PL248027B1

PL248027B1 - Nowy peptyd antybakteryjny oraz jego zastosowanie

Info

Publication number: PL248027B1
Application number: PL445342A
Authority: PL
Inventors: Aleksandra Bocian; Ewa Ciszkowicz; Konrad Hus; Katarzyna Lecka-Szlachta; Justyna Buczkowicz; Andrzej Łyskowski
Original assignee: Politechnika Rzeszowska Im Ignacego Lukasiewicza
Priority date: 2023-06-26
Filing date: 2023-06-26
Publication date: 2025-10-06
Also published as: PL445342A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowy peptyd antybakteryjny o wzorze chemicznym C119H202N20O38O31 i o sekwencji IKIAINGFGRIGRSVLRALYETGR. Zgłoszenie obejmuje także zastosowanie nowego peptydu antybakteryjnego jako środka o działaniu przeciwbakteryjnym wobec bakterii Gram-ujemnych, zwłaszcza Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa oraz wobec bakterii Gram-dodatnich, zwłaszcza Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy peptyd antybakteryjny oraz zastosowanie tego nowego peptydu antybakteryjnego.

Jednym z niezwykle ważnych problemów klinicznych pojawiających się w ostatnim czasie jest występowanie oporności bakterii na klasyczne antybiotyki. Lekooporne bakterie są groźnym wyzwaniem dla mikrobiologów i lekarzy, a także przedmiotem intensywnych badań naukowych skupionych na poszukiwaniu nowych czynników, które mogłyby tę oporność przełamać. Z drugiej strony zbyt duże przetworzenie żywności, a jednocześnie dążenie do zastosowania w produkcji substancji pochodzenia naturalnego, przyczyniają się do poszukiwania nowych, bezpiecznych i skutecznych substancji antybakteryjnych, które będą jednocześnie konserwantami żywności.

Intensywne stosowanie antybiotyków doprowadziło do zwiększonej oporności mikroorganizmów na standardowo stosowane antybiotyki. W związku z tym, w dobie stale rosnącej liczby lekoopornych szczepów bakteryjnych, istotne jest poszukiwanie kolejnych substancji aktywnych w ich zwalczaniu.

Pseudomonas aeruginosa jest oportunistycznym patogenem, należącym do bakterii Gram-ujemnych, która najczęściej związana jest z zakażeniami szpitalnymi i zapaleniem płuc związanym z funkcjonowaniem respiratorów, co zostało ujawnione w publikacji F. Barbier, A. Andremont, M. Wolff, L. Bouadma. Hospital-acquired pneumonia and ventilator-associated pneumonia: recent advances in epidemiology and management. Curr Opin Pulm Med, 19 (2013), pp. 216-228. Zakażenia stosunkowo rzadko dotykają osób zdrowych, ale bakteria ta powoduje wysoką zachorowalność i śmiertelność pacjentów z mukowiscydozą oraz osób z obniżoną odpornością, co zostało opisane w publikacji R.T. Sadikot, T.S. Blackwell, J.W. Christman, A.S. Prince. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med, 171 (2005), pp. 1209-1223. Odpowiada ona również, za około 5% infekcji u pacjentów z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc - POChP i wiąże się ze zwiększoną śmiertelnością chorych, co ujawniono w publikacji T.F. Murphy. Pseudomonas aeruginosa in adults with chronic obstructive pulmonary disease. Curr Opin Pulm Med, 15 (2009), pp. 138-142. Bakteria ta odpowiedzialna jest także za wiele innych zakażeń, w tym za wywoływanie infekcji dróg oddechowych i moczowych, zakażenia ran i tkanek miękkich oraz zakażenia pacjentów z poparzeniami, co zostało przedstawione w publikacji Roulova N, Mot’kova P, Broźkova I, Pejchaiova M. Antibiotic resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from hospital wastewater in the Czech Republic. J Water Health. 2022; 20(4): 692-701. doi:10.2166/wh.2022.101.

