PL247705B1 - Sulfoksymina butioniny do zastosowania w leczeniu chłoniaka Burkitta - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie wynalazku dotyczy sulfoksyminy butioniny do zastosowania w leczeniu chłoniaka Burkitta oraz sposobu obniżenia żywotności komórek nowotworowych ex vivo z udziałem sulfoksyminy butioniny.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sulfoksyminy butioniny do zastosowania w leczeniu chłoniaka Burkitta oraz sposobu obniżenia żywotności komórek chłoniaka Burkitta ex vivo z udziałem sulfoksyminy butioniny.

Chłoniak Burkitta (BL) to wysoce agresywny chłoniak nieziarniczy z komórek B (ang. non-Hodgkin lymphoma, NHL). Translokacja obejmująca gen c-MYC na chromosomie 8 jest cechą charakterystyczną dla BL i występuje u około 95% przypadków¹. W BL można wyróżnić trzy warianty kliniczne: endemiczny (związany z zakażeniem wirusem Epsteina-Barr EBV), sporadyczny i związany z niedoborem odporności². Wynik leczenia zależy od wieku pacjenta i stopnia zaawansowania choroby. Wskaźnik wyleczeń sporadycznego BL wynosi około 90% u dzieci i młodych dorosłych z krajów rozwiniętych. Jednak standardowe schematy chemioterapii są często niewystarczające w leczeniu dorosłych pacjentów z BL. Ponadto chemioterapia prowadzi do poważnych skutków ubocznych u znacznej części pacjentów². Dlatego istnieje zapotrzebowanie na mniej toksyczne opcje leczenia.

Cechą charakterystyczną komórek nowotworowych jest zmiana metabolizmu w celu zaspokojenia ich zwiększonego zapotrzebowania na energię i składniki odżywcze. Komórki nowotworowe często charakteryzują się wysokim poborem glukozy, produkcją mleczanu i metabolizmem glikolitycznym. Ponadto zwiększona synteza nukleotydów, aminokwasów i kwasów tłuszczowych wspomaga wzrost i proliferację komórek nowotworowych. Jednakże ubocznym skutkiem zwiększonego metabolizmu w komórkach nowotworowych jest wysoki poziom reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen specie, ROS), co skutkuje stresem oksydacyjnym³.

Glutation (GSH) to tripeptyd, γ-L-glutamylo-L-cysteinyloglicyna, obecny we wszystkich tkankach ssaków. Jest silnym przeciwutleniaczem, biorącym udział w utrzymaniu równowagi redoks w komórkach⁴. Ponadto GSH jest niezbędny do detoksykacji ksenobiotyków lub produktów stresu oksydacyjnego⁵ i bierze udział w naprawie DNA, proliferacji komórek i ferroptozie⁶. GCLC (podjednostka katalityczna ligazy glutaminianowo-cysteinowej) razem z GCLM (podjednostka modyfikująca ligazę glutaminianowo-cysteinową) tworzy syntetazę γ-glutamylocysteiny (GCL), enzym biorący udział w pierwszym etapie biosyntezy GSH de novo⁷. Podwyższony poziom GCLC obserwowano w kilku nowotworach, a wysoka ekspresja GCLC była związana z lekoopornością^8-10. Zgodnie z tym obserwowano, że inhibicja GSH wzmacnia efekt leczenia farmakologicznego m.in. w neuroblastomie¹¹,¹². Jak dotąd nie zbadano roli enzymów biorących udział w syntezie GSH i terapeutycznego potencjału ich hamowania w przypadku chłoniaka B-komórkowego.

Sulfoksymina butioniny (BSO) to swoisty inhibitor GCLC, zdolny do obniżania poziomu GSH in vitro i in vivo¹³,¹⁴. Wykazano, że BSO wzmacnia potencjał przeciwnowotworowy innych leków i składników aktywnych w raku piersi, neuroblastomie i chłoniaku^15-17. Ponadto badania na myszach wykazały, że BSO jest dobrze tolerowany i nietoksyczny¹⁸,¹⁹. Badania kliniczne nad neuroblastomą wykazały, że BSO zwiększa skuteczność leczenia melfalanem¹¹,¹². Właściwości te podkreślają potencjalne zastosowanie BSO w terapii przeciwnowotworowej.

