PL244541B1

PL244541B1 - Muteiny ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1), ich dimery i zastosowania

Info

Publication number: PL244541B1
Application number: PL438001A
Authority: PL
Inventors: Jacek Józef OTLEWSKI; Jacek Józef Otlewski; Małgorzata Urszula ZAKRZEWSKA; Małgorzata Urszula Zakrzewska; Daniel Rafał KROWARSCH; Daniel Rafał Krowarsch; Aleksandra Czyrek; Michał Mieczysław JANISZEWSKI; Michał Mieczysław Janiszewski; Jerzy Szczepan Pieczykolan; Ewa DRZAZGA; Ewa Drzazga; Katarzyna BAZYDŁO-GUZENDA; Katarzyna Bazydło-Guzenda; Paweł BUDA; Paweł Buda; Maciej Wieczorek
Original assignee: Celon Pharma Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia; Univ Wroclawski
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2024-02-05
Also published as: WO2022250555A1; MX2023013964A; AU2022282069A1; WO2022250556A4; WO2022250556A1; AU2022279881A1; WO2022250555A4; PL438001A1; BR112023024658A2; KR20240013800A; BR112023024645A2; CA3219965A1; EP4347631A1; EP4347630A1; CN117730092A; JP2024520065A; KR20240013801A; MX2023013963A; JP2024520066A; CN117425669A

Abstract

Przedmiotem niniejszego wynalazku są muteiny ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności, dimery mutein ludzkiego FGF-1, a także takie muteiny ludzkiego FGF-1, i dimery takich mutein do zastosowania w obniżaniu poziomu glukozy we krwi, zwłaszcza do zastosowania w leczeniu cukrzycy.

Description

Przedmiotem wynalazku są muteiny ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (z ang. fibroblast growth factor 1, FGF-1) o obniżonej mitogenności, dimery takich mutein FGF-1 o obniżonej mitogenności (zarówno homodimery jak i heterodimery takich mutein) posiadające zdolność obniżania poziomu glukozy po aplikacji oraz ich zastosowania w medycynie, farmacji, w terapii, zwłaszcza w leczeniu cukrzycy, w tym cukrzycy typu 2 (z ang. type 2 diabetes, T2D).

Stan techniki

Zaburzenia homeostazy metabolicznej manifestowane są m. in. przez otyłość oraz oporność komórek, w szczególności komórek obwodowych na działanie insuliny (insulinooporność). Skutkuje to osłabieniem wchłaniania glukozy z krwi, a w następstwie rozwinięciem cukrzycy typu 2. Cukrzyca zaliczana jest obecnie do najpoważniejszych schorzeń cywilizacyjnych na świecie. Liczba chorych na cukrzycę wciąż wzrasta, a towarzyszące jej powikłania stanowią niebezpieczeństwo dla zdrowia i życia pacjentów. Głównym objawem cukrzycy jest wysoki poziom glukozy we krwi (hiperglikemia). Stan taki utrzymujący się przez długi czas jest przyczyną uszkodzeń naczyń krwionośnych i tętnic. Doprowadza to do zaburzeń ukrwienia i dysfunkcji wielu narządów konsekwencją czego są przewlekłe powikłania: retinopatia cukrzycowa, nefropatia cukrzycowa i neuropatia cukrzycowa. Cukrzyca przyśpiesza także powstawanie zmian miażdżycowych w naczyniach krwionośnych, doprowadzając do rozwoju choroby niedokrwiennej serca i kończyn dolnych, a także udaru mózgu. Mimo postępów w medycynie, stosowane obecnie terapie nadal posiadają szereg niepożądanych efektów ubocznych, takich jak ryzyko wystąpienia zbyt niskiego poziomu glukozy we krwi (hipoglikemia), stłuszczenie wątroby czy spadek masy kości. Z uwagi na obserwowany ciągły przyrost liczby pacjentów z T2D, poszukiwane są nowe terapie skierowane na zniesienie insulinooporności. Jednymi z bardziej efektywnych leków stosowanych obecnie są tiazolidynodiony (TZD), które są agonistami jądrowych receptorów PPARy. Receptory te regulują adipogenezę, metabolizm lipidów oraz stymulują insulinowe mediatory pośredniczące w wychwycie glukozy przez tkanki obwodowe. Pomimo wysokiej skuteczności, stosowanie TZD niesie ze sobą szereg skutków ubocznych, takich jak np. wzrost masy ciała, utrata masy kości czy niewydolność serca. Dlatego też poszukiwane są inne mediatory receptorów PPAR, które nadal będą charakteryzować się wysokim potencjałem uwrażliwiającym na insulinę, ale nie będą obarczone ryzykiem występowania działań niepożądanych. W leczeniu T2D stosuje się także terapie łączone, czyli podawanie kilku leków jednocześnie, gdyż większość pacjentów nie odpowiada na pojedyncze leki lub szybko staje się na nie niewrażliwymi. Mimo postępów w medycynie i pojawiania się nowych leków nadal nie ma możliwości uzyskania pełnej kontroli choroby oraz jej powikłań. Ważnym aspektem w regulacji homeostazy metabolicznej jest zdolność komórek tkanki tłuszczowej do przebudowy i zmiany metabolizmu podstawowego w odpowiedzi na wahania dostępności składników odżywczych. W 2012 roku Jonker i wsp. zaprezentowali badania, które miały na celu identyfikację genów regulowanych dietą w różnych tkankach związanych z metabolizmem (mięśnie, wątroba, brązowa tkanka tłuszczowa (BAT), biała tkanka tłuszczowa (WAT)). Udowodniono, że FGF-1 jest selektywnie indukowany w trzewnej (gonadalnej) białej tkance tłuszczowej (gWAT) w odpowiedzi na dietę o wysokiej zawartości tłuszczu (Jonker, J. W., Suh, J. M., Atkins, A. R., Ahmadian, M., Li, P., Whyte, J., He, M., Juguilon, H., Yin, Y., Phillips, C. T., Yu, R. T., Olefsky, J. M., Henry, R. R., Downes, M., & Evans, R. M. (2012). A PPARy-FGF1 axis is required for adaptive adipose remodelling and metabolic homeostasis. Nature, 485(7398), 391-394. https://doi.org/10.1038/nature10998). Następne eksperymenty in vivo dowiodły, że delecja genu FGF-1 u myszy, prowadzi do ogólnoustrojowej dysfunkcji metabolicznej i wzrostu oporności na insulinę. Myszy pozbawione genu FGF-1 na diecie wysokotłuszczowej rozwijają agresywny fenotyp cukrzycowy, wynikający z ograniczonego wzrostu tkanki tłuszczowej. Dodatkowo wykazali oni, że indukcja FGF-1 w WAT jest regulowana przez jądrowe receptory PPARγ (Jonker i wsp., 2012).

Rodzina czynników wzrostu fibroblastów FGF u człowieka oraz gryzoni składa się z 22 genów kodujących strukturalnie pokrewne polipeptydy. Geny te zlokalizowane są na różnych chromosomach, co wskazuje, że rodzina FGF powstała na skutek duplikacji i translokacji genowych i chromosomalnych. Białko FGF-1 jest białkiem parakrynnym, wydzielanym przez różne typy komórek (np. fibroblasty, adipocyty) i działającym lokalnie. Ludzki FGF-1 (hFGF1) składa się ze 155 aminokwasów (aa), z których pierwsze 14 aa stanowi propeptyd, usuwany podczas dojrzewania w procesie ekspresji komórkowej białka. W literaturze znane są rekombinowane ludzkie (rh) formy FGF-1 o trzech długościach: pełnej długości (155 aa) oraz dwie N-końcowe formy delecyjne (zawierające aminokwasy 15-155 aa i 21-155 aa). Według obecnej wiedzy, wszystkie trzy formy wykazują podobne wiązanie do receptorów FGFR oraz heparyny i podobną mitogenność. FGF-1 jest znanym i silnym mitogenem dla wielu komórek (stymuluje komórki do podziału i proliferacji). Ligand FGF-1 wiąże się do wszystkich czterech komórkowych receptorów FGF (FGFR1 -4) Kompleks białko-receptor stabilizowany jest przez heparany, polisacharydy naturalnie występujące na powierzchni komórek. Literatura wskazuje, iż natywne (naturalnie występujące, dzikie) białko FGF-1 charakteryzuje się niską stabilnością termiczną (temperatura denaturacji ok. 40°C), a co za tym idzie krótkim czasem półtrwania biologicznego (czas półtrwania w DMEM to ok. 1,1-2 godziny) (Zakrzewska, M., Krowarsch, D., Wiedlocha, A., & Otlewski, J. (2004). Design of fully active FGF-1 variants with increased stability. Protein Engineering Design and Selection, 17(8), 603-611. https://pub- med.ncbi.nlm.nih.gov/16126225/).

