PL248077B1 - Sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta - Google Patents
Sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjentaInfo
- Publication number
- PL248077B1 PL248077B1 PL446346A PL44634623A PL248077B1 PL 248077 B1 PL248077 B1 PL 248077B1 PL 446346 A PL446346 A PL 446346A PL 44634623 A PL44634623 A PL 44634623A PL 248077 B1 PL248077 B1 PL 248077B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- covid
- patient
- locus
- risk
- disease
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Ujawniono sposób badania obecności dwóch polimorfizmów genetycznych, których występowanie istotnie modyfikuje przebieg choroby COVID-19, sposób ten stanowi nowe narzędzie w ochronie populacji przed chorobą COVID-19.
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy dziedzin diagnostyki genetycznej i zdrowia publicznego, a w szczególności sposobu określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta, obejmującego badanie obecności dwóch polimorfizmów genetycznych, których występowanie istotnie modyfikuje przebieg choroby COVID-19. Sposób ten zapewnia nowe narzędzie w ochronie populacji przed chorobą COVID-19.
Choroba COVID-19, wywoływana przez wirusa SARS-COV2 zebrała ogromne żniwo podczas pandemii w latach 2019-2021 z uwagi na niedostateczną liczbę stanowisk intensywnej opieki medycznej, brak możliwości skutecznego triażu, profilaktyki pierwotnej i odpowiednich leków.
W związku z tym, sposoby identyfikacji pacjentów o zwiększonej podatności na rozwinięcie infekcji wywołanej koronawirusem i sposoby diagnozy takich infekcji są przedmiotem dużego zainteresowania w dziedzinie, np. publikacja WO2022120130 A1 (Regeneron Pharmaceuticals Inc., US). W publikacji Pairo-Castineira, E. i in., „Genetic mechanisms of critical illness in COVID-19”, Nature (2021): 591(7848): 92-98, rozważa się wstępnie warianty genetyczne gospodarza związane z ciężkim przebiegiem COVID-19 do zastosowania w terapii, jednak badania te wymagają kontynuacji. Podobnie, w publikacji Ferreira, L.C. i in., „Genome-wide association studies of COVID-19: Connecting the dots”, Infection, Genetics and Evolution 106 (2022) 105379, podjęto próbę identyfikacji wariantów genetycznych związanych z podatnością na zakażenie COVID-19.
Obecnie dostępność profilaktyki pierwotnej w postaci szczepień ochronnych pozwala na redukcję liczby zachorowań i ich ciężkości, jednak dodatkowe narządzie oceniające indywidualną, genetyczną podatność osób na ciężki przebieg choroby może być pomocne na etapie triażu chorych objawowych, a także może być narzędziem pomocnym w typowaniu osób, które powinny być objęte ściślejszym nadzorem epidemiologicznym w postaci częstszych, regularnych szczepień.
Celem wynalazku jest zapewnienie sposobu nadającego się do badania predyspozycji do ciężkiego przebiegu COVID-19, w szczególności identyfikowania osób należących do grupy podwyższonego ryzyka ciężkiego przebiegu COVID-19.
Jako pacjenta do grupy podwyższonego ryzyka ciężkiego przebiegu COVID-19 uznaje się osobę, u której występuje co najmniej około 1,5-2-krotnie wyższe ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19 niż stwierdzone w populacji generalnej. U takich osób wskazane jest rygorystyczne stosowanie profilaktyki pierwotnej: szczepień ochronnych i zaleceń przeciwepidemicznych Ministerstwa Zdrowia.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta, charakteryzujący się tym, że w próbce DNA pobranej od pacjenta określa się układ alleli w locus rs143334143 oraz w locus rs74956615, przy czym:
- w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli GG w locus rs143334143 oraz układu alleli AT lub AA w locus rs74956615, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje podwyższone ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19,
- w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli AA lub AG w locus rs143334143 oraz układu alleli TT w locus rs74956615, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje obniżone ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19, natomiast
- w przypadku stwierdzenia występowania jednego z pozostałych układów uznaje się, że u badanego pacjenta występuje średnie populacyjne ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19.
