PL245810B1 - Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae do zastosowania w zwalczaniu infekcji bakteryjnych - Google Patents
Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae do zastosowania w zwalczaniu infekcji bakteryjnych Download PDFInfo
- Publication number
- PL245810B1 PL245810B1 PL442387A PL44238722A PL245810B1 PL 245810 B1 PL245810 B1 PL 245810B1 PL 442387 A PL442387 A PL 442387A PL 44238722 A PL44238722 A PL 44238722A PL 245810 B1 PL245810 B1 PL 245810B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- klebsiella pneumoniae
- bacteriophage
- bacteriophages
- phage
- phages
- Prior art date
Links
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 85
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 42
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 title description 6
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 title description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 11
- 230000001018 virulence Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 17
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 12
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 9
- 208000037041 Community-Acquired Infections Diseases 0.000 claims description 3
- 206010024652 Liver abscess Diseases 0.000 claims description 3
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010028885 Necrotising fasciitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014801 endophthalmitis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007970 necrotizing fasciitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026425 severe pneumonia Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 229940045505 klebsiella pneumoniae Drugs 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 24
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 15
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 241001137855 Caudovirales Species 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 4
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010068385 carbapenemase Proteins 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 241000702072 Podoviridae Species 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 description 2
- 241000702202 Siphoviridae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229940041011 carbapenems Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 101000740455 Klebsiella pneumoniae Metallo-beta-lactamase type 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 108700041567 MDR Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003214 anti-biofilm Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 239000012681 biocontrol agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000005282 brightening Methods 0.000 description 1
- 108010059049 capsular-polysaccharide galactohydrolase Proteins 0.000 description 1
- YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N carbapenem Chemical compound C1C=CN2C(=O)C[C@H]21 YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013043 cell viability test Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 231100000206 health hazard Toxicity 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004784 molecular pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5015—Organic compounds, e.g. fats, sugars
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/00032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest nowy szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae wybrany ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00192; F/00193; F/00194; F/00195, z których każdy ma potwierdzoną naturę lityczną i charakteryzuje się wysoką wirulencją. Zgłoszenie dotyczy także zastosowania szczepu bakteriofaga do wytwarzania preparatów do leczenia infekcji wywołanych przez bakterie z gatunku Klebsiella pneumoniae.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae do zastosowania w zwalczaniu infekcji bakteryjnych. Przedmiotem wynalazku są cztery bakteriofagi vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L specyficzne wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae jako modulatora wzrostu wpływającego na aktywność biologiczną szczepów tego gatunku zdolnych do wytwarzania β-laktamaz o rozszerzonym spektrum działania (ESBL), a także zdolnych do wytwarzania karbapenemaz (β-laktamaz hydrolizujących karbapenemy), w tym do ich zwalczania w warunkach środowiskowych, medycznych, weterynaryjnych i innych. Izolat vB_Kp-36L zdolny jest do zwalczania szczepu Klebsiella pneumoniae o zdolności do wytwarzania karbapenemazy klasy D OXA-48 (tzw. „superbakterii”).
Klebsiella pneumoniae jest gram ujemną bakterią należącą do rodziny Enterobacteriaceae. Bakteria ta jest patogenem oportunistycznym, który dotyka głównie osoby z osłabionym układem odpornościowym i ma tendencję do powodowania infekcji szpitalnych. Podzbiór hiperwirulentnych serotypów K. pneumoniae o podwyższonej zdolności do produkcji otoczek polisacharydowych może wpływać na zdrowe osoby i powodować zagrażające życiu zakażenia pozaszpitalne, takie jak ropień wątroby, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, martwicze zapalenie powięzi, zapalenie wnętrza gałki ocznej, ciężkie zapalenie płuc.
W patogenezie zakażeń bakterie te wykorzystują szereg czynników wirulencji, do których zalicza się otoczki polisacharydowe, lipopolisacharyd ściany komórkowej, fimbrie, białka błony zewnętrznej, determinanty pozyskiwania żelaza (siderofory) i wykorzystania źródeł azotu, które mają na celu utrzymanie komórek bakterii przy życiu i unikania ich niszczenia przez układ odpornościowy podczas infekcji [Li, B., et al., Molecular pathogenesis of Klebsiellapneumoniae. Future Microbiol, 2014. 9(9): p. 1071-81]. Pomimo wzrostu zakażeń wywoływanych przez szczepy o wysokim potencjale patogennym tzw. hvKP obserwuje się znaczny wzrost wysokiego poziomu oporności na leki przeciwbakteryjne pierwszego rzutu. Szczepy MDR K. pneumoniae w ostatnich latach zostały zaklasyfikowane jako główne zagrożenie dla zdrowia publicznego przez amerykańskie Centrum Kontroli i Prewencji Chorób. Dodatkowo Światowa Organizacja Zdrowia wskazuje enterobakterie (zwłaszcza szczepy NDM-1, MBL, KPC, AmpC, ESBL) w tym bakterie z rodzaju Klebsiella, jako szczególne zagrożenie dla zdrowia i wskazuje na konieczność szybkiego opracowania nowych strategii zwalczania tych bakterii, mające na celu ograniczenie krzyżowego przekazywania genów oporności między drobnoustrojami. Obecnie pałeczki Gram-ujemne (Enterobacteriaceae) wytwarzające enzymy beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) lub oporne na karbapenemy wpisane są na listę patogenów alarmowych (Załącznik do Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 11 marca 2005 r. w sprawie rejestrów zakażeń zakładowych oraz raportów o występowaniu tych zakażeń). W tym samym okresie liczba szczepów hvKP o wysokim potencjale patogennym również wzrosła. W przeszłości szczepy MDR i hvKP ewoluowały oddzielnie w odrębnych grupach klonalnych, ale niedawne pojawienie się szczepów hvKP niosących geny MDR budzi nowe obawy w skutecznej ich eliminacji [Surgers, L., et al., ESBL-Producing Strain of Hypervirulent Klebsiella pneumoniae K2, France: Emerg Infect Dis. 2016 September; 22(9):1687-8. doi: 10,3201/eid2209,160681]. Pojawienie się bakterii wielolekoopornych - MDR, a także brak perspektyw na wytwarzania nowych związków o aktywności przeciwdrobnoustrojowej zmusza do poszukiwania alternatywnych strategii ich eliminacji. Badania wskazują, że wirusy bakteryjne mogą być stosowane jako alternatywa dla antybiotyków, a także innych związków przeciwdrobnoustrojowych do ograniczania populacji mikroorganizmów środowiskowych, a także o fenotypach patogennych.
Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO18106135 A2 dotyczy kompozycji bakteriofagowych zawierających nowe szczepy bakteriofagów oraz sposobów ich stosowania w leczeniu i zapobieganiu infekcjom bakteryjnym, w tym infekcjom dróg oddechowych powodowanych przez np. Pseudomonas aeruginosa i/lub Klebsiella pneumoniae.
Chińskie zgłoszenie patentowe CN115029322 A dotyczy bakteriofaga wielolekoopornej Klebsiella pneumoniae i jego zastosowania.
Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO21125988 A1 dotyczy kompozycji koktajlowych zawierających oddechowe fagi antybakteryjne i sposobów ich stosowania w leczeniu i zapobieganiu infekcjom bakteryjnym, w tym infekcjom dróg oddechowych powodowanych przez np. Pseudomonas aeruginosa i/lub Klebsiella pneumoniae.
Chińskie zgłoszenie patentowe CN113583973 A dotyczy wysokolizowego bakteriofaga Klebsiella pneumoniae RDP-KP-20007 i jego zastosowania.
Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO22157776 A1 dotyczy bakteriofaga Klebsiella i jego zastosowania.
Chińskie zgłoszenie patentowe CN113025582 A dotyczy bakteriofaga Klebsiella pneumoniae i zastosowania medycznego.
Chińskie zgłoszenie patentowe CN112708600 A dotyczy bakteriofaga litycznego Klebsiella pneumoniae RDP-KP-20005 i jego zastosowania.
Chińskie zgłoszenie patentowe CN113201506 A dotyczy bakteriofaga Klebsiella pneumoniae efektywnie rozdzielającego odporność na karbapeny i zastosowanie bakteriofaga Klebsiella pneumoniae.
Chińskie zgłoszenie patentowe CN113174372 A dotyczy nowego bakteriofaga oddzielonego przez przyjęcie zmutowanego bakteriofaga szczepu Klebsiella pneumoniae typu K2 jako bakterii gospodarza, a bakteriofag ma węższe spektrum bakteriobójcze, może infekować i zabijać Klebsiella pneumoniae , a co ważniejsze ma działanie bakteriobójcze na opisane szczepy oporne na bakteriofagi.
Koreańskie zgłoszenie patentowe KR20180137814 A dotyczy bakteriofagów litycznych Klebsiella specyficznych dla typu Klebsiella odpornego na antybiotyki.
Koreańskie zgłoszenie patentowe KR20190079573 A dotyczy nowego bakteriofaga specyficznego dla rodzaju Klebsiella KP12 i kompozycji antybakteryjnej obejmującej ten bakteriofag.
Koreańskie zgłoszenie patentowe KR102193101 B1 dotyczy nowych bakteriofagów specyficznych dla bakterii z rodzaju Klebsiella odpornych na antybiotyki.
Chińskie zgłoszenie patentowe CN106754745 A dotyczy bakteriofaga Klebsiella pneumoniae i jego zastosowania.
Koreańskie zgłoszenie patentowe KR20180137813 A dotyczy bakteriofaga litycznego specyficznego dla Klebsiella odpornego na antybiotyki.
Koreańskie zgłoszenie patentowe KR20180137815 A dotyczy bakteriofaga litycznego specyficznego dla Klebsiella odpornego na antybiotyki.
Koreańskie zgłoszenie patentowe KR20180073449 A dotyczy nowych specyficznych dla Klebsiella KP1 bakteriofagów i kompozycji antybakteryjnej obejmującej te bakteriofagi.
Koreańskie zgłoszenie patentowe KR20190000944 A dotyczy bakteriofaga litycznego specyficznego dla Klebsiella odpornego na antybiotyki.
W dziedzinie wciąż istnieje zapotrzebowanie na nowe leki do zwalczania bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae. Celem niniejszego wynalazku było znalezienie bakteriofagów specyficznych wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae.
Cel ten został zrealizowany przez opisane w niniejszym zgłoszeniu patentowym bakteriofagi vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L pozyskane ze ścieków komunalnych.
A zatem, przedmiotem niniejszego wynalazku są nowe bakteriofagi specyficzne wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae zdeponowane w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00192; F/00193; F/00194; F/00195, z których każdy ma potwierdzoną naturę lityczną i charakteryzuje się wysoką wirulencją.
Wynalazek dotyczy także powyższego szczepu bakteriofaga do zastosowania w leczeniu infekcji wywołanych przez bakterie z gatunku Klebsiella pneumoniae.
Korzystnie, szczep bakteriofaga do zastosowania w leczeniu infekcji wywołanych przez bakterie z gatunku Klebsiella pneumoniae stosuje się jako mieszankę fagów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00192; F/00193; F/00194; F/00195, wykazujących się brakiem interferencji.
Korzystnie, szczep bakteriofaga jest do zastosowania w leczeniu infekcji szpitalnych i pozaszpitalnych, takich jak ropień wątroby, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, martwicze zapalenie powięzi, zapalenie wnętrza gałki ocznej, ciężkie zapalenie płuc.
Korzystnie, bakteriofagi są immobilizowane w kapsułkach alginianowych, korzystniej kapsułki alginianowe są opłaszczone chitozanem.
Przedstawione w zgłoszeniu patentowym bakteriofagi vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L pozyskane ze ścieków komunalnych mogą być wykorzystywane jako aktywne biologicznie modulatory wzrostu mikroorganizmów z gatunku Klebsiella pneumoniae, przyczyniając się tym samym do ograniczenia liczebności szczepów klinicznych wytwarzających enzymy β-laktamazy (fenotypy oporności ESBL), a także wytwarzających karbapenemazy w tym szczepu typu: OXA-48 („superbakteria”).
Klebsiella pneumoniae CPE o fenotypie lekooporności OXA-48 to groźna „superbakteria”, na którą nie działają powszechnie stosowane w lecznictwie antybiotyki, nawet te tzw. ostatniej szansy.
Z punktu widzenia wykorzystania technologicznego, czy też terapeutycznego wyizolowane bakteriofagi scharakteryzowano pod względem cykli replikacyjnych przy użyciu metody one-step growth, określając ich czas latencji na około 10 minut w przypadku vB_Kp-4M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L oraz 20 minut w przypadku vB_Kp-12M, co w praktyce zwiększa szansę na ich komercyjne zastosowanie. Plon fagowy z hodowli w przypadku vB_Kp-4M po 10 minutach replikacji wirusa wynosił około 118 fagów potomnych z jednej komórki bakteryjnej, w izolacie vB_Kp-12M około 130 fagi potomne po 20 minutach replikacji wirusa, a w przypadku pozostałych izolatów vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L po 10 minutach replikacji plon wynosił odpowiednio 100 i 97 fagów potomnych. Wskazuje się, że parametry określające proces replikacji wirusów tj. współczynnik adsorpcji, czas latencji, plon fagowy - z ang. „burst size” są ważne w określeniu dynamiki przeprowadzanej infekcji przez wirusy i tym samym jej skuteczności. Wymagania dotyczące bakteriofagów wykorzystywanych terapeutycznie zostały umieszczone w opisie patentowym PL 228 848 B1, gdzie wskazano, że w lecznictwie wybiera się fagi o stosunkowo wysokich plonach fagowych tj. (<100 pfu lub więcej) i niskich czasach latencji (>1-1,5 h), a które w przypadku zastosowania technologicznego izolaty fagowe będące przedmiotem wynalazku również spełniają. Uzyskane wartości tych parametrów dla poszczególnych izolatów fagowych wskazują na ich wysoki potencjał do zwalczania zakażeń bakteryjnych i czynią je potencjalnie atrakcyjnym narzędziem w zwalczaniu komórek wchodzących w skład biofilmów bakteryjnych.