Endogennie wytwarzane przez organizm białko FGF-1 wydzielane jest m.in. w tkance tłuszczowej i jest niezbędne do utrzymania homeostazy metabolicznej tej tkanki. Utrata możliwości syntezy FGF-1 skutkuje rozwinięciem T2D. Współczesna literatura wskazuje badania, których celem było określnie wpływu egzogennego podania białka FGF-1 (a dokładnie rekombinowanego ludzkiego FGF-1: rhFGF-1) zwierzętom z wyindukowaną spożywaniem wysokotłuszczowej diety cukrzycą typu 2. Celem tych badań było określenie wpływu podania ligandu FGF-1 na obniżenie poziomu glukozy we krwi zwierząt, a także przywrócenie homeostazy metabolicznej. Udowodniono, że rhFGF-1 powoduje spadek stężenia glukozy we krwi. Co więcej, dowiedziono, że rhFGF- 1 obniża stężenie glukozy, nie wywołując hipoglikemii, co stanowi ogromną przewagę w stosunku do obecnie stosowanych leków w terapii cukrzycy typu 2. Jednakże ze względu na silne właściwości mitogenne oraz krótki czas półtrwania (szybką degradację) r hFGF-1 nie może być podawany pacjentom z cukrzycą typu 2. Silna mitogenność FGF-1 może powodować wiele negatywnych skutków w tym indukować nowotworzenie. Jednak ze względu na korzystny mechanizm działania polegający na uwrażliwieniu komórek na działanie endogennej insuliny, a także brak ryzyka hipoglikemii, rhFGF-1 jest interesującym kandydatem do dalszego rozwoju terapeutycznego w leczeniu T2D.

W 2014 roku Suh i wsp. wykazali efekt przeciwcukrzycowy FGF-1 podanego podskórnie w modelach cukrzycy u zwierząt indukowanych spożywaniem wysokotłuszczowej diety (Suh, J. M., Jonker, J. W., Ahmadian, M., Goetz, R., Lackey, D., Osborn, O., Huang, Z., Liu, W., Yoshihara, E., van Dijk, T. H., Havinga, R., Fan, W., Yin, Y.-Q., Yu, R. T., Liddle, C, Atkins, A. R., Olefsky, J. M., Mohammadi, M., Downes, M., & Evans, R. M. (2014). Endocrinization of FGF1 produces a neomorphic and potent insulin sensitizer. Nature, 513(7518), 436-439. https://doi.org/10.1038/na- ture13540). W swoich eksperymentach Suh i wsp. zastosowali białko rhFGF 1- o pełnej długości (155 aa). Tabela numer 1 zawiera informacje na temat stosowanych przez Suh i wsp. modeli badawczych.

PL 244541 Β1

Modni zwierzęcy	Rodzaj zmiany	Najważniejsze cechy Genotypowe
ob/ob	Mutacja białka leptyny	e Otyłość 0 Hiperglikemia • Inuslinocporność ® Komórki β-trzustki wydzielają insulinę (cukrzyca typu 2)
db/db	Mutacja receptora leptyny	® Otyłość ® Hiperglikemia » Inusłinooporność • Komórki β-trzustki wydzielają insulinę (cukrzyca typu 2)
DIO (Diet Induced Obesity)	Dieta wysokotłuszczowa	® Otyłość • Hiperglikemia ® Komórki β-trzustki wydzielają insulinę (cukrzyca typu 2)
STZ	Podawanie streptozotocyny	® Brak otyłości • Hiperglikemia • Uszkodzone komórki β- trzustki nie wydzielają insuliny (cukrzyca typu 1)
C57BL/6J	Myszy karmione paszą standardową	• Zwierzęta zdrowe

Tabela 1. Wykaz i skrócona charakterystyka zwierzęcych modeli cukrzycowych wykorzystanych w eksperymentach Suh i wsp. (SALK Institute) (King, A. J. F. (2012). The use of animal models in diabetes research. British Journal of Pharmacology, 166(3), 877-894. https://doi.Org/10.1111/j. 14765381.2012.01911.x).

We wszystkich grupach zwierząt reprezentujących fenotyp cukrzycy typu 2 zaobserwowano istotny spadek stężenia glukozy we krwi po podaniu rhFGF-1. Zgodnie z oczekiwaniami w przypadku modelu STZ (myszy, które charakteryzują się brakiem wydzielania insuliny przez komórki beta trzustki) a więc prezentują fenotyp cukrzycy typu 1, rhFGF-1 nie spowodowało obniżenia glukozy we krwi. Wynik ten pozwala twierdzić, że białko to nie mimikuje efektu biologicznego osiąganego przez podanie insuliny. W przypadku zwierząt zdrowych (o fizjologicznej wartości stężenia glukozy we krwi ok. 135 mg/dl), podanie białka pozostało obojętne i nie obniżało stężenia glukozy we krwi. Efekt przeciwcukrzycowy jednorazowego podania rhFGF-1 utrzymywał się minimum przez kolejne 24 godz. Działanie rhFGF-1 okazało się być zależne od dawki, jednak w żadnej zastosowanej dawce nie zaobserwowano efektu

PL 244541 Β1 hipoglikemii. W przeciwieństwie do tiazolidynodionów, rhFGF-1 nie wpłynął na wzrost masy ciała, i nie zmniejszył gęstości kości a przyczynił się do obniżenia poziomu stłuszczenia wątroby (TZD zwiększają) co zaobserwowano podczas terapii rhFGF-21.

Poniżej przedstawiono sekwencję zastosowanego przez Suh i wsp. rekombinowanego ludzkiego rhFGF-1 pełnej długości (155 aa):

MAEGEITTFTALTEKFNLPPGNYKKPKLLYCSNGGHFLRILPDGTVDGTRDRSDQH!QLQLSAESVGEV

YIKSTETGQYLAMDTDGLLYGSQTPNEECLFLERLEENHYNTYiSKKHAEKNWFVGLKKNGSCKRGPR

THYGQKAILFLPLPVSSD

Jak wskazano wyżej natywne białko FGF-1 charakteryzuje się wysokim potencjałem mitogennym, co prowadzi do nadmiernej proliferacji komórek i wiąże się z ryzykiem nowotworzenia. Wiadomo, że FGF-1 wykazuje silne powinowactwo do swoich komórkowych receptorów (FGFR), co skutkuje silnym sygnałem przekazywanym do wewnątrz komórki. Przyłączenie ligandu FGF-1 do receptora uruchamia wewnątrzkomórkową kaskadę sygnałową, indukującą intensywne podziały komórkowe. Suh i wsp. sprawdzili, czy istnieje możliwość odseparowania potencjału mitogennego FGF-1 od jego aktywności przeciwcukrzycowej. W tym celu opracowali mutanta FGF-1, pozbawionego 24 N-końcowych aminokwasów. Zakładali oni, że usunięcie tych aminokwasów obniży siłę wiązania liganda FGF-1 do receptora FGFR, co skutkować będzie obniżeniem mitogenności białka.

Sekwencja opracowanego rekombinowanego, ludzkiego, skróconego o 24 aa FGF-1 (FGF1^ANT; K25-D155) jest następująca:

MKPKLLYCSNGGHFLRILPDGTVDGTRDRSDQHIQLQLSAESVGEVYIKSTETGQYLAMDTDGLLYGS

QTPNEECLFLERLEENHYNTYISKKHAEKNWFVGLKKNGSCKRGPRTHYGOKAILFLPLPVSSD

Zgodnie z przewidywaniami skrócony ligand wykazywał niższe powinowactwo do receptorów FGFR, co skutkowało znaczną redukcją efektu mitogennego jednakże FGF1^ANT zachował potencjał przeciwcukrzycowy obserwowany dla białka dzikiego.

W celu poznania mechanizmu działania FGF-1 i roli podstawowego receptora wiążącego ligand FGF-1 (FGFR), Suh i wsp. opracowali kolejny mutant (FGF1^ANT2), który został pozbawiony pierwszych 28 N-końcowych aminokwasów (tj. aminokwasów: MAEGEITTFT ALTEKFNLPP GNYKKPKL). Taka zmiana zablokowała wiązanie z receptorem FGFR1 i pozbawiła białko właściwości przeciwcukrzycowych.

Sekwencja wyjściowa rhFGF-1 użyta do modyfikacji była następująca:

MAEGEITTFTALTEKFNLPPGNYKKPKLLYCSNGGHFLRILPDGTVDGTRDRSDQHIQLQLSAESVGE

VYIKSTETGQYLAMDTDGLLYGSQTPNEECLFLERLEENHYNTYISKKHAEKNWFVGLKKNGSCKRGP

RTHYGQKAILFLPLPVSSD (Pogrubionym drukiem zaznaczono aminokwasy, które zostały pominięte w syntezie FGF1^ANT2)

Ostateczna sekwencja zastosowanego uzyskana przez Suh i wsp. skróconego o 28 aa ludzkiego FGF-1 (FGF-1^ΔΝΤ2; L29-D155):

MLYCSNGGHFLRILPDGTVDGTRDRSDQHIQLQLSAESVGEVYIKSTETGQYLAMDTDGLLYGSQTPN

EECLFLEREENHYNTYISKKHAEKNWFVGLKKNGSCKRGPRTHYGQKAILFLPLPVSSD

W Tabeli 2 poniżej zebrano najistotniejsze cechy natywnego białka FGF-1, jednakże z powodu naturalnych właściwości tego białka, jego zastosowanie terapeutyczne w tej formie (niezmienionej) jest niemożliwe.