W publikacjach: Pena C, Cabot G, Gomez-Zorrilla S, Zamorano L, Ocampo-Sosa A, Murillas J, Almirante B, Pomar V, Aguilar M, Granados A, Calbo E, Rodriguez-Bano J, Rodriguez-Lopez F, Tubau F, Martinez-Martinez L, Oliver A, Gurgui M, Sorde R, Larrosa N, Martin C, Fontanals D, de Cueto M, Navarro MD, Torre-Cisneros J, Casal M, Lara R, Natera C, Rivero A, Pena C, Cabot G, Gómez-Zorrilla S, Zamorano L, Ocampo-Sosa A, Murillas J, Almirante B, Pomar V, Aguilar M, Granados A, Calbo E, Rodriguez-Bano J, Rodriguez-López F, Tubau F, Martinez-Martinez L, Oliver A, Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI). 2015. Influence of virulence genotype and resistance profile in the mortality of Pseudomonas aeruginosa bloodstream infections. Clin Infect Dis 60:539-548; Walkty A, Lagace-Wiens P, Adam H, Baxter M, Karlowsky J, Mulvey MR, McCracken M, Zhanel GG. 2017. Antimicrobial susceptibility of 2906 Pseudomonas aeruginosa clinical isolates obtained from patients in Canadian hospitals over a period of 8 years: Results of the Canadian Ward surveillance study (CANWARD), 2008-2015. Diagn Microbiol Infect Dis 87:60-63; Sader HS, Castanheira M, Duncan LR, Flamm RK. 2018. Antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa isolates from United States medical centers stratified by infection type: results from the International Network for Optimal Resistance Monitoring (INFORM) surveillance program. Diagn Microbiol Infect Dis 92:69-74 ujawniono, że w ostatnich latach obserwuje się wzrost częstości występowania wielolekoopornych i skrajnie lekoopornych szczepów P. aeruginosa, przy czym w niektórych regionach geograficznych wskaźniki te wynoszą od 15 do 30%. Jak opisano w publikacji ECDC. 2015. Antimicrobial resistance surveillance in Europe 2015. Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net). European Centre for Disease Prevention and Control, większość krajów w Europie odnotowuje wskaźniki oporności powyżej 10% dla wszystkich grup środków przeciwbakteryjnych objętych nadzorem. U P. aeruginosa powszechna jest także oporność łączna. W 2015 roku Europejskie Centra Zapobiegania i Kontroli Chorób stwierdziły, że 13,7% izolatów P. aeruginosa było opornych na co najmniej trzy grupy, a 5,5% na wszystkie pięć grup środków antybakteryjnych objętych nad zorem EARS-Net, co ujawniono w publikacji ECDC. 2015. Antimicrobial resistance surveillance in Europę 2015. Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net). European Centre for Disease Prevention and Control. Jak pokazują dane ze Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej, które zostały przedstawione w publikacji CDC. 2013. Antibiotic resistance threats in the United States, 2013. CDC, Atlanta, GA, wielolekooporne szczepy P. aeruginosa są przyczyną 13% ciężkich zakażeń szpitalnych.

Jak ujawniono w publikacji P.D. Lister, D.J. Wolter, N.D. Hanson. Antibacterial-resistant Pseudomonas aeruginosa: clinical impact and complex regulation of chromosomally encoded resistance mechanisms. Clin Microbiol Rev, 22 (2009), pp. 582-610, P. aeruginosa charakteryzuje się dużą zdolnością do wykształcania oporności na wiele dostępnych obecnie antybiotyków, przez co leczenie zakażeń wywołanych przez tę bakterię jest skomplikowane. Pseudomonas aeruginosa wykazuje oporność na wiele antybiotyków, w tym aminoglikozydy, chinolony i β-laktamy, co ujawniono w publikacji R.E. Hancock, D.P. Speert. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and impact on treatment. Drug Resist Updat, 3 (2000), pp. 247-255, a także fluorochinolony, karbapenemy i cefalosporyny trzeciej generacji, które są preferowanymi opcjami w terapii poważnych zakażeń wywołanych przez szczepy wielolekooporne, co natomiast opisano w publikacji Imanah, E. O., Beshiru, A., & Igbinosa, E. O. (2017). Antibiogram profile of Pseudomonas aeruginosa isolated from some selected hospital environmental drains. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 7(10), 604-609; Azam, M. W., & Khan, A. U. (2019). Updates on the pathogenicity status of Pseudomonas aeruginosa. Drug discovery today, 24(1), 350-359. Jak przedstawiono w publikacjach Feng, W., Sun, F., Wang, Q., Xiong, W., Qiu, X., Dai, X., & Xia, P. (2017). Epidemiology and resistance characteristics of Pseudomonas aeruginosa isolates from the respiratory department of a hospital in China. Journalofglobalantimicrobialresistance, 8, 142-147; Imanah, E. O., Beshiru, A., & Igbinosa, E. O. (2017). Antibiogram profile of Pseudomonas aeruginosa isolated from some selected hospital environmental drains. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 7(10), 604-609, P. aeruginosajest samoistnie oporna na wiele antybiotyków i ma zdolność do łatwego nabywania determinatów oporności na antybiotyki oraz, co opisano z kolei w publikacji Golle, A., Janezic, S., & Rupnik, M. (2017). Low overlap between carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa genotypes isolated from hospitalized patients and wastewater treatment plants. PloS one, 12 (10), e0186736, ma ona duży potencjał do ewolucji fenotypów oporności lekowej. Światowa Organizacja Zdrowia - WHO wyróżnia oporną na karbapenemy bakterię P. aeruginosa jako jeden z trzech gatunków bakterii, u których istnieje krytyczna potrzeba opracowania nowych antybiotyków do leczenia zakażeń, co opisano w publikacji E. Tacconelli, N. Magrini, Y. Carmeli, S. Harbarth, G. Kahlmeter, J. Kluytmans, M. Mendelson, C. Pulcini, N. Singh, U. Theuretzbacher. Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics. World Health Organization (2017), pp. 1-7 - http://www.who.int/medicines/publications/WHO-PPL-Short_Sum- mary_25Feb-ET_NM_WHO.pdf. Nadmierne stosowanie antybiotyków w trakcie leczenia przyspiesza rozwój wielolekoopornych szczepów P. aeruginosa, co prowadzi do nieskuteczności dotychczasowej antybiotykoterapii wobec tego drobnoustroju, co przedstawiono w publikacji E.B. Hirsch, V.H. Tam. Impact of multi drug-resistant Pseudomonas aeruginosa infection on patient outcomes. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res, 10 (2010), pp. 441-451.