Dodatkowo w trakcie testów stopnia wirulencji (tzw. „bacterial challenge”) badanych bakteriofagów obserwowano spadek liczby komórek gospodarzy bakteryjnych (Klebsiella pneumoniae o oporności typu ESBL+) odpowiednio o 4 log podczas 6 h trwania infekcji dla vB_Kp-4M, vB_Kp-12M i vB_Kp-12SM. W przypadku izolatu vB_Kp-36L spadek liczby komórek bakteryjnych o 4 log obserwowano podczas 4 h infekcji. Efekt bakteriobójczy wobec wybranych szczepów Klebsiella pneumoniae ESBL+, CPE, w tym o fenotypie lekooporności OXA-48 występował już przy niskich wartościach MOI = 0,01, co jest istotne z punktu technologicznego ich wykorzystania.
Przeprowadzona analiza infekcyjności izolatów vB_Kp-4M, vB_Kp-12M i vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L potwierdziła lityczną naturę w stosunku do wybranych szczepów klinicznych Klebsiella pneumoniae innych niż szczepy-gospodarze. Dla vB_Kp-4M MOI na poziomie 0,01 był wystarczający do redukcji komórek bakteryjnych w zakresie od 0 do 93,29% po 8 godzinach od infekcji. Przy zastosowaniu innych MOI redukcja utrzymywała się w następujących zakresach: MOI 0,1 redukcja w zakresie od 0 do 94,79%; MOI 1 w zakresie od 0 do 94,21%; MOI 10 od 0 do 96,27%, MOI 100 od 0 do 95,17%. Dla bakteriofaga vB_Kp-12M zwiększoną aktywność lityczną obserwowano przy niższych zakresach MOI, gdzie redukcja procentowa wynosiła od 0 do 62,51% dla MOI 0,01 oraz od 0 do 69,34% dla MOI 0,1 w przypadku szczepów Klebsiella pneumoniae wrażliwych na badanego bakteriofaga. Zastosowanie bakteriofaga vB_Kp-12SM przy MOI na poziomie 0,01 był wystarczający do redukcji komórek bakteryjnych w zakresie od 0% do 88,14%. W przypadku MOI 1 obserwowana redukcja procentowa była w zakresie od 0% do 91,90%. MOI na poziomie 10 redukował liczbę komórek w zakresie od 0% do 91%, przy MOI 100 w zakresie 0% do 50,35%. W przypadku niższych MOI tj. 0,01; 0,1; 1 lub 10 zwiększała się liczba szczepów bakteryjnych o wyższej procentowej redukcji komórek. Należy podkreślić, że różnice w aktywności nie są jednak zbyt duże, co świadczy o tym, iż wirusy nawet w niskich stężeniach mogą osiągać zadowalające właściwości lityczne. W przypadku faga vB_Kp-36L przy najniższym badanym MOI 0,01 obserwowano 90,83% redukcję liczby komórek w stosunku do kontroli, utrzymująca się przy pozostałych zastosowanych MOI: od 0 do 94,16% przy MOI 0,1; od 2,02-95,21% przy MOI 1; od 0-87,44% przy MOI 10 oraz redukcja w zakresie od 0 do 94,66% przy MOI 100.
Dodatkowo badanie aktywności litycznej „koktajli fagowych” otrzymanych po zmieszaniu wirusów vB_Kp-4M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L, vB_Kp-12M w stosunku 1 : 1 : 1 : 1 na wzrost klinicznych gatunków Klebsiella pneumoniae wykazało spadek populacji komórek bakteryjnych w zakresie od 2,01 do 98,36% przy MOI 0,01; od 5,65 do 95,70% przy MOI 0,1; od 2,34 do 97,72% przy MOI 1; od 0,41 do 96,94% przy MOI 10, oraz w zakresie od 3,31 do 96,02% przy zastosowaniu MOI 100, co świadczy o braku wzajemnej interferencji w infekowaniu bakterii czy też hamowaniu swoich właściwości litycznych przez badane bakteriofagi. Otrzymane wyniki pozwalają przypuszczać, że terapeutyczne wykorzystanie badanych fagów przy niższych stężeniach, umożliwi osiągnięcie równie zadowalających efektów leczniczych/bakteriobójczych, jak przy podaniu ich wyższych stężeń. Ponadto stanowi to pozytywny aspekt pod względem wykorzystania technologicznego badanych wirusów, ponieważ pozwoli to na ominięcie etapu otrzymywania hodowli o wysokim mianie wirusów w trakcie procesu produkcji preparatów leczniczych.
W celu określenia aktywności litycznej badanych bakteriofagów będących przedmiotem wynalazku wykonano „spot test” w stosunku do 43 izolatów klinicznych bakterii z rodzaju Klebsiella. Bakteriofagi vB_Kp-4M, vB_Kp-12M i vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L wykazywały lityczność odpowiednio w stosunku do 11,6%, 9,3%, 18,6%, 41,86% przebadanych izolatów klinicznych bakterii z rodzaju Klebsiella, co świadczy o zwiększonym zakresie gospodarzy dla badanych wirusów oraz ich potencjale terapeutycznym w ich zwalczaniu. W tym celu wykonano posiewy badanych izolatów klinicznych Klebsiella pneumoniae, gdzie 100 μΙ hodowli bakteryjnej w fazie logarytmicznego wzrostu zmieszano z 5 ml agaru miękkiego (0,7%) i wylano na szalki Petriego z podłożem LB agar. Przygotowane szalki z hodowlami bakteryjnymi inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut. Na tak przygotowane hodowle nakropiono po 10 μl danego lizatu fagowego. Test aktywności litycznej „host range” wykonano na 43 szczepach klinicznych zidentyfikowanych gatunkowo.