Badania na myszach wykazały, że BSO jest dobrze tolerowany i nietoksyczny¹⁸,¹⁹. Ponadto, leczenie skojarzone BSO i melfalanem w modelach ksenograftu szpiczaka mnogiego spowodowało zmniejszenie objętości guza i dłuższe przeżycie wolne od zdarzeń²⁰. Na podstawie obiecujących właściwości BSO u myszy, w latach 90. XX wieku rozpoczęto badania kliniczne I fazy z zastosowaniem BSO i melfalanu u pacjentów z opornymi na leczenie nowotworami złośliwymi¹²,²¹. Badania te wykazały skuteczne obniżenie poziomu GSH oraz bezpieczeństwo stosowania leku. Najnowsze badania dotyczyły BSO i melfalanu w opornej neuroblastomie. Potwierdziły one bezpieczeństwo leczenia dawkami BSO do 75 g/m² oraz uzyskanie częściowej lub mieszanej odpowiedzi u 18-29% chorych¹¹,²². Pomimo tych obiecujących wyników badań I fazy, brak jest danych dotyczących kontynuacji badań II fazy z zastosowaniem BSO. We wstępnym doniesieniu przedstawiającym dane z badania melfalanu w połączeniu z BSO u chorych na czerniaka zaobserwowano silniejszy spadek GSH w komórkach guza w porównaniu z komórkami prawidłowymi²³. Ostatnie badania molekularne wskazały, że hamowanie syntezy GSH przez BSO mogą kompensować alternatywne szlaki, takie jak szlaki antyoksydacyjne deubikwitynazy i tioredoksyny^24,25. Jednoczesne hamowanie GSH i tioredoksyn lub deubikwitynaz było konieczne do zatrzymania proliferacji komórek nowotworowych. Ponadto eksperymenty na myszach wykazały, że hamowanie GSH za pomocą BSO może zapobiec rozwojowi raka, jeśli jest dostarczane przed wystąpieniem guza, ale nie ma efektu po rozwinięciu się guza, potencjalnie z powodu indukcji alternatywnych ścieżek antyoksydacyjnych²⁴. Jednak te eksperymenty zostały przeprowadzone w raku piersi, płuc i jajnika, które mają odmienne podłoże i mechanizmy biologiczne od chłoniaka Burkitta.

Pomimo udoskonalonych schematów leczenia, nadal u 15-40% pacjentów z BL dochodzi do nawrotu choroby opornej na leczenie. Ponadto u znacznej części pacjentów obserwuje się toksyczne działania uboczne, np. kardio- i neurotoksyczne następstwa chemioterapii oraz zespół lizy guza. Dlatego istnieje potrzeba bardziej specyficznych metod leczenia z mniejszą liczbą skutków ubocznych.

Wynalazek dotyczy sulfoksyminy butioniny do zastosowania w leczeniu chłoniaka Burkitta.

Korzystnie, sulfoksymina butioniny jest stosowana w połączeniu z lekiem cytostatycznym, przy czym sulfoksyminę butioniny podaje się przed zastosowaniem leku cytostatycznego lub równolegle z lekiem cytostatycznym.

Korzystnie, jako lek cytostatyczny stosuje się doksorubicynę i/albo cyklofosfamid.

W drugim aspekcie wynalazek dotyczy sposobu obniżenia żywotności komórek chłoniaka Burkitta ex vivo, w którym komórki traktuje się sulfoksyminą butioniny w połączeniu z lekiem cytostatycznym, przy czym sulfoksyminę butioniny podaje się przed zastosowaniem leku cytostatycznego lub równolegle z lekiem cytostatycznym.

Korzystnie, jako lek cytostatyczny stosuje się doksorubicynę i/albo cyklofosfamid.

