PL248287B1 - Stabilna nanocząstka polimerowo-lipidowa do wiązania i dostarczania leków, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych oraz sposób wytwarzania stabilnych nanocząstek polimerowo- lipidowych przenoszących leki, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych - Google Patents

Stabilna nanocząstka polimerowo-lipidowa do wiązania i dostarczania leków, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych oraz sposób wytwarzania stabilnych nanocząstek polimerowo- lipidowych przenoszących leki, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych

Info

Publication number
PL248287B1
PL248287B1 PL444724A PL44472423A PL248287B1 PL 248287 B1 PL248287 B1 PL 248287B1 PL 444724 A PL444724 A PL 444724A PL 44472423 A PL44472423 A PL 44472423A PL 248287 B1 PL248287 B1 PL 248287B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
plga
pva
nanoparticles
17aag
lipo
Prior art date
Application number
PL444724A
Other languages
English (en)
Other versions
PL444724A1 (pl
Inventor
Olga Święch
Weronika PIOTROWSKA
Weronika Piotrowska
Rafał MAĆKIEWICZ
Rafał Maćkiewicz
Wojciech Smoron
Mateusz Psurski
Joanna Wietrzyk
Natalia Labędź
Julia WITEK
Julia Witek
Original Assignee
Bs Biotechna Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bs Biotechna Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia filed Critical Bs Biotechna Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority to PL444724A priority Critical patent/PL248287B1/pl
Priority to CN202480044682.8A priority patent/CN121487725A/zh
Priority to IL324424A priority patent/IL324424A/en
Priority to EP24740620.0A priority patent/EP4704817A1/en
Priority to PCT/PL2024/000023 priority patent/WO2024228632A1/en
Publication of PL444724A1 publication Critical patent/PL444724A1/pl
Publication of PL248287B1 publication Critical patent/PL248287B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/553—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having at least one nitrogen and one oxygen as ring hetero atoms, e.g. loxapine, staurosporine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5138—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyvinyl pyrrolidone, poly(meth)acrylates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest stabilna nanocząstka polimerowo-lipidowa do wiązania i dostarczania leków, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych charakteryzująca się tym, że złożona jest z rdzenia zawierającego kwas polimlekowo-ko-glikolowy (PLGA) w ilości od 16,1% do 30,3% wagowych oraz alkohol poliwinylowy (PVA) w ilości od 60,6% do 75,5% wagowych oraz otoczki rdzenia zawierającej mieszankę lipidów: 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DDPC) w ilości od 3,66% do 12,6% wagowych, cholesterol w ilości od 1,85% do 6,29% wagowych oraz sól amonową 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N –[amino(glikol polietylenowy)-2000 (DSPE-PEG(2000)NH2] w ilości od 0,15% do 0,5% wagowych. Zgłoszenie obejmuje też sposób wytwarzania stabilnych nanocząstek polimerowo-lipidowych przenoszących leki, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest stabilna nanocząstka polimerowo-lipidowa do wiązania i dostarczania leków, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych oraz sposób wytwarzania stabilnych nanocząstek polimerowo-lipidowych przenoszących leki, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych.
Kwas polimlekowy-ko-glikolowy (PLGA) jest zatwierdzonym przez FDA kopolimerem kwasu mlekowego i kwasu glikolowego. Jest również jednym z najczęściej wykorzystywanych polimerów w projektowaniu i formułowaniu systemów dostarczania leków do zastosowań biomedycznych ze względu na jego: biodegradowalność, bezpieczeństwo biologiczne, biokompatybilność, wszechstronność formułowania i funkcjonalizacji. Nanocząstki na bazie PLGA zapewniają: optymalną biodostępność kapsułkowanego leku, chroniąc go przed przedwczesnym rozkładem w środowisku biologicznym, regulowaną kinetykę degradacji i ukierunkowane dostarczanie leku. Ponadto ułatwiają wewnątrzkomórkową penetrację związku bioaktywnego i zmniejszają ilość skutków ubocznych terapii. Nanocząstki PLGA znalazły szerokie zastosowanie w terapiach: przeciwnowotworowych [DOI: 10.1615/CritRevTherDrugCarrierSyst.v2115.20], przeciwzapalnych [https://doi.org/10.1039/C5RA17686G], sercowo-naczyniowych oraz immunologicznych [https://doi.org/10.1016/j.drudis.2014.09.018, https://doi.org/10.1039/C5TB00434A].
Zastosowanie PLGA pozwala na kapsułkowanie szerokiej gamy cząsteczek bioaktywnych w tym małych leków, białek oraz kwasów nukleinowych. Ze względu na niską toksyczność własną i łatwą biodegradowalność nanocząstki zawierające PLGA mogą być stosowane w preparatach do podawania ogólnoustrojowego (pozajelitowego), doustnego i wziewnego.
Niemniej jednak, oprócz atrakcyjnych cech nanocząstek opartych na PLGA istnieją pewne ograniczenia zwykle związane z ich właściwościami fizykochemicznymi i biologicznymi, wśród których możemy wymienić: słabe nasycenie lekiem (szczególnie w przypadku lipofilowych środków terapeutycznych), wyrzut farmaceutyku w pierwszych godzinach podania, wychwyt fagocytarny, krótki okres półtrwania, agregację, reakcje immunologiczne oraz niekontrolowana dystrybucję w tkankach [https://doi.org/10.1016Zj.drudis.2014.09.018, https://doi.org/10.1080/17425247.2016.1182492]. Właściwości te ograniczają wykorzystanie nanocząstek PLGA w biomedycynie, dlatego poszukuje się nanocząstek hybrydowych, w których PLGA łączy się z materiałem zabezpieczającym głównie na bazie polimerów, surfaktantów i lipidów.
Polimer PVA czyli polialkohol winylowy) jest emulgatorem najczęściej stosowanym do stabilizacji emulsji podczas tworzenia nanocząstek PLGA, ponieważ tworzy cząstki o stosunkowo małych rozmiarach i równomiernym rozkładzie wielkości. Powłoka PVA pozostaje związana z nanocząstkami pomimo wielokrotnego przemywania, ponieważ PVA tworzy połączoną sieć z polimerem na granicy faz [https://doi.org/10.1016/0168-3659(95)00070-0]. Powłoka PVA zmienia właściwości nanocząstek PLGA i może ograniczać wewnątrzkomórkowy wychwyt nanocząstek co związane jest z większą hydrofilowością powierzchni nanocząstek oraz ujemnym ładunkiem na powierzchni nanocząstek.
Nanocząstki hybrydowe PLGA z lipidami stały się bardziej obiecującym podejściem we współczesnej nanomedycynie, poprawiając farmakokinetykę i biodystrybucję systemu terapeutycznego w środowiskach biologicznych przy jednoczesnym zminimalizowaniu skutków ubocznych. PLGA-lipidy łączą cechy biomimetycznych lipidów z zaletami architektonicznymi nanocząstek PLGA w jedną całość [https://doi.org/10.3109/21691401.2014.951721 https://doi.org/10.1517/17425247.2016-1151872]. Wśród materiałów polimerowo-lipidowych rozróżniamy nanocząstki typu: lipid rdzeń-polimer otoczka lub polimer rdzeń-lipid otoczka. Drugi rodzaj nanostruktury hybrydowej składa się z biodegradowalnego rdzenia PLGA, który otacza środki terapeutyczne i który osadzony jest w otoczce lipidowej lub lipidowej zawierającej modyfikację z glikol polietylenowy (PEG) [https://doi.org/10.2147/IJN.S40579, https://doi.org/10.1039/C2NR32880A, https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2013.07.002]. Zewnętrzna warstwa lipidowa zmniejsza szybkość degradacji rdzenia PLGA, ograniczając dyfuzję wody wewnątrz cząsteczki, pozwalając na bardziej kontrolowaną kinetykę uwalniania. Dodatkowo warstwa ta działa jak bariera molekularna minimalizując wyciek leku na etapie przygotowania lub przechowywania [https://doi.org/10.1039/C2 N R32880A, https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2013.07.002]. Zewnętrzna warstwa nośnika jest również odpowiedzialna za czas cyrkulacji nośnika w krwioobiegu oraz jego akumulację w poszczególnych narządach i tkankach. Skład zewnętrznej warstwy lipidowej jest zatem kluczowym elementem konstrukcji nośnika leku typu polimer-lipid nadający mu unikalne właściwości.
Istota rozwiązania według wynalazku w zakresie nośnika polimerowo-lipidowego polega na tym, że nośnik złożony jest z rdzenia zawierającego kwas polimlekowo-ko-glikolowy (PLGA) w ilości od 16,1 do 30,3% wagowych oraz alkohol poliwinylowy (PVA) w ilości od 60,6 do 75,5% wagowych oraz otoczki rdzenia zawierającej mieszankę lipidów: 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DPPC) w ilości od 3,66% do 12,6% wagowych, cholesterol w ilości od 1,85 do 6,29% wagowych oraz sól amonową 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000 (DSPE-PEG(2000)NH2] w ilości od 0,15 do 0,5% wagowych.
Korzystnie PLGA jest kopolimerem 50:50 o masie Mw 24 000-38 000 g/mol.
Korzystnie PVA ma masę Mw 30 000-70 000 g/mol.