Szczegółowy opis wynalazku
Przeprowadzono badania profili genetycznych pacjentów należących do rasy kaukaskiej, u których stwierdzono różny przebieg COVID-19. W badaniu uczestniczyły następujące grupy pacjentów, u których stwierdzono różny przebieg COVID-19: grupa osób, które ciężko przechodziły chorobę COVID-19, tj. wymagała hospitalizacji, grupa osób, które przechodziły zakażenie w sposób objawowy, ale nie wymagający hospitalizacji, bezobjawowy lub nie zaraziły mimo przebywania z osobą chorującą. W badaniu uczestniczyło łącznie 340 pacjentów. DNA pozyskiwano z krwi obwodowej i wykonywano pełne sekwencjonowanie całogenomowe WGS.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że w przypadku niektórych układów polimorfizmów w locus rs143334143 i rs74956615 obserwuje się statystycznie istotną korelację z odmiennym przebiegiem COVID-19 niż obserwowany w populacji generalnej. Obserwacje te zostały podsumowane w tabeli 1 poniżej.
PL 248077 Β1
Tabela 1
Wyniki badań związku pomiędzy różnymi układami alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615 a przebiegiem COVID-19, w szczególności ryzykiem ciężkiego przebiegu COVID-19
| rs14333411 | rs7495661 | Ryzyko ciężkiego przebiegu COVID- | Ryzyko genetyczne (hazard ratio) | % populacji polskiej |
| GG | AA | Podwyższone | >1,4 | 0,0865% |
| GG | AT | Podwyższone | >1,4 | 5,882% |
| GG | TT | Populacyjne | 1 | 80,445% |
| GA | AA | Populacyjne | 1 | 0,013% |
| GA | AT | Populacyjne | 1 | 0,884% |
| GA | TT | Obniżone | <0,63 | 12,09% |
| AA | AA | Populacyjne | 1 | 0,0005% |
| AA | AT | Populacyjne | 1 | 0,034% |
| AA | TT | Obniżone | <0,63 | 0,465% |
Nieoczekiwanie stwierdzono, że w przypadku nosicieli układu alleli GG w locus rs143334143 oraz układu alleli AT lub AA w locus rs74956615 występuje podwyższone ryzyko ciężkiego przebiegu infekcji wirusem SARS-CoV-2 (HR>=1,4).
Jednocześnie, nieoczekiwanie stwierdzono, że przypadku nosicieli układu alleli AA lub AG w locus rs143334143 oraz układu alleli TT w rs74956615 występuje obniżone (HR<1) ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19.
Również nieoczekiwanie stwierdzono, że w przypadku pozostałych układów alleli ryzyko należy traktować jako populacyjne.
Powyższych obserwacji nie należy stosować w stosunku do populacji ras innych niż kaukaska z uwagi na bardzo rzadkie występowanie w rs74956615 allelu A.
Następnie, w celu umożliwienia łatwego badania układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615, zaprojektowano zestaw starterów i sond pozwalających na identyfikację i amplifikację regionów flankujących polimorfizmy rs143334143 i rs74956615 metodą POR w czasie rzeczywistym (qPCR).
Uzyskany test pozwala na przeprowadzenie genotypowania metodą POR, zwłaszcza w czasie rzeczywistym (qPCR), w co najwyżej dwóch zamkniętych probówkach z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanych sond molekularnych typu TaqMan. W przykładzie wykonania wynalazku, sondy TaqMan zostały optymalnie wyznakowane dwoma różnymi uniwersalnymi barwnikami fluorescencyjnymi o odmiennych spektrach emisji światła fluorescencyjnego, co umożliwia wykonywanie testów w większości dostępnych na rynku aparatów do reakcji POR, a nie tylko w urządzeniach przeznaczonych do testu danego producenta. Korzystne jest zastosowanie sond typu MGB o zwiększonym powinowactwie do DNA, które wyklucza ryzyko błędu genotypowania, zwiększając jednocześnie specyficzną emisję światła przez sondę.
