PL248416B1 - Nowe analogi kapu końca 5’ mRNA, cząsteczka RNA je zawierająca, ich zastosowania i sposób syntezy cząsteczki RNA i peptydu - Google Patents

Nowe analogi kapu końca 5’ mRNA, cząsteczka RNA je zawierająca, ich zastosowania i sposób syntezy cząsteczki RNA i peptydu

Info

Publication number
PL248416B1
PL248416B1 PL432883A PL43288320A PL248416B1 PL 248416 B1 PL248416 B1 PL 248416B1 PL 432883 A PL432883 A PL 432883A PL 43288320 A PL43288320 A PL 43288320A PL 248416 B1 PL248416 B1 PL 248416B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
rna molecule
compound
rna
mrna
group
Prior art date
Application number
PL432883A
Other languages
English (en)
Other versions
PL432883A1 (pl
Inventor
Marcin WARMIŃSKI
Marcin Warmiński
Paweł SIKORSKI
Paweł Sikorski
Joanna Kowalska
Jacek Jemielity
Original Assignee
Explorna Therapeutics Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Univ Warszawski
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Explorna Therapeutics Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia, Univ Warszawski filed Critical Explorna Therapeutics Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority to PL432883A priority Critical patent/PL248416B1/pl
Priority to US17/798,099 priority patent/US20230130423A1/en
Priority to KR1020227030072A priority patent/KR20220163359A/ko
Priority to PCT/PL2021/050007 priority patent/WO2021162567A1/en
Priority to CA3167570A priority patent/CA3167570A1/en
Priority to AU2021219563A priority patent/AU2021219563A1/en
Priority to JP2022548990A priority patent/JP7805938B2/ja
Priority to EP21754142.4A priority patent/EP4103577A4/en
Publication of PL432883A1 publication Critical patent/PL432883A1/pl
Priority to JP2025162162A priority patent/JP2026012182A/ja
Publication of PL248416B1 publication Critical patent/PL248416B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Wynalazek dotyczy nowych analogów kapu końca 5' mRNA, cząsteczek RNA je zawierających, ich zastosowań i sposobów ich syntezy in vitro, jak również sposobu syntezy białka lub peptydu in vitro lub w hodowlach komórkowych, który to sposób obejmuje translację cząsteczki RNA.

Description

Opis wynalazku
Dziedzina techniki
Wynalazek ten odnosi się do nowych analogów kapu końca 5’ mRNA, cząsteczek RNA je zawierających, ich zastosowań i sposobów ich syntezy in vitro, jak również sposobu syntezy białka lub peptydu in vitro lub w hodowlach komórkowych, który to sposób obejmuje translację cząsteczki RNA.
STAN TECHNIKI
Kap 7-metyloguanozynowy (m7G) obecny na 5’ końcu eukariotycznego mRNA odgrywa istotną rolę w licznych fundamentalnych procesach komórkowych, głównie poprzez chronienie mRNA przed przedwczesną degradacją oraz poprzez służenie jako znacznik molekularny dla białek uczestniczących w transporcie i translacji mRNA.[1] Dlatego też chemiczne modyfikacje 5’ kapu torują drogę projektowaniu molekularnych narzędzi do selektywnego modulowania procesów zależnych od kapu i w konsekwencji metabolizmu mRNA.2 Obecność 5’ kapu jest potrzebna do nadzoru mRNA i jego efektywnej translacji w normalnych warunkach. Chemicznie syntetyzowane analogi kapu mRNA typu m7GpppG są używane jako reagenty do transkrypcji in vitro kapowanych mRNA.[3]
In vitro transkrybowane (IVT) 5’-kapowane mRNA to użyteczne narzędzia do badań translacji, transportu i obróbki mRNA i są wyłaniającą się klasą obiecujących cząsteczek terapeutycznych. IVT mRNA znajduje zastosowanie w ekspresji białek w komórkach eukariotycznych, ekstraktach, hodowlach komórkowych, a nawet w całych organizmach. Wreszcie, IVT RNA zwróciło ostatnio dużą uwagę jako narzędzie do bezpiecznego egzogennego dostarczania białek dla celów szczepionek antynowotworowych i terapii z zastępowaniem genu.[4]
Synteza 5’-kapowanych mRNA z użyciem analogów kapu może być osiągnięta metodą transkrypcji in vitro.3 W metodzie tej, nazywanej ko-transkrypcyjnym kapowaniem, syntezę RNA przeprowadza polimeraza RNA na matrycy DNA w obecności wszystkich 4 5’-trifosforanów rybonukleozydów (tzw. NTP-ów: ATP, GTP, CTP, UTP) oraz dinukleotydowego kapu, takiego jak m7GpppG. Matryca DNA jest tak zaprojektowana, aby pierwszym transkrybowanym nukleotydem było G. Polimeraza inicjuje transkrypcję z udziałem GTP lub m7GpppG, wbudowując tym samym jeden z nukleotydów na 5’ końcu powstającego RNA. Aby zwiększyć odsetek inkorporacji analogu kapu (wydajność kapowania), stężenie GTP jest zmniejszone w stosunku do innych NTP-ów, a stężenie dinukleotydowego kapu jest zwiększone (4-10-krotny nadmiar w stosunku do GTP). Niestety, nawet przy zastosowaniu wysokiego nadmiaru dinukleotydowego kapu w stosunku do GTP wydajność kapowania jest mniejsza niż 100% i rzadko przekracza 90%. Niekapowane mRNA są znacznie mniej stabilne i aktywne translacyjnie niż kapowane mRNA, a co więcej mogą prowadzić do wywołania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej w komórkach prowadzącej do zmniejszenia wydajności translacji również dla kapowanych mRNA[11]. Sposobem na usunięcie niekapowanych mRNA jest potraktowanie mieszaniny po-transkrypcyjnej odpowiednimi enzymami (np. mieszaniną 5’-polifosforatazy i 5’-nukleazy), które degradują niekapowane RNA a kapowane mRNA pozostawiają w formie nienaruszonej. Kolejnym ograniczeniem metody kapowania mRNA z wykorzystaniem dinukleotydów jest fakt, że dinukleotydowy kap może zostać odwrotnie wbudowany, prowadząc do frakcji ‘Gpppm7G-kapowanych’ RNA, które są nieaktywne translacyjnie. Ten problem rozwiązało odkrycie ‘anti-reverse cap analogs’ (ARCAs; anty-odwrotne analogi kapu), które są modyfikowane w pozycjach 2’- lub 3’- 7-metyloguanozyny (zazwyczaj poprzez zastąpienie jednej z grup OH grupą OCH3), aby zablokować odwrotne wbudowywanie.[5 6]
Pokazano już, że metoda ko-transkrypcyjnego kapowania umożliwia wbudowanie różnych modyfikowanych struktur kapu na końcu 5’ mRNA. Te modyfikowane struktury kapu mogą być nośnikami molekularnych znaczników lub nadawać cząsteczkom mRNA nowe właściwości, takie jak zwiększona wydajność translacji i stabilność. Szczególnie korzystne analogi kapu są wśród tych modyfikowanych w mostku trifosforanowym.[7] Wykazano, że podstawienie nawet jednego atomu w 5’,5’-trifosforanowym mostku może znacząco wpływać na właściwości mRNA. Przykładowo, podstawienie pojedynczego atomu w pozycji β mostka oligofosforanowego kapu, przedstawiane jako tzw. β-S-ARCA, spowodowało znaczący wzrost wydajności translacji mRNA in vitro i in vivo,[8’9] podczas gdy podstawienie pojedynczego atomu O grupą CH2 w pozycji α-β skutkowało zmniejszeniem wydajności translacji.[10] Te dramatycznie różne biologiczne efekty różnych podstawień pojedynczych atomów w obrębie kapu wskazują na wysoką czułość maszynerii translacyjnej na modyfikacje łańcucha oligofosforowego i sugerują, że jest to ważny obszar do dalszej eksploracji.