PL 244541 Β1

Korzyści	Komentarz	Wady
Długotrwały efekt	Zgodnie z literaturą, efekt obniżenia stężenia glukozy we krwi po podaniu FGF-1 utrzymuje się minimum przez kolejne 24 godz. Większość obecnie dostępnych na rynku leków należy przyjmować min. 2 razy dziennie. Tak długi efekt FGF-1 umożliwia zredukowanie częstości przyjmowania leku, co przekłada się na zwiększenie komfortu życia pacjenta.	Właściwości mitogenne białka, mogące długoterminowo indukować nowotworzenie.
Korzystny dla organizmu mechanizm działania	Działanie leku skierowane jest na uwrażliwienie komórek na działanie insuliny. Oznacza to, że aplikując lek, endogennie wydzielana insulina przez komórki-β trzustki będzie mogła być efektywniej wykorzystana przez organizm. Jeżeli organizm będzie wykorzystywał własne	Niestabilność białka i krótki czas półtrwania in νίνο

PL 244541 Β1

Korzyśi'	komentarz	Wady _
	zasoby insuliny, nie będzie konieczności stosowania preparatów insulinowych (egzogennej insuliny) lub konieczność włączenia egzogennej insuliny wystąpi później i/lub będą wymagane mniejsze dawki insuliny
Brak ryzyka hipoglikemii	Wszystkie dane doświadczalne i literaturowe jednoznacznie dowodzą, że FGF-1 nie wywołuje hipoglikemii, co zwiększa bezpieczeństwo terapii

Tabela 2. Korzyści wynikające z zastosowania FGF-1 jako potencjalnego terapeutyku i cechy uniemożliwiające zastosowanie jego natywnej formy w terapii cukrzycy typu 2.

Prace Suh i wsp. były jednymi z pierwszych zmierzających do modyfikacji w celu wykorzystania terapeutycznego zmutowanego ligandu FGF-1. Obecnie znanych i opisanych w literaturze jest kilka strategii, których celem jest obniżenie potencjału mitogennego przy zachowaniu pozytywnego działania biologicznego w obszarze regulacji homeostazy metabolizmu. Strategie te obejmują celowe wprowadzanie zmian do sekwencji aminokwasów białka FGF-1 w różnych obszarach:

1. Usunięcie pierwszych 24 aa (od końca N) białka hFGF-1 pełnej długości, a zatem skrócenie łańcucha ze 155 aa do 131 aa. Ta metoda odseparowania potencjału przeciwcukrzycowego od mitogennego została wykorzystana przez Suh i wsp. oraz opisana w pracy (Suh i wsp., 2014).

2. Wytworzenie częściowego agonisty FGFR, charakteryzującego się mutacją w miejscu wiązania do siarczanu heparyny. FGF-1 wymaga siarczanu heparyny do związania z receptorem, dimeryzacji i aktywacji szlaku komórkowego. Tylko stabilny kompleks FGF-1 :FGFR wywołuje odpowiedź mitogenną. Huang i wsp. opracowali mutant białka FGF-1 z trzema miejscowymi mutacjami w miejscu wiązania heparyny ( Huang, Z., Tan, Y., Gu, J., Liu, Y., Song, L, Niu, J., Zhao, L, Srinivasan, L, Lin, Q., Deng, J., Li, Y., Conklin, D. J., Neubert, T. A., Cai, L., Li, X., & Mohammadi, M. (2017). Uncoupling the Mitogenic and Metabolic Functions of FGF1 by Tuning FGF1-FGF Receptor Dimer Stability. CelIReports, 20(7), 1717-1728. https://doi.0rg/10.1016/j.celrep.2017.06.063). Dzięki temu, osłabiono siłę tworzenia kompleksu FGF-1 :FGFR:HS (siarczan heparanu) i zmniejszono znacząco w badanych warunkach odpowiedź mitogenną komórek. Mutant znany jest w literaturze jako FGF-1^AHBSi posiada mutacje w pozycjach 127, 128, 133 łańcucha polipeptydowego (Huang i wsp., 2017).

3. Obniżenie powinowactwa do kinazy CK2. Po egzogennym podaniu FGF-1, wiąże się on z receptorem FGFR. Skutkiem powstania kompleksu FGF-1 :FGFR1 jestdimeryzacja receptorów, a w efekcie fosforylacja wewnątrzkomórkowych domen receptora. Dochodzi także do internalizacji kompleksu i translokacji FGF-1 do jądra, gdzie stymuluje syntezę DNA. Ze względu na plejotropowość efektów biologicznych jakie wywołuje ligand FGF-1 zidentyfikowano szereg białek cytozolowych i jądrowych, odpowiedzialnych za bezpośrednie z nim oddziaływanie. Jednym z nich jest plejotropowa, konstytutywnie aktywna kinaza CK2, zbudowana z dwóch podjednostek α i dwóch podjednostek β. Dane literaturowe wskazują na fakt oddziaływania obu podjednostek z FGF-1. W pracy Skjerpen i wsp. wykazano korelację pomiędzy powinowactwem do CK2 szeregu różnych mutantów FGF-1 a ich potencjałem mitogennym (Skjerpen, C. S., Nilsen, T., Wesche, J., & Olsnes, S. (2002). Binding of FGF-1 variants to protein kinase CK2 correlates with mitogenicity. The EMBO Journal, 21(15), 4058-4069.

https://doi.org/10.1093/emboj/cdf402). Ustalono, iż mutacje obejmujące naturalnie występujący aminokwas - lizynę (L), która zostaje zamieniona na obojętny lub ujemnie naładowany aminokwas, prowadzą do obniżenia lub braku wiązania białka do CK2. Wśród testowanych wariantów były białka z podstawieniami lizyny i seryny (S) (K133R, K133A, K133E, S114A, S131E, S131E/K133E, podstawienia liczone względem pełnej długości łańcucha, 155 aa). Mutacje S131A, S131A/K133A charakteryzowały się niższym potencjałem mitogennym od typu dzikiego. Mutacja K133E nie wykazywała natomiast potencjału mitogennego (Skjerpen i wsp., 2002). Wyniki te są zgodne z danymi uzyskanymi z innych pracach (mutacja K133E występuje również jako jedna z trzech w wariancie FGF-1^AHBS).

Kolejnym problemem związanym z zastosowaniem natywnego ludzkiego FGF-1 jest jego niska stabilność i krótki czas półtrwania biologicznego (Culajay, J. F., Blaber, S. I., Khurana, A., & Blaber, M. (2000). Thermodynamic characterization of mutants of human fibroblast growth factor 1 with an increased physiological half-life. Biochemistry, 39(24), 7153-7158. https://doi.org/10.1021/bi9927742). Niska stabilność jest istotnym czynnikiem limitującym w aplikacjach farmakologicznych białek, ponieważ utrudnia proces formulacji czy przechowywania i stosowania leków biologicznych (Wang, W. (1999). Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. In International Journal of Pharmaceutics (Vol. 185, Issue 2). https://doi.org/10.1016/S0378-5173(99)00152-0). Ponadto, w żywych organizmach białka narażone są na różne czynniki, takie jak np. nieoptymalna temperatura, pH, wolne rodniki tlenowe czy działanie proteaz. Te czynniki mogą prowadzić do rozfałdowania białka, agregacji lub degradacji proteolitycznej. W warunkach fizjologicznego pH i temperatury ok. 50% białka ulega rozfałdowaniu, gdyż temperatura denaturacji FGF-1 wynosi ok. 40°C. Tak więc zwiększenie stabilności termicznej białka miałoby bezpośredni wpływ na jego aktywność biologiczną i przeciwcukrzycową. Zwiększenie stabilności białka można osiągnąć poprzez wprowadzenie mutacji punktowych w łańcuch polipeptydowy białka. Culajay i wsp. dowiedli iż pojedyncza mutacja H108G w skróconym, rekombinowanym, ludzkim białku rhFGF-1 podniosła jego temperaturę denaturacji o ok. 8°C a tym samym zwiększyła jego stabilność (Tabela 3 poniżej) Culajay i wsp., 2000).