Wskazuje się również, że na skuteczność infekcji fagów mają wpływ różne zewnętrzne czynniki fizyczne i chemiczne, takie jak pH, temperatura, stabilność wirusów w soku żołądkowym i jelitowym, które mogą doprowadzać do uszkodzeń elementów strukturalnych wirionów (główka, ogon, otoczka), utraty lipidów otoczek, a także prowadzić do zmian strukturalnych materiału genetycznego wirusów (Ackermann HW, Tremblay D, Moineau S. Long-term bacteriophage preservation. WFCC Newslett. 2004;38:35-40; Jończyk E, Kłak M, Międzybrodzki R, Górski A., The influence of external factors on bacteriophages--review. FoliaMicrobiol (Praha), 2011 May; 56(3):191-200). Termostabilność infekcyjną vB_Kp-4M, vB_Kp-12M i vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L określono w zakresie temperatur 37°C, 50°C, 60°C, 70°C przez 1 h; 80°C przez 30 minut, 90°C przez 15 minut w stosunku do kontroli 21 °C. Stabilność infekcyjna vB_Kp-4M, vB_Kp-12M i vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L utrzymywała się w temperaturach w 37°C, 50°C. W przypadku wszystkich fagów zaobserwowano niewielki spadek aktywności biologicznej wirusów o jeden rząd wielkości w temperaturze 60°C po 1 h inkubacji. W przypadku 70°C spadek o dwa rzędy wielkości w mianie dla vB_Kp-36L, cztery rzędy wielkości w mianie dla faga vB_Kp-12M oraz o pięć rzędów wielkości vB_Kp-4M, vB_Kp-12SM obserwowano po 1 h inkubacji. Natomiast w temperaturze 80°C po 30 minutach obserwowano redukcję aktywności wirusów vB_Kp-4M, vB_Kp-12M i vB_Kp-12SM odpowiednio o 6 rzędów wielkości oraz o 3 rzędy wielkości dla vB_Kp-36L. Po 15 minutach inkubacji w 90°C zanotowano redukcję aktywności badanych fagów odpowiednio o 3 rzędy wielkości dla vB_Kp-36L, 5 rzędów wielkości dla vB_Kp-4M oraz o 8 rzędów wielkości dla vB_Kp-12M i vB_Kp-12SM. Przeprowadzona analiza wykazała zwiększoną tolerancję na wyższą temperaturę białek kapsydowych vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L. Dodatkowo w zakresie pH 3-11 nie zanotowano wpływu pH na aktywność biologiczną fagów po 1 h inkubacji, co wskazuje, że wirusy vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L cechuje odporność na działanie czynników fizykochemicznych tj. pH i temperaturę.
Zdolność infekcyjna vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L w niskim zakresie PH < 6 to cecha biologiczna umożliwiająca szersze ich zastosowanie technologiczne w przeciwieństwie do opisanego już w literaturze naukowej faga ZCKP1, którego aktywność biologiczna spadała wraz z zakwaszeniem środowiska. (Taha OA, Connerton PL, Connerton IF, El-Shibiny A. Bacteriophage ZCKP1: A Potential Treatment for Klebsiella pneumoniae Isolated From Diabetic Foot Patients. Front Microbiol. 2018 Sep 11;9:2127. doi: 10,3389/fmicb,2018,02127. PMID: 30254618; PMCID: PMC6141743.)
Istnieją dane literaturowe wskazujące, że fagi należące do rodziny Siphoviridae ze wszystkich rodzin Caudovirales są zazwyczaj najbardziej odporne na niekorzystne warunki środowiskowe (mogą przeżyć duże wahania temperatur, są stabilne w szerokim zakresie pH 3-11 przez 24 godziny) (Lasobras J, Muniesa M, Lucena F, Jofre J. Relationship between the morphology of bacteriophages and their persistence in the environment. Water Sci Tech. 1997;35:129-132.; Jepson CD, March JB. Bacteriophage lambda is highly stable DNA vaccine delivery vehicle. Vaccine. 2004;22:3413-1419. doi: 10,1016/j.vaccine,2003,11,065.). Natomiast fagi z rodziny Podoviridae wykazują stabilność w szerokim zakresie temperatur, a także w pH bardziej alkalicznym (w zakresie 5-9,2) (Prigent M, Leroy M, Confalonieri F, Dutertre M, DuBow MS., A diversity of bacteriophage forms and genome scan be isolated from the surface sands of the Sahara Desert., Extremophiles. 2005 Aug; 9(4):289-96., Tsutsaeva AA, Visekantsev IP, Mikulinskiy YE, Butenko AE. Effect of low temperatures of the survival and intracellular multiplication of Escherichia coli bacteriophages (in Russian) Mikrobiologiia. 1981;50:292-244., Jończyk E, Kłak M, Międzybrodzki R, Górski A. The influence of external factors on bacteriophages--review. Folia Microbiol (Praha). 2011;56(3):191-200. doi:10,1007/s12223-011-0039-8.).
Dodatkowo badane vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L wykazywały odporność przed proteolityczną aktywnością pepsyny w niskim pH w symulowanym środowisku żołądka, a także przed działaniem trzech głównych enzymów trawiennych: lipazy, amylazy i proteazy wchodzących
PL 245810 Β1 w skład pankreatyny w symulowanych warunkach jelitowych podczas 1 h inkubacji, co może mieć praktyczne zastosowanie przy immobilizacji wirusów w postaci kapsułek, a także co jest istotne przy wykorzystaniu fagów z innymi preparatami, które mogą mieć niskie lub wysokie pH.
Wpływ temperatury na przeżywalność fagów jest niezwykle istotny, jeśli chodzi o zapewnienie prawidłowej aktywności fagów w trakcie ich przechowywania. Bakteriofagi vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L charakteryzowały się zwiększoną odpornością na niskie temperatury tj. -21 °C i -86°C przez 1,7, 14 i 30 dni ich przechowywania. Dodatkowo analiza wpływu powszechnie stosowanych w biologii krioprotektorów (glicerol, DMSO) na aktywność biologiczną badanych izolatów fagowych nie wykazała wzrostu inaktywacji wirusów podczas ich przechowywania do 30 dni. Brak istotnych różnic w mianach vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L pomiędzy badanymi punktami czasowymi, pozwala przypuszczać, iż wirusy te pozostają stabilne przez dłuższy okres czasu, a to z kolei sprzyja możliwości ich wykorzystania w przemyśle, ze względu na łatwość przechowywania i transportu. Przykład 1
Przynależność taksonomiczna i charakterystyka morfologiczna wirionów vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L
Przynależność taksonomiczną fagów otrzymanych z próbek ścieków komunalnych oraz ich charakterystykę morfologiczną przeprowadzono z zastosowaniem transmisyjnego mikroskopu elektronowego. W badaniach wykorzystano technikę kontrastowania negatywowego wg. następującej metodyki. Lizat fagowy zagęszczano i oczyszczano metodą ultrawirowania (25 000 x g) z użyciem 0,1 M roztworu octanu amonu. Otrzymany roztwór nakrapiano na siatki miedziane 400 mesh z pokryciem formwar/węgiel (AgarScientific) i kontrastowano negatywowo za pomocą 2% octanu uranylu. Po wyschnięciu preparaty z poszczególnymi izolatami fagowymi analizowano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego Jeol-F200 z cyfrową rejestracją obrazu.
Wiriony vB_Kp-4M, vB_Kp-12M zaklasyfikowano do rzędu bakteriofagów ogoniastych Caudovirales, reprezentujących rodzinę Siphoviridae, natomiast vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L do rodziny Podoviridae. Do obydwu rodzin przynależą bakteriofagi lityczne, co jest istotne w aspekcie ich technologicznego zastosowania. W szczegółowej klasyfikacji uwzględniono analizę morfometryczną, gdzie wyznaczono średnicę głowy (hd; szerokość prostopadła do ogona), długość głowy (wzdłuż osi ogona; hl), średnicę ogona (td) i długość ogona (tl) zgodnie z wytycznymi zawartymi w publikacji - Hans-W. Ackermann - Tailed Bacteriophages: The Order Caudovirales.