Celem wynalazku jest dostarczenie nowych analogów kapu końca 5’ mRNA, które będą pozwalały na otrzymywanie wyższego poziomu transkrypcji kapowanego nimi mRNA oraz wyższego poziomu
PL 248416 Β1 ekspresji białek kodowanych przez takie mRNA niż uzyskiwane za pomocą znanych ze stanu techniki analogów kapu końca 5’ mRNA. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie nowych analogów kapu końca 5’ mRNA, które będą pozwalały na łatwe oddzielenie kapowanych i niekapowanych mRNA znajdujących się w mieszaninie reakcyjnej in vitro bez konieczności stosowania enzymów. Właściwości te zostały uzyskane dzięki wprowadzeniu hydrofobowego podstawnika w pozycję N6-adenozyny znajdującej się w trinukleotydowym analogu kapu. Modyfikacja ta powoduje znaczącą zmianę migracji kapowanych mRNA na kolumnach chromatograficznych z wypełnieniem typu odwrócona faza co umożliwia oddzielenie mRNA kapowanych od niekapowanych. Niezależnie modyfikacja ta powoduje zwiększenie wydajności ekspresji mRNA w komórkach eukariotycznych. Co więcej, modyfikacja ta nie stoi na przeszkodzie do wprowadzenia innych, wcześniej zidentyfikowanych modyfikacji kapu poprawiających właściwości mRNA, takich jak modyfikacje mostka trifosforanowego lub naturalne epigenetyczne modyfikacje w postaci metylacji pozycji 2’-O pierwszego lub drugiego transkrybowanego nukleotydu, może więc być stosowana łącznie z nimi.
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze:
w którym:
R-i, R2, Rs, R4 są wybrane z grupy o składzie: H, CH3, alkil o liczbie atomów węgla od 2 do 10, przy czym podstawniki R o różnych numerach mogą być takie same lub różne, n wynosi 0 lub 1,
Zasadai i Zasada2 są wybrane z grupy obejmującej:
przy czym R5 jest wybrane z grupy z grupy obejmującej: benzyl, chlorobenzyl, fluorobenzyl, bromobenzyl, jodobenzyl, metylobenzyl, alikobenzyl, nitrobenzyl, karboksybenzyl, azydobenzyl, aminobenzyl, hydroksybenzyl, przy czym w każdym przypadku benzyl może być orto-, meta- lub para- podstawiony, (1-naftylometyl), (2-naftylometyl),
Χ1, Χ3 są wybrane z grupy obejmującej: O, S, Se,
Χ2, Χ4, Χ5 są wybrane z grupy obejmującej: O, S, Se, BH3,
Χθ jest wybrane z grupy obejmującej: O, CH2, CF2, CCI2,
PL 248416 Β1 przy czym podstawniki X o różnych numerach mogą być takie same lub różne, korzystnie R5 jest benzylem lub podstawionym benzylem, Χ1, Χ2, Χ3, Χ4, Χ5, Χθ są O, a R3, R4 są H. Korzystnie, związek ten został wybrany z grupy obejmującej:
związek rn7Gpppbn6AmpG o wzorze:
OH OH związek rn7Gppsbn6AmpG o wzorze:
OH OH
Korzystnie, związek ten składa się zasadniczo z pojedynczego stereoizomeru lub zawiera mieszaninę przynajmniej dwóch stereoizomerów, pierwszego diastereiozmeru i drugiego diastereoizomeru, przy czym diastereoizomery te są identyczne z wyjątkiem tego, że posiadają różne konfiguracje stereochemiczne wokół stereogenicznego atomu fosforu, przy czym rzeczony stereogeniczny atom fosforu jest związany z atomem siarki, selenu, lub grupą boranową.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest cząsteczka RNA, która na 5’ końcu zawiera związek według wynalazku określony powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy in vitro cząsteczki RNA według wynalazku określonej powyżej, przy czym sposób ten obejmuje reagowanie ATP, CTP, UTP i GTP, związku według wynalazku określonego powyżej oraz matrycy polinukleotydowej w obecności polimerazy RNA, w warunkach umożliwiających transkrypcję przez polimerazę RNA kopii RNA na matrycy polinukleotydowej; przy czym niektóre z kopii RNA będą zawierały związek według wynalazku określony powyżej, z wytworzeniem cząsteczki RNA według wynalazku określonej powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy białka lub peptydu in vitro, przy czym wymieniony sposób obejmuje translację cząsteczki RNA według wynalazku określonej powyżej, w bezkomórkowym systemie syntezy białek, przy czym cząsteczka RNA zawiera otwartą ramkę odczytu, w warunkach umożliwiających translację z otwartej ramki odczytu cząsteczki RNA białka lub peptydu kodowanego przez otwartą ramkę odczytu.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy białka lub peptydu in vitro, charakteryzujący się tym, że obejmuje wprowadzenie cząsteczki RNA według wynalazku określonej powyżej do komórki, przy czym cząsteczka RNA zawiera otwartą ramkę odczytu, w warunkach umożliwiających translację z otwartej ramki odczytu cząsteczki RNA z utworzeniem białka lub peptydu kodowanych przez tę otwartą ramkę odczytu.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania RNA według wynalazku określonej powyżej, przy czym cząsteczki mRNA zawierające związek według wynalazku określony powyżej są oddzielone od pozostałych cząsteczek RNA metodą chromatograficzną, korzystnie techniką HPLC w odwróconym układzie faz.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku według wynalazku określonego powyżej w syntezie in vitro cząsteczki RNA.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie cząsteczki RNA według wynalazku określonej powyżej w syntezie in vitro białka lub peptydu.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest związek według wynalazku określony powyżej lub cząsteczka RNA według wynalazku określona powyżej do stosowania w medycynie.
Nieoczekiwanie okazało się, że trój- lub czteronukleotydowe analogi kapu końca 5’ mRNA według wynalazku pozwalają na łatwe oczyszczanie mRNA poddanego transkrypcji in vitro poprzez ułatwienie rozdzielenia kapowanego nimi mRNA od niekapowanego mRNA dostępnymi metodami chromatograficznymi, zwłaszcza techniką HPLC w odwróconym układzie faz.
Równie nieoczekiwanie, wynalazek umożliwia wytwarzanie mRNA, które charakteryzują się znacznie wyższą wydajnością ekspresji białka niż mRNA uzyskane przy użyciu znanych analogów kapu końca 5’ mRNA.
Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia zostają niniejszym włączone jako referencje.
KRÓTKI OPIS FIGUR
Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:
Na Fig. 1 przedstawione zostało oczyszczanie mRNA otrzymanych z użyciem różnych analogów kapu metodą HPLC w odwróconych fazach.
Na Fig. 2 przedstawiona została ekspresja białka w komórkach 3T3-L1 uzyskana dla mRNA oczyszczanych na HPLC.
Na Fig. 3 przedstawiona została ekspresja białka w komórkach JAWSII uzyskana dla mRNA oczyszczanych na HPLC.
Termin „alkil’ odnosi się do nasyconego, liniowego, lub rozgałęzionego podstawnika węglowodorowego o wskazanej liczbie atomów węgla, wynoszącej korzystnie od 1 do 10 atomów węgla.
Przykładami podstawnika alkilowego są -metyl, -etyl, -n-propyl, -n-butyl, -n-pentyl, -n-heksyl, - n -heptyl, - n-oktyl, - n -nonyl, i - n-decyl. Reprezentatywne rozgałęzione -(C1-C10)alkile obejmują -izopropyl, -sec-butyl, -izobutyl, - tert-butyl, -izopentyl, -neopentyl, -1-metylobutyl, - 2-metylobutyl, -3-metylobutyl, -1,1-dimetylopropyl, -1,2-dimetylopropyl, -1-metylopentyl, -2-metylopentyl, -3-metylopentyl, -4-metylopentyl, -1-etylobutyl, -2-etylobutyl, -3-etylobutyl, -1,1-dimetylobutyl, -1,2-dimetylobutyl, -1,3-dimetylobutyl, -2,2-dimetylobutyl, -2,3-dimetylobutyl, -3,3-dimetylobutyl, -1-metyloheksyl, -2-metyloheksyl, -3-metyloheksyl, -4-metyloheksyl, -5-metyloheksyl, -1,2-dimetylopentyl, -1,3-dimetylopentyl, -1,2-dimetyloheksyl, -1,3-dimetyloheksyl, -3,3-dimetyloheksyl, -1,2-dimetyloheptyl, -1,3-dimetyloheptyl, i -3,3-dimetyloheptyl i tym podobne.
Termin „aryl odnosi się do się do nienasyconego, pierścieniowego, aromatycznego lub heteroaromatycznego (tj. zawierającego zamiast atomu węgla heteroatom) podstawnika węglowodorowego o wskazanej liczbie atomów węgla, wynoszącej korzystnie od 6 do 10 atomów węgla. Przykładami arylu są: fenyl, naftyl, antracyl, fenantryl.
Termin „aIkiloaryl” odnosi się do nienasyconego podstawnika węglowodorowego zbudowanego z połączonej ze sobą części alkilowej oraz arylowej (według powyższych definicji). Przykładami alkiloarylu są benzyl, fenyloetyl, fenylopropyl, naftylomethyl, neftyloetyl, itd.
Termin „ heteroatom ” oznacza atom wybrany z grupy tlen, siarka, azot, fosfor i inne.
Termin „ HPLC ” oznacza wysokosprawną chromatografię cieczową, a rozpuszczalniki oznaczone jako rozpuszczalniki dla „HPLC” oznaczają rozpuszczalniki o odpowiedniej czystości dla analizy HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography).
Termin „NMR” oznacza magnetyczny rezonans jądrowy (ang. Nuclear Magnetic Resonance).
SPOSOBY WYKONANIA WYNALAZKU
Poniższe przykłady umieszczono jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach. W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody stosowane w dziedzinie lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.
PRZYKŁADY
Trinukleotydowe analogi kapu zsyntezowano tak jak opisano to w Przykładach 1-4 łącząc metody syntezy na podłożu stałym i syntezy w roztworze, a następnie wydzielając z stosowaniem dwustopniowej procedury oczyszczania. Punktem wyjścia była synteza odpowiednio zmodyfikowanych dinukleotydów (pA*pG, gdzie A* oznacza adenozynę podstawioną w pozycji N6) na wysoko obsadzonym podłożu, stosując metodę amidofosforynową.[11] Odpowiednie amidofosforyny modyfikowane w pozycji N6-Adenozyny otrzymano poprzez N-alkilowanie handlowo dostępnego amidofosforynu adenozynowego w warunkach katalizy przeniesienia fazowego. Dinukleotydy odcięto od podłoża, odbezpieczono i wydzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej jako sole trietyloamoniowe odpowiednie do reakcji sprzęgania w obecności ZnCb. Dinukleotydy poddano reakcji sprzęgania z m7GDP-lm[12] uzyskując analogi typu m7GpppA*pG, gdzie oznacza modyfikowaną w pozycji N6-adenozynę. Synteza analogów β-tiofosforanowych wymagała przekształcenia pA*pG w odpowiednie P-imidazolidy, które następnie poddano reakcji sprzęgania z m7GDP^-S[12]. Związki wydzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej i dodatkowo odczyszczono za pomocą RP HPLC, uzyskując sole amonowe odpowiednie do badań biologicznych. W przypadku β-tiofosforanów otrzymany produkt jest mieszaniną dwóch stereoizomerów, których nie udało się rozdzielić na etapie oczyszczania za pomocą RP HPLC, więc wydzielono je jako mieszaninę.
Transkrypty zawierające na końcu 5’ związki według wynalazku lub związki odniesienia (referencyjne) otrzymano metodą transkrypcji in vitro w obecności polimerazy RNA T7 i matrycy DNA zawierającej sekwencję promotora Φ6.5 dla tej polimerazy. W celu analizy wydajności ekspresji białka w komórkach ssaczych uzyskano transkrypty mRNA zawierające związki według wynalazku lub związki odniesienia i kodujące lucyferazę Gaussia jako gen reporterowy. Reakcję transkrypcji in vitro przeprowadzono w warunkach opisanych w Przykładzie 5. Otrzymane mRNA poddano analizie metodą HPLC w odwróconych fazach w warunkach opisanych w Przykładzie 6. Wyniki tej analizy zestawione z wynikami analogicznej analizy dla mRNA otrzymanych z użyciem niemodyfikowanego trinukleotydowego analogu kapu[11] (m7GpppApG) pokazano na Fig. 1. Przed zbadaniem wydajności ekspresji białka, mRNA kapowane trinukleotydowymi analogami kapu według wynalazku poddano oczyszczaniu metodą RP HPLC w celu usunięcia zanieczyszczeń dwuniciowym RNA tak jak opisano w Przykładzie 6. mRNA referencyjne również poddano oczyszczaniu na HPLC tak jak opisano w Przykładzie 6, przy czym wcześniej poddano je procedurze enzymatycznego usuwania niekapowanych (zakończonych 5’-trifosforanem) mRNA tak jak opisano w Przykładzie 5. Otrzymane mRNA kapowane związkami według wynalazku lub związkami referencyjnymi wprowadzono do komórek linii ssaczych (fibroblasty - 3T3-L1 i komórki denrytyczne - JAWS II) metodą transfekcji z użyciem lipofektaminy, po czym w odpowiednich odstępach czasu mierzono poziom ekspresji lucyferazy Gaussia w medium zewnątrzkomórkowym metodą luminescencyjną tak jak opisano w Przykładzie 7. Wyniki tych eksperymentów przedstawiono na Fig. 2 i Fig. 3, gdzie pokazano całkowity (sumaryczny) poziom ekspresji lucyferazy Gaussia uzyskany przez cały czas trwania eksperymentu (88 h), a będący sumą poziomów ekspresji lucyferazy Gaussia uzyskanych w poszczególnych punktach czasowych.