Jak wykazano w publikacji Ibrahim D, Jabbour J-F, Kanj SS. Current choices of antibiotic treatment for Pseudomonas aeruginosa infections. Current Opinion in Infectious Diseases 2020 - Volume 33 - Issue 6 - p 464-473, Pseudomonas aeruginosa to jedna z najtrudniejszych do leczenia klinicznego bakteria, a stosowana antybiotykoterapia opiera się na zaleceniach European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing - EUCAST. W publikacjach Paul M, Lador A, Grozinsky-Glasberg S i wsp. Beta lactam antibiotic monotherapy versus beta lactam-aminoglycoside antibiotic combination therapy for sepsis. Cochrane Database Syst Rev 2014; 1: CD003344; Paul M, Dickstein Y, Schlesinger A i wsp. Beta-lactam versus beta-lactam-aminoglycoside combination therapy in cancer patients with neutropenia. Cochrane Database Syst Rev 2013; 6: CD003038 wykazano, że jednym z rozwiązań prowadzących do zwalczania ciężkiego zakażenia bakteryjnego jest stosowanie naraz więcej niż jednego leku przeciwbakteryjnego, którego celem jest rozszerzenie spektrum aktywności mikrobiologicznej oraz wzmocnienie działania przeciwbakteryjnego poprzez uniknięcie selekcji drobnoustrojów opornych na jeden ze stosowanych środków. W zależności od tego czy skuteczność leczenia jest większa czy mniejsza od skuteczności poszczególnych leków stosowanych oddzielnie wyróżnia się antagonizm, działanie addytywne oraz synergizm - działanie superaddytywne, co przedstawiono w publikacji Sopirala, M.M.; Mangino, J.E.; Gebreyes, W.A.; Biller, B.; Bannerman, T.; Balada-Llasat, J.M.; Pancholi, P. Synergy testing by Etest, microdilution checkerboard, and time-kill methods for pan-drug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents Chemother. 2010, 54, 4678-4683.

Przykładem wykorzystania zjawiska synergizmu przy łączonym stosowaniu leków przeciwbakteryjnych jest połącznie aminoglikozydów, będących nieskutecznymi w monoterapii zakażeń Enterococcus species oraz antybiotyków beta-laktamowymownych. Zjawisko antagonizmu, pomiędzy antybiotykami hamującymi syntezę białka a upośledzającymi syntezę DNA zostało opisane w publikacji Bollenbach T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Curr Opin Microbiol 2015; 27: 1-9, zaś pomiędzy tetracyklinami a antybiotykami beta-laktamowymi zostało opisane w publikacji Olajuyigbe OO. Synergistic influence of tetracycline on the antibacterial activities of amoxicillin against resistant bacteria. J Pharm Allied Health Sci 2012; 2: 12-20.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe - AMP to krótkie sekwencje zbudowane z liniowo ułożonych aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi. Większość znanych peptydów AMP jest wytwarzana przez organizmy zwierząt, ponieważ są jednym z elementów immunologicznej obrony nieswoistej. Jednakże peptydy te występują również w jadach zwierząt, a także w bakteriach, grzybach lub roślinach. Znane są również sekwencje syntetyczne, które zostały zaprojektowane in silico, przy czym zdecydowana większość peptydów AMP to peptydy o długości od 20 do 50 aminokwasów, ładunku wypadkowym z zakresu od 0 do +5 i stopniu hydrofobowości w zakresie od 40 do 70%, co przedstawiono w publikacji Wang, G. Database-Guided Discovery of Potent Peptides to Combat HIV-1 or Superbugs. Pharmaceuticals 2013, 6, 728-758. https://doi.org/10.3390/ph6060728