Jedną z pożądanych cech wyizolowanych ze środowiska bakteriofagów jest ich przynależność taksonomiczna, klasyfikująca dane izolaty do bakteriofagów ogoniastych rząd Caudovirales. Ackermann i in. (2004) wykazali, że fagi ogoniaste są najbardziej stabilne w niekorzystnych warunkach środowiskowych, a także nie istnieją istotne różnice we wrażliwości na czynniki fizykochemiczne między fagami z kurczliwymi, niekurczliwymi lub z krótkimi ogonkami. Dodatkowo wskazuje się, że fagi z dużym kapsydem (o średnicy 100 nm) są stabilniejsze od fagów z mniejszym kapsydem (o średnicy 60 nm) (Ackermann HW, Tremblay D, Moineau S. Long-term bacteriophage preservation. WFCC Newslett. 2004;38:35-40).
Tabela 1
| Nazwa faga | Przynależność taksonomiczna | Morfotyp | Wymiary w nm | ||||
| szerokość kapsydu | długość kapsydu | przekrój kapsydu | dhjgość ogona | szerokość ogona | |||
| vB_Kp-4M | Caudovira/es, Siphoviride | B1 | 61,1322 ± 4,180234 | 64,6326 ± 4,764205 | 60,6289± 3,751671 | 160,1966 ± 12,39742 | 9,68± 0,634119 |
| vB_Kp-12M | Caudovirales, Siphowride | B1 | 59,0365+ 2,831362 | 63,7462 ± 3,597532 | 59,8926± 3,56683 | 180,4083 ± 9,724063 | 10,867 + 0,86077 |
PL 245810 Β1
| vB_Kp-12SM | Caudovirales, Podaviridae | - | 62,3601 ± 1,84309 | 62,1283 ± 1,4957 | 59,6899 ± 1,104201 | 22,3402 ± 3,831723 | 7,6276 ± 0,717006 |
| vB_Kp-36L | Caudovirales, Podwiridae | - | 53,3627 ± 1,996388 | 54,354 ± 3,055976 | 52,7882 ± 2,162572 | 16,0942 ± 1,78913 | 7,9457 ± 1,058769 |
Przykład 2
Badane bakteriofagi wykazywały różnorodną morfologie łysinki:
Łysinki bakteriofaga vB_Kp-4M charakteryzowały się klarownymi strefami przejaśnień o φ w zakresie od 0,5 do 1,5 mm. Łysinki bakteriofaga vB_Kp-12M charakteryzowały się środkową klarowną strefą o φ w zakresie od 2 do 3 mm oraz zewnętrzną mętną strefą „halo”, której promień zwiększał się wraz z czasem inkubacji o φ w zakresie od 7,5 do 8 mm. Podobnie łysinki bakteriofaga vB_Kp-12SM charakteryzowały się środkową klarowną strefą o φ w zakresie od 1 do 2 mm oraz otaczających stref „halo” o φ w zakresie od 6 do 8 mm. Łysinki bakteriofaga vB_Kp-36L charakteryzowały się środkową klarowną strefą o φ w zakresie 1-2 mm oraz otaczających je stref przejaśnień o φ w zakresie od 1,5 do 3 mm. Badane bakteriofagi formują na murawie bakteryjnej łysinki charakterystyczne dla fagów litycznych, a powstające strefy „halo” to efekt działania depolimeraz polisacharydowych.
Aby określić rozmiar łysinek, przygotowano seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia mieszaniny fagów w pożywce LB lub buforze SM (50 mM Tris-HCI, pH 7,5; 0,1 M NaCI, 8 mM MgSO4 · 7H2O i 0,01% (w/v) żelatyny). W kolejnym etapie 0,2 ml hodowli szczepu gospodarza zmieszano z 10 pl odpowiedniego rozcieńczenia mieszaniny bakteriofagów i dodano do 5 ml górnego agaru LB 0,7%. Mieszaninę wylano na płytkę z agarem podstawowym. Szalki Petriego inkubowano w temperaturze 37°C i po 24 godzinach oceniano morfologię i średnicę „łysinek” poszczególnych bakteriofagów.
K. pneumoniae jest również znana ze swojej zdolności do tworzenia biofilmu, które są zbiorowiskami bakterii osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej. Ta macierz składa się z białek, egzopolisacharydów, DNA i lipopeptydów. Dodatkowo wskazuje się, że K. pneumoniae wykorzystuje czynniki wirulencji (otoczki polisacharydowe, LPS lipopolisacharyd, fimbrie typu 1, 3; białka błony zewnętrznej, siderofory) nie tylko do przeżycia i unikania odpowiedzi ze strony układu odpornościowego podczas infekcji, ale również do formowania struktury biofilmu. K. pneumoniae może wytwarzać grubą warstwę biofilmu zewnątrzkomórkowego, który wspiera przyczepność bakterii do żywych lub nieożywionych powierzchni, chroniąc tym samym penetrację antybiotyków i zmniejszając ich działanie. Zastosowanie bakteriofagów vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L w badaniach in vitro jako czynników biokontroli powodowało eradykację liczby komórek biofilmu wśród szczepów gospodarzy Klebsiella pneumoniae, przy czym najbardziej skuteczny był nierozcieńczony 100% lizat fagowy. Największy spadek gęstości optycznej biofilmów odnotowano po 48 godzinach inkubacji. W tym punkcie czasowym liczba komórek bakteryjnych w biofilmie dla lizatu fagowego vB_Kp-4M zastosowanego w najwyższej koncentracji została zmniejszona o blisko 73%.W przypadku vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L spadek gęstości komórek biofilmu obserwowano w zakresie 65,03%; 41%; 50%. Traktowanie biofilmów lizatem fagowym vB_Kp-4M przez 24 godziny wywołało również znaczną jego degradację. Dla tego punktu czasowego przy zastosowaniu stężenia 100%, 75%, 50% i 25% lizatu fagowego redukcja biomasy biofilmu była w zakresie od 83,59 do 63,56%. W przypadku vB_Kp-12M obserwowano redukcję w zakresach od 37,03 do 67,07%, vB_Kp-12SM od 51 do 69%, vB_Kp-36L od 41 do 59%. W przypadku 2 h traktowania wykształconych biofilmów lizatami fagowymi przy stężeniach 100%, 75%, 50% i 25%, redukcja biomasy biofilmu dochodziła do 20% dla vB_Kp-4M, od 19 do 29% dla vB_Kp-12M, od 11,95 do 23,89% dla vB_Kp-12SM oraz od 40 do 44% vB_Kp-36L.
Aktywność metaboliczną biofilmów K. pneumoniae zbadano przy użyciu testu z resazuryną, który potwierdził śmiertelność komórek bakteryjnych o 31,22% już po 2 h od zastosowania 100% (nierozcieńczonego) lizatu fagowego vB_Kp-4M. Również pozostałe rozcieńczenia lizatu vB_Kp-4M do stężeń 75%, 50%, 25%, 12,5%, 0,5% wykazywały efekt lityczny odpowiednio w zakresie 22,74%, 23,87%, 25,87%, 27,71%, 26,82%. Efekt bakteriobójczy utrzymywał się po 12 h inkubacji odpowiednio dla stężeń 100% o 28,19%; dla 75% o 30,15%, 50% o 23,80%; 25% o 17,08%, 12,5% o 19,57% oraz dla stężenia 0,5% o 7,27%. Najsilniejszy spadek aktywności metabolicznej komórek biofilmu obserwowano po 24 h odpowiednio o 40,26% dla 100% lizatu, o 41,70% dla 75% rozcieńczenia lizatu, o 41,18% dla 50% lizatu; o 36,74% dla 25% lizatu; 29,63% dla 12,5% lizatu oraz o 20,71% dla lizatu o stężeniu 0,5%.