Przykład 1: Synteza 3’-O-amidofosforynu N-benzoilo-2’-O-metyloadenozyny (5'-O-DMT-bn6AmPaC)
Amidofosforyn 5'-O-DMT-2'-O-Me-rAPac (468 mg, 0.51 mmol) oraz bromek benzylu (242 μ!, 2.04 mmol) rozpuszczono w CH2CI2 (5.1 ml) i dodano wodny roztwór (5.1 ml) bromku tetrabutyloamoniowego (164 mg, 0.51 mmol) i NaOH (204 mg, 5.10 mmol). Zawartość kolby energicznie mieszano przez 30 minut a następnie dodano 50 ml wody i 50 ml eteru dietylowego. Warstwę organiczną oddzielono, a fazę wodną przeekstrahowano dwukrotnie eterem dietylowym (50 ml). Fazy organiczne połączono, wysuszono nad Na2SO4 i odparowano. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 z dodatkiem trietyloaminy (0.5% obj./obj.), dodano silika-żel i odparowano. Produkt wydzielono za pomocą chromatografii flash na 20 g silika-żelu, stosując elucję gradientową (0 > 100% octanu etylu w n-heksanie), uzyskując po odparowaniu mieszaninę diastereoizomerów amidofosforynu 5'-O -DMT-bn6AmPac (292 mg, 0.29 mmol, 57%) w postaci białej pianki.
bn6Am CEP: 1H NMR (500 MHz, CDCI3, 25°C): δ = 8.60 (s, 1 H, H2), 8.58 (s, 1 H, H2), 8.26 (s, 1H, H8), 8.19 (s, 1 H, H8), 7.46-6.60 (m, 46H, ArH), 6.15 (d, 3Jh,h= 5.4 Hz, 1H, H1'), 6.13 (d, 3Jh,h = 5.0 Hz, 1H, H1'), 5.65 (s, 4H, C H2(bn6)) 5.13 (s, 4H, C H2(Pac)), 4.67 (m, 2H, H3'), 4.54 (m, 2H, H2'), 4.41 (m, 1H,
H4'), 4.35 (m, 1H, H4'), 3.90 (m, 2H, OCH2CH2CN), 3.77 (s, 12H, OCH3 dmt), 3.72-3.52 (m, 8H, OCH2CH2CN, H5', CHiPr), 3.48 (s, 6H, CH3 2'-o), 3.38 (dd, 2Jh,h = 10.6 Hz, 3Jh,h = 3.8 Hz, 2H, H5), 2.63 (t, 3Jh,h = 6.3 Hz, 2H, OCH2CH2CN), 2.37 (t, 3Jh,h = 6.3 Hz, 2H, OCH2CH2CN), 1.19 (m, 24 H, CH3 iRr)ppm; 31P NMR (202.5 MHz, CDCI3, H3PO4, 25°C): δ = 151.0 (s, 1P, P), 150.3 (s, 1P, P) ppm;
Przykład 2: Synteza 5'-fosforanu dinukleotydu Pbn6AmpG
Syntezę dinukleotydów wykonano z użyciem automatycznego syntetyzera AKTA Oligopilot plus 10 (GE Healthcare) na podłożu 5'-O -DMT-2'-O-TBDMS-rGiBu 3'-lcaa PrimerSupport 5G (308 pmol/g, GE Healthcare). W etapie sprzęgania, 2-krotny nadmiar molowy amidofosforynu (bn6Am lub amidofosforynu biscyjanoetylowego) oraz roztwór 0,30 M 5-(benzylotio)-1-H-tetrazolu w acetonitrylu przetłaczano w obiegu zamkniętym przez kolumnę wypełnioną podłożem przez 15 minut. Do usuwania grupy dimetoksytrytylowej użyto 3% (obj./obj.) roztwór kwasu dichlorooctowego w toluenie; w etapie utleniania użyto 0,05 M roztwór jodu w mieszaninie pirydyna/woda (9:1); nieprzereagowane grupy hydroksylowe blokowano mieszaniną 20% (obj./obj.) N-metyloimidazolu w acetonitrylu (Cap A) oraz 40% (obj./obj.) bezwodnika octowego i 40% (obj./obj.) pirydyny w acetonitrylu (Cap B). Po ostatnim cyklu syntezy, podłoże przemyto 20% (obj./obj.) roztworem dietyloaminy w acetonitrylu w celu usunięcia grup 2-cyjanoetylowych. Podłoże przepłukano acetonitrylem i wysuszono argonem. Produkt odcięto od podłoża i odbezpieczono za pomocą AMA (40% metyloamina / 33% amoniak 1:1 obj./obj.; 55°C, 1 h), przesącz odparowano do sucha i rozpuszczono w DMSO (200 μβ. Grupy TBDMS usunięto za pomocą TEAOHF (250 μ!, 65°C, 3 h), a następnie mieszaninę ochłodzono i rozcieńczono 0,25 M roztworem NaHCO3 w wodzie (20 ml). Produkt wydzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE Sephadex z elucją gradientową 0-0.9 M TEAB, uzyskując po odparowaniu eluatu sól trietyloamoniową dinukleotydu pNpG. Wydajność oszacowano poprzez pomiar absorpcji roztworu przy długości fali 260 nm, przyjmując jako współczynnik ekstynkcji wartość ε = 27.1 l/mmol/cm.
pbn6AmpG: RP-HPLC (elucja gradientowa 0-50% MeOH w CH3COONH4 pH 5.9 w 15 min): Rt = 15.534 min; HRMS ESI(-): m/z 795.16658 (obliczono dla C28H33N10O14P2IM-H]- 795.16584);
Przykład 3: Synteza trinukleotydowego analogu kapu m7Gpppbn6AmpG
Sól trietyloamoniową pbn6AmpG (406 mnOD260 nm, 15 μmol) rozpuszczono w DMSO (300 μθ, a następnie dodano m7GDP-lm[12] (18.8 mg, 30 μmol) oraz bezwodny ZnCl2 (40.7 mg, 300 μmol). Zawartość kolby mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 h, po czym reakcję zakończono dodając roztwór EDTA (139 mg) oraz NaHCO3 (70 mg) w wodzie (7 ml). Produkt wydzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE Sephadex z elucją gradientową 0-1.2 M TEAB, a następnie oczyszczono za pomocą RP HPLC (C18), stosując liniowy gradient acetonitrylu w buforze CH3COONH4 pH 5.9, uzyskując po odparowaniu eluatów i kilkukrotnej liofilizacji zwody sól amoniową m7Gpppbn6AmpG (295 mOD260 nm, 9.2 μ^ί, 62%).