Przedmiot wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym:

Fig. 1. (A) Żywotność komórek po knockoucie GCLC. B-D) Reprezentatywne przykłady barwienia na GCLC w (B) migdałkach, (C) tkance BL ocenionej jako + (pozytywna), (D) tkance BL ocenionej jako ++ (silnie pozytywna),

Fig. 2. Wpływ BSO na żywotność komórek BL (A) oraz kontrolnych limfoblastycznych linii komórek B (B). Na wykresach pokazane są wartości średnie oraz odchylenia standardowe z trzech niezależnych eksperymentów, każdy wykonany w trzech powtórzeniach technicznych,

Fig. 3. Żywotność komórek DG75 i ST486 po wstępnym traktowaniu 25 μΙ^ BSO, a następnie traktowaniu (A) doksorubicynę (80 nM dla DG75, 400 nM dla ST486) i (B) cyklofosfamidem (6400 μM). Na wykresach pokazano wartości średnie i odchylenia standardowe z trzech niezależnych eksperymentów, każdy wykonany w trzech powtórzeniach technicznych. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001; ****, p<0,0001; test t. DOX - doksorubicyna, CP - cyklofosfamid.

Przedmiot wynalazku przedstawiono w przykładach wykonania.

Przykłady wykonania

Linie komórkowe

Linie komórkowe BL i limfoblastoidalne linie komórkowe komórek B (K1-K4) hodowano w pożywce Roswell Park Memorial Institute 1640 (Lonza, Bazylea, Szwajcaria) uzupełnionej 2 mM L-glutaminą (Biowest, Nuaille, Francja), 1% penicyliną/streptomycyna (Biowest) i 10-20% płodowej surowicy bydlęcej (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C. HEK293T (DSMZ, Braunschweig, Niemcy) użyte do produkcji cząstek lentiwirusowych hodowano w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Lonza) o niskiej zawartości glukozy, uzupełnionej jak opisano powyżej. Linie komórkowe DG75, BL14, CA46 uzyskano z DSMZ, linię komórkową ST486 z ATCC (Manassas, VA, USA), linie komórek limfoblastoidalnych K1-K4 wyprowadzono od zdrowych dawców.

Barwienie immunohistochemiczne

Czternaście pierwotnych tkanek BL utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) oraz 3 próbki z migdałków zostały wybrane z repozytorium tkanek Wydziału Patologii i Biologii Medycznej Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Groningen. Tkanki wykorzystano zgodnie z Deklaracją Helsińską, a protokół został zatwierdzony przez komisję Medical Ethical Review UMCG (RR#201800554). Barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono zgodnie ze standardowymi protokołami stosując 10 mM bufor cytrynianowy (pH 6,0) w kuchence mikrofalowej w celu uwidocznienia antygenu. GCLC wykrywano stosując przeciwciało anty-GCLC firmy Abcam (ab53179, rozcieńczenie 1:800, Cambridge, Wielka Brytania). Wizualizacja została przeprowadzona za pomocą diaminobenzydyny, a preparaty zostały ocenione przez doświadczonego hematopatologa. Barwienie oceniono jako negatywne (-), jako pozytywne, gdy intensywność barwienia była podobna do intensywności barwienia obserwowanej w dużych centroblastach zlokalizowanych w centrach namnażania (+) i silnie dodatnie, gdy sygnały były bardziej intensywne niż te obserwowane w dużych centroblastach (++).

Klonowanie sgRNA

Sekwencje dwóch sgRNA nakierowanych na GCLC wybrano z biblioteki Brunello²⁶, w oparciu o najsilniejszy efekt obserwowany w naszym wcześniej opublikowanym badaniu przesiewowym z bi

PL 247705 Β1 blioteką Brunello. Oligonukleotydy sgRNA hybrydyzowano i ligowano z wektorem lentiCRISPR_v2 (Addgene #5296125) wykorzystując miejsce restrykcyjne BsmBI. Komórki kompetentne JM109 (Promega, Madison, Wl, USA) transformowano z użyciem produktów reakcji ligacji. Plazmidowy DNA wyizolowano z pojedynczych kolonii przy użyciu zestawu Plasmid Plus Maxi Kit (Qjagen, Hilden, Niemcy). Sekwencje sgRNA zweryfikowano przez sekwencjonowanie Sangera (Genomed, Warszawa, Polska).