Spadek aktywności metabolicznej komórek biofilmu K. pneumoniae infekowanego przy użyciu izolatu fagowego vB_Kp-12M po 2 h obserwowano odpowiednio o 28,21%, 30,70%, 33,58%, 30,40%, 30,60%, 32,16% dla stężeń 100%, 75%, 50%, 25%, 12,5%, 0,5% lizatu fagowego. Spadek aktywności metabolicznej komórek biofilmu po 12 h inkubacji z fagiem vB_Kp-12M obserwowano o 31,95%, 32,42%, 31,60%, 28,27%, 21,03%, 17,57% odpowiednio dla stężeń 100%, 75%, 50%, 25%, 12,5%, 0,5%. Spadek aktywności metabolicznej komórek biofilmu K. pneumoniae obserwowano również po 24 h inkubacji odpowiednio o 22,81%, 23,94%, 24,83%, 22,24%, 24,79%, 14,99% odpowiednio dla stężeń zastosowanego lizatu fagowego 100%, 75%, 50%, 25%, 12,5%, 0,5%.
W obecności faga vB_Kp-12SM po 2 h inkubacji aktywność metaboliczna komórek bakteryjnych w biofilmie zmalała odpowiednio o 16,18%, 14,99%, 13,89%, 7,59%, 5,84%, 4,22% przy stężeniach lizatu 100%, 75%, 50%, 25%, 12,5%, 0,5%. Podczas 12 h inkubacji spadek przeżywalności komórek bakteryjnych w uformowanym biofilmie po infekcji bakteriofagiem vB_Kp-12SM zwiększył się odpowiednio o 28,87%, 25,62%, 27,18%, 21,85%, 14,69%, 4,75%. Najsilniejszy efekt bakteriobójczy komórek biofilmu obserwowano po 24 h odpowiednio o 47,75%, 48,65%, 42,95%, 45,07%, 48,20%, 38,28% przy stężeniach lizatu 100%, 75%, 50%, 25%, 12,5%, 0,5%.
W przypadku bakteriofaga vB_Kp-36L największy spadek aktywności metabolicznej komórek biofilmu obserwowano po 2 h i 12 h inkubacji odpowiednio o 33,88%, 33,36%, 32,15%, 32,05%, 29,33%, 0% / po 2 h oraz o 21,20%, 25,93%, 17,24%, 21,17%, 22,61%, 3,9% / po 12 h przy stężeniach roboczych lizatu 100%, 75%, 50%, 25%, 12,5%, 0,5%. Po 24 h inkubacji biofilmu z fagiem nie obserwowano zwiększenia aktywności litycznej bakteriofaga, w wyniku czego malała śmiertelność komórek odpowiednio o 7,49%, 5,12%, 8,96%, 14,64%, 13,19%, 0% dla badanych stężeń lizatu 100%, 75%, 50%, 25%, 12,5%, 0,5%.
Wykazana skuteczność przeciwbiofilmowa badanych fagów vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L (spadek biomasy biofilmów, spadek aktywności metabolicznej komórek biofilmów) może wskazywać na ich potencjalne zastosowanie w walce z biofilmami bakteryjnymi stanowiącymi problem w usuwaniu zakażeń bakteryjnych w medycynie przy użyciu dostępnych antybiotyków.
Degradację uformowanego biofilmu bakteryjnego Klebsiella pneumoniae przeprowadzono w 96-studzienkowej płytce przez 2, 12, 24, 48 h w temperaturze 37°C. W celu zainicjowania wzrostu biofilmu hodowlę bakteryjną Klebsiella pneumoniae (250 μθ dodano do 96-studzienkowej płytki hodowlanej i inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny bez wytrząsania. Redukcję otrzymanego biofilmu po odpłukaniu komórek planktonowych przeprowadzono metodą fioletu krystalicznego (CV) po 2, 12, 24, 48 h przy użyciu zawiesiny fagowej o różnych stężeniach tj. stężony 100% roztwór i cztery rozcieńczenia lizatu wyjściowego w buforze SM- 75%, 50%, 25%, 12,5%. Ilość wyekstrahowanego barwnika CV (odpowiadającego biomasie biofilmu) zmierzono za pomocą pomiaru gęstości optycznej przy 595 nm (OD595) w czytniku płytek Infinite 200 PRO TECAN. Jako kontrolę negatywną zastosowano podłoże wzrostowe (bulion LB) z zawiesiną bakterii. Względną masę biofilmu określono poprzez porównanie absorbancji z kontrolą negatywną -100%.
Badanie aktywności metabolicznej komórek biofilmu przeprowadzono z wykorzystaniem testu żywotności komórek Alamar Blue (resazuryna). W tym celu przygotowano 24 h hodowle bakteryjne Klebsiella pneumoniae w 96-studzienkowej płytce hodowlanej w celu zainicjowania wzrostu biofilmu. Otrzymane biofilmy przemyto PBS, a następnie potraktowano zawiesiną fagową o różnych stężeniach tj. stężony 100% roztwór i cztery rozcieńczenia lizatu wyjściowego w buforze SM- 75%, 50%, 25%, 12,5% przez 2, 12, 24 h. Po odpowiednim czasie inkubacji biofimów z bakteriofagami do każdej studzienki 96-dołkowej płytki dodano 10 μl roztworu resazuryny (0,8 μg/ml w PBS) i inkubowano przez 2 godziny (aż kontrola negatywna zmieniła kolor z niebieskiego na czerwony/różowy). Aby ocenić wpływ analizowanych fagów na aktywność metaboliczną komórek bakteryjnych biofilmów wykonano pomiar absorbancji przy 570 nm.
Sekwencjonowanie genomowe bakteriofagów vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L
Sekwencjonowanie genomowego DNA vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L pozwoliło na uzyskanie 4 kontigów odpowiednio o wielkości 49 691 pz, 50595pz, 73 276pz, 40886pz, które wykorzystano do przeszukania bazy danych NCBI narzędziem BLAST (dla wirusów) w celu potwierdzenia znalezienia najbliższego podobnego faga.