Istota rozwiązania według wynalazku w zakresie sposobu polega na tym, że:
- w pierwszym etapie uzyskuje się rdzeń w taki sposób, że sporządza się klarowny roztwór wodny PVA o stężeniu od 15 mg/ml do 20 mg/ml, po czym sporządza się roztwór PLGA w dichlorometanie o stężeniu od 10 mg/ml do 20 mg/ml, następnie odważa się co najmniej jeden lek w ilości potrzebnej do sporządzenia roztworów o przedziale stężeń od 0,43 mM do 4,30 mM i rozpuszcza w roztworze PLGA, po czym schładza się oba roztwory do temperatury od 4°C do 7°C, a następnie miesza w stosunku objętościowym 1:2, gdzie na jedną część roztworu PLGA w dichlorometanie z dodatkiem leku przypadają dwie części wodnego roztworu PVA i ponownie schładza do temperatury 4°C do 7°C i całość miesza się do uzyskania emulsji; emulsję przelewa się do krystalizatora z elementem mieszającym, a jej pozostałości wypłukuje się buforem PBS o pH 7.4 lub wodą w stosunku objętościowym roztworu płuczącego (PBS lub woda) do mieszaniny reakcyjnej od 1:7,5 do 1:10 i również umieszcza w krystalizatorze, po czym całkowicie odparowuje się dichlorometan, następnie uzupełnia się objętość roztworem PBS 7.4 lub wodą do uzyskania końcowego stężenia PLGA na poziomie od 3,33 mg/ml do 6,67 mg/ml,
- w drugim etapie wytworzony uprzednio rdzeń pokrywa się liposomami DPPC/Cholesterol/DSPE-PEG(2000)NH2 (1,0/0,61/0,040), zsyntetyzowanymi wybraną metodą, a następnie powstały film lipidowy hydratuje za pomocą sterylnego roztworu soli fizjologicznej NaCI 0,9% do uzyskania sumarycznego stężenia lipidów równego 10 mg/ml i dysperguje za pomocą ultradźwięków otrzymując roztwór liposomów DPPC/Cholesterol/DSPE-PEG(2000)NH2 jako półprodukt do dalszej syntezy; następnie otrzymane liposomy dodaje się do rdzeni polimerowych PVA/PLGA nie poddanych procesowi oczyszczania w stosunku objętościowym liposomów do rdzeni polimerowych od 0,1:1 do 0,3:1, po czym całość podgrzewa się do temperatury od 45 do 60°C przez od 2 h do 4 h mieszając z prędkością od 200 do 600 RPM, a otrzymane w ten sposób nanocząstki PLGA/PVA/LIPO pozostawia w temperaturze 4°C od 12 do 24 h i oczyszcza dwukrotnie przemywając buforem PBS 7.4.
Korzystnie PLGA jest kopolimerem 50:50 o masie Mw 24 000-38 000 g/mol.
Korzystnie PVA ma masę Mw 30 000-70 000 g/mol.
Korzystnie do roztworu PVA dodaje się 0.1 M bufor PBS o pH 7.4.
Korzystnie lekiem wprowadzanym do rdzenia jest Staurosporyna w ilości od 5 do 11,5 mg.
Korzystnie lekiem wprowadzanym do rdzenia jest 17AAG (Tanespimycyna) w ilości od 5 do 11,5 mg. Korzystnie do rdzenia wprowadza się Staurosporynę i 17AAG (Tanespimycyna) przy stosunku stężeń 17AAG (Tanespimycyna) do Staurosporyny w przedziale od 0,62 do 9,5.
Korzystnie odparowanie dichlorometanu prowadzi się z użyciem mieszadła magnetycznego z prędkością od 200 do 600 RPM przy temperaturze od 37°C do 40°C.
Korzystnie emulsję uzyskuje się poprzez mieszanie za pomocą sondy ultradźwiękowej od 1 minuty do 2 minut przy amplitudzie 70% - 90%.
Korzystnie w celu kontroli jakości wytworzonego rdzenia polimerowego PLGA/PVA wykonuje się pomiar wielkości nanocząstek za pomocą metody dynamicznego rozpraszania światła.
Korzystnie liposomy DPPC/Cholesterol/DSPE-PEG(2000)NH2 syntezuje się za pomocą metody hydratacyjnej, sporządzając roztwór mieszaniny lipidów o stężeniu: DPPC równym 96,0 mM, Cholesterolu równym 58,8 mM, DSPE-PEG(2000)NH2 równym 3,84 mM w chloroformie.
Korzystnie liposomy DPPC/Cholesterol/DSPE-PEG(2000)NH2 syntezuje się za pomocą metody iniekcji etanolowej, sporządzając roztwór mieszaniny lipidów o stężeniu: DPPC równym 96,0 mM, Cholesterolu równym 58,8 mM, dSpE-PEG(2000)NH2 równym 3,84 mM w etanolu.
Korzystnie w metodzie hydratacyjnej rozpuszczalnik odparowuje się za pomocą wyparki próżniowej lub suszarki próżniowej.
Korzystnie w metodzie iniekcji etanolowej roztwór lipidów w etanolu wkrapla się do sterylnej soli fizjologicznej mieszanej za pomocą mieszadła magnetycznego otrzymując roztwór liposomów
DPPC/Cholesterol/DSPE-PEG(2000)NH2 o sumarycznym stężeniu lipidów 10 mg/ml jako półprodukt do dalszej syntezy.
Korzystnie oczyszczanie nanocząstek prowadzi się w wirówce wysokoobrotowej z prędkością 15000 RPM w czasie od 2 do 6 min.
Korzystnie po każdorazowym dodatku PBS 7.4 nanocząstki dysperguje się za pomocą ultradźwięków przez czas nie krótszy niż 5 sekund.
Korzystnie w celu stabilizacji nanocząstek, po ostatnim odwirowaniu dodaje się 40%-owy roztwór niejonowego surfaktantu w stosunku objętościowym 0,02:1 (surfaktant:nanocząstki) lub glukozy do osiągnięcia stężenia 2 mg/ml, po czym roztwór się miesza.
Główną zaletą rozwiązań według wynalazków jest to, że zastosowana w nanocząstkach kombinacja polimerów z lipidami pozwalająca na: załadunek pojedynczych leków takich jak 17AAG (Tanespimycyna) oraz Staurosporyna, a także ich kombinacji na poziomie od 32% do 80%; długotrwałe uwalnianie leku lub kombinacji leków, zapobieganie nadmiernemu wyciekowi leków oraz agregacji nośnika w obecności białek osocza. Ponadto pozwala na uzyskanie zakresu stosunków stężeń 17AAG do Staurosporyny w przedziale od 0,62 do 9,5. Zastosowana powłoka z dwuwarstwy lipidowej z dodatkiem polietylenoglikolu pozwala na zapobieganie agregacji nanocząstek w obecności białek i zapewnia stabilność nanocząstek w temperaturze 37°C powyżej 96 h. Rozmiar nanocząstek PLGA/PVA/LIPO mieszczący się w przedziale od 209 nm do 388 nm zapewnia selektywny, pasywny transport leku do tkanek nowotworowych dzięki efektowi zwiększonej przepuszczalności i retencji EPR. Ponadto, dodatkowa modyfikacja glikolu polietylenowego grupami aminowymi nadającymi nanocząstkom niewielki potencjał dodatni od 6,5 mV do 9,5 mV pozwala na zwiększoną skuteczność przeciwnowotworową lepszą akumulację i penetrację nośnika w tkankach guza oraz leszy wychwyt komórkowy w porównaniu z nanocząstkami obojętnymi i obdarzonymi ładunkiem ujemnym (https://doi.org/10.1016/j.nantod.2016.04.008). Przy tak rozwiniętej strukturze opracowane nanocząstki charakteryzują się niewielką średnicą i niskim współczynnikiem polidyspersji PDI.
Podsumowując, opracowane nanocząstki zapewniają wysoki stopień załadunku, redukcję początkowego wyrzutu leków oraz ich długotrwałe uwalnianie, dodatni potencjał zeta powalający na akumulację nośnika w tkance nowotworowej a także długotrwałą stabilność nanocząstki w obecności białek osocza powyżej 96 h.