Zidentyfikowano także dwie kolejne mutacje punktowe zwiększające stabilność termiczną ludzkiego FGF-1 (Q55P oraz S62I). Zwiększały one temperaturę denaturacji względem białka natywnego o odpowiednio 8,1 i 9,3°C (Zakrzewska, Małgorzata, Krowarsch, D., Wiedlocha, A., Olsnes, S., & Otlewski, J. (2005). Highly Stable Mutants of Human Fibroblast Growth Factor-1 Exhibit Prolonged Biological Action. Journal of Molecular Biology, 352(4), 860-875. https://doi.org/10.1016/jjmb.2005.07.066). Ten sam zespół wygenerował kolejne warianty obejmujące podstawienia wielokrotne, w tym: Q55P/S62I oraz Q55P/S62I/H108G. Uzyskane wyniki wskazują, iż spośród wszystkich przebadanych mutacji, to właśnie potrójne podstawienie okazało się najbardziej stabilizować białko, zwiększać temperaturę denaturacji i zabezpieczać przed proteolizą (Tabela 3 poniżej). Mutacja potrójna wydłużyła także okres półtrwania białka do blisko 10 godzin (dla porównania, czas półtrwania białka FGF1 natywnego wynosi ok 1,5 godz.). Należy zaznaczyć, iż dane dotyczące czasów półtrwania białek dotyczą preparatów bez dodatku heparyny (heparyna zabezpiecza dzikie białko FGF-1 przed inaktywacją termiczną i proteolityczną) (Małgorzata Zakrzewska i wsp., 2005). Analizy pokazały, iż trawienie trypsyną (proteazą) w 37°C przez godzinę mutanta Q55P/S621/H108G nie doprowadziło do fragmentacji białka. W przypadku białka rekombinowanego dzikiego FGF1, został on niemalże całkowicie zdegradowany przez proteazę. Uzyskane wyniki świadczą o wysokiej stabilności proteolitycznej białka z substytucją trzech aminokwasów (Małgorzata Zakrzewska i wsp., 2005).

PL 244541 Β1

Mutant	Temperatura denaturacji Tden [°C]
FGF-1 (dzikie)	40,3
Q55P	48,1
S62I	49,3
H108G	48,0
Q55P/S62I	55,5
QS5P/S62l/H108G	61,8

Tabela 3. Skrócony wykaz temperatury denaturacji poszczególnych mutein białka FGF-1, wyznaczonej za pomocą dichroizmu kołowego (Małgorzata Zakrzewska i wsp., 2005).

Podsumowując, współczesna literatura identyfikuje szereg różnych kierunków modyfikacji struktury l-rzędowej białka FGF-1 w celu obniżenia jego potencjału mitogennego, zachowania lub podniesienia jego aktywności biologicznej w kierunku zachowania homeostazy metabolizmu komórkowego czy także poprawy jego właściwości fizykochemicznych a w konsekwencji farmakologicznych. Jednakże przeprowadzone dotychczas prace badawcze nie pozwoliły na opracowanie muteiny wykazującej oczekiwane dla cząsteczki terapeutycznej właściwości farmakologiczne i wysoką efektywność. Dlatego też nadal istnieje paląca potrzeba opracowania optymalnych z punktu widzenia farmakoterapii mutein FGF-1 (charakteryzujących się wysoką stabilnością termiczną, opornością na degradację proteolityczną, a w rezultacie wydłużonym okresem półtrwania w organizmie), które nie wykazują potencjału mitogennego, i które z jednej strony wykazują wysoki efekt terapeutyczny, zwłaszcza w T2D (mierzony poprzez efektywne obniżanie i stabilizację poziomu glukozy we krwi), i jednocześnie nie stwarzają ryzyka hipoglikemii.

Cel wynalazku

Celem wynalazku jest opracowanie mutein ludzkiego FGF-1 i ich konstruktów, takich jak dimery, pozbawionych niepożądanych cech znanych ze stanu techniki. Dokładniej, celem wynalazku jest opracowanie mutein ludzkiego FGF-1, które nie wykazują potencjału mitogennego. Ponadto celem wynalazku jest opracowanie mutein ludzkiego FGF-1 charakteryzujących się wysoką stabilnością termiczną, opornością na degradację proteolityczną, a w konsekwencji wydłużonym okresem półtrwania po podaniu do organizmu. Celem wynalazku także jest opracowanie mutein ludzkiego FGF-1 wykazujących działanie obniżające poziom glukozy we krwi bez ryzyka wywołania hipoglikemii, charakteryzujących się właściwościami fizykochemicznymi i farmakologicznymi predestynującymi je do zastosowania w terapii, w szczególności w leczeniu cukrzycy, zwłaszcza cukrzycy typu 2.

Cele te zrealizowano poprzez wynalazki zdefiniowane w załączonych zastrzeżeniach patentowych.

Skrócony opis wynalazku

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem i ujawnieniem opracowano muteiny białka ludzkiego FGF-1 i ich dimery, które zawierają mutacje punktowe zmniejszające potencjał mitogenny białek FGF-1. Zgodnie z wynalazkiem i ujawnieniem opracowano także muteiny białka ludzkiego FGF-1 i ich dimery zawierające korzystnie dodatkowe mutacje punktowe, które zwiększają stabilność mutein ludzkiego FGF-1, poprzez zwiększenie ich temperatury denaturacji, a także mutacje, dzięki którym uzyskuje się wydłużony czas półtrwania w krwioobiegu po podaniu osobnikowi, dzięki zwiększonej oporności na proteolizę. Takie właściwości sprawiają, że możliwy jest wydajny proces produkcji w dużej skali, a tym samym rozwój farmakologiczny, jako potencjalnego terapeutyku, a także zabezpieczają białko przed szybką degradacją w organizmie, co zapewnia wysoki efekt terapeutyczny. Opracowane zgodnie z wynalazkiem muteiny ludzkiego FGF-1 zawierające połączenia mutacji punktowych są unikalne, dotychczas nieznane w literaturze, i wywierają nieoczywiste efekty techniczne, pozwalające na ich efektywne działanie terapeutyczne, zwłaszcza do zastosowania w leczeniu cukrzycy, w tym cukrzycy typu 2.

Przedmiotem wynalazku jest muteina ludzkiego FGF-1 o obniżonej mitogenności, charakteryzująca się tym, że zawiera dwie mutacje punktowe: w pozycji aminokwasowej S114 oraz w pozycji aminokwasowej

L150, przy czym numeracja pozycji aminokwasowych oparta jest na pełnej długości sekwencji białka FGF-1 dzikiego typu jak przedstawiono w Sekwencji nr 1 (SEK1), przy czym mutację punktową w pozycji S114 stanowi mutacja S114A, zaś mutację punktową w pozycji L150 stanowi mutacja L150D.

Muteina FGF-1 zawierająca mutację punktową S114A to muteina o Sekwencji nr 3 (SEK3).

Muteina FGF-1 zawierająca mutację punktową L150D to muteina o Sekwencji nr 4 (SEK4).

Korzystnie muteina FGF-1 według wynalazku zawierająca zarówno mutację punktową S114A jak i mutację punktową L150D to muteina o Sekwencji nr 5 (SEK5).

Korzystnie muteina FGF-1 według wynalazku ponadto zawiera co najmniej jedną mutację stabilizującą w pozycji aminokwasowej wybranej spośród: Q55, S62 i H108.

Korzystniej co najmniej jedną mutację stabilizującą w pozycji aminokwasowej Q55, S62 lub H108 stanowi mutacja punktowa wybrana odpowiednio spośród: Q55P, S62I i H108G.

Korzystnie muteina FGF-1 według wynalazku zawiera trzy mutacje stabilizujące: Q55P, S62I iH108G.

Korzystniej muteina FGF-1 według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 10 (SEK10).

Korzystnie muteina FGF-1 według wynalazku dodatkowo zawiera N-końcową delecję co najmniej 19 kolejnych aminokwasów białka FGF-1 pełnej długości.

Korzystniej muteina FGF-1 według wynalazku zawiera N-końcową delecję aminokwasów E3 do G21 białka FGF-1 pełnej długości.

Korzystnie muteina FGF-1 według wynalazku zawiera mutację punktową S114A, mutację punktową L150D i N-końcową delecję aminokwasów E3 do G21 białka FGF-1 pełnej długości.

Korzystniej muteina FGF-1 według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 18 (SEK18).

Przedmiotem wynalazku jest ponadto dimer zmutowanego białka FGF-1 o obniżonej mitogenności według wynalazku jak określono powyżej.

Korzystnie dimer według wynalazku stanowi homodimer.

Korzystniej muteiny tworzące dimer według wynalazku połączone są łącznikiem, jeszcze korzystniej łącznikiem aminokwasowym, najkorzystniej taki łącznik stanowi sekwencja aminokwasowa GGGGSGGGGSGGGG.

Jeszcze korzystniej dimer według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji nr 21 albo 22 (SEK21 albo SEK22).

Przedmiotem wynalazku jest ponadto muteina ludzkiego FGF-1 o obniżonej mitogenności według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania w obniżaniu poziomu glukozy we krwi.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto muteina ludzkiego FGF-1 o obniżonej mitogenności według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania w leczeniu cukrzycy, w szczególności cukrzycy typu 2.

Korzystnie muteina FGF-1 do zastosowania według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 10 (SEK10).