PL 245810 Β1 φ
« Η
| « .-X | 2285 | 1665 | £001. | 2490 | ||
| Pokryć | Vł Ki s | |||||
| 1 | ||||||
| fe ¢) “§ 13 0 CL i i O. | cyklu życia | ś 0,973 l | ί 0,999 [ | i 0,978 | | 0,999 | |
| u | życia \ | lityczny | lityczny i | lityczny | lityczny | |
| •r- | ||||||
| fe E »3 z | zs Cl <LF «1 o | CM 00 s, | K ^£3 | .048700. | cx> wO o | |
| u z | 0 | U Z | u | |||
| g | ||||||
| 'Q V> O t?z> □ δ | ’5Ż u c fi <2 | 50526 | 49674 | 73679 | LO ί» o | |
| £ | ||||||
| mości j | CD | LH | 'l- | ŁJ> | ||
| 54 | £ | M& Oh | ΜΪ O | 3? | ’Τ o | |
| 2 | ||||||
| Stopień | pokrycia [%J | §> | co | 8 | ||
| Genom referencyjny | (Blast) | Fag Klebsielła ΚΟΧ1 | Fag Klebsielła Kp$4 | Fag Kłebsiella KP8 | Wirus Kiebsietla | KP32 izolat 192 |
| Długość | | kontigu | O> %£> O | S6S0S | 73276 | 40886 | |
| Oznaczenie i | faga | ς 't o. aż ca > | Z CM £X CO > | Z <Λ CM OD > | ζο c*> CL CQ > |
Przeprowadzona analiza otrzymanych kontigów vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L pozwoliła zaklasyfikować je jako nowe na podstawie zasady: < 95% podobieństwa i < 95% pokrycia dla najbardziej podobnego genomu. Dodatkowo w genomach badanych bakteriofagów wykluczono obecności genów toksyn bakteryjnych, integraz, genów konwersji lizogennej, mogących zmienić fenotyp bakterii na patogenny, co potwierdza lityczny cykl rozwojowy badanych bakteriofagów, a tym samym spełnia główne wymagania stawiane wirusom terapeutycznym w fagoterapii.
Sekwencje genomowe fagów vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L zdeponowano na czas zgłoszenia patentowego w bazie GenBank pod numerami akcesyjnymi:
Dla vB_Kp-4M: OP442078
Dla vB_Kp-12M: OP442079
Dla vB_Kp-12SM: OP442080
Dla vB_Kp-36L: OP459304
Bakteriofagi vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L będące przedmiotem wynalazku zostały zdeponowane zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (53-114 Wrocław, ul. R. Weigla 12) w dniu 03.08.2022 r. i otrzymały numery akcesyjne depozytu F/00193 dla vB_Kp-4M, F/00195 dla vB_Kp-12M, F/00194 dla vB_Kp-12SM oraz F/00192 dla vB_Kp-36L.
Immobilizacja fagów vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L przy użyciu alginianu/CaCO3 - modyfikacje zapewniające utrzymanie stabilności infekcyjnej (pokrycie otrzymanych kapsułek alginianowych otoczką chitozanową, mokre mikrosfery, a także poprzez ich wysuszenie w obecności 10% trehalozy)
Bakteriofagi vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L będące przedmiotem wynalazku utrzymywały lityczny charakter pod kątem specyficzności gatunkowej atakowanych bakterii, wpływu czynników fizykochemicznych, a także stabilności w symulowanym soku żołądkowym, jelitowym po zastosowaniu procedury enkapsulacji z wykorzystaniem alginianu/CaCOs.
Otrzymane kapsułki z immobilizowanymi fagami poddano modyfikacjom zapewniającym utrzymanie stabilności infekcyjnej, poprzez pokrycie otrzymanych kapsułek alginianowych otoczką chitozanową tzw. mokre mikrosfery, a także poprzez ich wysuszenie w obecności 10% trehalozy. Wysuszone mikrosfery w obecności 10% trehalozy to przykład taniej technologii otrzymywania blistrowanego preparatu fagowego o dużej skuteczności ochronnej badanych fagów. Wskazuje się, że trehaloza minimalizuje wpływ stresu termicznego na wiriony fagowe, a także działa stabilizacyjnie na białka kapsydowe. Przedstawiony sposób suszenia enkapsułkowanych fagów to przykład taniego, a tym samym skutecznego ich wykorzystania technologicznego w porównaniu do innych ekonomicznie nieopłacalnych metod tj. liofilizacji czy suszenia rozpyłowego [Gonzalez-Menendez, E., Fernandez, L, Gutierrez, D., Rodriguez, A., Martinez, B. i Garcia, P. (2018). Comparative analysis of different preservation techniques for the storage of Staphylococcus phages aimed for the industrial development of phage-based antimicrobial products. PLoS ONE, 13(10), e0205728. https://doi.org/10,1371/journal.pone,0205728.]
Analiza stabilności termicznej immobilizowanych w alginianie/CaCO3 vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, potwierdziła ich zdolność do przeprowadzania cyklu litycznego w stosunku do Klebsiella pneumoniae w zakresie temperatur 21 °C - 90°C; natomiast vB_Kp-36L w zakresie 21 °C - 60°C, wskazując tym samym na przydatność kapsułkowanych fagów pod względem zastosowań terapeutycznych i technologicznych. Wykazano, że proces immobilizacji fagów, a następnie powlekania otrzymanych kapsułek alginianowych naturalnym polimerem-chitozanem nie wywierały szkodliwego wpływu na biologię badanych bakteriofagów. Otrzymany kapsułkowany biopreparat zawierający vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L cechował się stabilnością infekcji w pH 3, 7, 11, gdzie miana wirusów po godzinnej inkubacji utrzymywały się na stałym poziomie. Dodatkowo przeprowadzone analizy kapsułkowanych wirusów wykazały utrzymanie mian vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L na stałym poziomie w stosunku do kontroli zarówno w symulowanym płynie żołądkowym, jak i jelitowym, co potwierdza stabilność kapsułkowanych bakteriofagów w tych warunkach.
Badanie właściwości bakteriobójczych vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-12SM, vB_Kp-36L w stosunku do bakterii gospodarzy potwierdziły efektywność przeciwdrobnoustrojową kapsułek w zakresie od 49,53 do 53,32% dla vB_Kp-4M; od 69,55 do 75,56% dla vB_Kp-12M; od 17,88 do 75,71% dla vB_Kp-12SM; od 17 do 19,14% dla vB_Kp-36L po 8 h prowadzenia infekcji. Dodatkowo obserwowano właściwości stabilizacyjne w uwalnianiu fagów przy wykorzystaniu kapsułek opłaszczonych chitozanem, a także kapsułek otoczonych chitozanem i wysuszonych w obecności 10% trehalozy w przypadku bakteriofaga vB_Kp-12SM odpowiednio o 57,83% i 51,34% w stosunku do nieopłaszczonych kapsułek alginianowych. W przypadku pozostałych izolatów vB_Kp-4M, vB_Kp-12M, vB_Kp-36L właściwości stabilizacyjne chitozanu, a także modyfikacji chitozanu i 10% trehalozy były mniejsze i wynosiły od 1,03% do 6% w stosunku do nieopłaszczonych kapsułek alginianowych.
Claims (6)
1. Nowy szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae wybrany ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00192; F/00193; F/00194; F/00195, z których każdy ma potwierdzoną naturę lityczną i charakteryzuje się wysoką wirulencją.
2. Szczep bakteriofaga wybrany ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00192; F/00193; F/00194; F/00195, do zastosowania w leczeniu infekcji wywołanych przez bakterie z gatunku Klebsiella pneumoniae.