Rozwiązania według wynalazków zostały zilustrowane poniższymi przykładami wykonania oraz rysunkami, gdzie Fig. 1.1. przedstawia przykładowy rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/1G mierzony za pomocą dynamicznego rozproszenia światła, Fig. 1.2 - przykładowy rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 1.3.A -widmo UV-Vis nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G rozpuszczonych w DMSO z dodatkiem kwasu chlorowodorowego według proporcji: 50 ul nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G, 50 uL 0,3M HCI, 50 uL PBS 7.4 oraz 850 uL DMSO, Fig. 1.3.B - krzywą kalibracyjną Staurosporyny rejestrowaną w roztworze: 50 uL 0,3M HCI, 100 uL PBS 7.4, 850 uL DMSO, Fig. 1.4 - Zależność zahamowania proliferacji komórek 8MGBA (glejak mózgu człowieka) od stężenia 17AAG wolnego oraz zamkniętego w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G, Fig. 1.5 - Zależność zahamowania proliferacji komórek A172 (glejak wielopostaciowy mózgu człowieka) od stężenia 17AAG wolnego oraz zamkniętego w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G, Fig. 1.6 - Zależność zahamowania proliferacji komórek Hs683 (glejak mózgu człowieka) od stężenia 17AAG wolnego oraz zamkniętego w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G, Fig. 1.7 - Zależność zahamowania proliferacji komórek LN-229 (glejak mózgu człowieka) od stężenia 17AAG wolnego oraz zamkniętego w nanocząstce
PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G, Fig. 1.8 - Zależność zahamowania proliferacji komórek LUDLU-1 (glejak mózgu człowieka) od stężenia 17AAG wolnego oraz zamkniętego w nanocząstce
PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G, Fig. 1.9 - Zależność zahamowania proliferacji komórek NCI-H226 (Ludzki rak płaskonabłonkowy płuca) od stężenia 17AAG wolnego oraz zamkniętego w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G, Fig. 1.10 - Zależność zahamowania proliferacji komórek NCI-H520 (Ludzki rak płaskonabłonkowy płuca) od stężenia 17AAG wolnego oraz zamkniętego w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G, Fig. 1.11 - Zależność zahamowania proliferacji komórek SK-MES-1 (Ludzki rak płaskonabłonkowy płuca) od stężenia 17AAG wolnego oraz zamkniętego w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G, Fig. 2.1 - Przykładowy rozkład potencjału Zeta nanocząstek
PLGA/PVA/LIPO/ST/3G przed dodatkiem surfaktantu, mierzony za pomocą dynamicznego rozprasza nia światła. Próbka rozcieńczona 20x wodą destylowaną, Fig. 2.1. - przykładowy rozkład wielkościpromieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/ST/4T mierzony za pomocą dynamicznego rozproszenia światła, Fig. 2.2. - pokazuje przykładowy rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/ST/4T mierzony za pomocą dynamicznego rozproszenia światła, Fig. 2.3A - widmo UV-Vis nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/ST/4T rozpuszczonych w DMSO z dodatkiem kwasu chlorowodorowego według proporcji: 25 uL nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/ST/4T, 50 uL 0,3M HCI, 75 uL PBS 7.4 oraz 850 uL DMSO, Fig. 2.3B - krzywą kalibracyjną Staurosporyny rejestrowaną w roztworze: 50 uL 0,3M HCI, 100 uL PBS 7.4, 850 uL DMSO, Fig. 2.4 - Zależność zahamowania proliferacji komórek A172 (glejak wielopostaciowy mózgu człowieka) od stężenia wolnej Staurosporyny oraz zamkniętej w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/ST/4T, Fig. 2.5 - Zależność zahamowania proliferacji komórek A172 (glejak wielopostaciowy mózgu człowieka) od stężenia wolnej Staurosporyny oraz zamkniętej w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/ST/4T. Fig. 2.6 - Zależność zahamowania proliferacji komórek Hs683 (glejak mózgu człowieka) od stężenia wolnej Staurosporyny oraz zamkniętej w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/ST/4T, Fig. 2.7 - Zależność zahamowania proliferacji komórek LN-229 (glejak mózgu człowieka) od stężenia wolnej Staurosporyny oraz zamkniętej w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/ST/4T, Fig. 2.8 - Zależność zahamowania proliferacji komórek LUDLU-1 (glejak mózgu człowieka) od stężenia wolnej Staurosporyny oraz zamkniętej w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/ST/4T, Fig. 2.9 - Zależność zahamowania proliferacji komórek NCI-H226 (ludzki rak płaskonabłonkowy płuca) od stężenia wolnej Staurosporyny oraz zamkniętej w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/ST/4T, Fig. 2.10 - Zależność zahamowania proliferacji komórek NCI-H520 (ludzki rak płaskonabłonkowy płuca) od stężenia wolnej Staurosporyny oraz zamkniętej w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/ST/4T, Fig. 2.11 - Zależność zahamowania proliferacji komórek SKMES-1 (ludzki rak płaskonabłonkowy płuca) od stężenia wolnej Staurosporyny oraz zamkniętej w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/ST/4T, Fig. 3.1A - przykładowy rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.1B - Przykładowy rozkład potencjału Zeta nanocząstek
PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 przed dodatkiem surfaktantu, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Próbka rozcieńczona 20x wodą destylowaną, Fig. 3.2. - wykres zależności średnicy hydrodynamicznej (HR) nanocząstek PLGA/PVA/17AAG/ST/Lipo_2 od temperatury rejestrowana w buforach o pH charakterystycznych dla endosomów i lizosomów (pH5, pH 6) oraz pH naturalnym (charakterystycznym dla krwioobiegu pH 7,4) dla nanocząstek po 24 h od syntezy oraz po 7 dniach od syntezy (dla pH 7,4), Fig. 3.3. - wykres zależności współczynnika polidyspersji PDI nanocząstek
PLGA/PVA/17AAG/ST/Lipo_2 od temperatury rejestrowana w buforach o pH charakterystycznych dla endosomów i lizosomów (pH 5, pH 6) oraz pH naturalnym (charakterystycznym dla krwioobiegu pH 7,4) dla nanocząstek po 24 h od syntezy oraz po 7 dniach od syntezy (dla pH 7,4), Fig. 3.4. - profil uwalniania leków (17AAG i Staurosporyny-ST) z nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w buforze PBS o pH 7,4 w porównaniu z oczyszczonymi nanocząstkami PLGA/PVA załadowanymi 17AAG oraz Staurosporyną (ST) ale nie poddanymi procesowi pokrywania nanocząstek otoczką lipidową, Fig. 3.5. profil uwalniania Staurosporyny (ST) i 17AAG z nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w buforze PBS 7,4 z dodatkiem 5% BSA w temperaturze 37°C, Fig. 3.6. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 po 1 h od dodatku 5% BSA i inkubowanych w temperaturze 37°C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.7. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 po 2h od dodatku 5% BSA i inkubowanych w temperaturze 37°C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.8. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 po 3 h od dodatku 5% BSA i inkubowanych w temperaturze 37°C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.9. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 po 4 h od dodatku 5% BSA i inkubowanych w temperaturze 37°C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.10. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 po 24 h od dodatku 5% BSA i inkubowanych w temperaturze 37°C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.11. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 po 48 h od dodatku 5% BSA i inkubowanych w temperaturze 37 °C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.12. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PlGa/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 po 96 h od dodatku 5% BSA i inkubowanych w temperaturze 37°C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.13. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PvA/LIPO/17AAG/ST_2 po 120 h od dodatku 5% BSA i inkubowanych
PL 248287 Β1 w temperaturze 37°C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.14. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA przed dodatkiem 5% BSA wT = 25°C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.15. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA po dodatku 5% BSA wT = 25°C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.16. - rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych nanocząstek PLGA/PVA po dodatku 5% BSA i inkubacji przez 1 godzinę wT = 37°C, mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, Fig. 3.17. - wykres zawartości procentowej Staurosporyny zamkniętej wewnątrz nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w odniesieniu do całkowitej zawartości leku w roztworach leków przechowywanych w buforze PBS o pH 7,4 bez oraz z dodatkiem substancji stabilizujących, Fig. 3.18. - wykres zawartości procentowej 17AAG zamkniętej wewnątrz nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w odniesieniu do całkowitej zawartości leku w roztworach leków przechowywanych w buforze PBS o pH 7,4 bez oraz z dodatkiem substancji stabilizujących, Fig. 3.19 - Zależność zahamowania proliferacji komórek 8MGBA (glejak mózgu człowieka) od stężenia mieszaniny wolnych leków 17AAG + Staurosporyny oraz leków zamkniętych w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2, Fig. 3.20 - Zależność zahamowania proliferacji komórek A172 (glejak wielopostaciowego mózgu człowieka) od stężenia mieszaniny wolnych leków 17AAG + Staurosporyny oraz leków zamkniętych w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2, Fig. 3.21. - Zależność zahamowania proliferacji komórek Hs683 (glejak mózgu człowieka) od stężenia mieszaniny wolnych leków 17AAG + Staurosporyny oraz leków zamkniętych w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2, Fig. 3.22. - Zależność zahamowania proliferacji komórek LN229 (glejak mózgu człowieka) od stężenia mieszaniny wolnych leków 17AAG + Staurosporyny oraz leków zamkniętych w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2, Fig. 3.23. - Zależność zahamowania proliferacji komórek LUDLU-1 (glejak mózgu człowieka) od stężenia mieszaniny wolnych leków 17AAG + Staurosporyny oraz leków zamkniętych w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2, Fig. 3.24. - Zależność zahamowania proliferacji komórek NCIH226 (ludzki rak płasko nabłonkowy płuca) od stężenia mieszaniny wolnych leków 17AAG + Staurosporyny oraz leków zamkniętych w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2, Fig. 3.25 - Zależność zahamowania proliferacji komórek NCI-H520 (ludzki rak płaskonabłonkowy płuca) od stężenia mieszaniny wolnych leków 17AAG + Staurosporyny oraz leków zamkniętych w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2, Fig. 3.26 - Zależność zahamowania proliferacji komórek SKMES-1 (ludzki rak płaskonabłonkowy płuca) od stężenia mieszaniny wolnych leków 17AAG + Staurosporyny oraz leków zamkniętych w nanocząstce PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST 2.
Tabela 1. Skład masowy oraz % ww nośników PLGA/PVA/LIPO
L.p NOŚNIK PLGA/PVA/LIPO
PLGA PVA DPPC Cholesterol DSPE-PEG(2000)NH2
[mg] % ' w/w [mg] [mg] *4’ i wAw [mg] >4 ” [mg] % wM 1 4 4 V 1
1 50 21 7, ·,ι· 150 19,5 9,75 4 24 0,78 Ó.34 ζ Al · । i * r r Ί *
2 100 30 3' p i 200 ńW łł 19,5 591 ł r 9,75 295 0,78 Λ • H <' ί 1
3 50 200 75® •. i·, .'ii i·1:! 9,7 3,6B > _ b i 4,9 ftSS ’ 1 Λ 0,39 '6,18’' , n’ f Ή
4 50 ^161 200 04,5 39 7 \ h· 12 58 19,5 β.?9 ,’V * 1,58 : 4 r ¢50 1 j <
5 80 25,8 200 64 5' Ϊ ( h 19,5 ^29 9,75 314, 0,78 G23 Ą ( 11 JA J _________________u
PL 248287 Β1
Tabela 2. Skład masowy nanoczastek PLGA/PVA/LIPO wraz z rozpuszczalnikami użytymi do tworzenia emulsji oraz dodatkiem leków i stabilizatora.