Korzystnie muteina FGF-1 do zastosowania według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 18 (SEK18).

Przedmiotem wynalazku jest również dimer mutein ludzkiego FGF-1 o obniżonej mitogenności według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania w obniżaniu poziomu glukozy we krwi.

Przedmiotem wynalazku jest także dimer mutein ludzkiego FGF-1 o obniżonej mitogenności według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania w leczeniu cukrzycy, w szczególności cukrzycy typu 2.

Korzystnie dimer do zastosowania według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji nr 21 (SEK21).

Korzystnie dimer do zastosowania według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji nr 22 (SEK22).

Ujawniono tu ponadto muteinę ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności, charakteryzującą się tym, że zawiera mutację punktową w pozycji aminokwasowej S153, przy czym numeracja pozycji aminokwasowych oparta jest na pełnej długości sekwencji białka FGF-1 dzikiego typu jak przedstawiono w Sekwencji nr 1.

Taką mutację punktową w pozycji S153 może stanowić mutacja S153A (muteina o Sekwencji nr 32 (SEK32) albo mutacja S153R (muteina o Sekwencji nr 31 (SEK31).

Taka muteina ludzkiego FGF-1 według wynalazku może zawierać dodatkowo mutację punktową S154.

PL 244541 Β1

W takiej muteinie FGF-1 według ujawnienia mutację punktową w pozycji S154 może stanowić mutacja S154D, a mutację punktową w pozycji S153 może stanowić mutacja punktowa S153D (taka muteina przedstawiona jest w Sekwencji nr 27).

Taka muteina ludzkiego FGF-1 według ujawnienia ponadto zawiera ewentualnie co najmniej jedną mutację stabilizującą w pozycji aminokwasowej wybranej spośród: Q55, S62 i H108. Taką co najmniej jedną mutację stabilizującą w pozycji aminokwasowej Q55, S62 lub H108 może stanowić mutacja punktowa wybrana odpowiednio spośród: Q55P, S62I i H108G.

Taka muteina FGF-1 według ujawnienia może zawierać w szczególności trzy mutacje stabilizujące: Q55P, S62I i H108G, a zwłaszcza taka muteina FGF-1 według ujawnienia ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 23, Sekwencji nr 25, lub Sekwencji nr 29.

Taka muteina FGF-1 według ujawnienia dodatkowo może zawierać ewentualnie N-końcową delecję co najmniej 19 kolejnych aminokwasów białka FGF-1 pełnej długości, zwłaszcza N-końcową delecję aminokwasów E3 do G21 białka FGF-1 pełnej długości.

Taka muteina FGF-1 według ujawnienia może ewentualnie zawierać: mutację punktową S153A, mutację punktową S153R albo kombinację mutacji punktowych S153D i S154D, oraz N-końcową delecję aminokwasów E3 do G21 białka FGF-1 pełnej długości, a w szczególności taka muteina według ujawnienia ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 24, Sekwencji nr 26, Sekwencji nr 30, Sekwencji nr 33 lub Sekwencji nr 34. Ujawniono tu także dimer mutein ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności zawierających mutację w pozycji S153 jak określono powyżej, w tym homodimer.

Muteiny tworzące taki dimer połączone są łącznikiem, zwłaszcza łącznikiem aminokwasowym, w szczególności łącznikiem, który stanowi sekwencja aminokwasowa GGGGSGGGGSGGGG.

Taki dimer według ujawnienia ma sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji o numerach 35 do 38 (SEK35 do SEK38).

Ujawniono tu także muteinę ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności zawierającą mutację w pozycji S153, i opcjonalnie w pozycji S154, jak określono powyżej do zastosowania w obniżaniu poziomu glukozy we krwi.

Ujawniono tu także muteinę ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności zawierającą mutację w pozycji S153, i opcjonalnie w pozycji S154, jak określono powyżej do zastosowania w leczeniu cukrzycy, w szczególności cukrzycy typu 2.

Taka muteina ludzkiego FGF-1 według ujawnienia ma sekwencję aminokwasów wybraną spośród Sekwencji o nr. 23 do 30.

Szczegółowy opis wynalazku

W pierwszym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zmutowane białko ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej, względem czynnika FGF-1 typu dzikiego, mitogenności. Takie zmutowane białko ludzkiego FGF-1 jest tu określane zamiennie jako muteina ludzkiego FGF-1 czy też mutant ludzkiego FGF-1. Sposoby wprowadzania mutacji punktowych do sekwencji białkowych oraz testy mitogenności czynników białkowych znane są w dziedzinie, a korzystne przykłady takich sposobów i testów odpowiednich do realizacji niniejszego wynalazku przedstawiono poniżej. Muteina ludzkiego FGF-1 według pierwszego aspektu wynalazku zawiera co najmniej dwie mutacje punktowe, mianowicie mutację naturalnie występującego aminokwasu S w pozycji 114 białka pełnej długości (155 aa) oraz mutację naturalnie występującego aminokwasu L w pozycji 150 białka FGF-1 pełnej długości jak przedstawiono w Sekwencji nr 1, przy czym mutację punktową w pozycji S114 stanowi mutacja S114A, zaś mutację punktową w pozycji L150 stanowi mutacja L150D.

Mutacje punktowe w pozycjach S114 i L150 dzikiego typu białka ludzkiego FGF-1 o pełnej długości sprawiają, że muteina FGF-1 ma obniżoną mitogenność.

Muteina FGF-1 według wynalazku zawiera mutację S114A:

S114A

Aminokwas, który występuje w Aminokwas, który wstał wprowadzony na miejKO prawidłowej wkwencji FGF1 |tiw. aminokwasu normalnie występił^cegc w sekwtnCji tialku dzikim)

Pozycja aminokwasu w sekwencji

FGFliokreśla miejsce mutacji

Powyższy zapis mutacji punktowej to standardowy sposób oznaczania mutacji punktowych w białkach i oznacza w tym przypadku mutację punktową polegającą na zastąpieniu naturalnie występującego w łańcuchu polipeptydowym białka ludzkiego FGF-1 typu dzikiego w pozycji 114 aminokwasu - seryny, innym aminokwasem - alaniną (A).

Mutacja S114A obniża powinowactwo zmutowanego białka do kinazy CK2 i skutkuje obniżoną mitogennością komórek w porównaniu do typu dzikiego ludzkiego FGF-1 pełnej długości, jak wykazano w przykładach realizacji poniżej i pokazano na Figurach (np. Fig. 2). Wariant pełnej długości muteiny FGF-1 według pierwszego aspektu niniejszego wynalazku zawiera także mutację L150D. Mutacja L150D zmniejsza wiązanie zmutowanego białka FGF-1 według wynalazku z receptorem FGFR1. Mutacja ta zlokalizowana jest w domenie odpowiedzialnej za powinowactwo do receptora, ale nie jest kluczowa do tego wiązania. Na Fig. 3 przedstawiono obniżone wiązanie do receptora FGFR1 muteiny ludzkiego FGF-1 zawierającej mutację L150D. Takie białko cechuje się zmniejszoną mitogennością jak wykazano poniżej i pokazano na Figurach (np. Fig. 3).

Muteina FGF-1 według wynalazku zawiera zarówno mutację S114A jak i mutację L150D. Takie białka FGF-1 według wynalazku charakteryzują się optymalnym obniżeniem mitogenności jak wykazano poniżej i pokazano na Figurach (np. Fig. 4).

Korzystnie niniejszy wynalazek dostarcza muteinę ludzkiego FGF-1 o obniżonej mitogenności jak opisano powyżej dodatkowo zawierającą co najmniej jedną stabilizującą punktową mutację w pozycji aminokwasowej wybranej spośród: Q55, S62 i H108 (według numeracji pozycji aminokwasów ludzkiego białka pełnej długości dzikiego typu - sekwencja o numerze identyfikacyjnym nr 1), przy czym korzystniej mutacje te wybrane są spośród: Q55P, S62I i H108G. Jeszcze korzystniej, muteina FGF-1 według wynalazku zawiera dodatkowe mutacje we wszystkich tych trzech pozycjach. Sposoby oznaczania stabilności białek FGF-1 znane są w dziedzinie, a przykładowy sposób oznaczania ich stabilności podano w poniżej i w Tabeli 3.

Takie muteiny FGF-1 według wynalazku charakteryzują się zarówno obniżoną mitogennością, jak również zwiększoną stabilnością, opornością na proteolizę, wydłużonym okresem półtrwania po podaniu, a także efektywnie obniżają poziom glukozy we krwi, bez jednoczesnego wywoływania hipoglikemii, wykazują zatem optymalne działanie przeciwcukrzycowe.

Korzystniej takie muteiny FGF-1 według pierwszego aspektu niniejszego wynalazku zawierają ponadto delecję co najmniej 19 aminokwasów od N-końca białka, w szczególności delecję aminokwasów E3-G21 (z końca N), co dodatkowo obniża mitogenność.