Peptydy AMP były szeroko testowane na wielu różnych gatunkach bakterii, przy czym w zależności od gatunku bakterii, wobec którego aktywność wykazuje peptyd, można zaplanować jego wykorzystanie. Z publikacji Morais TP, Zaini PA, Chakraborty S, Gouran H, Carvalho CP, Almeida-Souza HO, Souza JB, Santos PS, Goulart LR, Luz JMQ, Nascimento R, Dandekar AM. The plant-based chimeric antimicrobial protein SlP14a-PPC20 protects tomato against bacterial wilt disease caused by Ralstonia solanacearum. Plant Sci. 2019 Mar;280:197-205. doi: 10.1016/j.plantsci.2018.11.017. Epub 2018 Nov 29. PMID: 30823998 znane jest zastosowanie chimerycznych peptydów przeciwko Ralstonia solanacearum, który jest patogenem pomidorów, który wykazują minimalne stężenie hamujące, przy czym wartość MIC jest z zakresu od 25 do 100 μΜ. Natomiast AMP pochodzące z jadu węży mają szeroki zakres wartości MIC w zależności od gatunku bakterii, na którym dany peptyd testowano. Dla Escherichia coli są to wartości zaczynające się od 0,25 μg/ml, natomiast dla Staphylococcus aureus 4 μg/ml, co przedstawiono w publikacji Perez-Peinado, C.; Defaus, S.; Andreu, D. Hitchhiking with Nature: Snake Venom Peptides to Fight Cancer and Superbugs. Toxins 2020, 12, 255. https://doi.org/10.3390/toxins12040255. W przeprowadzonych innych badaniach, syntetyczne AMP miały właściwości hamujące względem E. coli, a wartość MIC najefektywniejszego z nich wynosiła 3 μg/ml, co przedstawiono w publikacji Huang, Y.-T., Kumar, S. R., Chan, H.-C., Jhan, Z.-H., Chen, D. W., & Lue, S. J. (2021). Efficacy of antimicrobial peptides (AMPs) against Escherichia coli and bacteria morphology change after AMP exposure. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 126, 307-312. doi:10.1016/j.jtice.2021.07.003. Syntetyczne AMP testowano również względem Pseaudomonas aeruginosa i S. aureus, dla których uzyskano wartość MIC równą 125 μg/ml, co przedstawiono w publikacji Kampshoff, F.; Willcox, M.D.P.; Dutta, D. A Pilot Study of the Synergy between Two Antimicrobial Peptides and Two Common Antibiotics. Antibiotics 2019, 8, 60. https://doi.org/10.3390/anti- biotics8020060. Zgodnie z wytycznymi AMP Database, https://aps.unmc.edu/about, bazy, która deponuje peptydy antybakteryjne i antydrobnoustrojowe, za peptyd z potwierdzonymi wspomnianymi właściwościami uważa się jeżeli jego MIC jest niższe niż 100 μM lub 100 μg/ml.

Jak przedstawiono w publikacji Ibrahim D, Jabbour J-F, Kanj SS. Current choices of antibiotic treatment for Pseudomonas aeruginosa infections. Current Opinion in Infectious Diseases 2020 - Volume 33 - Issue 6 - p 464-473, Pseudomonas aeruginosa to jedna z najtrudniejszych do leczenia klinicznego bakterii, a stosowana antybiotykoterapia opiera się na zaleceniach EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Jednym z rozwiązań prowadzących do zwalczenia ciężkiego zakażenia bakteryjnego jest stosowanie naraz więcej niż jednego leku przeciwbakteryjnego, którego celem jest rozszerzenie spektrum aktywności mikrobiologicznej oraz wzmocnienie działania przeciwbakteryjnego poprzez uniknięcie selekcji drobnoustrojów opornych na jeden ze stosowanych środków, co ujawniono w publikacjach Paul M, Lador A, Grozinsky-Glasberg S i wsp. Beta lactam antibiotic monotherapy versus beta lactam-aminoglycoside antibiotic combination therapy for sepsis. Cochrane Database Syst Rev 2014; 1: CD003344; Paul M, Dickstein Y, Schlesinger A I wsp. Beta-lactam versus beta-lactam-aminoglycoside combination therapy in cancer patients with neutropenia. Cochrane Database Syst Rev 2013; 6: CD003038.