W korzystnym przykładzie realizacji, sposób jest oparty na stosowaniu technologii genotypowania w punkcie końcowym metodą qPCR (ang. endpoint genotyping) dwóch polimorfizmów o znamiennym wpływie na odporność populacyjną na COVID-19: rs143334143 oraz rs74956615. Do rozróżnienia alleli używane są dwie sondy typu TaqMan MGB w reakcji multipleks. Jedna sonda jest komplementarna w pełni do sekwencji allelu wariantu częstego (A), druga do sekwencji wariantu rzadkiego (B). Każda sonda jest wyznakowana na końcu 5' odróżniającym fluorochromem - w realizacji wynalazku jest to FAM lub VIC oraz na końcu 3’ wygaszaczem, przykładowo NFQ. W fazie wydłużania reakcji PCR idealnie dopasowana sonda jest rozcinana przez polimerazę DNA Taq, która ma aktywność 5' >3' egzonukleazy. Uwalniany jest fluorochrom, co powoduje emisję fluorescencji. Sonda, która nie jest idealnie dopasowana, w niewielkim jedynie stopniu zostanie rozcięta przez polimerazę. Z tego względu fluorochrom zostanie uwolniony w dużo mniejszym stopniu.
Wygenerowany sygnał fluorescencyjny (VIC lub FAM) jest odczytywany w ostatnim cyklu reakcji PCR (punkt końcowy) i bezpośrednio wskazuje na układ alleli (AA, AB, BB) bez konieczności wykonywania długich i pracochłonnych etapów po reakcji PCR, które zwiększają ryzyko kontaminacji.
Technologia genotypowania w punkcie końcowym metodą qPCR cechuje się prostotą użycia i łatwością interpretacji uzyskanych wyników, dużą przepustowością (do 192 próbek jednoczasowo), możliwością wykonania przy pomocy ogólnie dostępnych urządzeń laboratoryjnych (termocykler qPCR) na różnej jakości DNA pobranym zarówno z wymazu, jak i z krwi obwodowej. Wykonanie testu dla obu polimorfizmów odbywa się w tych samych warunkach reakcji i może być przeprowadzone jednoczasowo, co jest ważne przy zastosowaniu testu skriningowo na dużych populacjach.
Przedmiot wynalazku w przykładzie wykonania uwidoczniono na Fig. 1 i 2, gdzie przedstawiono wyniki uzyskane w przykładzie realizacji testu z wykorzystaniem reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla polimorfizmu rs143334143, z zastosowaniem próbki kontrolnej homozygotycznej GG, próbki kontrolnej heterozygotycznej GA, próbki kontrolnej homozygotycznej AA oraz próbki bez matrycy (NTC). Zastosowano kanały detekcji 465 nm oraz 540 nm. Na Fig. 1 pokazano kinetykę reakcji PCR z różnicami w profilach fluorescencji dla zastosowanych sond, natomiast na Fig. 2 przedstawiono interpretację danych pochodzących ze stosunku poziomu fluorescencji dla obu sond, które są wyznacznikiem danego genotypu.
Przedmiot wynalazku w przykładzie wykonania uwidoczniono na Fig. 3 i 4, gdzie przedstawiono wyniki uzyskane w przykładzie realizacji testu z wykorzystaniem reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla polimorfizmu rs74956615, z zastosowaniem próbki kontrolnej homozygotycznej TT, próbki kontrolnej heterozygotycznej TA, próbki kontrolnej homozygotycznej AA oraz próbki bez matrycy (NTC). Zastosowano kanały detekcji 465 nm oraz 540 nm. Na Fig. 3 pokazano kinetykę reakcji PCR z różnicami w profilach fluorescencji dla zastosowanych sond, natomiast na Fig. 4 przedstawiono interpretację danych pochodzących ze stosunku poziomu fluorescencji dla obu sond, które są wyznacznikiem danego genotypu.
Poniżej podano przykład realizacji wynalazku.
Przykład realizacji wynalazku
W niniejszej realizacji wykonywanie genotypowania dla polimorfizmu rs143334143 i rs74956615 w testowej próbce od probanta wobec próbek kontrolnych zawierających każdy z 3 genotypów oraz kontroli bez matrycy (NTC) odbywa się według poniższego protokołu.