3. Szczep bakteriofaga według zastrz. 2, do zastosowania w leczeniu infekcji wywołanych przez bakterie z gatunku Klebsiella pneumoniae, przy czym stosuje się mieszankę fagów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00192; F/00193; F/00194; F/00195, wykazujących się brakiem interferencji.
4. Szczep bakteriofaga według zastrz. 2 albo 3, do zastosowania w leczeniu infekcji szpitalnych i pozaszpitalnych, takich jak ropień wątroby, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, martwicze zapalenie powięzi, zapalenie wnętrza gałki ocznej, ciężkie zapalenie płuc.
5. Szczep bakteriofaga według któregokolwiek z zastrz. 2-4, znamienny tym, że bakteriofagi zdefiniowane w zastrz. 1 są immobilizowane w kapsułkach alginianowych.
6. Szczep bakteriofaga według zastrz. 5, znamienny tym, że kapsułki alginianowe są opłaszczone chitozanem.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442387A PL245810B1 (pl) | 2022-09-28 | 2022-09-28 | Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae do zastosowania w zwalczaniu infekcji bakteryjnych |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442387A PL245810B1 (pl) | 2022-09-28 | 2022-09-28 | Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae do zastosowania w zwalczaniu infekcji bakteryjnych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL442387A1 PL442387A1 (pl) | 2024-04-02 |
| PL245810B1 true PL245810B1 (pl) | 2024-10-14 |
Family
ID=90526621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL442387A PL245810B1 (pl) | 2022-09-28 | 2022-09-28 | Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae do zastosowania w zwalczaniu infekcji bakteryjnych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL245810B1 (pl) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021163663A2 (en) * | 2020-02-14 | 2021-08-19 | William Colton | Bacteriophage cocktail-containing hydrogel compositions and methods of production and use thereof |
| CN113583973A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-11-02 | 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 | 一株高裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体rdp-kp-20007及其应用 |
-
2022
- 2022-09-28 PL PL442387A patent/PL245810B1/pl unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021163663A2 (en) * | 2020-02-14 | 2021-08-19 | William Colton | Bacteriophage cocktail-containing hydrogel compositions and methods of production and use thereof |
| CN113583973A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-11-02 | 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 | 一株高裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体rdp-kp-20007及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BAI J, ZHANG F, LIANG S, CHEN Q, WANG W, WANG Y, MART´IN-RODR´IGUEZ AJ, SJÖLING Å, HU R AND ZHOU Y: "Front. Cell. Infect. Microbiol. 12:897531.", ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF VB_KPNM_ 17-11, A NOVEL PHAGE EFFICIENT AGAINST CARBAPENEM-RESISTANT KLEBSIELLA PNEUMONIAE, DOI: 10.3389/fcimb.2022.897531 * |
| BALCÃO, V.M.; MORELI, F.C.; SILVA, E.C.; BELLINE, B.G.; MARTINS, L.F.; ROSSI, F.P.N.; PEREIRA, C.; VILA, M.M.D.C.; DA SILVA, A.M.: "Pharmaceutics 06.07.2022, 14, 1421.", ISOLATION AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF A NOVEL LYTIC BACTERIOPHAGE THAT INACTIVATES MDR KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAINS., DOI: https://doi.org/ 10.3390/pharmaceutics14071421 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL442387A1 (pl) | 2024-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Protective and therapeutic application of the depolymerase derived from a novel KN1 genotype of Klebsiella pneumoniae bacteriophage in mice | |
| US8282920B2 (en) | Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa | |
| JP6053727B2 (ja) | 抗細菌組成物 | |
| Mohammadi et al. | Isolation, characterization, therapeutic potency, and genomic analysis of a novel bacteriophage vB_KshKPC-M against carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae strains (CRKP) isolated from Ventilator-associated pneumoniae (VAP) infection of COVID-19 patients | |
| Li et al. | Characterization and whole-genome sequencing of broad-host-range Salmonella-specific bacteriophages for bio-control | |
| CN118147088B (zh) | 一种铜绿假单胞菌噬菌体组合物、噬菌体制剂及其应用 | |
| Mohamed et al. | Isolation and characterization of bacteriophages active against Pseudomonas aeruginosa strains isolated from diabetic foot infections | |
| Tsai et al. | Therapeutic effect and anti-biofilm ability assessment of a novel phage, phiPA1-3, against carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa | |
| Goodarzi et al. | Biological characteristics and anti-biofilm activity of a lytic phage against vancomycin-resistant Enterococcus faecium | |
| RU2412243C1 (ru) | Штамм бактериофага salmonella typhimurium s-394, обладающий литической активностью | |
| Zhao et al. | A newly isolated bacteriophage vB8388 and its synergistic effect with aminoglycosides against multi-drug resistant Klebsiella oxytoca strain FK-8388 | |
| Karthika et al. | Chitosan-encapsulated bacteriophage cocktail as promising oral delivery system to surpass gastrointestinal infection caused by Klebsiella aerogenes | |
| Shah et al. | Isolation and characterization of lytic bacteriophage from waste water to control clinical multidrug resistant Klebsiella pneumoniae | |
| Majdani et al. | Isolation and characterization of lytic bacteriophages against Pseudomonas aeruginosa isolates from human infections in the north-west of Iran | |
| Chai et al. | Isolation, characterization, and application of the novel polyvalent bacteriophage vB_EcoM_XAM237 against pathogenic Escherichia coli | |
| Nasr-Eldin et al. | Characterization and development of a phage cocktail for Escherichia coli causing gastrointestinal diseases | |
| Erol et al. | Characterization of two bacteriophages specific to Acinetobacter baumannii and their effects on catheters biofilm | |
| El-Wafai et al. | Controlling of multidrug resistant Aeromonas hydrophila infected Nile tilapia (Oreochromis niloticus) using Ah01 and Ah02 virulent bacteriophages isolates | |
| PL245810B1 (pl) | Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii z gatunku Klebsiella pneumoniae do zastosowania w zwalczaniu infekcji bakteryjnych | |
| CN114196637B (zh) | 一种沙门氏菌噬菌体JNwz02及其用途 | |
| KR102851110B1 (ko) | 신규한 스타필로코커스 우레일리티쿠스 박테리오파지 vB_SurP-PSU3 및 이의 용도 | |
| KR101093089B1 (ko) | 항-슈도모나스 애루지노사 항생제에 대한 스크리닝 방법 | |
| WO2025026474A1 (en) | A mixture for preparation of lyophilized tablets with an antimicrobial effect against the bacteria staphylococcus aureus and pseudomonas aeruginosa containing bacteriophages and lytic enzymes with optimum stability and efficiency of the active ingredients | |
| PL240027B1 (pl) | Kompozycja bakteriofagów specyficzna wobec bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, zwłaszcza Escherichia coli, zastosowanie kompozycji bakteriofagów w zwalczaniu bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, zwłaszcza Escherichia coli oraz zastosowanie kompozycji bakteriofagów jako czynnika biokontroli | |
| Tunç et al. | Bacteriophage Isolation, Characterization and Antibiofilm Effect Against Multidrug Resistant Gram Negative Bacteria Isolated from Intensive Care Units; Therapeutic Approach |