L.p. PLGA [mg] PVA [mg] DPPC [mg] Cholesterol [mg] DSPEPEG(2000) NH2 [mg] 17 AAG [mg] ST [mg] Faza organiczna/ Faza wodna Stabilizator- Surfaktant niejonowy / Glukoza / Brak (-)
PLGA/PVA /LIPO/17A AG/ST1 50,0 150,0 19,5 9,75 0,78 10 8,1 CH2CI2 /H2O (-)
PLGA/PVA /UPO/17A AG/ST_2 100,0 200,0 19,5 9,75 0,78 11,5 9,5 CH2CI2 / PBS 7,4 (-)
PLGA/PVA /LIPO/17A AG/ST_3 50,0 200,0 9,7 4,9 0,39 10 8,1 CH2CI2 /H2O (-)
PLGA/PVA /LIPO/17A AG/ST_4 50,0 200,0 39,0 19,5 1,56 10 8,1 CH2CI2 / h2o (-)
PLGA/PVA /LIPO/17A AG/ST_5 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 11,5 9,5 CH2CI2 / PBS 7,4 (-)
PLGA/PVA /LIPO/17A AG/3G 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 10 - CH2CI2 / PBS 7,4 Glukoza
PL 248287 Β1
PLGA/PVA /LIPO/17A AG/1T 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 10 - CHzCb / PBS 7,4 Surfaktant niejonowy
PLGA/PVA /LIP0/ST/1G 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 - 10 CH2CI2 / PBS 7,4 Glukoza
PLGA/PVA /LIP0/ST/4T 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 - 10 CH2CI2 / PBS 7,4 Surfaktant niejonowy
PLGA/PVA /LIPO/17A AG/ST/1G 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 8,4 1,7 CH2CI2 / PBS 7,4 Glukoza
PLGA/PVA /LIP0/17A AG/ST/1T 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 8,4 1,7 CH2CI2 / PBS 7,4 Surfaktant niejonowy
PLGA/PVA /LIP0/17A AG/ST/2G 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 10 2,0 CH2CI2 / PBS 7,4 Glukoza
PLGA/PVA /LIPO/17A AG/ST/2T 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 10 2,0 CH2CI2 / PBS 7,4 Surfaktant niejonowy
PLGA/PVA /LIP0/17A AG/ST/3G 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 10 1,0 CH2CI2 / PBS 7,4 Glukoza
PLGA/PVA /LIP0/17A AG/ST/3T 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 10 1,0 CH2CI2 / PBS 7,4 Surfaktant niejonowy
PLGA/PVA /LIPO/17A AG/ST/4G 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 5 1,0 CH2CI2 / PBS 7,4 Glukoza
PLGA/PVA /LIPO/17A AG/ST/4T 80,0 200,0 19,5 9,75 0,78 5 1,0 CH2CI2 / PBS 7,4 Surfaktant niejonowy
PL 248287 Β1
Tabela 3. Parametry fizykochemiczne nanoczastek PLGA/PVA/LIPO - rozmiar (promień hydrodynamiczny, HR), współczynnik polidyspersji (PDI), współczynniki enkapsulacji leków (% EE) oraz stosunek stężeń Ci?aag/Cst wyrażonych w mg/ml dla nanoczastek załadowanych więcej niż jednym lekiem.
L.p. Rozmiar/ HR [nm] SD PDI SD %EE 17AAG %EE ST C-I7AAG/ Cst
PLGA/PVA/LIPO 387,9 9,32 0,043 0,003 - - -
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST_1 223,7 3,21 0,087 0,011 55 75 0,91
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST_2 209,4 3,23 0,126 0,016 75 79 1,2
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST_3 214,6 1,25 0,097 0,023 32 63,5 0,62
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST_4 264,1 0,96 0,172 0,024 74,4 75 1,2
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST_5 237,0 2,56 0,030 0,010 79,2 74 1,3
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/3G 227,2 2,40 0,085 0,021 56 - -
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/1T 226,1 0,76 0,108 0,012 69,4 - -
PLGA/PVA/LIPO/ ST/1G 298,4 4,34 0,141 0,003 - 75,5 -
PLGA/PVA/LIPO/ ST/4T 298,9 3,40 0,122 0,016 - 79,5 -
PL 248287 Β1
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST/1G 220,2 0,65 0,076 0,031 53,4 61,5 4,3
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST/1T 225,6 3,03 0,033 0,017 60 84 3,5
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST/2G 245,2 3,5 0,166 0,0004 61,7 51,5 6,0
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST/2T 231,4 1,93 0,038 0,03 72,2 74,6 4,8
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST/3G 220,8 0,18 0,068 0,013 46,2 63 7,3
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST/3T 217,5 2,48 0,048 0,025 71 75 9,5
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST/4G 230,3 0,66 0,108 0,026 45,6 58,5 3,9
PLGA/PVA/LIPO/ 17AAG/ST/4T 216,7 2,2 0,019 0,015 60,2 75 4
Przykład I. Nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G
Odważono 200 mg PVA, 80 mg PLGA i 10,0 mg 17AAG, według Tabeli 2, dla nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/1G. PVA rozpuszczono w 10 ml buforu PBS 7.4 za pomocą ultradźwięków ok 1 h, aż do całkowitego rozpuszczenia kryształków PVA, następnie pozostawiono w lodówce na noc. PLGA rozpuszczono w 5 ml dichlorometanu i ultradźwiękowano 5 s. Następnie 17AAG rozpuszczono w roztworze PLGA. Schłodzono do 4°C (60 minut w lodówce). Następnie do dużego naczynka szklanego (buteleczka 50 ml) dodano roztwór dichlorometanu z PLGA i 17AAG a następnie roztwór wodny PVA, ponownie schłodzono w lodówce przez 30 minut. Po tym czasie całość mieszano, aż do uzyskania emulsji za pomocą sondy ultradźwiękowej przez 1 minutę, amplituda 80%. Sonda ultradźwiękowa zanurzona została na granicy pomiędzy dwoma fazami około 5 mm nad granicą faz. Otrzymaną emulsję przelano do krystalizatora o pojemności 100 ml z elementem mieszającym upewniając się, że całość emulsji została przeniesiona do krystalizatora. Butelkę przemyto 2 ml PBS 7.4 (roztwór po przemyciu umieszczono w krystalizatorze). Całość pozostawiono na mieszadle magnetycznym przez 12 h (400 RPM, 37°C) aż do całkowitego odparowania dichlorometanu. Roztwór uzupełniono do 15 ml za pomocą buforu PBS o pH 7,4. Do butelek szklanych (10 ml) z elementem mieszającym dodano po 1 ml nanocząstki PLGA/PVA załadowanych 17AAG (nieoczyszczonych) a następnie 200 uL liposomów (DPPC/Cholesterol/DSPE_PEG(2000)NH2 (1/0,5/0,04) 10 mg/ml) syntezowanych w 0.9% NaCI. Próbki ogrzewano w łaźni wodnej przez 4 h, 45°C, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego z grzaniem (400 RPM). Następnie pozostawiono w lodówce przez 12 h. 0,5ml próbki pozostawiono do oznaczenia współczynnika enkapsulacji % EE za pomocą metody chromatograficznej na kolumnie z wypełnieniem Sephadex G-25. Resztę nanocząstek oczyszczono za pomocą wirówki wysokoobrotowa (15000 RPM, 4 min), dwukrotnie przemywając buforem PBS 7.4. Po każdorazowym dodatku PBS 7.4 redyspersowano nanocząstki za pomocą ultradźwięków przez 5 sekund. Zmierzono potencjał Zeta nanocząstek i przedstawiono na Fig. 1.1. Po ostatnim dodatku buforu PBS 7,4 do nanocząstek dodano 20 μL roztworu glukozy (100 mg/ml) na każdy 1 ml nanocząstek. Otrzymano w ten sposób nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G. Następnie wyznaczono rozmiar i współczynnik polidyspersji nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G za pomocą metody DLS. Kolejno nanocząstki poddano sterylizacji za pomocą sterylnych filtrów strzykawkowych z wypełnieniem hydrofilowym PTFE o średnicy porów 0,45 μm i ponownie wyznaczono rozmiar i PDI. Fig. 1.2 przedstawia rozkład promieni hydrodynamicznych dla nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G wraz ze współczynnikiem polidyspersji PDI po procesie sterylizacji.
Stężenie załadowanych leków oraz współczynnik % EE wyznaczono za pomocą spektroskopii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej przy długościach fali 333 nm. Próbkę nanocząstek rozpuszczono w DMSO z dodatkiem kwasu chlorowodorowego według proporcji: 50 uL próbki, 50 uL 0,3 M HCI, 50 uL PBS 7.4 oraz 850 uL DMSO i wykonano widmo. Widmo zamieszczono na rysunku fig. 1.3A i Fig. 1.3B.
Dodatkowo oceniono aktywności antyproliferacyjnej nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G w porównaniu do wolnego leku. Hodowane in vitro komórkowi nowotworowe nowotworów płuc i glejaków wysiewane były na jałowe płytki 384-dołkowe w liczbie 1 000 komórek na dołek. Po 24-godzinnej inkubacji (37°C, 5% CO2, wilgotność 95%) komórki traktowane były roztworami 17AAG lub nanocząstkami PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G w co najmniej 8 różnych stężeniach. Następnie komórki inkubowano przez 72 godziny (37°C, 5% CO2, wilgotność 95%) i oceniano zahamowanie wzrostu komórek z wykorzystaniem testu SRB. W skrócie, białko w każdym z dołków testowych strącane było 20% roztworem kwasu trichlorooctowego przez 1 godzina, płukane i znakowane z wykorzystaniem 0,4% roztworu sulforodaminy B w 1% kwasie octowym (30 minut). Po odpłukaniu nadmiaru barwnika za pomocą 1% roztworu kwasu octowego związany z białkami barwnik rozpuszczany był w 10 mM roztworze buforu TRIS (30 minut) a poziom absorbancji odczytywany był z użyciem spektrofotometru przy długości fali 540 nm. Zahamowanie proliferacji obliczone zostało z użyciem wzoru:
% Zahlnh = ((^P_ ^m)x 100) - 100 gdzie:
% Zahlnh - zahamowanie proliferacji
Am - absorbancja dołków bez komórek (medium)
Ak - absorbancja dołków kontrolnych (komórki traktowane czystym medium hodowlanym)
Ap - absorbancja dołków traktowanych związkami
Wyniki przedstawione zostały na rysunkach fig. 1.4-1.11
Wnioski: Lek 17-AAG po załadowaniu do opracowanych nanonośników wykazał aktywność antyproliferacyjną co najmniej porównywalna do tej wykazywanej przez wolny. W przypadku znacznej części linii obserwowano istotny wzrost aktywności związku 17AAG po załadowaniu do nanośnika w szczególności dla niższych stężeń leku co wskazuje na możliwość obniżenia dawek terapeutycznych PLGA/PVA/LIPO/17AAG/3G w stosunku do wolnego 17AAG przy zachowaniu wymaganej aktywności przeciwnowotworowej.