Do oportunistycznych patogenów wywołujących przewlekłe infekcje należą Pseudomonas aeruginosa oraz Staphylococcus aureus, co znane jest z publikacji Vanderwoude J, Fleming D, Azimi S, Trivedi U, Rumbaugh KP, Diggle SP.2020 The evolution of virulence in Pseudomonas aeruginosa during chronic wound infection. Proc. R. Soc. B287:20202272. http://dx.doi.org/10.1098/rspb.2020.2272. S. aureus jest główną przyczyną infekcji skóry i tkanek miękkich, a obserwowane zwiększanie ilości szczepów wielolekoopornych, powoduje zmniejszenie dostępnych antybiotyków, co ma bezpośredni wpływ na utrzymujący się stan zapalny i utrudnione gojenia ran, co zostało ujawnione w publikacji Malachowa N, Kobayashi SD, Lovaglio J, DeLeo F. Mouse Model of Staphylococcus aureus Skin Infection. Mouse Models of Innate Immunity pp 139-147, Part of the Methods in Molecular Biology book series (MIMB, volume 1960). W publikacji Gonzalez MR, Fleuchot B, Lauciello L, Jafari P, Applegate LA, Raffoul W, Que Y-A, Perron K. 2016. Effect of human bum wound exudate on Pseudomonas aeruginosa virulence, mSphere 1 (2):e00111-15. doi:10.1128/mSphere.00111-15 ujawniono, że rany oparzeniowe to złożone mikrośrodowiska, w których infekcje patogenami bakteryjnymi, takimi jak P. aeruginosa lub S. aureus, stanowią poważny problem w leczeniu pacjentów, dlatego też duże znaczenie ma opracowanie nowych strategii leczenia infekcji bakteryjnych. Jak przedstawiono w publikacji Cogen AL, Nizet V, Galio RL. Skin microbiota: a source of disease or defence? Br Jour Dermatol. 2008; 158(3): 442-455.), Staphylococcus epidermidis jest oportunistycznym patogenem, który w normalnych warunkach rezyduje w skórze jako komensal, ale może stać się patogenny u pacjentów z obniżoną odpornością lub kiedy bariera skórna zostanie przerwana. S. epidermidis może przenikać przez uszkodzony naskórek do krwioobiegu i jest najczęstszą przyczyną pierwotnej bakteriemii i zakażeń wszczepianych wyrobów medycznych, szczególnie u osób z obniżoną odpornością i noworodków, co przedstawiono w publikacji Rupp ME. Clinical characteristics of infections in humans due to Staphylococcus epidermidis. Methods Mol Biol. 2014; 1106: 1-16. Zarówno w przypadku oparzeń, jak i ran pooperacyjnych, bardzo często obserwuje się infekcje wywołane przez Staphylococcus epidermidis, co ujawniono w publikacjach Sharma, L., Srivastava, H., Pipal, D. K., Dhawan, R., Purohit, P. M., & Bhargava, A. (2017). Bacteriological profile of burn patients and antimicrobial susceptibility pattern of bum wound isolates. International surgery journal, 4(3), 1019-1023 oraz Barret, J. P., & Herndon, D. N. (2003). Effects of burn wound excision on bacterial colonization and invasion. Plastic and reconstructive surgery, 111 (2), 744-750. Jak opisano w publikacji Burchard, K. W. (1984). Staphylococcus epidermidis Sepsis in Surgical Patients. Archives of Surgery, 119(1), 96, zakażenia te mogą zagrażać życiu ofiar poparzeń, gdyż niejednokrotnie wywołują sepsę u hospitalizowanych pacjentów. Ponadto warto zauważyć, że szczepy S. epidermidis są coraz bardziej oporne na antybiotyki takie jak penicyliny, aminoglikozydy i chinolony, co opisano w publikacji Grice EA, Segre JA. The skin microbiome. Nat RevMicrobiol. 2011; 9(4): 244-253.

Jak wykazano w publikacji Ibrahim D, Jabbour J-F, Kanj SS. Current choices of antibiotic treatment for Pseudomonas aeruginosa infections. Current Opinion in Infectious Diseases 2020 - Volume 33 - Issue 6 - p 464-473, Pseudomonas aeruginosa to zatem jedna z najtrudniejszych do leczenia klinicznego bakterii. Dowodem na to są uzyskane wyniki antybiogramu, pokazanego w tabeli I, które potwierdzają oporność bakterii na antybiotyki z różnych grup. Najczęściej stosowaną terapią w zwalczaniu P. aeruginosa jest terapia skojarzona wykorzystująca kombinację dwóch środków przeciwbakteryjnych, co opisano w publikacji Paul M, Lador A, Grozinsky-Glasberg S i wsp. Beta lactam antibiotic monotherapy versus beta lactam-aminoglycoside antibiotic combination therapy for sepsis. Cochrane Database Syst Rev 2014; 1: CD003344; Paul M, Dickstein Y, Schlesinger A i wsp. Beta-lactam versus beta-lactam-aminoglycoside combination therapy in cancer patients with neutropenia. Cochrane Database Syst Rev 2013; 6: CD003038.