Tabela 1. Sensowne i antysensowne oligonukleotydy sgRNA ukierunkowane na GCLC.

Nazwa	Sekwencja 5' - 3'
GCLC_sgl_S	CACCGAGAAATATCCGACATAGGAG
GCLC_sgl_AS	AAACCTCCTATGTCGGATAI ULIC
GCLC_sg2_S	CACCGAGGCCAACATGCGAAAACGC
GCLC_sg2_AS	AAACGCGI I I ICGCATGTTGGCCTC

Podkreślone części są kompatybilne z wektorem lentiCRISPR_v2 trawionym enzymem restrykcyjnym BsmBI.

Produkcja cząsteczek lentiwirusowych

Milion komórek HEK293T wysiano na 6-dołkową płytkę i transfekowano następnego dnia metodą transfekcji fosforanem wapnia (lnvitrogen) z plazmidami pakującymi psPAX (1,5 μg), pMD2.G (1 μg) i plazmidem lentiCRISPR_v2 zawierającym sekwencję sgRNA (2 μg). Po 24 godzinach do komórek dodano 1,1 ml świeżego DMEM uzupełnionego 10% FBS. 48 godzin po transfekcji zbierano supernatant lentiwirusowy, filtrowano przez filtr 0,45 μπι i stosowano bezpośrednio lub przechowywano w -80°C.

Test wzrostu

Komórki ST486 i DG75 stransdukowano dwoma sgRNA nakierowanymi na gen GCLC i dwoma kontrolnymi sgRNA. Komórki selekcjonowano przez cztery dni z użyciem 0,3 (ST486) lub 3 (DG75) μg/ml puromycyny, a następnie wysiano w trzech powtórzeniach na 96-dołkową płytkę: ST486 1000 i DG75 2000 komórek na dołek. Następnie dodano 100 μΙ odczynnika CellTiter-Glo (Promega, Madison, Wl, USA) rozcieńczonego 1:2 w PBS na dołek po 1 godzinie (poziom bazowy), 48 godzin i 96 godzin. Sygnał luminescencyjny mierzono przy użyciu czytnika mikropłytek GloMax (Promega). Eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych. Szybkość wzrostu obliczono po 48 godzinach i 96 godzinach w stosunku do pomiaru po 1 godzinie.

Wyniki

Całogenomowe badanie przesiewowe CRISPR/Cas9 w linii komórkowej ST486 wykazało, że geny kodujące enzymy zaangażowane w syntezę GSH są niezbędne dla wzrostu komórek (GCLC: FC= -3,28, p_adj=0,0004; GCŁMFC=-5,3, p_adj=5,67E-14; GSS FC=-5, p_adj=0,22)²⁷. Używając poszczególnych sgRNA, potwierdzono, że GCLC jest niezbędny dla wzrostu komórek BL. Komórki DG75 i ST486 zostały stransdukowane dwoma sgRNA nakierowanymi na GCLC. Żywotność komórek była oceniania przy użyciu odczynnika CellTiter-Glo. Celowanie w GCLC w komórkach DG75 i ST486 silnie obniżyło żywotność komórek, odpowiednio o 88-91% i 97% po 96 godzinach (Fig. 1A). Na wykresach pokazane są wartości średnie oraz odchylenia standardowe z trzech niezależnych eksperymentów, każdy wykonany w trzech powtórzeniach technicznych. **, p<0,01; ***, p<0,001; ****, p<0,0001; t-test.

Następnie przeanalizowano ekspresję GCLC w tkankach pierwotnych 14 przypadków BL i 3 tkankach migdałków. W migdałkach sygnał GCLC obserwowano głównie w centroblastach zlokalizowanych w centrach namnażania. W tkankach BL intensywność barwienia była co najmniej tak silna jak w centroblastach w 6 przypadkach, a nawet silniejsza w 8 przypadkach (Fig. 1B-D). Razem te dane pokazują, że GCLC ulega nadekspresji w tkankach BL i jest niezbędny dla wzrostu komórek BL.