Sekwencja aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym skróconego na N-końcu białka FGF1 w wersji bez mutacji, na matrycy której wykonywano podstawienia aminokwasowe zgodnie z wynalazkiem w wersji skróconej (białka/warianty opisywane jako „krótkie” - skrócona sekwencja, to znaczy z delecją co najmniej 19 aminokwasów od N-końca) ma całkowitą długość łańcucha 136 aa. Sekwencja nr 2 (SEK2) i w porównaniu do dzikiego typu ludzkiego białka FGF-1 pełnej długości pozbawiona jest aminokwasów E3-G21 (tj. aminokwasów EGEITTFTALTEKFNLPPG). Zgodnie z wynalazkiem wersja skrócona ludzkiego białka FGF-1 to inaczej wariant krótki ludzkiego białka FGF-1, korzystnie składający się ze 136 aa, zaś wersja pełnej długości ludzkiego białka FGF-1 to inaczej wariant długi ludzkiego białka FGF-1, który składa się ze 155 aa i nie zawiera delecji aminokwasów E3-G21.

Z uwagi na korzystne z punktu widzenia farmakologicznego parametry takiej muteiny ludzkiego FGF-1 poza obniżoną mitogennością (tj. osiągnięcie wyższej stabilności termicznej i wydłużenie czasu półtrwania bez obecności heparyny), potrójna mutacja stabilizująca została także przetestowana w badaniu in vivo. Jak się okazało takie muteiny ludzkiego FGF-1 zawierające 5 wskazanych mutacji punktowych według wynalazku wykazują także działanie przeciwcukrzycowe. Opisane właściwości mutein FGF1 według tego aspektu wynalazku sprawiają, że mogą być one skutecznie stosowane w medycynie, w szczególności do obniżania poziomu glukozy we krwi, zwłaszcza w leczeniu cukrzycy, w tym cukrzycy typu 2.

W drugim aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza dimer dowolnych z opisanych powyżej mutein ludzkiego FGF-1 o obniżonej mitogenności według wynalazku. Sposoby wytwarzania dimerów białek znane są w dziedzinie, a korzystny sposób otrzymywania dimerów mutein według wynalazku opisano poniżej. Korzystnie dimer według wynalazku stanowi homodimer dowolnych z opisanych powyżej mutein ludzkiego FGF-1 o obniżonej mitogenności według wynalazku, korzystniej połączonych łącznikiem, w szczególności łącznikiem aminokwasowym. Pozwala to na uzyskanie stabilizacji fizykochemicznej ułatwiającej dimeryzację ligandu. Dimer ligandu w łatwiejszy sposób indukuje dimeryzację receptorów komórkowych. Dodatkowo pozwala to na zwiększenie masy białka, ponieważ białka o masach powyżej

30-40 kDa nie podlegają szybkiej eliminacji drogę nerkową z ustroju i posiadają dłuższy czas półtrwania. Jeszcze korzystniej taki łącznik stanowi sekwencja aminokwasowa GGGGSGGGGSGGGG. Szczególnie korzystne warianty dimerów mutein ludzkiego FGF-1 według wynalazku mają sekwencje aminokwasowe przedstawione w Sekwencji nr 21 i 22 (SEK21 i SEK22)).

Właściwości opisanych powyżej mutein ludzkiego FGF-1 według wynalazku pozwalają na ich zastosowanie w medycynie, w szczególności do obniżania glukozy we krwi, a zwłaszcza w leczeniu cukrzycy, jak wykazano poniżej.

Muteiny ludzkiego FGF-1 i ich dimery według wynalazku pozbawione są niepożądanych cech znanych ze stanu techniki i dlatego mogą być stosowane w medycynie, w farmacji, w terapii, jako leki. Cechują się one obniżoną mitogennością i korzystnie zwiększoną stabilnością termiczną oraz zwiększoną opornością na proteolizę a także odpowiednimi właściwościami farmakologicznymi. Dodatkowo charakteryzują się one korzystnie działaniem obniżającym poziom glukozy we krwi bez powodowania ryzyka hipoglikemii, dzięki czemu mogą być w szczególności stosowane do obniżania poziomu glukozy, zwłaszcza w leczeniu cukrzycy, w szczególności cukrzycy typu 2.

Ujawniono tu ponadto muteinę ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności, która zawiera mutację punktową w pozycji aminokwasowej S153, przy czym numeracja pozycji aminokwasowych oparta jest na pełnej długości sekwencji białka FGF-1 dzikiego typu jak przedstawiono w Sekwencji nr 1. Taka muteina ludzkiego FGF-1 według opisywanego aspektu ujawnienia zawiera mutację punktową wybraną spośród: mutacji S153A (muteina o Sekwencji nr 32 (SEK32) i mutacji S153R (muteina o sekwencji nr 31 (SEK31).

Taka muteina ludzkiego FGF-1 według ujawnienia może zawierać dodatkowo mutację punktową w pozycji aminokwasowej S154. Taką mutację może stanowić mutacja S154D, przy czym mutację punktową w pozycji S153 stanowi wtedy mutacja S153D (taka muteina przedstawiona jest w Sekwencji nr 27 (SEK27). Wymienione mutacje w pozycjach S153 i S154 zlokalizowane są w domenie odpowiedzialnej za powinowactwo ligandu do receptora. Muteiny ludzkiego FGF-1 według opisywanego aspektu ujawnienia cechują się obniżoną mitogennością i skutecznym obniżaniem poziomu glukozy we krwi, dzięki czemu mogą być one stosowane do obniżania poziomu glukozy, zwłaszcza w leczeniu cukrzycy, w tym cukrzycy typu 2.

Taka muteina ludzkiego FGF-1 według ujawnienia ponadto może zawierać co najmniej jedną mutację stabilizującą w pozycji aminokwasowej wybranej spośród: Q55, S62 i H108, w szczególności wybraną spośród: Q55P, S62I i H108G, zwłaszcza trzy takie mutacje stabilizujące (Q55P, S62I i H108G). Taka muteina FGF-1 według opisywanego aspektu niniejszego ujawnienia ma w szczególności sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 23 (SEK23), Sekwencji nr 25 (SEK25), lub Sekwencji nr 29 (SEK29). Takie warianty charakteryzują się optymalnym obniżeniem mitogenności, optymalną stabilnością termiczną, jak również wykazują one potencjał do obniżania poziomu glukozy, a co za tym idzie wykazują działanie przeciwcukrzycowe. Takie muteiny według ujawnienia mogą w szczególności zawierać także N-końcową delecję co najmniej 19 aminokwasów ludzkiego białka pełnej długości (wariant krótki), zwłaszcza aminokwasów E3 do G21 białka ludzkiego FGF-1 pełnej długości. Sposoby oznaczania stabilności białek FGF-1 znane są w dziedzinie, a przykładowy sposób oznaczania ich stabilności podano poniżej.

Ujawniono tu także dimer mutein ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności zawierających mutację w pozycji S153, i opcjonalnie S154, jak określono powyżej. Dimery mutein ludzkiego FGF-1 według opisywanego aspektu niniejszego ujawnienia otrzymuje się w analogiczny sposób jak dimery mutein według pierwszego aspektu niniejszego wynalazku. Taki dimer stanowi homodimer dowolnych z opisanych powyżej mutein ludzkiego FGF-1 o obniżonej mitogenności według opisywanego aspektu ujawnienia, zwłaszcza połączonych łącznikiem, w szczególności łącznikiem aminokwasowym, który w szczególności może stanowić sekwencja aminokwasowa GGGGSGGGGSGGGG. Pozwala to na uzyskanie stabilizacji fizykochemicznej ułatwiającej dimeryzację ligandu. Taki dimer w łatwiejszy sposób indukuje dimeryzację receptorów komórkowych. Dodatkowo utworzenie formy dimerycznej pozwala na zwiększenie masy białka, co jest pożądane, ponieważ białka o masach powyżej 30-40 kDa nie podlegają szybkiej eliminacji drogę nerkową z ustroju i posiadają dłuższy czas półtrwania. Szczególnie korzystne warianty dimerów mutein ludzkiego FGF-1 według opisywanego aspektu ujawnienia mają sekwencje aminokwasowe wybrane spośród sekwencji przedstawionych w Sekwencjach o nr 35 do 38.

PL 244541 Β1

Muteiny według opisywanego aspektu niniejszego ujawnienia posiadają właściwości, które predestynują je do zastosowania w obniżaniu poziomu glukozy we krwi, w szczególności w leczeniu cukrzycy, zwłaszcza cukrzycy typu 2.

Niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany na poniższych figurach i w poniższych przykładach, które jednak nie mają na celu ograniczenia w żaden sposób zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzeżeniach patentowych. O ile nie wskazano inaczej wszelkie metody, odczynniki i parametry są takie jakie powszechnie stosuje się w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek i jakie są zalecane przez ich wytwórców.