m7Gpppbn6AmpG: RP-HPLC (elucja gradientowa 0-50% MeOH w CH3COONH4 pH 5.9 w 15 min): Rt = 15.534 min; HRMS ESI(-): m/z 1234.19524 (obliczono dla C39H48N15O24P4- [M-H]- 1234.19526);
Przykład 4: Synteza trinukleotydowego analogu kapu z ugrupowaniem β-tiofosforanowym (m7Gppspbn6AmpG)
Etap 1. Aktywacja pbn6AmpG: 5'-fosforan dinukleotydu pbn6AmpG (615 mOD260 nm, 22.7 μmol) rozpuszczono w DMF (400 μθ, a następnie dodano imidazol (24.7 mg, 363 μmol), 2,2'-ditiodipirydynę (30 mg, 136 μmol), trietyloaminę (9.5 μΐ, 68 μmol) oraz trifenylofosfinę (35.7 mg, 136 μmol). Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Produkt wytrącono dodając roztwór nadchloranu litu (24.1 mg, 227 μmol) w acetonitrylu (4.0 ml). Osad zwirowano w temperaturze 4°C, przemyto trzykrotnie schłodzonym acetonitrylem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując sól litową P-imidazolidu dinukleotydu lm-pbn6AmpG (19 mg).
Etap 2. Utworzenie mostka trifosforanowego: β-tiodifosforan 7-metyloguanozyny m7GDP-p-S (378 mOD260 nm, 33.2 μmol; otrzymany jak opisano wcześniej i przechowywany w temperaturze -20°C jako roztwór w TEAB)[13] odparowano do sucha i rozpuszczono w DMF (890 μL). Następnie dodano ZnCl2 (24.1 mg, 177 μmol) oraz lrn-pbn6AmpG (19 mg) i zawartość kolby mieszono w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Reakcję zakończono dodając roztwór Na2EDTA (72.5 mg) oraz NaHCO3 (36 mg) w wodzie (3,6 ml), a produkt wydzielono za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE Sephadex z elucją gradientową 0-1.2 M TEAB, uzyskując po odparowaniu eluatu sól trietyloamoniową m7GppspNpG. Produkt w postaci mieszaniny dwóch diastereoizomerów oczyszczono za pomocą RP HPLC (C18) stosując liniowy gradient acetonitrylu w buforze CH3COONH4 pH 5.9, uzyskując po odparowaniu eluatów i kilkukrotnej liofilizacji z wody sól amoniową mieszaniny P-diastereoizomerów m7Gppspbn6AmpG.
Przykład 5: Otrzymywanie kapowanego mRNA metoda transkrypcji in vitro
Transkrypty kodujące lucyferazę Gaussia zostały przygotowane na matrycy plazmidu pJET_T7_Gluc_128A przeciętego enzymem restrykcyjnym Aarl (ThermoFisher Scientifics). Wspomniany plazmid uzyskano poprzez wklonowanie sekwencji promotora T7 oraz sekwencji kodującej lucyferazę Gaussia do plazmidu pJET_luc_128A.[3] Typową reakcję in vitro transkrypcji (20 μΙ) inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 h i składała się z: buforu RNA Pol (40 mM Tris-HCI pH 7,9, 10 mM MgCI2, 1 mM DTT, 2 mM spermidyna), 10 U^l T7 RNA polimerazy, 1 U^l inhibitora RNazy RiboLock, 2 mM ATP/CTP/UTP, 0,5 mM GTP, 3 mM analogu kapu i 50 ng^l przeciętego restrykcyjnie plazmidu jako matrycy. Po 2 h inkubacji dodano 1 U^l DNazy I i kontynuowano inkubację przez kolejne 30 min w temperaturze 37°C. Otrzymane transkrypty zostały oczyszczone za pomocą zestawu NucleoSpin RNA Clean-up XS (Macherey-Nagel). Jakość transkryptów sprawdzano na natywnym żelu agarozowym 1,2% 1xTBE, a ich stężenie oznaczano spektrofotometrycznie. W celu usunięcia niekapowanego RNA, transkrypty referencyjne poddano działaniu 5'-polifosfatazy (Epicentre) i Xrn1 (New England Biolabs). W tym celu cząsteczki mRNA inkubowano z 5'-polifosfatazą (20U / 5 μg mRNA) w dedykowanym buforze przez 30 min w temperaturze 37°C, następnie mRNA oczyszczano za pomocą zestawu NucleoSpin RNA Clean-up XS. Oczyszczone mRNA poddano inkubacji z Xrn1 (1 U /1 μg mRNA) w dedykowanym buforze przez 60 min w temp. 37°C, a następnie oczyszczono mRNA za pomocą NucleoSpin RNA Clean-up XS.
Przykład 6: Oczyszczanie kapowanego mRNA przy użyciu HPLC
Transkrypty oczyszczano przy użyciu Agilent Technologies Series 1200 HPLC, do tego celu zastosowano kolumnę RNASep™ Prep-- RNA Purification Column (ADS Biotec). Sam rozdział prowadzono w temperaturze 55°C, jak opisano w [14]. Do oczyszczania mRNA zastosowano liniowy gradient buforu B (0,1 M octanu trietyloamoniowego o pH 7,0 i 25% acetonitrylu) od 35% do 55% w buforze A (0,1 M octanu trietyloamoniowego o pH 7,0) przez 22 min przy przepływie 0,9 ml/min. Po oczyszczeniu cząsteczki mRNA odzyskano wytrącając izopropanolem z zebranych frakcji. Jakość transkryptów sprawdzano na natywnym żelu agarozowym 1,2% 1xTBE, a ich stężenie oznaczano spektrofotometrycznie.
Co ważne, zastosowanie powyżej opisanej procedury oczyszczania pozwoliło na oddzielenie mRNA kodującego Gaussia lucyferazę posiadającego nowy trinukleotydowy analog kapu (m7Gpppbn6AmpG-RNA) od jego niekapowanej wersji (ppp-RNA). Czasy retencji analizowanych transkryptów były odpowiednio 19,4 min dla m7Gpppbn6AmpG-RNAGluc oraz 18,2 min dla ppp-RNAGluc.
Przykład 7: Analiza ekspresji białek
Linie komórkową 3T3-L1 (komórki fibroblastopodobne zarodków mysich, ATCC CL-173) hodowano w pożywce DMEM (Gibco) uzupełnionej 10% FBS (Sigma), GlutaMAX (Gibco) i 1% penicyliną/streptomycyną (Gibco) w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2. Natomiast linia niedojrzałych komórek dendrytycznych JAWS II (ATCC CRL-11904) była hodowana w pożywce RPMI 1640 (Gibco) uzupełnionej 10% FBS, pirogronianem sodu (Gibco), 1% penicyliną/streptomycyną i 5 ng/ml GM-CSF (PeproTech) w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2. W typowym doświadczeniu użyto 104 komórek JAWS II i 4·103 komórek 3T3-L1, które hodowano w 100 μl pożywki bez antybiotyków w dołku płytki 96-dołkowej. Komórki w każdym dołku były poddane transfekcji przez 16 h z użyciem mieszaniny 0,3 μl Lipofectaminy MessengerMAX Transfection Reagent (Invitrogen), 25 ng mRNA oraz 10 μl OptiMEM (Gibco). W celu oceny ekspresji lucyferazy Gaussia w różnych punktach czasowych, pożywka została całkowicie usunięta i zastąpiona świeżą w każdym z badanych punktów czasowych. W celu wykrycia luminescencji do 10 μl podłoża hodowlanego dodano 50 μl 10 ng/ml h-coloenterazyny (NanoLight) rozpuszczonej w PBS, samą luminescencję mierzono na czytniku mikropłytek Synergy H1 (BioTek).