Przykład II. Nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/ST/4T
Odważono 200 mg PVA, 80 mg PLGA, według Tabeli 2, dla nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/ST/$T. PVA rozpuszczono w 10 ml buforu PBS 7.4 za pomocą ultradźwięków - ok 1 h, aż do całkowitego rozpuszczenia kryształków PVA, następnie pozostawiono w lodówce na noc. PLGA rozpuszczono w 5 ml dichlorometanu i ultradźwiękowano 5 s. Następnie odważono 10 mg Staurosporyny i rozpuszczono w roztworze PLGA. Schłodzono do 4°C (30 minut w lodówce). Następnie do dużego naczynka szklanego (buteleczka 100 ml) dodano roztwór dichlorometanu z PLGA i Staurosporyną, oraz roztwór wodny PVA, ponownie schłodzono w lodówce przez 30 minut. Po tym czasie całość mieszano, aż do uzyskania emulsji za pomocą sondy ultradźwiękowej przez 2 minuty, amplituda 80%. Sonda ultradźwiękowa zanurzona została na granicy pomiędzy dwoma fazami około 5 mm nad granicą faz. Otrzymaną emulsję przelano do krystalizatora o pojemności 50 ml z elementem mieszającym upewniając się, że całość emulsji została przeniesiona do krystalizatora. Butelkę przemyto 2 ml PBS 7.4 (roztwór po przemyciu umieszczono w krystalizatorze). Całość pozostawiono na mieszadle magnetycznym przez 2 h (400 RPM, 37°C) aż do całkowitego odparowania dichlorometanu. Roztwór uzupełniono do 15 ml za pomocą buforu PBS o pH 7,4. Do butelek szklanych (10 ml) z elementem mieszającym dodano po 1 ml nanocząstki PLGA/PVA załadowanych Staurosporyną (nieoczyszczonych) a następnie 200 uL liposomów (DPPC/Cholesterol/DSPE_PEG(2000)NH2 (1/0,5/0,04) 10mg/ml) syntezowanych w 0.9% NaCI. Próbki ogrzewano w łaźni wodnej przez 2 h, 60°C, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego z grzaniem (400 RPM). Następnie pozostawiono w lodówce przez 14 h . 0,5 ml próbki pozostawiono do oznaczenia współczynnika enkapsulacji % EE za pomocą metody chromatograficznej na kolumnie z wypełnieniem Sephadex G-25. Resztę nanocząstek oczyszczono za pomocą wirówki wysokoobrotowa (15000 RPM, 4 min), dwukrotnie przemywając buforem PBS 7.4. Po każdorazowym dodatku PBS 7.4 redyspersowano nanocząstki za pomocą ultradźwięków przez 5 sekund. Zmierzono potencjał Zeta nanocząstek, przedstawiono na rysunku Fig. 2.1. Po ostatnim dodatku buforu PBS 7,4 do nanocząstek dodano 20 μL 40% roztworu surfaktantu niejonowego na każdy 1 ml nanocząstek. Otrzymano w ten sposób nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/ST/4T. Następnie wyznaczono rozmiar i współczynnik polidyspersji nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/ST/4T za pomocą metody DLS. Kolejno nanocząstki poddano sterylizacji za pomocą sterylnych filtrów strzykawkowych z wypełnieniem hydrofilowym PTFE o średnicy porów 0,45 μm i ponownie wyznaczono rozmiar i PDI. Fig. 2.2 przedstawia rozkład promieni hydrodynamicznych dla nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/ST/4T wraz ze współczynnikiem polidyspersji PDI po procesie sterylizacji.
Stężenie załadowanej staurosporyny oraz współczynnik % EE wyznaczono za pomocą:
- spektroskopii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej przy długościach 372, 294 oraz 353 nm. Próbkę nanocząstek rozpuszczono w DMSO z dodatkiem kwasu chlorowodorowego według proporcji: 25 uL próbki, 50 uL 0,3M HCI, 75 uL PBS 7.4 oraz 850 uL DMSO i wykonano widmo, jak przedstawiono na Fig. 2.3.
- metodą chromatograficzną, oczyszczając 0,5 ml próbki końcowych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/ST/4T. Oczyszczanie przeprowadzono na kolumnach chromatograficznych z wypełnieniem Sephadex G-25. Po nałożeniu 0,5 ml próbki nieoczyszczonych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/ST/4T na kolumnę z wypełnieniem Sephadex G-25 zebrano 8 frakcji o objętości 1 ml za pomocą buforu PBS o pH 7,4. Zawartość każdej frakcji kontrolowano za pomocą spektroskopii UV-Vis. Frakcje 3-5 zawierające nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/ST/4T zlano razem i wyznaczono stężenie leków w nanocząstkach za pomocą spektroskopii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej. Próbkę PLGA/PVA/LIPO/ST/4T rozpuszczono w DMSO z dodatkiem kwasu chlorowodorowego według proporcji: 50 uL próbki, 50 uL 0,3M HCI, 50 uL PBS 7.4 oraz 850 uL DMSO. Kolejno z kolumny eluowano niezwiązaną z nanocząstkami Staurosporynę przemywając kolumnę chromatograficzną 25 ml roztworu 50% alkoholu etylowego. Wyznaczono stężenie niezwiązanej staurosporyny względem krzywej kalibracyjnej Staurosporyny w 50% etanolu przy długości fali 372, 294 oraz 353 nm.
W yniki obliczeń % EE zamieszczono w zbiorczej Tabeli 3.
Dodatkowo oceniono aktywności antyproliferacyjnej nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/ST/4T w porównaniu do wolnej Staurosporyny. Hodowane in vitro komórkowi nowotworowe nowotworów płuc i glejaków wysiewane były na jałowe płytki 384-dołkowe w liczbie 1 000 komórek na dołek. Po 24-godzinnej inkubacji (37°C, 5% CO2, wilgotność 95%) komórki traktowane były roztworami Staurosporyny lub nanocząstkami PLGA/PVA/LIPO/ST/4T w co najmniej 8 różnych stężeniach. Następnie komórki inkubowano przez 72 godziny (37°C, 5% CO2, wilgotność 95%) i oceniano zahamowanie wzrostu komórek z wykorzystaniem testu SRB. W skrócie, białko w każdym z dołków testowych strącane było 20% roztworem kwasu trichlorooctowego przez 1 godzinę, płukane i znakowane z wykorzystaniem 0,4% roztworu sulforodaminy B w 1% kwasie octowym (30 minut). Po odpłukaniu nadmiaru barwnika za pomocą 1% roztworu kwasu octowego związany z białkami barwnik rozpuszczany był w 10 mM roztworze buforu TRIS (30 minut) a poziom absorbancji odczytywany był z użyciem spektrofotometru przy długości fali 540nm. Zahamowanie proliferacji obliczone zostało z użyciem wzoru:
% Zahlnh = ((^P_ ^m)x 100) - 100 gdzie:
% Zahlnh - zahamowanie proliferacji
Am - absorbancja dołków bez komórek (medium)
Ak - absorbancja dołków kontrolnych (komórki traktowane czystym medium hodowlanym)
Ap - absorbancja dołków traktowanych związkami
Wyniki przedstawione zostały na fig. 2.3-2.11
Wnioski: Staurosporyną po załadowaniu do opracowanych nanonośników wykazała aktywność antyproliferacyjną co najmniej porównywalna do tej wykazywanej przez wolną Staurosporyną. W przypadku części linii obserwowano istotny wzrost aktywności związku 17AAG po załadowaniu do nanośnika co wskazuje na możliwość obniżenia dawek terapeutycznych PLGA/PVA/LIPO/ST/4T w stosunku do wolnej Staurosporyny przy zachowaniu aktywności przeciwnowotworowej.
Przykład III. Nanocząstka PLGA/PvA/LIPO/17AAG/ST - nanocząstka polimerowa ładowana Staurosporyną i 17AAG pokrywana dwuwarstwy lipidową DPPC/Cholestrol/DSPE_PEG(2000)NH2
Odważono 200 mg PVA, 100 mg PLGA, 9,5 mg Staurosporyny i 11,5 mg 17AAG, według Tabeli 2, dla nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2. PVA rozpuszczono w 10 ml buforu PBS 7.4 za pomocą ultradźwięków - ok 1 h, aż do całkowitego rozpuszczenia kryształków PVA, następnie pozostawiono w lodówce na noc. PLGA, Staurosporyną i 17AAG rozpuszczono w 5 ml dichlorometanu i ultradźwiękowano 5 s. Schłodzono do 4°C (30 minut w lodówce). Następnie do dużego naczynka szklanego (buteleczka 50 ml) dodano roztwór dichlorometanu z PLGA, Staurosporyną i 17AAG a następnie roztwór wodny PVA, ponownie schłodzono w lodówce przez 30 minut. Po tym czasie całość mieszano, aż do uzyskania emulsji za pomocą sondy ultradźwiękowej przez 1,5 minuty, amplituda 80%. Sonda ultradźwiękowa zanurzona została na granicy pomiędzy dwoma fazami około 5 mm nad granicą faz. Po sonifikacji otrzymano jednorodną emulsję. Emulsję przelano do krystalizatora o pojemności 50 ml z elementem mieszającym upewniając się, że całość emulsji została przeniesiona do krystalizatora. Butelkę przemyto 2 ml PBS 7.4 (roztwór po przemyciu umieszczono w krystalizatorze). Całość pozostawiono na mieszadle magnetycznym przez 2 h (400 RPM, 37°C) aż do całkowitego odparowania dichlorometanu. Następnie uzupełniono roztwór do 15 ml za pomocą buforu PBS o pH7,4. Do 4 butelek szklanych (10 ml) z elementem mieszającym dodano po 1 ml nanocząstki PLGA/PVA załadowanych Staurosporyną i 17AAG (nieoczyszczonych) a następnie 200 uL liposomów (DPPC/Cholesterol/DSPE_PEG(2000)NH2 (1/0,5/0,04) 10 mg/ml) syntezowanych w 0.9% NaCI. Próbki ogrzewano w łaźni wodnej przez 3 h, 50°C, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego z grzaniem (400 RPM). Następnie pozostawiono w lodówce przez 16 h. 0,5 ml próbki pozostawiono do oznaczenia współczynnika enkapsulacji % EE za pomocą metody chromatograficznej na kolumnie chromatograficznej. Resztę nanocząstek oczyszczono za pomocą wirówki wysokoobrotowa (15000 RPM, 4 min), dwukrotnie przemywając buforem PBS 7.4. Po każdorazowym dodatku PBS 7.4 redyspersowano nanocząstki za pomocą ultradźwięków przez 5 sekund. Otrzymano w ten sposób nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2. Następnie wyznaczono rozmiar i współczynnik polidyspersji nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 za pomocą metody DPL. Kolejno nanocząstki poddano sterylizacji za pomocą sterylnych filtrów strzykawkowych z wypełnieniem hydrofilowym PTFE o średnicy porów 0,45 μm i ponownie wyznaczono rozmiar, PDI oraz potencjał Zeta nanocząstek. Fig. 3.1 A przedstawia rozkład promieni hydrodynamicznych dla nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 wraz ze współczynnikiem polidyspersji PDI po procesie sterylizacji. Fig. 3.1 B przedstawia rozkład potencjału Zeta.