Traktowanie komórek BSO

Wpływ BSO (Sigma-Aldrich) na przeżywalność BL i limfoblastoidalnych komórek B badano w zakresie stężeń 1,25 - 100 μΜ. 1*10⁴ - 4*10⁴ komórek wysiano na 96-dołkową płytkę i traktowano BSO przez 48 godzin. Żywotność komórek oceniano przy użyciu testu CellTiter-Glo (Promega). Przeżywalność traktowanych komórek określono względem komórek bez BSO. Wartość medialnego stężenia hamującego wzrost (GI50) obliczono stosując GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Boston, MA,

USA). Eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych, każde z trzema powtórzeniami technicznymi.

Określono wartości medialnego stężenia hamującego wzrost (GI50) BSO w czterech liniach komórkowych BL: DG75, ST486, BL41 i CA46. Mieściły się one w zakresie od 5 do 10 μΜ, co potwierdziło znaczenie GLCL w BL. Jako kontrolę zastosowano BSO również w czterech liniach komórek limfoblastoidalnych komórek B (K1-K4). W przeciwieństwie do BL, linie komórkowe LCL (K1-K4) były oporne na traktowanie BSO. Wyniki te pokazują, że BSO zmniejsza żywotność komórek BL, nie mając jednocześnie wpływu na nienowotworowe komórki B (Fig. 2).

Terapia skojarzona w liniach komórkowych BL

Komórki BL wysiano na 96-dołkową płytkę i wstępnie traktowano 25 μM BSO przez 24 godziny. Następnego dnia dodano doksorubicynę (Sigma-Aldrich) (80 nM dla DG75; 400 nM dla ST486) albo cyklofosfamid (Sigma-Aldrich) (6400 μM). Dawki oparto na stężeniach GI50 określonych doświadczalnie. Żywotność komórek BL mierzono za pomocą testu CellTiter-Glo (Promega) po 48 godzinach. Eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych, każde z trzema powtórzeniami technicznymi.

Istotność różnic w przeżywalności komórek traktowanych sgRNA nakierowanych na gen GCLC w porównaniu z kontrolnymi sgRNA oraz komórek traktowanych poszczególnymi lekami w porównaniu z lekiem w połączeniu z BSO oceniono za pomocą testu t-Studenta w GraphPad Prism 5 (oprogramowanie GraphPad).

Wstępne potraktowanie linii komórkowych BL BSO znacznie wzmocniło działanie zarówno doksorubicyny, jak i cyklofosfamidu. W przypadku doksorubicyny odsetek żywych komórek zmniejszył się z 49% do 26% w ST486 i z 75% do 1,4% w DG75 (Fig. 3A). Podobny efekt zaobserwowano w przypadku cyklofosfamidu, ze spadkiem żywotności komórek ST486 z 35% do 3%, a w komórkach DG75 z 65% do 0,42% (Figura 3B). Wyniki te pokazują po raz pierwszy, że wstępne traktowanie BSO wzmacnia efekt leków cytostatycznych w BL

Dodatkowo, wykonano analizę zależności genetycznych dostępnych na stronie depmap.org, która potwierdziła, że geny zaangażowane w syntezę GSH są niezbędne wyłącznie w przypadku nowotworów krwi: ostrej białaczki limfoblastycznej i chłoniaka nieziarniczego z komórek B (BL i DLBCL). Dane te wskazują, że nowotwory złośliwe układu krwiotwórczego silnie polegają na GSH i są podatne na hamowanie za pomocą BSO.

Powyższe wyniki potwierdziły skuteczność BSO jako silnego inhibitora w komórkach chłoniaka Burkitta, przy jednoczesnej ograniczonej cytotoksyczności wobec prawidłowych komórek B. Ponadto BSO silnie wzmacniała efekt cytotoksyczny powszechnie stosowanych leków cytostatycznych: doksorubicyny i cyklofosfamidu. Te wyniki są zgodne z wcześniejszymi pracami pokazującymi, że BSO nie jest toksyczny dla normalnych komórek i jest dobrze tolerowany w badaniach klinicznych. Dlatego też terapia skojarzona z BSO może stwarzać możliwość zmniejszenia dawki leków koniecznych do podania w celu skutecznego leczenia pacjentów z BL.