PL 248027 Β1

Tabela I

Szczep bakteryjny	Antybiogram
	Ampicylina	Chloramfenikol	Genta- mycyna	Kanamycyna
Pseudomonas aeruginosa ATCC15442	BA BZ	250 BZ	BA BZ	125

gdzie:

BA - brak aktywności antybakteryjnej

BZ - brak skuteczności w leczeniu zakażeń bakteryjnych P. aeruginosa.

Intensywne stosowanie antybiotyków doprowadziło do zwiększenia oporności mikroorganizmów na standardowo stosowane antybiotyki. W dobie stale rosnącej liczby lekoopornych szczepów bakteryjnych niezwykle istotne jest poszukiwanie kolejnych substancji aktywnych w ich zwalczaniu.

Celem wynalazku jest opracowanie nowego peptydu antybakteryjnego, który będzie wykazywał właściwości hamujące wzrost bakterii, zwłaszcza wykazujących cechy lekooporności.

Nowy peptyd antybakteryjny o wzorze chemicznym C119H202N38O31 i o sekwencji IKIAINGFGRIGRSVLRALYETGR.

Peptyd antybakteryjny przeznaczony jest do zastosowania w leczeniu jako środek o działaniu przeciwbakteryjnym wobec bakterii Gram-ujemnych, zwłaszcza Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa oraz wobec bakterii Gram-dodatnich, zwłaszcza Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.

Korzystnie peptyd antybakteryjny stosowany jest jako składnik maści lub opatrunku w leczeniu zakażeń Staphylococcus aureus lub Staphylococcus epidermidis, przy czym korzystnie do leczenia zakażeń Pseudomonas aeruginosa stosuje się go w połączeniu z antybiotykiem, zwłaszcza z chloramfenikolem.

Nowy peptyd antybakteryjny, według wynalazku, znajduje zastosowanie w leczeniu zakażeń lekoopornych szczepów bakterii, w szczególności bakterii Gram-ujemnych, zwłaszcza Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa oraz wobec bakterii Gram-dodatnich, zwłaszcza Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony w przykładzie wykonania oraz na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia płytkę 96-dołkową z wynikami analizy wspólnego oddziaływania nowego peptydu antybakteryjnego oraz chloramfenikolu na bakterie szczepu Pseudomonas aeruginosa ATCC15442.

Nowy peptyd antybakteryjny, według wynalazku, ma sekwencję IKIAINGFGRIGRSVLRALYETGR i wzór chemiczny C119H202N38O31. Masa cząsteczkowa tego nowego peptydu wynosi 2661,15 Da. Peptyd wykazuje hydrofobowość rzędu 42%, a jego ładunek netto wynosi +4.

Inne parametry nowego peptydu penetrującego:

- uśredniona hydropatia peptydu GRAVY - the Grand Average hydropathy value of the peptide = 0,121;

- hydrofobowość peptydu wg. Wimleya-White’a - The Wimley-White whole-residue hydrophobicity of the peptide = 2,96;

- Indeks Bomana, współczynnik oddziaływań białko-białko - Protein-binding Potential - Boman index = 1,7 kcal/mol;

- współczynnik alifatyczny = 117,92;

- teoretyczny punkt izoelektryczny = 11,55.

Nowy peptyd penetrujący zawiera aminokwasy w następujących ilościach:

- Aminokwasy hydrofobowe: I: 4 V: 1 L: 2 F: 1 C: 0 M: 0 A: 2 W: 0

- Glicyna i Prolina: G: 4 P: 0

PL 248027 Β1

- Ujemnie naładowane aminokwasy: E: 1 D: 0

- Dodatnio naładowane aminokwasy: K: 1 R: 4 H: 0

- Inne aminokwasy: T: 1 S: 1 Y: 1 Q: ON: 1

Udział procentowy poszczególnych aminokwasów w nowym peptydzie penetrującym jest następujący: Ile = 17% Val = 4% Leu = 8% Phe = 4% Cys = 0% Met = 0% Ala = 8% Trp = 0% Gly = 17% Pro = 0% Thr = 4% Ser = 4% Tyr = 4% Gin = 0% Asn = 4% Glu = 4% Asp = 0% His = 0% Lys = 4% Arg = 17%

Peptyd antybakteryjny otrzymany został na drodze standardowej syntezy chemicznej na stałym nośniku polimerowym.

Zastosowanie nowego peptydu antybakteryjnego, który ma sekwencję IKIAINGFGRIGRSVLRALYETGR i wzór chemiczny C119H202N38O31, jako środka o działaniu przeciwbakteryjnym wobec bakterii Gram-ujemnych, Escherichia coli ATCC 10536 oraz Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 oraz wobec bakterii Gram-dodatnich Staphylococcus aureus ATCC 6538 oraz Staphylococcus epidermidis ATCC 35984.