Stężenie załadowanych leków oraz współczynnik % EE wyznaczono za pomocą:
- spektroskopii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej przy długościach fali 372 nm i 333 nm, korzystając z zasady addytywności absorbancji. Próbkę nanocząstek rozpuszczono w DMSO z dodatkiem kwasu chlorowodorowego według proporcji: 50 uL próbki, 50 uL 0,3M HCI, 50 uL PBS 7.4 oraz 850 uL DMSO i wykonano widmo,
- metodą chromatograficzną, oczyszczając 0,5 ml próbki końcowych nanocząstek
PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2. Oczyszczanie przeprowadzono na kolumnach Sephadex z rozdzieleniem leków. Po nałożeniu 0,5 ml próbki nieoczyszczonych nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 na kolumnę z wypełnieniem Sephadex G-25 zebrano 8 frakcji o objętości 1 ml za pomocą buforu PBS o pH 7,4. Zawartość każdej frakcji kontrolowano za pomocą spektroskopii UV-Vis. Frakcje 4-7 zawierające nanocząstki PLGA/PVA/17AAG/ST zlano razem i wyznaczono stężenie leków na nanocząstkach za pomocą spektroskopii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej, korzystając z zasady addytywności absorbancji poprzez rozpuszczenie próbki z frakcji 4-7 w DMSO z dodatkiem kwasu chlorowodorowego według proporcji: 50 uL próbki, 50 uL 0,3M HCI, 50 uL PBS 7.4 oraz 850 uL DMSO. Kolejno z kolumny eluowano niezwiązany z nanocząstkami 17AAG przemywając kolumnę chromatograficzną 25 ml buforu PBS o pH 7,4 i wyznaczono stężenie niezwiązanego 17AAG względem krzywej kalibracyjnej 17AAG w buforze PBS przy długości fali 333 nm. Następnie wymyto z kolumny niezwiązaną z nanocząstkami Staurosporynę poprzez przemywanie kolumny ml roztworu Etanol:Woda (1:1). Stężenie wolnej Staurosporyny wyznaczono za pomocą spektroskopii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej przy długości fali 372, 294 oraz 353 nm. Wyniki zamieszczono w zbiorczej Tabeli 3.
Sprawdzono stabilność nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST w zakresie temperatur od 25 do 45°C w pH endosomalnym/lizosomalnym (pH 5, pH 6) i pH charakterystycznym dla krwioobiegu (pH 7,4) po 24 godzinach od syntezy oraz po 7 dniach przechowywania w temperaturze 4°C dla pH 7,4.
Rysunek 3.2 oraz 3.3 przedstawiają zależności średnicy hydrodynamicznej (HR) nanocząstek PLGA/PVA/17AAG/ST/Lipo_2 oraz współczynnika PDI w zakresie temperatur od 25°C do 45°C w buforach o pH charakterystycznych dla endosomów i lizosomów (pH 5, pH 6) oraz pH neutralnym (pH 7,4) dla nanocząstek po 24 h od syntezy oraz po 7 dniach od syntezy (w pH 7,4).
Brak istotnych zmian w średnicy hydrodynamicznej od współczynnika PDI dla zakresu temperatur od 25°C do 45°C w pH 5, 6 oraz 7,4 świadczy o stabilności nanocząstek PLGA/PVA/17AAG/ST/Lipo_2 w badanym zakresie temperatury, pH oraz po czasie.
Dla nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 na Fig. 3.4 przedstawiono kinetykę uwalniania leków w buforze PBS o pH 7,4 w porównaniu z oczyszczonymi nanocząstkami PLGA/PVA załadowanymi 17AAG oraz Staurosporyną (ST) ale nie poddanym procesowi pokrywania nanocząstek otoczką lipidową.
W przypadku nanocząstek PLGA/PVA załadowanych 17AAG i ST nie poddanych procesowi pokrywania dwuwarstwy lipidową uwalnianie 17AAG już po 5 h osiągało wartość bliską 30% natomiast po 24 h osiągnęło wartość 45% podczas gdy nanocząstki pokrywane warstwą lipidu PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST charakteryzują się brakiem wyrzutu leku oraz stopniowym uwalnianiem 17AAG o wartości średniej: 10% po 5 h, 25% po 24 h oraz 30% po 48 h. Wartość średniego uwalniania ST po czasie był niezależny od obecności otoczki lipidowo-polimerowej.
Dalej zbadano wpływ białka na ilość uwalnianych leków w temperaturze 37°C w czasie. Na Fig. 3.5 przedstawiono przykładowy profil uwalniania 17AAG oraz ST w buforze PBS w obecności 5% BSA rejestrowany w temperaturze 37°C.
W obecności %5 BSA nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 wykazują średnie uwalnianie obu leków 17AAG i ST na poziomie 30% zarówno po 24 h jak i 48 h. Po 72 h obserwuje się uwolnienie obu leków na poziomie 55%. Dla nanocząstek PLGA/PVA/17AAG/ST/Lipo_2 nie obserwowano nagłego wyrzutu leków z nanocząstki do 48 h, leki uwalniają się stopniowo.
Zbadano stabilność struktur nanocząstki na przykładzie nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w buforze PBS 7,4 w dodatkiem 5% albuminy wołowej BSA w celu wykluczenia agregacji nanocząstek w badaniach in vitro i in vivo. Albuminy są białkami występującymi najliczniej w krwioobiegu oraz są stosowane jako dodatek do medium komórkowego w badaniach in vitro. Rozkład wielkości promieni hydrodynamicznych dla nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 po dodatku 5% albuminy wołowej po czasie 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 24 h, 28 h, 96 h oraz 120 h przedstawiono na Fig. 3.6-3.13. Dodatkowo wykonano tożsame testy dla nanocząstek PLGA/PVA ale nie poddanych procesowi okrywania dwuwarstwą lipidową. Rozkład promieni hydrodynamicznych dla liposomów PLGA/PVA przed oraz po dodatku 10% roztworu BSA w stosunku objętościowym (1:1) w czasie T=0 w temperaturze 25°C oraz po godzinie inkubacji w 37°C przedstawiono na Fig. 3.14-3.16.
Po dodatku 5% BSA do roztworu nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 zaobserwowano niewielki wzrost promienia średniego promienia hydrodynamicznego nanocząstki świadczący o oddziaływaniu nanocząstki z albuminą wołową i osadzeniu się niewielkiej ilości białka na powierzchni nanocząstki. Nie zaobserwowano pojawienia się większych nanostruktur co świadczy o stabilności nanocząstek w obecności białka osocza. Dopiero po 120 h inkubacji w temperaturze 37°C w obecności BSA obserwowano pojawienie się sygnału od niewielkiej ilości większych struktur powyżej 1 um świadczące o początkowej utracie stabilności przez nanocząstki. Powyższe wyniki wskazują, że nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 są stabilne w obecności białek nawet do 120 h. W przeciwieństwie do nanocząstek pokrywanych warstwą lipidową, nanocząstki PLGA/PVA pozbawione osłonki lipidowej ulegają agregacji w 5% BSA, co świadczy o ich niestabilności w obecności białek osocza.
Wykonano badania stabilności nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w trakcie przechowywania w trzech różnych roztworach: w roztworze glukozy o stężeniu 2 mg/ml, w 0,8 % roztworze Tween 20 oraz 0,1 M buforze PBS o pH 7,4. Pomiary wykonywano w odstępach tygodniowych przez 4 kolejne tygodnie. Wszystkie zebrane frakcje i badane roztwory przechowywano w lodówce (temp. 4°C -7°C) do kolejnych pomiarów.
Każdorazowo określono stężenia leków (staurosporyny oraz 17-AAG) dla każdej z 3 badanych próbek. W tym celu w kuwetach akrylowych przygotowano roztwory zawierające 50 μl badanej próbki,
PL 248287 Β1 μΙ 0,3 Μ roztworu HCI, 50 μΙ buforu PBS o pH 7,4 oraz 850 μΙ DMSO (20-krotne rozcieńczenie). Następnie za pomocą spektrofotometru UV-Vis zarejestrowano absorbancję tak przygotowanych roztworów. Stężenia leków wyznaczano względem krzywych kalibracyjnych korzystając z zasady addytywności absorbancji.
W kolejnym etapie, powtarzanym analogicznie przez 4 tygodnie dla każdej z trzech badanych próbek, wyznaczono średnice hydrodynamiczne i współczynniki polidyspersji (PDI) za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Dane zestawiono w Tabeli 4.
Tabela 4. Wartości średnic hydrodynamicznych i współczynników polidyspersji PDI dla nanocząstek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 mierzone po czasie 0, 7, 14, 21, 28 dni przechowywania w temperaturze 4°C-7°C z dodatkiem środków stabilizujących.
PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w roztworze glukozy 2 mg/ml
Czas [dni] Średnica hydrodynamiczna [nm] SD PDI SD
0 305,4 60,33 0,197 0,010
7 293,7 27,88 0,229 0,030
14 377,5 25,50 0,210 0,026
21 417,3 51,48 0,205 0,026
28 370,4 69,20 0,223 0,024
PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w 0,8 % roztworze Tween 20
Czas [dni] Średnica hydrodynamiczna [nm] SD PDI SD
0 254,2 19,46 0,141 0,025
7 234,3 4,14 0,229 0,030
14 265,2 14,34 0,126 0,019
21 249,7 6,57 0,177 0,027
28 256,9 7,15 0,087 0,002
PL 248287 Β1
PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w 0,1 M buforze PBS 7,4
Czas [dni] Średnica hydrodynamiczna [nm] SD PDI SD
0 255,60 31,46 0,189 0,025
7 307,20 46,80 0,183 0,019
14 272,70 24,56 0,196 0,043
21 270,80 13,02 0,158 0,026
28 285,40 4,79 0,181 0,020
Dodatkowo kontrolowano wyciek leków z nanocząstek z użyciem metod chromatograficznych na złożu Sephadex G-50.