LITERATURA

1. Kalisz K, Alessandrino F, Beck R, et al. An update on burkitt lymphoma: A review of pathogenesis and multimodality imaging assessment of disease presentation, treatment response, and recurrence. Insights into Imaging. 2019;10(1).

2. Bellan C, Lazzi S, De Falco G, Nyongo A, Giordano A, Leoncini L. Burkitt's lymphoma: New insights into molecular pathogenesis. J Clin Pathol. 2003;56(3):188-192.

3. Dang CV. Links between metabolism and cancer. Genes Dev. 2012;26(9):877-890.

4. Traverso N, Ricciarelli R, Nitti M, et al. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance. Oxid Med Cell Longev. 2013;2013:972913.

5. Desideri E, Ciccarone F, Ciriolo MR. Targeting glutathione metabolism: Partner in crime in anticancer therapy. Nutrients. 2019;11(8):1926. doi:10.3390/nu11081926.

6. Kennedy L, Sandhu JK, Harper ME, Cuperlovic-Culf M. Role of glutathione in cancer: From mechanisms to therapies. Biomolecules. 2020;10(10):1429. doi:10.3390/biom10101429.

7. Griffith OW, Mulcahy RT. The enzymes of glutathione synthesis: Gamma-glutamylcysteine synthetase. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1999;73:209-67, xii.

8. Fujimori S, Abe Y, Nishi M, et al. The subunits of glutamate cysteine ligase enhance cisplatin resistance in human non-small cell lung cancer xenografts in vivo. Int J Oncol. 2004; 25(2) :413-418.

9. Hiyama N, Ando T, Maemura K, et al. Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit is associated with cisplatin resistance in lung adenocarcinoma. Jpn J Clin Oncol. 2018;48(4):303-307.

10. Jarvinen K, Soini Y, Kahlos K, Kinnula VL. Overexpression of gamma-glutamylcysteine synthetase in human malignant mesothelioma. Hum Pathol. 2002;33(7):748-755.

11. Villablanca JG, Volchenboum SL, Cho H, et al. A phase I new approaches to neuroblastoma therapy study of buthionine sulfoximine and melphalan with autologous stem cells for recurrent/refractory high-risk neuroblastoma. Pediatric blood & cancer. 2016;63(8): 1349-1356.

12. O'Dwyer PJ, Hamilton TC, LaCreta FP, et al. Phase I trial of buthionine sulfoximine in combination with melphalan in patients with cancer. Journal of Clinical Oncology. 1996;14(1):249-256.

13. Griffith OW, Meister A. Potent and specific inhibition of glutathione synthesis by buthionine sulfoximine (S-n-butyl homocysteine sulfoximine). J Biol Chem. 1979; 254(16):7558-7560.

14. Bailey HH. L-S,R-buthionine sulfoximine: Historical development and clinical issues. Chem Biol Interact. 1998;111-112:239—254.

15. Dusre L, Mimnaugh EG, Myers CE, Sinha BK. Potentiation of doxorubicin cytotoxicity by buthionine sulfoximine in multidrug-resistant human breast tumor cells. Cancer Res. 1989;49(3):511-515.

16. Marengo B, De Ciucis C, Verzola D, et al. Mechanisms of BSO (L-buthionine-S,R-sulfoximine)-induced cytotoxic effects in neuroblastoma. Free Radic Biol Med. 2008;44(3):474-482.

17. Yang S, Evens AM, Prachand S, et al. Mitochondrial-mediated apoptosis in lymphoma cells by the diterpenoid lactone andrographolide, the active component of andrographis paniculata. Clinical Cancer Research. 2010;16(19):4755-4768.

18. Dorr RT, Liddil JD, Sobie MJ. Cytotoxic effects of glutathione synthesis inhibition by L-buthionine-(SR)-sulfoximine on human and murine cells. Invest New Drugs. 1986;4(4):305-313.