DNA od probantów został wyizolowany z krwi obwodowej, wymazu z nabłonka jamy ustnej lub zestawu opartego na ślinie (spit, kit), z zastrzeżeniem otrzymania minimalnie 50 ng genomowego DNA.
Do każdorazowego oznaczenia korzystnie stosowano po 3 próbki kontrolne dla poszczególnych genotypów i jedną próbkę bez matrycy (NTC). W niniejszej realizacji, próbki kontrolne genotypów korzystnie wskazują na poprawność przeprowadzonej reakcji (prawidłowe działanie odczynników, poprawny profil termiczny urządzenia, brak inhibicji reakcji). Próbka kontrolna NTC pozwala na weryfikację czy w trakcie przygotowywania reakcji amplifikacji nie doszło do kontaminacji eluatu odczynników materiałem biologicznym pochodzenia ludzkiego lub zamplifikowanym produktem PCR. Jeśli dla próbki kontrolnej NTC zostanie wykryty sygnał pozytywny w przynajmniej jednym z dwóch kanałów detekcji, oznacza to, iż doszło do zanieczyszczenia odczynników.
1. Sekwencje zastosowanych starterów, sond i kontroli według wynalazku:
a) sekwencje oligonukleotydowe startera dla polimorfizmu rs143334143: sekwencje nr id. 1 i 2,
b) sekwencje oligonukleotydowe startera dla polimorfizmu rs74956615: sekwencja nr id. 3 i 4,
c) sekwencje oligonukleotydowe sond: sekwencja nr id. 5, 6, 7, 8.
2. Zastosowane stężenia starterów i sond według wynalazku:
PL 248077 Β1
a) Stężenia końcowe koncentratu starterów i sond dla polimorfizmu rs143334143: 100 μΜ
b) Stężenia końcowe koncentratu starterów i sond dla polimorfizmu rs74956615: 100 pM
Przygotowano odpowiednie ilości starterów i sond w podanych wyżej stężeniach. Wszystkie składniki przed przygotowaniem mieszaniny worteksowano i żwirowano. Następnie przygotowano mieszaniny koncentratów sond i starterów i podzielono na porcje o odpowiednich ilościach do probówek.
3. Zastosowane kontrole dodatnie według wynalazku
a) Kontrole dodatnie dla polimorfizmu rs143334143:
| Kontrola | Oznaczenie | Genotyp |
| K1A | rs143334143 | GG |
| K1B | rs143334143 | GA |
| K1C | rs143334143 | AA |
b) Kontrole dodatnie dla polimorfizmu rs74956615:
| Kontrola | Oznaczenie | Genotyp |
| K2A | rs74956615 | | I |
| K2B | rs74956615 | TA |
| K2C | rs74956615 | AA |
4. Opis zestawu do genotypowania
Mastermix wykorzystany w teście zawiera polimerazę Taq blokowaną przeciwciałem monoklonalnym oraz inne składniki wymagane w reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Mastermix jest stabilny w temperaturze 4 stopni C, co czyni go łatwym w transporcie i przechowywaniu przed użyciem. W skład zestawu wchodzą również: 2 mieszaniny sond i starterów, • 2 zestawy po 3 dodatnie próbki kontrolne dla poszczególnych genotypów • woda dejonizowana do PCR.
Wszystkie składniki testu należy przechowywać w +4°C w ciemnym miejscu do czasu pierwszego użycia. Po rozcieńczeniu koncentratów starterów należy je przenieść do temperatury -20°C. Transport odczynników odbywa się +4°C, co redukuje koszt dostawy, eliminując konieczność mrożenia zestawu.
5. Protokół testu:
a) Przygotowanie próbek DNA • Stężenie DNA do testu powinno być w zakresie 5-50 ng/pl.
• W przypadku próbek bardziej stężonych należy rozcieńczyć je wodą (załączona w zestawie) do stężenia 5-50 ng/pl.
b) Przygotowanie odczynników • Przed pierwszym użyciem testu do odczynnika PC1 i PC2 dodać po 247,5 pl wody DEPC (w zestawie), w celu otrzymania stężeń roboczych.