Wnioski
Przykłady 1-4 opisują sposoby uzyskania trójnukleotydowych analogów kapu według wynalazku. Realizacje wynalazku objęte zastrzeżeniami, których synteza nie została przedstawiona w poniższych przykładach mogą zostać otrzymane sposobami syntezy identycznymi lub bardzo zbliżonymi do przedstawionych w przykładach.
Przykłady 5 i 6 opisują sposób otrzymywania i przeprowadzenia oczyszczania mRNA uzyskanych przy użyciu związków według wynalazku w warunkach pozwalających na oddzielenie kapowanych mRNA od niekapowanych mRNA. Przykładowe chromatogramy demonstrujące taki rozdział pokazano na Fig. 1 i zestawiono je z analogicznymi wynikami uzyskanymi dla mRNA uzyskanych z niemodyfikowanych trinukleotydem referencyjnym, który jak zademonstrowano, nie daje możliwości oddzielenia kapowanych i niekapowanych mRNA w tych samych warunkach. Co więcej, analiza danych (pól powierzchni odpowiednich sygnałów) przedstawionych na Fig. 1 pozwoliła również na obliczenie wydajności kapowania mRNA uzyskanych przy użyciu związków według wynalazków, która wyniosła 91.5%.
Wskazuje to, że w przypadku zastosowania trójnukleotydowych analogów kapu według wynalazku uzyskane wydajności kapowania są porównywalne do trójnukleotydów nie zawierających modyfikacji według wynalazku, dla których wydajności kapowania uzyskane w literaturze w podobnych warunkach wyniosły około 90%[12].
Przykład 7, opisuje sposób wykonania analizy ekspresji białka z mRNA według wynalazku uzyskanych z użyciem związków według wynalazku w komórkach ssaczych. Analizy dokonano w dwóch liniach komórkowych reprezentujących komórki różnego pochodzenia (fibroblasty - 3T3-L1 i komórki denrytyczne - JAWS II). W przypadku mRNA referencyjnych badano transkrypty uprzednio traktowane enzymatycznie w celu usunięcia zanieczyszczeń niekapowanym mRNA. W przypadku mRNA uzyskanych z użyciem związków według wynalazku traktowanie enzymatyczne zostało pominięte ponieważ nie było konieczne. mRNA uzyskane z użyciem związków według wynalazku przynajmniej w jednym z badanych wariantów wykazywało zwiększony poziom ekpresji białka w porównaniu do mRNA uzyskanych z użyciem analogów kapu reprezentujących najbardziej aktualny stan techniki. Uzyskanie zwiększonej ekspresji białka ma wiele zastosowań w biotechnologii i produkcji biofarmaceutyków (produkcja ludzkich białek rekombinowanych), a także w terapiach genowych z użyciem mRNA. Zwiększona ekspresja białek w komórkach dentrytycznych jest szczególnie korzystna w przypadku zastosowań w leczniczych szczepionkach przeciwnowotworowych[15]. Zwiększona ekspresja białek w komórkach pochodzących z innych tkanek (np. płuc, wątroby, innych organów) jest szczególnie korzystna w przypadku zastosowań leczniczych opartych na zastępowaniu uszkodzonego genu[16]. Można oczekiwać, że uzyskanie efektu terapeutycznego dla mRNA według wynalazku z użyciem analogów kapu według wynalazku będzie możliwe przy niższym stężeniu mRNA niż w przypadku mRNA uzyskiwanego sposobami według stanu techniki. Obniżenie dawki mRNA pociąga za sobą mniejsze prawdopodobieństwo wystąpienia skutków ubocznych związanych z toksycznością terapii, a tym samym zwiększa prawdopodobieństwo powodzenia zastosowanej terapii. Można również oczekiwać, że otrzymywanie mRNA z użyciem związków według wynalazku pozwoli na łatwiejszą produkcję mRNA pozbawionych niepożądanych zanieczyszczeń trifosforanami.
LITERATURA
1. Moore, M., From birth to death: The complex lives of eukaryotic mRNAs. Science 2005, 309 (5740), 1514-1518.
2. Ziemniak, M.; Strenkowska, M.; Kowalska, J.; Jemielity, J., Potential therapeutic applications of RNA cap analogs. Future Medicinal Chemistry 2013, 5 (10), 1141-1172.
3. Grudzien-Nogalska, E.; Stepinski, J.; Jemielity, J.; Zuberek, J.; Stolarski, R.; Rhoads, R. E.; Darzynkiewicz, E., Synthesis of anti-reverse cap analogs (ARCAs) and their applications in mRNA translation and stability. Translation Initiation: Cell Biology, High-Throughput Methods, and Chemical-Based Approaches 2007, 431, 203-227.
4. Sahin, U.; Kariko, K.; Tureci, O., mRNA-based therapeutics - developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery 2014, 13 (10), 759-780.
5. Stępiński, J.; Waddell, C.; Stolarski, R.; Darzynkiewicz, E.; Rhoads, R. E., Synthesis and properties of mRNAs containing the novel anti-reverse cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'-deoxy)GpppG. Rna-a Publication of the Rna Society 2001, 7 (10), 1486-1495.
6. Jemielity, J.; Fowler, T.; Zuberek, J.; Stępiński, J.; Lewdorowicz, M.; Niedzwiecka, A.; Stolarski, R.; Darzynkiewicz, E.; Rhoads, R. E., Novel anti-reverse cap analogs with superior translational properties. Rna-a Publication of the Rna Society 2003, 9 (9), 1108-1122.
7. Jemielity, J.; Kowalska, J.; Rydzik, A. M.; Darzynkiewicz, E., Synthetic mRNA cap analogs with a modified triphosphate bridge - synthesis, applications and prospects. New Journal of Chemistry 2010, 34 (5), 829-844.
PL 248416 Β1
8. Grudzien-Nogalska, E.; Jemielity, J.; Kowalska, J.; Darzynkiewicz, E.; Rhoads, R. E., Phosphorothioate cap analogs stabilize mRNA and increase translational efficiency in mammalian cells. Rna-a Publication ofthe Rna Society 2007, 13 (10), 1745-1755.
9. Kuhn, A. N.; Diken, M.; Kreiter, S.; Selmi, A.; Kowalska, J.; Jemielity, J.; Darzynkiewicz, E.; Huber, C.; Tureci, O.; Sahin, U., Phosphorothioate cap analogs increase stability and translational efficiency of RNA vaccines in immature dendritic cells and induce superior immune responses in vivo. Gene Therapy 2010, 17 (8), 961-971.