19. Ishikawa M, Takayanagi G, Sasaki K. Effect of buthionine sulfoximine, an inhibitor of glutathione biosynthesis, on the selenium-induced lethality in mice. Japan J.Pharmacol. 1988;48:283-286.

20. Tagde A, Singh H, Kang MH, Reynolds CP. The glutathione synthesis inhibitor buthionine sulfoximine synergistically enhanced melphalan activity against preclinical models of multiple myeloma. Blood Cancer Journal. 2014;4(7):e229-13.

21. Bailey HH, Mulcahy RT, Tutsch KD, et al. Phase I clinical trial of intravenous L-buthionine sulfoximine and melphalan: An attempt at modulation of glutathione. Journal of Clinical Oncology. 1994;12(1):194-205.

22. Anderson CP, Matthay KK, Perentesis JP, et al. Pilot study of intravenous melphalan combined with continuous infusion L-S,R-buthionine sulfoximine for children with recurrent neuroblastoma. Pediatr Blood Cancer. 2015;62(10):1739-1746.

23. Chen X, Carystinos GD, Batist G. Potential for selective modulation of glutathione in cancer chemotherapy. Chem Biol Interact. 1998;111-112:263-275.

24. Harris IS, Treloar AE, Inoue S, et al. Glutathione and thioredoxin antioxidant pathways synergize to drive cancer initiation and progression. Cancer Cell. 2015;27(2):211-222.

25. Harris IS, Endress JE, Coloff JL, et al. Deubiquitinases maintain protein homeostasis and survival of cancer cells upon glutathione depletion. Cell Metab. 2019;29(5):1166-1181 .e6.

26. Doench JG, Fusi N, Sullender M, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 2016;34(2):184-191.

27. Niu F, Kazimierska M, Nolte IM, et al. The miR-26b-5p/KPNA2 axis is an important regulator of burkitt lymphoma cell growth. Cancers (Basel). 2020;12(6):1464. doi:10.3390/cancers12061464.

PL 247705 Β1

Lista sekwencji:

<110> INSTYTUT GENETYKI CZŁOWIEKA POLSKIEJ AKADEMII NAUK <120> Sulfoksymina butioniny do zastosowania w leczeniu chłoniaka Burkitta <130> 59362/23 <160>4 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211>25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> GCLC_sg1_S <400> 1 caccgagaaa tatccgacat aggag 25 <210>2 <211>25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> GCLC.sgl AS <400> 2 aaacctccta tgtcggatat ttctc 25 <210>3 <211 >25 <212> RNA

PL 247705 Β1 <213> Artificial Sequence <220>

<223> GCLC_sg2_S <400> 3 caccgaggcc aacatgcgaa aacgc 25 <210>4 <211 >25 <212> RNA < 213> Artificial Sequence <220>

< 223> GCLC. sg2AS < 400> 4 aaacgcgttttcgcatgttggcctc 25

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sulfoksymina butioniny do zastosowania w leczeniu chłoniaka Burkitta.
2. 2. Sulfoksymina butioniny do zastosowania według zastrzeżenia 1, znamienna tym, że sulfoksymina butioniny jest stosowana z w połączeniu lekiem cytostatycznym, przy czym sulfoksyminę butioniny podaje się przed zastosowaniem leku cytostatycznego lub równolegle z lekiem cytostatycznym.
3. 3. Sulfoksymina butioniny do zastosowania według zastrzeżenia 2, znamienna tym, że jako lek cytostatyczny stosuje się doksorubicynę i/albo cyklofosfamid.
4. 4. Sposób obniżenia żywotności komórek chłoniaka Burkitta ex vivo, znamienny tym, że komórki traktuje się sulfoksyminę butioniny w połączeniu z lekiem cytostatycznym, przy czym sulfoksyminę butioniny podaje się przed zastosowaniem leku cytostatycznego lub równolegle z lekiem cytostatycznym.
5. 5. Sposób według zastrzeżenia 4, znamienny tym, że jako lek cytostatyczny stosuje się doksorubicynę i/albo cyklofosfamid.