oligonucleotides (MGB probes) | |
| EP1229128A1 (en) | New method for genotype determination | |
| US11542556B2 (en) | Single nucleotide polymorphism in HLA-B*15:02 and use thereof | |
| WO2014181107A1 (en) | Genetic method of aiding the diagnosis and treatment of familial hypercholersterolaemia | |
| Sjöroos et al. | Time‐resolved fluorometry based sandwich hybridisation assay for HLA‐DQA1 typing | |
| Hayes et al. | Arab population data on the PCR-based loci: HLA-DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, Gc, and D1S80 | |
| US20100273175A1 (en) | Method of judging risk for onset of drug-induced granulocytopenia | |
| US20220389488A1 (en) | Multiplexed genotyping assays with a single probe using fluorescent amplitude tuning | |
| PL249351B1 (pl) | Zestaw i sposób do określania metodą łańcuchowej reakcji polimerazy układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615 | |
| PL248077B1 (pl) | Sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta | |
| Abildgaard et al. | Lactase persistence genotyping on whole blood by loop-mediated isothermal amplification and melting curve analysis | |
| EP1964929B1 (en) | Hla-b genotyping method and kit based on real-time pcr | |
| Kho et al. | Specific and straightforward molecular investigation of β-thalassemia mutations in the Malaysian Malays and Chinese using direct TaqMan genotyping assays | |
| Lizanecz et al. | Mistyping of angiotensinogen M235T alleles | |
| EP1743946A9 (en) | Method and kit for the genotypification of hla-drb based on real time pcr | |
| Upanan et al. | Accuracy of hemoglobin E screening test using allelic discrimination assay | |
| RU2652895C2 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека | |
| Gaafar et al. | Rapid screening of β-Globin gene mutations by Real-Time PCR in Egyptian thalassemic children | |
| RU2352641C1 (ru) | Способ диагностики наследственной предрасположенности к тромбофилии | |
| Chantarangsu et al. | Comparison of the TaqMan and LightCycler systems in evaluation of CYP2B6 516G> T polymorphism | |
| Freeman et al. | Template-directed dye-terminator incorporation with fluorescence polarization detection for analysis of single nucleotide polymorphisms associated with cardiovascular and thromboembolic disease | |
| Kupfer et al. | A rapid and inexpensive PCR-based STR genotyping method for identifying forensic specimens | |
| US20050153300A1 (en) | Methods and compositions for the detection of mucolipidosis IV mutations | |
| Van Nguyen et al. | A novel multiplex PCR assay for detection of both HLA-A* 31: 01/HLA-B* 15: 02 alleles, which confer susceptibility to carbamazepine-induced severe cutaneous adverse reactions |