Ocenę in vitro aktywności przeciwbakteryjnej peptydu przeprowadzono według metodologii Clinical & Laboratory Standards Institute. W tym celu roztwór wyjściowy bakterii przygotowano przez inkubację drugiej hodowli bakteryjnej w pożywce Mueller Hinton Broth - MHB przez czas od 20 do 24 godzin w temperaturze 37°C na wytrząsarce orbitalnej. Hodowla prowadzona była do momentu uzyskania gęstości 10⁸ komórek/mL. Z tak przygotowanej hodowli, w wyniku tysiąckrotnego rozcieńczenia, uzyskano hodowlę roboczą o gęstości 10⁵ komórek/mL, którą wykorzystano w kolejnych etapach. W każdym dniu badania przygotowywano seryjne dwukrotne rozcieńczenie związku na mikrotitracyjnych płytkach 96-dołkowych i dodawano bakterie z hodowli roboczej. Wyjściowe stężenie peptydu wynosiło 3 mg/mL, a zakres badanych stężeń wynosił od 0,046 do 750 pg/mL. Płytki następnie inkubowano w 37°C w otaczającym powietrzu przez czas od 20 do 24 godzin. Następnie analizowano stopień zmętnienia hodowli w dołkach zawierających określone stężenie badanego związku i sprawdzano spektrofotometrycznie poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 600 nm. Wyznaczono najniższe stężenie związku, które całkowicie hamowało wzrost hodowli bakteryjnej MIC - Minimum Inhibitory Concentration. W tabeli 1 pokazano wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii uzyskane dla nowego peptydu antybakteryjnego.

Tabela 1

Szczep bakteryjny	Nowy peptyd antybakteryjny AMPAB5K
MIC [pg/mL]
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442	187,50
Escherichia coli ATCC 10536	11,72
Staphylococcus aureus ATCC 6538	29,12
Staphylococcus epidermidis ATCC 35984	29,12

Wykazano, że nowy peptyd antybakteryjny ma zdolność inhibicji wzrostu bakterii i może być powszechnie stosowany jako związek przeciwbakteryjny, który najwyższą średnią aktywność wykazuje wobec Escherichia coli ATCC 10536 Staphylococcus aureus ATCC 6538 oraz Staphylococcus epidermidis ATCC 35984, a najniższą wobec Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442.

Wykazano również zwiększoną lub zbliżoną aktywność nowego peptydu antybakteryjnego wobec E. coli w porównaniu do znanych i stosownych antybiotyków. W tabeli 2 pokazano wartości minimalnego

PL 248027 Β1 stężenia hamującego wzrost bakterii, które zostały uzyskane dla nowego peptydu antybakteryjnego oraz dla czterech znanych antybiotyków stosowanych w zwalczaniu infekcji powodowanych przez Escherichia coli.

Tabela 2

Antybiotyk	Szczep bakteryjny: Escherichia coli ATCC 10536 MIC \|ugmL\|
Ampicylina	15,62
Chloramfenikol	3,91
Gentamycyna	1,95
Kanamycyna	3,91
Nowy peptyd antybakteryjny	11,72

Nowy peptyd antybakteryjny hamuje wzrost i namnażanie się bakterii Escherichia coli i może być powszechnie stosowany jako chemioterapeutyk w leczeniu zakażań bakteryjnych.

Nowy peptyd antybakteryjny, według wynalazku, wykazuje synergistyczne działanie w połączeniu z antybiotykiem jakim jest chloramfenikol wobec bakterii Pseudomonas aeruginosa. Ocenę in vitro wspólnego oddziaływania nowego peptydu antybakteryjnego i antybiotyku przeprowadzono z wykorzystaniem metody szachownicy - checkerboard.

Roztwór wyjściowy bakterii przygotowano przez inkubację drugiej hodowli bakteryjnej w pożywce Muller Hinton Broth - MHB przez czas od 20 do 24 godzin w 37°C na wytrząsarce orbitalnej. Hodowla prowadzona była do momentu uzyskania gęstości 10⁸ komórek/mL. Z tak przygotowanej hodowli, w wyniku tysiąckrotnego rozcieńczenia, uzyskano hodowlę roboczą o gęstości 10⁵ komórek/mL, którą wykorzystano w kolejnych etapach. W każdym dniu badania przygotowywano seryjne dwukrotne rozcieńczenie związków na mikrotitracyjnych płytkach 96-dołkowych i dodawano do nich bakterie z hodowli roboczej. W kombinacji dwóch środków przeciwbakteryjnych, wyjściowe stężenie nowego peptydu antybakteryjnego wynosiło 3 mg/mL - 16 x MIC, natomiast chloramfenikolu 62,5 pg/mL - 8 x MIC. Płytki następnie inkubowano w 37°C w otaczającym powietrzu przez czas od 20 do 24 godzin. Następnie analizowano stopień zmętnienia hodowli w dołkach zawierających określone stężenia środków antybakteryjnych. MIC każdego środka przeciwbakteryjnego w kombinacji wyznaczono jako najniższe stężenie, które całkowicie hamowało wzrost bakterii. Interakcję leków w kombinacji wyrażono ilościowo jako ułamkowe stężenie hamujące - FIC lndex - FICI i obliczono dla każdej kombinacji leków przy użyciu następującego równania:

FICI = FICA +FICB, w którym:

FICA - MIC leku A w kombinacji/MIC samego leku A,

FCIB - MIC leki B w kombinacji/ MIC samego leku B.

Wyniki FICI interpretowano jako synergiczne, jeśli FICI < 0,5, jako addytywne, jeśli FICI mieści się w zakresie od > 0,5 do < 1 albo antagonistyczne, jeśli FICI > 2.

W tabeli 3 pokazano wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii uzyskane dla nowego peptydu antybakteryjnego, chloramfenikol! oraz przy łącznym zastosowaniu obu związków przeci wbakteryj nych.

PL 248027 Β1

Tabela 3

Szczep bakteryjny	Samodzielnie stosowane związki	Kombinacja związków
Nowy peptyd antybakteryjny	Chloramfenikol	Nowy peptyd antybakteryjny + Chloramfenikol
Pseudomonas aeruginosa ATCC15442	MIC \|ugml\|	MIC w kombinacji \|pg/mLl
	187,50	250,00	187,5+3,91 93,75+7,81 46,87+15,62 23,43+31,25

Nowy peptyd antybakteryjnyjest stosowany również jako składnik maści i opatrunków w leczeniu zakażeń Staphylococcus aureus lub Staphylococcus epidermidis oraz jako środek działający w synergii z konwencjonalnym antybiotykiem w leczeniu zakażeń Pseudomonas aeruginosa.

W tabeli 4 pokazano wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii S. aureus i S. epidermidis uzyskane dla nowego peptydu antybakteryjnego, chloramfenikolu oraz wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii P. aeruginosa przy łącznym zastosowaniu obu związków przeci wbakteryj nych.

Tabela 4

Szczep bakteryjny	Samodzielnie stosowane związki	Kombinacja związków
Nowy peptyd antybakteryjny	Chloramfenikol	Nowy peptyd antybakteryjny + Chloramfenikol
MIC [pg/mL]	MIC w kombinacji [pg/mL]
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442	187,50	250,00	187,5+3,91 93,75+7,81 46,87+15,62 23,43+31,25
Staphylococcus aureus ATCC 6538	29,12
Staphylococcus epidermidis ATCC 35984	29,12

Nowy peptyd antybakteryjny, według wynalazku, hamuje wzrost i namnażanie bakterii odpowiedzialnych ze przewlekłe infekcje skórne, w tym spowodowane zmianami oparzeniowymi. Wobec P. aeruginosa, nowy peptyd antybakteryjny, w kombinacji z chloramfenikolem, wykazuje zwiększoną aktywność antybakteryjną, która jest dopełniona jego aktywnością wobec S. aureus oraz S. epidermidis. Ponadto ten nowy peptyd antybakteryjny ma zwiększoną aktywność wobec P. aeruginosa po jego połączeniu z chloramfenikolem i wykazuje wartość MIC od dwu- do ośmiokrotnie niższą w porównaniu do działania samego nowego peptydu antybakteryjnego. Natomiast chloramfenikol w połączeniu z nowym peptydem antybakteryjnym wykazuje od ośmio- do sześćdziesięcioczterokrotnie niższą wartość MIC w porównaniu do działania samego antybiotyku.

Claims

1. Nowy peptyd antybakteryjny o wzorze chemicznym C119H202N38O31 i o sekwencji IKIAINGFGRIGRSVLRALYETGR.

2. Peptyd antybakteryjny, określony w zastrz. 1, do zastosowania w leczeniu jako środek o działaniu przeciwbakteryjnym wobec bakterii Gram-ujemnych, zwłaszcza Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa oraz wobec bakterii Gram-dodatnich, zwłaszcza Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis.

3. Peptyd antybakteryjny do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że stosowany jest jako składnik maści lub opatrunku w leczeniu zakażeń Staphylococcus aureus lub Staphylococcus epidermidis.

4. Peptyd antybakteryjny do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że do leczenia zakażeń Pseudomonas aeruginosa stosuje się go w połączeniu z antybiotykiem, zwłaszcza z chloramfenikolem.