• Reagenty dokładnie zmieszać poprzez pipetowanie lub worteksowanie.
• Po wymieszaniu, odczynniki żwirować krótko, by zapobiec osadzeniu się kropli na zakrętce lub ściankach.
c) Przygotowanie reakcji PCR • Badanie składa się z 2 reakcji PCR, osobno z użyciem odczynników MX, PC1, K1A, K1B, K1C (oznaczenie rs143334143) oraz osobno odczynników MX, PC2, K2A, K2B, K2C (oznaczenie rs74956615).
Sposób przygotowania reakcji:
| Reagent | Reakcja 1 | Reakcja 2 |
| MX | 10 μΙ | 10 μΙ |
PL 248077 Β1
| PC1 | 5 pl | - |
| PC2 | - | 5 μΙ |
| K1A, K1B, K1C lub próbka badana | 5 pl | - |
| K2A, K2B, K2C lub próbka badana | - | 5 μΙ |
| Objętość końcowa | 20 μΙ | 20 μΙ |
Przygotowane reakcje, pipetowane na płytkę 96-dołkową wstawić do termocyklera PCR. Możliwe jest wykonanie wspólnej reakcji dla obu mieszanin 1 i 2 na jednej płytce reakcyjnej, pod warunkiem przygotowania do 48 reakcji.
Profil reakcji PCR jest identyczny dla obu polimorfizmów:
| Tryb | Temp. | Czas | Liczba cykli | Pomiar fluorescencji |
| Aktywacja polimerazy | 95 | 5 minut | 1 | Brak |
| Denaturacja | 95 | 15 sekund | 45 | Brak |
| Annealing elongacja | 59 | 60 sekund | FAM, VIC/HEX (nieobligatoryjnie) | |
| Genotypowanie | 37 | 30 sekund | 1 | FAM, VIC/HEX |
6. Oznaczenie genotypów • Oznaczenie genotypów dla każdego z polimorfizmów następuje na podstawie 3 kontroli reakcji o określonych genotypach, dołączonych do zestawu.
• Kontrole należy każdorazowo uwzględniać w oznaczeniu, podobnie jak kontrolę bez matrycy (NTC). Kontrole te wyznaczają klastry, wokół których grupować się będą sygnały dla prób badanych.
Genotypy w kontrolach reakcji przedstawiono w poniższej tabeli.
| Kontrola | Oznaczenie | Genotyp |
| K1A | rs 143334143 | GG |
| K1B | rs 143334143 | GA |
| K1C | rs 143334143 | AA |
| K2A | rs74956615 | TT |
| K2B | rs74956615 | TA |
| K2C | rs74956615 | AA |
7. Oznaczenie genotypów dla polimorfizmu rs143334143
Homozygoty allelu dominującego (GG) oraz kontrola K1A grupują się w lewym górnym rogu (kolor zielony), heterozygoty (GA) oraz kontrola K1B pośrodku wykresu (kolor czerwony), homozygoty allelu rzadszego (AA) oraz kontrola K1C po prawej u dołu (kolor niebieski). Reakcje bez matrycy lub z niedostateczną ilością DNA grupują się w blisko lewego dolnego rogu (Figura 2).
8. Oznaczenie genotypów dla polimorfizmu rs74956615
Homozygoty allelu dominującego (TT) oraz kontrola K2A grupują się w lewym górnym rogu (kolor zielony), heterozygoty (TA) oraz kontrola K2B pośrodku wykresu (kolor czerwony), homozygoty allelu rzadszego (AA) oraz kontrola K2C po prawej u dołu (kolor niebieski). Reakcje bez matrycy lub z niedostateczną ilością DNA grupują się w blisko lewego dolnego rogu (Figura 4).
9. Interpretacja wyników testu
Uznaje się, że test został przeprowadzony poprawnie, gdy:
• kontrola bez matrycy nie wykazuje amplifikacji PCR oraz • wszystkie próbki kontrolne (K1A, K1B, K1C, K2A, K2B, K2C) wskazują poprawny genotyp zgodny z ulotką testu oraz • wyniki dla próbki badanej można przyporządkować do jednego z 3 genotypów opisanych w p. 7-8.