10. Grudzień, E.; Kalek, M.; Jemielity, J.; Darzynkiewicz, E.; Rhoads, R. E., Differential inhibition of mRNA degradation pathways by novel cap analogs. Journal ofBiological Chemistry 2006, 281 (4), 1857-1867.
11. Sikorski, Paweł J; Warmiński, Marcin; Kubacka, Dorota; Ratajczak, Tomasz; Nowis, Dominika; Kowalska, Joanna; Jemielity, Jacek; The identity and methylation status of the first transcribed nucleotide in eukaryotic mRNA 5' cap modulates protein expression in living cells. Nucleic Acids Research 2020, 305-1048.
12. J. Kowalska, M. Lewdorowicz, J. Zuberek, E. Grudzien-Nogalska, E. Bojarska, J. Stępiński, R. E. Rhoads, E. Darzynkiewicz, R. E. Davis, J. Jemielity, RNA 2008, 14, 1119-1131.
13. M. Warmiński, P. J. Sikorski, Z. Warmińska, M. Łukaszewicz, A. Kropiwnicka, J. Zuberek, E. Darzynkiewicz, J. Kowalska, J. Jemielity, Bioconjugate Chemistry 2017, 28, 1978-1992.
14. D. Weissman, N. Pardi, H. Muramatsu, K. Karikó, Methods Mol Biol 2013, 969, 43-54.
15. Norbert Pardi, Michael J. Hogan, Frederick W. Porter, Drew Weissman, N. Naturę Reviews Drug Discovery vol. 17, 261-279 (2018).
16. Berraondo P, Martini PGV, Avila MA, et al Messenger RNA therapy for rare genetic metabolic diseases Gut 2019; 68:1323-1330.

Claims (11)

1. Związek o wzorze:
Χ5-Ρ-0
□ OH w którym:
R1, R2, R3, R4 są wybrane z grupy o składzie: H, CH3, alkil o liczbie atomów węgla od 2 do 10, przy czym podstawniki R o różnych numerach mogą być takie same lub różne, n wynosi 0 lub 1,
PL 248416 Β1
Zasadai i Zasada2 są wybrane z grupy obejmującej:
przy czym R5 jest wybrane z grupy z grupy obejmującej: benzyl, chlorobenzyl, fluorobenzyl, bromobenzyl, jodobenzyl, metylobenzyl, alikobenzyl, nitrobenzyl, karboksybenzyl, azydobenzyl, aminobenzyl, hydroksybenzyl, przy czym w każdym przypadku benzyl może być orto-, meta- lub para- podstawiony, (1-naftylometyl), (2-naftylometyl),
Χ1, Χ3 są wybrane z grupy obejmującej: O, S, Se,
Χ2, Χ4, Χ5 są wybrane z grupy obejmującej: O, S, Se, BH3,
Χθ jest wybrane z grupy obejmującej: O, CH2, CF2, CCI2, przy czym podstawniki X o różnych numerach mogą być takie same lub różne, korzystnie R5 jest benzylem lub podstawionym benzylem, Χ1, Χ2, Χ3, Χ4, Xs,Xe są O, a R3, R4 są H.
2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że związek ten został wybrany z grupy obejmującej:
związek rn7Gpppbn6AmpG o wzorze:
OH OH związek rn7Gppsbn6AmpG o wzorze
OH OH
3. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że związek ten składa się zasadniczo z pojedynczego stereoizomeru lub zawiera mieszaninę przynajmniej dwóch stereoizomerów, pierwszego diastereiozmeru i drugiego diastereoizomeru, przy czym diastereoizomery te są identyczne z wyjątkiem tego, że posiadają różne konfiguracje stereochemiczne wokół stereogenicznego atomu fosforu, przy czym rzeczony stereogeniczny atom fosforu jest związany z atomem siarki, selenu, lub grupą boranową.
4. Cząsteczka RNA, która na 5’ końcu zawiera związek określony w którymkolwiek z zastrzeżeń 1-3.
5. Sposób syntezy in vitro cząsteczki RNA jak określona w zastrzeżeniu 4, przy czym wymieniony sposób obejmuje reagowanie ATP, CTP, UTP i GTP, związku określonego w którymkolwiek z zastrzeżeń 1-3 oraz matrycy polinukleotydowej w obecności polimerazy RNA, w warunkach umożliwiających transkrypcję przez polimerazę RNA kopii RNA na matrycy polinukleotydowej; przy czym niektóre z kopii RNA będą zawierały związek określony w którymkolwiek z zastrzeżeń 1-3, z wytworzeniem cząsteczki RNA określonej w zastrzeżeniu 4.
6. Sposób syntezy białka lub peptydu in vitro, przy czym wymieniony sposób obejmuje translację cząsteczki RNA określonej w zastrzeżeniu 4, w bezkomórkowym systemie syntezy białek, przy czym cząsteczka RNA zawiera otwartą ramkę odczytu, w warunkach umożliwiających translację z otwartej ramki odczytu cząsteczki RNA białka lub peptydu kodowanego przez otwartą ramkę odczytu.
7. Sposób syntezy białka lub peptydu in vitro, znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie cząsteczki RNA określonej w zastrzeżeniu 4 do komórki, przy czym cząsteczka RNA zawiera otwartą ramkę odczytu, w warunkach umożliwiających translację z otwartej ramki odczytu cząsteczki RNA z utworzeniem białka lub peptydu kodowanych przez tę otwartą ramkę odczytu.
8. Sposób oczyszczania cząsteczki określonej jak w zastrzeżeniu 4, przy czym cząsteczki mRNA zawierające związek określony jak w którymkolwiek z zastrzeżeń 1-3 są oddzielone od pozostałych cząsteczek RNA metodą chromatograficzną, korzystnie techniką HPLC w odwróconym układzie faz.