Opis wykazu sekwencji

Wszystkie sekwencje aminokwasów zawarte w zastrzeżeniach patentowych i niniejszym opisie oparte są na sekwencji cDNA FGF1_WT wariant dzikiego typu (ang. Wild Type), numer dostępu GenBank NM 001354952.2, kodujący ludzki czynnik wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o całkowitej długości 155 aminokwasów.

Sekwencja nr 1 (SEK1)

Na podstawie powyższej sekwencji, wyprodukowano pełną wersję FGF1 (1-155aa) nazwaną tu :? m Ii i: =: ia

MAEGEITTFT Ai.TEKIT4LPP GHYKKPKLLY CSNGGHFLRI LPCGTTDGTR DR5&ęHIOŁQ :-, go ίο ios :ΐϊ

LSAE3VGEVY 1KSTETGOYL AMDTDGLLYG SOTPSEECLF LERLEENHYW TY1SKKHAEK

NW?VGLKKNG 5CKRGPRTHY GJKAILFLPL PWSS&

FGF1(155aa).

nr 1 <SEK1)

F5F1 (1-łSraa)

FGF_NT

Sekwencja nr 2 (SEK2)

Na podstawie powyżej sekwencji wyprodukowano skróconą wersję FGF1 (22-15538), nazywaną tu FGF1(A155aa). Białko powstało przez delecje fragmentu Ν' końca. W sekwencji wskazano pogrubieniem pierwsze 2 aminokwasy, których obecność wynika ze sposobu klonowania skróconej sekwencji FGF1 (aa 22-155) do wektora ekspresyjnego. Metionina (M) kodowana jest przez kodon startowy AUG, od którego rozpoczyna się proces ekspresji białka i której obecność jest konieczna na Ν' końcu, Alanina (A) została dodana do sekwencji w wyniku dodania dwóch nukleotydów do sekwencji flankującej miejsce restrykcyjne w celu zachowania odpowiedniej ramki odczytu w procesie transkrypcji. Dodanie alaniny nie powoduje zmian fizyko-chemicznych białka ze względu na jej niepolarny i alifatyczny charakter.

Wt------------------ -UYKKPKLiY CSKGGHFLRI LPQGTVDGTR DRSB^HISLO

LSAESVGEVY IKSETGQYL AMDTDGLLYG SQT?KEECLF LERLEENHYN TYISKKHAEK *MFVGŁKKNG SCKF.GPRTHY GOKMLFLPL WSSD ;GF_iWT

Sekwencja nr 3 (SEK3)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 114 podstawiono Alaninę (A) w miejsce Seryny (S). Mutacja punktowa FGF1(155aa; S114A). Nr porządkowy mutacji M1.

MAEGE’TT ALTEKFNLPP GMYKKPK1LY C3NGGHFLRI LFDGTYDGTR DRSMHIiLO L3AE3VGEVY IKSTłTGOYL AMDTDGLLYG S2TPNEECLF LEP.LEEHHYN ΤΥΙ^ΚΚΗΑΕΚ WSFVGLKKNG SCKRGPRTHY GGKAILFLPL PVSSD nr 3 (SEK3)

TGFl (l-155aał

FGF15114ΆΙ

Ml

Sekwencja nr 4 (SEK4)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 150 podstawiono Kwas asparaginowy (D) w miejsce Leucyny (L). Mutacja punktowa FGF1(155aa; L150D). Nr porządkowy mutacji M2.

nr 4 l££K41

FGF1(155aa;Li 50Dt

Mi

MAEGEITTFT ALTEKFNLFP GNYKKPKLLY CSNGGHFLRI LPDGTVDGTR DRSDQHIQLO L3AESVGEVY IKSTETGQYL AMDTDGLLYG SQTPNEECLF LERLEEHHYN TYISKKHAEK SHFVGLKKTiG SCKRGPRTHY COKAIlFtpg PVSSO

PL 244541 Β1

Sekwencja nr 5 (SEK5)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 114 podstawiono Alaninę (A) w miejsce Seryny (S) S114A i w pozycji 150 podstawiono Kwas asparaginowy (D) w miejsce Leucyny (L) L150D. Mutacja podwójna FGF1(155aa;S114A/L150D). Nr porządkowy mutacji M3.

Sekwencja nr 5 (SEKS)

FGFI (1-155 aa)

FGFi( 155aa;3114A/L1SOD)

M3 is ίο l·: w sc

MAEGEITTFF ALTEKFNUP GNYKKPKLLY C3NGGHFLRI LPDGTYDGTR DRSDQHIQLQ

BO .ii 1£0

LSAESVGEVY LKSTETGQYL AMDTDGLLYG 3QIPNEECLF LERLEENHYN TYiQk.KHAEK i K mi itr

WWFYGLKKNG SCKRGPRTHY GQKAILFLP@ PYSSD

Sekwencja nr 6 (SEK6)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa); w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q). Mutacja punktowa FGF1(155aa;Q.55P). Nr porządkowy mutacji M4.

Sekwencje nr 6 (SEK6)

FGFI ll-155aa)

FGFi

M4

MAEGEI7TF?

ŁSAESVGEVY

NWFVGLKKNG

ALTEKFNLPF

IKSTITGCYL

SCKRGPRTHY

SNYKKPKŁLY

AMDTDGLLYG

GQKAELFLPL

CSUGGHFUU

S^TPNEECLF

PVSSD

ŁFDGTVDG“R

LSRLEłNHYN

DRSDgHIQLQ

TYISKKHAEK

Sekwencja nr 7 (SEK7)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S). Mutacja punktowa FGF1(155aa;S62l). Nr porządkowy mutacji M5.

Sekwencja nr 7 (SEK7)

FGFi (l-li5aa|

FGFI(155aa;3611)

M5

MAEGEITTFT ALTEKFNLP? GHYKKPKLLY CSNGGHFLRI LPDGWDGTR DRSDQHIQLQ

L@A£SVG£VY IKSTETGOYL AHDTDGLLYG SęTPWEECLF LERŁEEHHTN TYISKKHAEK HWFYGLKKNG SCKRGPRTHY GQKAILFLPL PYSSD

Sekwencja nr 8 (SEK8)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H). Mutacja punktowa FGF1(155aa;H108G). Nr porządkowy mutacji M6.

Sekwencja nr 6 (SEKS)

FGFI (1-155*3)

FGFII155aa;HiO3G)

Mo

MAEGEITTFT

LSAESVGEVY

NWFVGLKKNG

ALTEKFNLPP

IKSTETGQYL

SCKRGPRTHY

GNYKKPKŁLi

AMDTDGLLYG

GQKAILFLPL

CSNGGHFLRI

SOTPNEECLP

PVSSD

LPCGTVDGTR

LERLEEt^Yti □RSDQHIQLQ

TYISKKHAEK

Sekwencja nr 9 (SEK9)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q) Q55P i w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S) S62I oraz w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H) H108G. Mutacja potrójna FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G). Nr porządkowy mutacji M7.

Sekwencja nr 9 (SEKS)

FGFI (l-155aa)

FGFI (155aa; Q55P/s6S

M7 i 2 i! li 4C i 3

MAEGEITTFT ALTEKFMLPP GMYKKPKI.LY CSNGGHFLRI LPDGTYBGTR DRSC^HGOLQ a: i: im i:d us

I^AESYGEYY IKSTETGQYL AMDTDGLLYG SQTFHEECLF LERLEE^YH TYISKKHAEK

·. 2?

NWFYGLKKNG SCKRGPRTHY GQKAILFLPL PVSSD

Sekwencja nr 10 (SEK10)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q) Q55P i w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S) S62I oraz w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H) H108G, dodatkowo w pozycji 114 podstawiono Alaninę (A) w miejsce Seryny (S) S114A, a w pozycji 150 podstawiono Kwas asparaginowy (D) w miejsce Leucyny (L) L150D. Mutacja pięciokrotna FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D). Nr porządkowy mutacji M8.

PL 244541 Β1

Sekwencja ne iseriίi

F3F1 (l-155aa>

-'iSaiiiKr sen-s

MM3SSTTTT AŁTEKFNŁ?? SireKSSRŁŁT £3»3βΜΤ*«Χ ŁPB-STTOGTR δΜΙ01ΙΟ&3

IKSTETGSSi aKDTSSi^S «TPSESCŁF LERŁEE1QyM TYI§KKHA£R

JWJF75LKFJi5 3 ΤΕΜίΡΤΗΧ 3&KAIŁFŁi@ iYSSD

Sekwencja nr 11 (SEK11)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 114 podstawiono Alaninę (A) w miejsce Seryny (S). Mutacja punktowa FGF1(A155aa;S114A). Nr porządkowy mutacji M9.