W przypadku niejednoznacznego wyniku testu musi być on wykonany ponownie z zastosowaniem nowej próbki DNA.
W celu ustalenia poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu COVID-19 należy skorzystać z korelacji ujawnionych w tabeli 1.
W szczególności, w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli GG w locus rs143334143 oraz układu alleli AT lub AA w locus rs74956615 uznaje się, że u badanego pacjenta występuje podwyższone ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19. Natomiast w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli AA lub AG w locus rs143334143 oraz układu alleli TT w locus rs74956615 uznaje się, że u badanego pacjenta występuje obniżone ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19.
Ponadto, w przypadku stwierdzenia występowania jednego z pozostałych układów uznaje się, że u badanego pacjenta występuje średnie populacyjne ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19.
Niniejszy przykład wykonania nie jest przykładem ograniczającym zakres wynalazku. Test został zwalidowany dla termocyklerów: Roche LightCycler480, Cobas Z480 oraz Bio-Rad CFX96.
Po zaprojektowaniu testu i opracowaniu warunków reakcji qPCR skuteczność testu potwierdzono w badaniu walidacyjnym na 50 próbkach DNA. Genotypowanie w punkcie końcowym metodą qPCR wykonano na uprzednio zsekwencjonowanych próbkach klinicznych, wcześniej przebadanych metodą sekwencjonowania całogenomowego WGS, uzyskując 100% zgodność genotypów z metodą ortogonalną.
PL 248077 Β1
Wykaz sekwencji
Sekwencja nr id. 1
Opis startera: rs143334143_F
Sekwencja: 5-CGGGCCTTGAAGGAATCAGA-3’
Sekwencja nr id. 2
Opis startera: rs143334143_R
Sekwencja: 5’-CCTCCCGTGAAGATACAGAGACT-3’
Sekwencja nr id. 3
Opis startera: rs74956615_F
Sekwencja: 5’-GGCGAAACCCTGTCTCTACT-3’
Sekwencja nr id. 4
Opis startera: rs74956615_R
Sekwencja: 5’-CCCTTGTTTTCTCCCAGTTCC-3’
Sekwencja nr id. 5
Opis sondy: rs143334143_A
Sekwencja: 5'-VIC-AAGTCAGTTGTCAAAGTT-NFQ-3'
Sekwencja nr id. 6
Opis sondy: rs143334143_B
Sekwencja: 5’-6FAM-AGTCAGTTGACAAAGTT-NFQ-3’
Sekwencja nr id. 7
Opis sondy: rs74956615_A
Sekwencja: 5’-VIC-TGAGCTGAGACTGTGCCATT-NFQ-3’
Sekwencja nr id. 8
Opis sondy: rs74956615_B
Sekwencja: 5'-6FAM-TGAGCCGAGACTGTGCCATT-NFQ-3'
Claims (1)
- Zastrzeżenie patentowe1. Sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta, znamienny tym, że w próbce DNA pobranej od pacjenta określa się układ alleli w locus rs143334143 oraz w locus rs74956615, przy czym:- w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli GG w locus rs143334143 oraz układu alleli AT lub AA w locus rs74956615, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje podwyższone ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19,- w przypadku stwierdzenia występowania układu alleli AA lub AG w locus rs143334143 oraz układu alleli TT w locus rs74956615, uznaje się, że u badanego pacjenta występuje obniżone ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19, natomiast- w przypadku stwierdzenia występowania jednego z pozostałych układów uznaje się, że u badanego pacjenta występuje średnie populacyjne ryzyko ciężkiego przebiegu COVID-19.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL446346A PL248077B1 (pl) | 2023-10-10 | 2023-10-10 | Sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta |
| PCT/PL2024/050073 WO2025080149A1 (en) | 2023-10-10 | 2024-10-10 | Method for determining the level of risk of severe covid-19 disease in a patient |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL446346A PL248077B1 (pl) | 2023-10-10 | 2023-10-10 | Sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL446346A1 PL446346A1 (pl) | 2024-07-29 |
| PL248077B1 true PL248077B1 (pl) | 2025-10-13 |
Family
ID=91971279
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL446346A PL248077B1 (pl) | 2023-10-10 | 2023-10-10 | Sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL248077B1 (pl) |