9. Zastosowanie związku określonego w dowolnym zastrz. 1-3 w syntezie in vitro cząsteczki RNA.
10. Zastosowanie cząsteczki RNA określonej w zastrz. 4 w syntezie in vitro białka lub peptydu.
11. Związek określony w dowolnym zastrz. 1-3 lub cząsteczka RNA określona w zastrz. 4 do stosowania w medycynie.
PL432883A 2020-02-12 2020-02-12 Nowe analogi kapu końca 5’ mRNA, cząsteczka RNA je zawierająca, ich zastosowania i sposób syntezy cząsteczki RNA i peptydu PL248416B1 (pl)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL432883A PL248416B1 (pl) 2020-02-12 2020-02-12 Nowe analogi kapu końca 5’ mRNA, cząsteczka RNA je zawierająca, ich zastosowania i sposób syntezy cząsteczki RNA i peptydu
US17/798,099 US20230130423A1 (en) 2020-02-12 2021-02-12 Novel mrna 5'-end cap analogs, rna molecule incorporating the same, uses thereof and method of synthesizing rna molecule or peptide
KR1020227030072A KR20220163359A (ko) 2020-02-12 2021-02-12 신규 mRNA 5'-말단 캡 유사체, 이를 혼입한 RNA 분자, 이의 용도 및 RNA 분자 또는 펩티드의 합성 방법
PCT/PL2021/050007 WO2021162567A1 (en) 2020-02-12 2021-02-12 Novel mrna 5'-end cap analogs, rna molecule incorporating the same, uses thereof and method of synthesizing rna molecule or peptide
CA3167570A CA3167570A1 (en) 2020-02-12 2021-02-12 Novel mrna 5'-end cap analogs, rna molecule incorporating the same, uses thereof and method of synthesizing rna molecule or peptide
AU2021219563A AU2021219563A1 (en) 2020-02-12 2021-02-12 Novel mRNA 5'-end cap analogs, RNA molecule incorporating the same, uses thereof and method of synthesizing RNA molecule or peptide
JP2022548990A JP7805938B2 (ja) 2020-02-12 2021-02-12 新規ｍＲＮＡ５’－末端キャップ類似体、それを組み込んだＲＮＡ分子、それらの使用、及びＲＮＡ分子又はペプチドを合成する方法
EP21754142.4A EP4103577A4 (en) 2020-02-12 2021-02-12 NEW MRNA 5' END CAP ANALOGUES, RNA MOLECULES THEREFROM, THEIR USE AND METHOD FOR SYNTHESIS OF RNA MOLECULES OR PEPTIDES
JP2025162162A JP2026012182A (ja) 2020-02-12 2025-09-29 新規ｍＲＮＡ５’－末端キャップ類似体、それを組み込んだＲＮＡ分子、それらの使用、及びＲＮＡ分子又はペプチドを合成する方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL432883A PL248416B1 (pl) 2020-02-12 2020-02-12 Nowe analogi kapu końca 5’ mRNA, cząsteczka RNA je zawierająca, ich zastosowania i sposób syntezy cząsteczki RNA i peptydu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL432883A1 PL432883A1 (pl) 2021-08-16
PL248416B1 true PL248416B1 (pl) 2025-12-08

Family

ID=77292947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL432883A PL248416B1 (pl) 2020-02-12 2020-02-12 Nowe analogi kapu końca 5’ mRNA, cząsteczka RNA je zawierająca, ich zastosowania i sposób syntezy cząsteczki RNA i peptydu

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230130423A1 (pl)
EP (1) EP4103577A4 (pl)
JP (2) JP7805938B2 (pl)
KR (1) KR20220163359A (pl)
AU (1) AU2021219563A1 (pl)
CA (1) CA3167570A1 (pl)
PL (1) PL248416B1 (pl)
WO (1) WO2021162567A1 (pl)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI4104687T3 (fi) 2015-09-21 2024-03-01 Trilink Biotechnologies Llc Koostumuksia ja menetelmiä 5-huputettujen RNA:iden syntetisoimiseksi
PL432884A1 (pl) * 2020-02-12 2021-08-16 Uniwersytet Warszawski Nowe analogi kapu końca 5' mRNA, cząsteczka RNA je zawierająca, ich zastosowania i sposób syntezy cząsteczki RNA i peptydu
KR20230034333A (ko) * 2020-07-02 2023-03-09 라이프 테크놀로지스 코포레이션 트리뉴클레오티드 캡 유사체, 제조 및 이의 용도
CN116368226A (zh) 2020-09-04 2023-06-30 维乎医疗有限公司 用于加帽rna的组合物和方法
EP4577553A2 (en) * 2022-08-26 2025-07-02 TriLink BioTechnologies, LLC Efficient method for making highly purified 5'-capped oligonucleotides
WO2024075022A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 BioNTech SE Rna constructs and uses thereof
EP4464713A1 (en) 2023-05-18 2024-11-20 Siec Badawcza Lukasiewicz - PORT Polski Osrodek Rozwoju Technologii Circular rna analogs, preparation and application thereof
TW202526022A (zh) * 2023-09-06 2025-07-01 美商垂林克生物技術有限責任公司 帽類似物及其使用方法
WO2025147660A2 (en) 2024-01-04 2025-07-10 Trilink Biotechnologies, Llc Modified rna for increasing protein expression
EP4606900A1 (en) * 2024-02-21 2025-08-27 ExploRNA Therapeutics Sp. z o. o. Modified rna for the treatment of cfdna-associated diseases
WO2025187713A1 (en) * 2024-03-07 2025-09-12 Eisai R&D Management Co., Ltd. Polynucleotide and producing method thereof
WO2026010855A1 (en) 2024-07-02 2026-01-08 Trilink Biotechnologies, Llc Modified rna for increasing protein expression

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI4104687T3 (fi) * 2015-09-21 2024-03-01 Trilink Biotechnologies Llc Koostumuksia ja menetelmiä 5-huputettujen RNA:iden syntetisoimiseksi

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023513764A (ja) 2023-04-03
EP4103577A1 (en) 2022-12-21
KR20220163359A (ko) 2022-12-09
US20230130423A1 (en) 2023-04-27
WO2021162567A1 (en) 2021-08-19
CA3167570A1 (en) 2021-08-19
AU2021219563A1 (en) 2022-09-08
PL432883A1 (pl) 2021-08-16
JP2026012182A (ja) 2026-01-23
EP4103577A4 (en) 2024-03-06
JP7805938B2 (ja) 2026-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL248416B1 (pl) Nowe analogi kapu końca 5’ mRNA, cząsteczka RNA je zawierająca, ich zastosowania i sposób syntezy cząsteczki RNA i peptydu
US20230295215A1 (en) Novel mrna 5'-end cap analogs modified within phosphate residues, rna molecule incorporating the same, uses thereof and method of synthesizing rna molecule or peptide
CA2790483C (en) Phosphoramidites for synthetic rna in the reverse direction
JP4236812B2 (ja) オリゴヌクレオチド類似体
US8309707B2 (en) RNA synthesis-phosphoramidites for synthetic RNA in the reverse direction, and application in convenient introduction of ligands, chromophores and modifications of synthetic RNA at the 3′-end
JP7144050B2 (ja) ５’－ホスホロチオラート ｍＲＮＡ ５’－末端（キャップ）類似体、それを含むｍＲＮＡ、それらを得る方法およびそれらの使用方法
Kozarski et al. Towards superior mRNA caps accessible by click chemistry: synthesis and translational properties of triazole-bearing oligonucleotide cap analogs
US11072624B2 (en) Synthesis of nucleoside 5′-triphosphates and their derivatives
EP2961757B1 (en) Cell-penetrating oligonucleotides
Grosjean et al. RNA‐modifying and RNA‐editing enzymes: Methods for their identification
US8618279B2 (en) Synthesis of 2′,3′— and 3′,5′—cyclic phosphate mono-and oligonucleotides
EP3950699A1 (en) Rna capping method, production method for modified rna, and modified rna
Bartosik et al. Access to capped RNAs by chemical ligation
Iannazzo et al. Synthesis of tRNA analogues containing a terminal ribose locked in the South conformation to study tRNA-dependent enzymes
Nagatsugi Cross-Linking Duplex of Nucleic Acids with Modified Oligonucleotides
Kosmidis Development of site-specific RNA labeling strategies to probe alternative RNA splicing
Sittiwong Synthesis of pseudouridine derivatives