Na wcześniej przygotowaną kolumnę nakładano po 200 μΙ próbki, do kuwet akrylowych zbierano kolejno 4 frakcje po 1 ml, 4 frakcje po 0,5 ml oraz 2 frakcje po 1 ml. Po zebraniu 10 frakcji badano ich absorbancję w zakresie długości fal 220-800 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Na podstawie widm UV-Vis wykrywano frakcję liposomalne i zlewano razem. Pozostałe frakcje zawierające wolny lek (17AAG) niezwiązany z nanocząstkami przenoszono do kolby miarowej i dalej wymywano z kolumny buforem PBS o pH 7,4, aż do objętości 25 ml. Kolejno kolumnę przemywano 50% roztworem alkoholu etylowego w celu wymycia z kolumny niezwiązanej z nanocząstkami Staurosporyny. W zależności od próbki zbierano od 25 ml do 35 ml roztworu. Następnie wyznaczono stężenie wolnej Staurospotyny za pomocą spektrofotometrii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej.
Stężenie leków we frakcjach liposomalnych wyznaczano za pomocą spektrofotometrii UV_Vis analogicznie do całkowitego stężenia leków. W kuwetach akrylowych przygotowano roztwory zawierające 100 μΙ frakcji liposomalnej badanej próbki, 50 μΙ 0,3 M roztworu HCI oraz 850 μΙ DMSO. Roztwory mieszano za pomocą pipety automatycznej, po czym mierzono ich absorbancję i wyznaczono stężenia leków względem krzywych kalibracyjnych korzystając z zasady addytywności absorbancji.
Zawartość leków z nanocząstkach PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 przechowywaniu po czasie 0, 7, 14, 21 i 28 dni przedstawiona została na Fig. 3.17 dla staurosporyny oraz Fig. 3.18 dla 17AAG.
Nanocząstki PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 charakteryzują się stosunkowo niskim, akceptowalnym stopniem wycieku leków z nanocząstki na poziomie do 15% w przeciągu 4 tygodni przechowywania w temperaturze 4°C-7°C. Dodatek substancji stabilizujących typu glukoza, czy niejonowe środki powierzchniowo czynne eliminuje wyciek leku z nanocząstki.
Sprawdzono stabilność parametrów fizycznych po 4 miesiącach od syntezy.
Dane zebrano w Tabeli 5.
PL 248287 Β1
Tabela 5. Parametry fizyczne nanoczastek PLGA/PVA/LIPO po syntezie oraz po 4 miesiącach od syntezy.
PLGA/ PVA/ LIPO/ 17AAG/ ST/ Po syntezie 4 miesiące po syntezie
ZAverage [nm] ± Z- average [nm] PDI ± PDI ZAverage [nm] ± Z- average [nm] PDI ± PDI
1G 220,20 0,65 0,08 0,03 223,00 4,94 0,11 0,04
1T 225,60 3,03 0,03 0,02 213,30 3,11 0,04 0,01
2G 245,20 3,50 0,17 0,00 224,30 3,37 0,02 0,01
2T 231,40 1,93 0,04 0,03 217,60 4,62 0,02 0,02
3G 220,80 0,18 0,07 0,01 232,30 9,98 0,19 0,04
3T 217,50 2,48 0,05 0,03 205,60 4,39 0,01 0,01
4G 230,30 0,66 0,11 0,03 228,80 5,14 0,16 0,07
4T 216,70 2,20 0,02 0,02 207,90 0,03 0,03 0,01
Dodatkowo oceniono aktywności antyproliferacyjnej nanoczastek PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w porównaniu do mieszaniny wolnych leków 17AAG + Staurosporyna. Hodowane in vitro komórkowi nowotworowe nowotworów płuc i glejaków wysiewane były na jałowe płytki 384-dołkowe w liczbie 1 000 komórek na dołek. Po 24-godzinnej inkubacji (37°C, 5% CO2, wilgotność 95%) komórki traktowane były roztworami mieszaniny leków 17AAG + Staurosporyny lub nanocząstkami PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w co najmniej 8 różnych stężeniach względem leku bardziej aktywnego przeciwnowotworowo - Staurosporyny. Następnie komórki inkubowano przez 72 godziny (37°C, 5% CO2, wilgotność 95%) i oceniano zahamowanie wzrostu komórek z wykorzystaniem testu SRB. W skrócie, białko w każdym z dołków testowych strącane było 20% roztworem kwasu trichlorooctowego przez 1 godzina, płukane i znakowane z wykorzystaniem 0,4% roztworu sulforodaminy B w 1% kwasie octowym (30 minut). Po odpłukaniu nadmiaru barwnika za pomocą 1% roztworu kwasu octowego związany z białkami barwnik rozpuszczany był w 10 mM roztworze buforu TRIS (30 minut) a poziom absorbancji odczytywany był z użyciem spektrofotometru przy długości fali 540 nm. Zahamowanie proliferacji obliczone zostało z użyciem wzoru:
//4 _ Δ \ \ %Zahlnh = [ p _ m)x 100 - 100 gdzie:
%ZahInh - zahamowanie proliferacji
Am - absorbancja dołków bez komórek (medium)
Ak - absorbancja dołków kontrolnych (komórki traktowane czystym medium hodowlanym)
Ap - absorbancja dołków traktowanych związkami
Wyniki przedstawione zostały na fig. 3.19-3.2
Wnioski: Mieszanina leków 17AAG + Staurosporyna po załadowaniu do opracowanych nanonośników wykazała aktywność antyproliferacyjną znacznie wyższą od mieszaniny wolnych leków 17AAG + Staurospotyna. Stwarza to możliwość znacznego obniżenia dawek teraupeutycznych PLGA/PVA/LIPO/17AAG/ST_2 w stosunku do wolnej Staurosporyny przy zachowaniu wysokiej aktywności przeciwnowotworowej.

Claims (20)

1. Stabilna nanocząstka polimerowo-lipidowa do wiązania i dostarczania leków, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych znamienna tym, że złożona jest z rdzenia zawierającego kwas polimlekowo-ko-glikolowy (PLGA) w ilości od 16,1 do 30,3% wagowych oraz alkohol poliwinylowy (PVA) w ilości od 60,6 do 75,5% wagowych oraz otoczki rdzenia zawierającej mieszankę lipidów: 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DPPC) w ilości od 3,66% do 12,6% wagowych, cholesterol w ilości od 1,85 do 6,29% wagowych oraz sól amonową 1,2--distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)2000 (DSPE-PEG(2000)NH2] w ilości od 0,15 do 0,5% wagowych.
2. Nanocząstka według zastrz. 1 znamienna tym, że PLGA stanowi kopolimer 50:50 o masie Mw 24 000-38 000 g/mol.
3. Nanocząstka według zastrz. 1 znamienna tym, że PVA ma masę Mw 30 000-70 000 g/mol.
4. Sposób wytwarzania stabilnych nanocząstek polimerowo-lipidowych przenoszących leki, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych, znamienny tym, że
- w pierwszym etapie uzyskuje się rdzeń w taki sposób, że sporządza się klarowny roztwór wodny PVA o stężeniu od 15 mg/ml do 20 mg/ml, po czym sporządza się roztwór PLGA w dichlorometanie o stężeniu od 10 mg/ml do 20 mg/ml, następnie odważa się co najmniej jeden lek w ilości potrzebnej do sporządzenia roztworów o przedziale stężeń od 0,43 mM do 4,30 mM i rozpuszcza w roztworze PLGA, po czym schładza się oba roztwory do temperatury od 4°C do 7°C, a następnie miesza w stosunku objętościowym 1:2, gdzie na jedną część roztworu PLGA w dichlorometanie z dodatkiem leku przypadają dwie części wodnego roztworu PVA i ponownie schładza do temperatury 4°C do 7°C i całość miesza się do uzyskania emulsji; emulsję przelewa się do krystalizatora z elementem mieszającym, a jej pozostałości wypłukuje się buforem PBS o pH 7.4 lub wodą w stosunku objętościowym roztworu płuczącego (PBS lub woda) do mieszaniny reakcyjnej od 1:7,5 do 1:10 i również umieszcza w krystalizatorze, po czym całkowicie odparowuje się dichlorometan, następnie uzupełnia się objętość roztworem PBS 7.4 lub wodą do uzyskania końcowego stężenia PLGA na poziomie od 3,33 mg/ml do 6,67 mg/ml,
- w drugim etapie wytworzony uprzednio rdzeń pokrywa się liposomami DPPC/Cholesterol/DSPE-PEG(2000)NH2 (1,0/0,61/0,040), zsyntetyzowanymi wybraną metodą, a następnie powstały film lipidowy hydratuje za pomocą sterylnego roztworu soli fizjologicznej NaCI 0,9% do uzyskania sumarycznego stężenia lipidów równego 10 mg/ml i dysperguje za pomocą ultradźwięków otrzymując roztwór liposomów DPPC/Cholesterol/DSPE-PEG(2000)NH2 jako półprodukt do dalszej syntezy; następnie otrzymane liposomy dodaje się do rdzeni polimerowych PVA/PLGA nie poddanych procesowi oczyszczania na kolumnach Sephadex w stosunku objętościowym liposomów do rdzeni polimerowych od 0,1:1 do 0,3:1, po czym całość podgrzewa się do temperatury od 45 do 60°C przez od 2 h do 4 h mieszając z prędkością od 200 do 600 RPM, a otrzymane w ten sposób nanocząstki PLGA/PVA/LIPO pozostawia w temperaturze 4°C od 12 do 24 h i oczyszcza dwukrotnie przemywając buforem PBS 7.4.
5. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że PLGA stanowi kopolimer 50:50 o masie Mw 24 000-38 000 g/mol.
6. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że PVA ma masę Mw 30 000-70 000 g/mol.
7. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że do roztworu PVA dodaje się 0.1 M bufor PBS o pH 7.4.
8. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że lekiem wprowadzanym do rdzenia jest Staurosporyna w ilości od 5 do 11,5 mg.
9. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że lekiem wprowadzanym do rdzenia jest Tanespimycyna (17AAG) w ilości od 5 do 11,5 mg.
10. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że do rdzenia wprowadza się Staurosporynę i Tanespimycyna (17AAG) przy stosunku stężeń Tanespimycyny (17AAG) do Staurosporyny w przedziale od 0,62 do 9,5.
11. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że odparowanie dichlorometanu prowadzi się z użyciem mieszadła magnetycznego z prędkością od 200 do 600 RPM przy temperaturze od 37°C do 40°C.
12. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że emulsję uzyskuje się poprzez mieszanie za pomocą sondy ultradźwiękowej od 1 minuty do 2 minut przy amplitudzie 70% - 90%.
13. Sposób według, zastrz. 4 znamienny tym, że w celu kontroli jakości wytworzonego rdzenia polimerowego PLGA/PVA wykonuje się pomiar wielkości nanocząstek za pomocą metody dynamicznego rozpraszania światła.
14. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że liposomy DPPC/Cholesterol/DSPEPEG(2000)NH2 syntezuje się za pomocą metody hydratacyjnej, sporządzając roztwór mieszaniny lipidów o stężeniu: DPPC równym 96,0 mM, Cholesterolu równym 58,8 mM, DSPEPEG(2000)NH2 równym 3,84 mM w chloroformie.
15. Sposób według zastrz. 14 znamienny tym, że w metodzie hydratacyjnej rozpuszczalnik odparowuje się za pomocą wyparki próżniowej lub suszarki próżniowej.
16. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że liposomy DPPC/Cholesterol/DSPE-PEG(2000)NH2 syntezuje się za pomocą metody iniekcji etanolowej, sporządzając roztwór mieszaniny lipidów o stężeniu :DPPC równym 96,0 mM, Cholesterolu równym 58,8 mM, DSPE-PEG(2000)NH2 równym 3,84 mM w etanolu.
17. Sposób według zastrz. 16 znamienny tym, że w metodzie iniekcji etanolowej roztwór lipidów w etanolu wkrapla się do sterylnej soli fizjologicznej mieszanej za pomocą mieszadła magnetycznego otrzymując roztwór liposomów DPPC/Cholesterol/DSPE-PEG(2000)NH2 o sumarycznym stężeniu lipidów 10 mg/ml jako półprodukt do dalszej syntezy.
18. Sposób według, zastrz. 4 znamienny tym, że oczyszczanie nanocząstek prowadzi się w wirówce wysokoobrotowej z prędkością 15000 RPM w czasie od 2 do 6 min.
19. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że po każdorazowym dodatku PBS 7.4 nanocząstki dysperguje się za pomocą ultradźwięków przez czas nie krótszy niż 5 sekund.
20. Sposób według zastrz. 4 znamienny tym, że stabilizacji nanocząstek, po ostatnim odwirowaniu dodaje się niejonowego surfaktantu tworząc 40%-owy roztwór w stosunku objętościowym 0,02:1 (surfaktant:nanocząstki) lub glukozy.
PL444724A 2023-05-03 2023-05-03 Stabilna nanocząstka polimerowo-lipidowa do wiązania i dostarczania leków, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych oraz sposób wytwarzania stabilnych nanocząstek polimerowo- lipidowych przenoszących leki, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych PL248287B1 (pl)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL444724A PL248287B1 (pl) 2023-05-03 2023-05-03 Stabilna nanocząstka polimerowo-lipidowa do wiązania i dostarczania leków, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych oraz sposób wytwarzania stabilnych nanocząstek polimerowo- lipidowych przenoszących leki, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych
CN202480044682.8A CN121487725A (zh) 2023-05-03 2024-05-03 一种用于药物结合与递送尤其是具有抗癌特性药物的结合与递送的稳定聚合物-脂质纳米颗粒以及制备载药尤其是具有抗癌特性药物的稳定聚合物-脂质纳米颗粒的方法
IL324424A IL324424A (en) 2023-05-03 2024-05-03 Stable polymer-lipid nanoparticles for binding and delivering drugs, especially with anticancer properties, and a method for producing stable drug-carrying polymer-lipid nanoparticles, especially with anticancer properties
EP24740620.0A EP4704817A1 (en) 2023-05-03 2024-05-03 Stable polymer-lipid nanoparticle for drug binding and delivery, especially with anticancer properties, and a method for producing stable polymer-lipid nanoparticles carrying drugs, especially with anticancer properties
PCT/PL2024/000023 WO2024228632A1 (en) 2023-05-03 2024-05-03 Stable polymer-lipid nanoparticle for drug binding and delivery, especially with anticancer properties, and a method for producing stable polymer-lipid nanoparticles carrying drugs, especially with anticancer properties

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL444724A PL248287B1 (pl) 2023-05-03 2023-05-03 Stabilna nanocząstka polimerowo-lipidowa do wiązania i dostarczania leków, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych oraz sposób wytwarzania stabilnych nanocząstek polimerowo- lipidowych przenoszących leki, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL444724A1 PL444724A1 (pl) 2024-11-04
PL248287B1 true PL248287B1 (pl) 2025-11-17

Family

ID=91898606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL444724A PL248287B1 (pl) 2023-05-03 2023-05-03 Stabilna nanocząstka polimerowo-lipidowa do wiązania i dostarczania leków, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych oraz sposób wytwarzania stabilnych nanocząstek polimerowo- lipidowych przenoszących leki, zwłaszcza o właściwościach przeciwnowotworowych

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP4704817A1 (pl)
CN (1) CN121487725A (pl)
IL (1) IL324424A (pl)
PL (1) PL248287B1 (pl)
WO (1) WO2024228632A1 (pl)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080286372A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Therapeutic compositions for targeted vessel delivery
US20180092854A1 (en) * 2015-03-11 2018-04-05 University Of South Australia Drug delivery composition comprising polymer-lipid hybrid microparticles

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080286372A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Therapeutic compositions for targeted vessel delivery
US20180092854A1 (en) * 2015-03-11 2018-04-05 University Of South Australia Drug delivery composition comprising polymer-lipid hybrid microparticles

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FANG DL, CHEN Y, XU B, REN K, HE ZY, HE LL, LEI Y, FAN CM, SONG XR.: "Int J Mol Sci. 2014 Feb 25;15(3):3373-88", DEVELOPMENT OF LIPID-SHELL AND POLYMER CORE NANOPARTICLES WITH WATER-SOLUBLE SALIDROSIDE FOR ANTI-CANCER THERAPY., DOI: 10.3390/ijms15033373 *
GUO Y, BERA H, SHI C, ZHANG L, CUN D, YANG M.: "Acta Pharm Sin B. 2021 Aug;11(8):2565-2584", PHARMACEUTICAL STRATEGIES TO EXTEND PULMONARY EXPOSURE OF INHALED MEDICINES., DOI: 10.1016/j.apsb.2021.05.015 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN121487725A (zh) 2026-02-06
EP4704817A1 (en) 2026-03-11
IL324424A (en) 2026-01-01
PL444724A1 (pl) 2024-11-04
WO2024228632A1 (en) 2024-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bazylińska et al. Polymer-free cubosomes for simultaneous bioimaging and photodynamic action of photosensitizers in melanoma skin cancer cells
Dang et al. Nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy
US10322092B2 (en) Substance-containing vesicle, and production method therefor
EP3417934B1 (en) Substance-encapsulating vesicle and process for producing the same
JP7041676B2 (ja) ガンの処置において使用するためのリポソーム製剤
Bhattacharya et al. Liposomal drug delivery and its potential impact on cancer research
Leonhard et al. Self-assembled micelles of monosialogangliosides as nanodelivery vehicles for taxanes
JP6764864B2 (ja) 腫瘍のナノ粒子媒介微小血管塞栓形成を誘導するための組成物および方法
Yin et al. Effects of cholesterol incorporation on the physicochemical, colloidal, and biological characteristics of pH-sensitive AB2 miktoarm polymer-based polymersomes
AU2003270102B2 (en) Non-vesicular cationic lipid formulations
JP2018533628A (ja) エキノマイシン製剤、その製造法および使用法
CN108024962A (zh) 用于治疗癌症的雷帕霉素和雷帕霉素衍生物的稳定的脂质体制剂
CA3238846A1 (en) Polysarcosine-vitamin e derivatives
Shah et al. Niosomes: a promising novel nano carrier for drug delivery
Emam et al. The post-insertion method for the preparation of PEGylated liposomes
Zhang et al. Contrastive studies of cytarabine/daunorubicin dual-loaded liposomes prepared by pH gradient and Cu2+ gradient method
CN113840624B (zh) 单醣标记的纳米脂质体药物递送系统，其制法及其作为药物靶定递送载体的应用
Ondreas et al. Interactions of hydrophobically modified hyaluronan carrier with bovine serum albumin
WO2024228632A1 (en) Stable polymer-lipid nanoparticle for drug binding and delivery, especially with anticancer properties, and a method for producing stable polymer-lipid nanoparticles carrying drugs, especially with anticancer properties
Dao et al. Giant hybrid polymer/lipid vesicles
Minh et al. Developing and evaluating in vitro effect of pegylated liposomal doxorubicin on human cancer cells
JP2026515210A (ja) がんおよび過度な細胞増殖に起因する疾患の予防または治療における使用のための、１７－ａａｇおよびスタウロスポリンを含む医薬組成物、ならびにその組成物を含有するポリマー脂質ナノ粒子
Brar Nanocarrier-Enhanced Nose-to-Brain Delivery of a Drug-Dye Conjugate: A New Frontier in Glioblastoma Treatment
WO2024228633A1 (en) Modified liposome for drug delivery, use of liposome for drug delivery, especially with anti-cancer activity, and ways to load liposome with drugs, especially with anti-cancer activity
Büyüksungur Bioactive agents carrying quantum dot labeled liposomes