| WO (1) | WO2025080149A1 (pl) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022120130A1 (en) * | 2020-12-03 | 2022-06-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying subjects having an increased risk of developing a coronavirus infection and treatment thereof |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4158067A4 (en) * | 2020-05-27 | 2024-09-25 | Genetic Technologies Limited | Methods of assessing risk of developing a severe response to coronavirus infection |
-
2023
- 2023-10-10 PL PL446346A patent/PL248077B1/pl unknown
-
2024
- 2024-10-10 WO PCT/PL2024/050073 patent/WO2025080149A1/en active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022120130A1 (en) * | 2020-12-03 | 2022-06-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying subjects having an increased risk of developing a coronavirus infection and treatment thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FERREIRA, L.C. I IN.: "Genetics and Evolution 106 (2022) 105379", "GENOME-WIDE ASSOCIATION STUDIES OF COVID-19: CONNECTING THE DOTS" * |
| PAIRO-CASTINEIRA, E. I IN.: "Nature (2021): 591(7848): 92-98", "GENETIC MECHANISMS OF CRITICAL ILLNESS IN COVID-19" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2025080149A1 (en) | 2025-04-17 |
| PL446346A1 (pl) | 2024-07-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| de Kok et al. | Rapid genotyping of single nucleotide polymorphisms using novel minor groove binding DNA oligonucleotides (MGB probes) | |
| US6177249B1 (en) | Method for nucleic acid analysis using fluorescence resonance energy transfer | |
| Old et al. | Fetal DNA analysis | |
| EP1229128A1 (en) | New method for genotype determination | |
| US20140134613A1 (en) | Direct Molecular Diagnosis of Fetal Aneuploidy | |
| US11542556B2 (en) | Single nucleotide polymorphism in HLA-B*15:02 and use thereof | |
| WO2014181107A9 (en) | Genetic method of aiding the diagnosis and treatment of familial hypercholesterolaemia | |
| JP2015510756A (ja) | 自閉症のリスクを評価するため遺伝子型決定テスト | |
| Hayes et al. | Arab population data on the PCR-based loci: HLA-DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8, Gc, and D1S80 | |
| Sjöroos et al. | Time‐resolved fluorometry based sandwich hybridisation assay for HLA‐DQA1 typing | |
| US20220389488A1 (en) | Multiplexed genotyping assays with a single probe using fluorescent amplitude tuning | |
| PL248077B1 (pl) | Sposób określania poziomu ryzyka ciężkiego przebiegu choroby COVID-19 u pacjenta | |
| PL249351B1 (pl) | Zestaw i sposób do określania metodą łańcuchowej reakcji polimerazy układu alleli w locus rs143334143 oraz rs74956615 | |
| Sebastian et al. | Integrated amplification microarray system in a lateral flow cell for warfarin genotyping from saliva | |
| Huang et al. | Rapid identification of aminoglycoside-induced deafness gene mutations using multiplex real-time polymerase chain reaction | |
| Schneider et al. | PCR typing of the human HLA-DQA locus: population genetics and application in forensic casework | |
| EP1964929B1 (en) | Hla-b genotyping method and kit based on real-time pcr | |
| CN104789673A (zh) | rs1800818在检测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征中的应用 | |
| Nagy | Application of real-time polymerase chain reaction in the clinical genetic practice | |
| Kho et al. | Specific and straightforward molecular investigation of β-thalassemia mutations in the Malaysian Malays and Chinese using direct TaqMan genotyping assays | |
| Lizanecz et al. | Mistyping of angiotensinogen M235T alleles | |
| RU2352641C1 (ru) | Способ диагностики наследственной предрасположенности к тромбофилии | |
| Upanan et al. | Accuracy of hemoglobin E screening test using allelic discrimination assay | |
| Gaafar et al. | Rapid screening of β-Globin gene mutations by Real-Time PCR in Egyptian thalassemic children | |
| Chantarangsu et al. | Comparison of the TaqMan and LightCycler systems in evaluation of CYP2B6 516G> T polymorphism |