Mk-------------------- -NYKKPKŁŁY C5NGGHFLRI LPDGTVDGTR DRSDQHIQLQ

Sekwencja nr 11 (SEKłl)

FGF1 (22-1

FGF1 ^155aa:3114A)

M9

LSAE£VGEVY IK3YETGQYL AMDTDGLLYG SQTPNEECLF LERLEENHYN TYI^KKHAEK

NWFYę.LKKNC SCKRGPRTHY GQKAILFLPL PVS$P

Sekwencja nr 12 (SEK12)

FGF1 (22-lS5aa)

FGF1<2155aa;LliOD)

MIG

Sekwencja nr 12 (SEK12)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 150 podstawiono Kwas asparaginowy (D) w miejsce Leucyny (L). Mutacja punktowa FGF1(A155aa;L150D). Nr porządkowy mutacji M10.

_m-------- ---------- -NYKKPKLLY CSHGGHFLRI LPDGIWGTR DRSDQHIOLQ i_SAESVGEVY IKSTETGCYL AMDTDGLLYG SGTPNEECLF LERLEENHYN TYISKKHAEK NHFYGUCKNG SCKF.GPRTHY GOKAILFLPg PVSSD

Sekwencja nr 13 (SEK13)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1(22-155aa), w której w pozycji 114 podstawiono Alaninę (A) w miejsce Seryny (S) S114A i w pozycji 150 podstawiono Kwas asparaginowy (D) w miejsce Leucyny (L) L150D. Mutacja podwójna FGF1(A155aa;S114A/L150D). Nr porządkowy mutacji M11.

Sekwencja nr 13 (SEK13) ²³

ML------------------ -HYKKPKlLY CStiGGHPLRI LP^GT-ZDGTR

FGF1 (22-155aał .. ,, _{w lje u}, _:M

FGFHil55aa;S114A/L’?0D> LSAESVGEVY IKSTETGOYL AMDTDGLLYG S0TP8EECLF LERLEEMHYB TYISKKHAEK ^M11 NWFYGLKKNG SCKF.GPRTHY GOKAILFLF^ ?VSSD

Sekwencja nr 14 (SEK14)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q). Mutacja punktowa FGF1(A155aa;Q55P). Nr porządkowy mutacji M12.

Sekwencja nr 14 łSEKli}

FSFl (22-l5Saaj

FGF1 (Ji55aa;Q55P)

M12 ia-------L£A£3VGEUY

NWFVGLKKV5

IKSTETGOYL

5CKRGPRTHY

-HYKKPKLLY

AMDTDG1-LYG

GQKAILFLPL

CSNGGHFLRI

SOTPNRECLF

FVSSD

LPDGTVDGIR

LERL£E«HYM

Z)RSD§KIQLQ

TYISKKHAEK

Sekwencja nr 15 (SEK15)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 62 podstawiono izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S). Mutacja punktowa FGF1(A155aa;S62l). Nr porządkowy mutacji M13.

Sekwencja nr 15 (SEK15)

FGF1 (22-15Saa?

FGF1Ξ62Ι]

Mli

MU------------------ 'NYKKPKLLY CSNGGHFLRI LPDGTYDGTR DPJ3DQHIQLQ

L@AE5VGEVY ZKSTETG2YL AMDTCGLLYG SQTPNEECLF LERLEEMHYN TYISKKHAEK

NWF7GLKKNG 3CKRGFRTHY GQKAILFLPL PVSSD

PL 244541 Β1

Sekwencja nr 16 (SEK16)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H). Mutacja punktowa FGF1(A155aa;H108G). Nr porządkowy mutacji M14.

Sekwencja nr iSEK16&

FGF1 (22-155aai

FGF1

MU _m------------------ -NYKKFKLLY CSNGGMFLRI LPDGTYDGTR DRSDQHIQLQ

LSAESVGEVY K3TETGQYL AMDTDGLLYG 3QTPNEECLF LEHLEEf^YN TY1SKKHAEK

NWFYGLKKNG SCKFGPRTKY GCKAILFLPL PVSSD

Sekwencja nr 17 (SEK17)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q) Q55P i w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S) S62I oraz w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H) H108G. Mutacja potrójna FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G). Nr porządkowy mutacji M15.

Sekwencja nr 17 <SEK17>

FGFl (22-155aa}

FGFł U155aa;Q55P/S62l/H108G)

ML5

U .'O

Nh------------------ HiYKKPKLLY

7-3 ί 5 «c igAE^GF/Y 7KST£TGC'YL AMDTDGLLYG lj?

»iWFVGLKKMG 3CKP.GFPTRY G^KAILFLrL u ii

CSNGGHFLRI LPDGTVDGTR DRSD§HiQbQ .sc

SQTPNESCLF LERLEEf^fN TYISKKHAEK

Sekwencja nr 18 (SEK18)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q) Q55P i w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S) S62I oraz w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H) H108G, dodatkowo w pozycji 114 podstawiono Alaninę (A) w miejsce Seryny (S) S114A, a w pozycji 150 podstawiono Kwas asparaginowy (D) w miejsce Leucyny (L) L150D. Mutacja pięciokrotna FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D). Nr porządkowy mutacji M16.

Sekwencja nr 19 (SEK19) ------------------ -NYKKPKLLY CSKGGHFLRI LPDGTYDGTR DRSOgBIiLC

FGF1 lg)RESVGEVY IKSTETGQYL AMDTDGLLYG SGTPNŁECLF LES.LEE1Qy!I ΪΥΙ^ίΚίΙΑΕΚ

FGF1 (ilSSaa;QS5P/S62I/HIG9G/S HWFYGLKKNG SCKRGPRTHY GQKAILFLpg ?VSS& IHA/I.15OD) M16

Sekwencja nr 19 (SEK19)

Homodimer pełnej długości FGF1 (1-155 aa), w którym dwie Sekwencje nr 1 zostały połączone łącznikiem: GGGGSGGGGSGGGG Ν' koniec-(1-155-łącznik-2-155)-C' koniec. Drugi monomer FGF1(155aa) rozpoczyna się Alanina (A) w pozycji 170, Metionina (M) została pominięta. FGF1_DIMER(155aa).

Sekwencja nr li fgfi (i-iS5aa) FGFl_DIMER(155ad> FGF1 «AłGEITTF; ALTEKFNLPP GMYKKPKLLY CSNGGHFLRI LPDGTVDGiR :k LSAESVGEVY IKSTETGOYL AMDTDGLLYG SQTPNEECLF LERLEENHYN :» u:

WWFYGLKWJG SCKRGPRTHY GQKAILFLPL : <«5

TEKFNLPPNY KKPKŁLYCSM GSHFLRZLPD GTVDGTRDRS £^HTQLCLSA .c .sę.-,3

TETGQYLAMD TDGLLYGSOT PNEECLFLER LłENHYNTYI SKKHAEKNWF '.O521

DRSDQHIQLQ

TYISKKHAEK ISO

EGEITTFTAL its £SVGEVYIKS

VGLKKNG9CK

RGPF.THYGOK AILFLPLPVS SD

Sekwencja nr 20 (SEK20)

Homodimer o skróconej długości FGF1 (22-155 aa), w którym dwie Sekwencje nr 2 zostały połączone łącznikiem: GGGGSGGGGSGGGG Ν' koniec-(22-155-łącznik-22-155)-C' koniec. W sekwencji wskazano pogrubieniem pierwsze 2 aminokwasy pierwszego monomeru FGF1(A155aa), oraz pierwszy aminokwas drugiego monomeru FGF1 (Δ155aa), których obecność wynika ze sposobu klonowania skróconej sekwencji FGF1 (aa 22-155) do wektora ekspresyjnego. Metionina (M) kodowana jest przez kodon startowy AUG, od którego rozpoczyna się proces ekspresji białka i której obecność jest konieczna

PL 244541 Β1 na Ν' końcu, Alanina 20(A) została dodana do sekwencji w wyniku dodania dwóch nukleotydów do sekwencji flankującej miejsce restrykcyjne w celu zachowania odpowiedniej ramki odczytu w procesie transkrypcji. Dodanie alaniny nie powoduje zmian fizyko-chemicznych białka ze względu na jej niepolarny i alifatyczny charakter. Drugi monomer FGF1(A155aa) rozpoczyna się Alaniną (A) w pozycji 170, Metionina (M) została pominięta. FGF1_DIMER(A155aa).

Sekwencja nr 20 (SEK20)

FGF1 (22-155aaJ fgfi_d:mer(Λ1SSaaj

FGF1_iWT_DIMER

KI-------------------NYKKPKLLY CSNGGHFLRI LPDGTVDG”R DRSDQHIQLQ LSAESVGEVY 1KSTETGQ*L AM&TDGLŁYG 5QTPNE£CLc LERLESHHYN TYISKKHAEK HHFYGLRKNG SCKRGPRTHY CCKAILFLPL PVSSljSGGGS CCCCSCGG<fr-----------------_Nv kkpjch.YCSN GGHFLRILPD GWDGTRDRS DQHIQLQLS* ESYGEWiKS TEISCYŁAHD TDGLLYGS-QT PNEECLFLŁR LEENHYNTYS 3KKHAEKNHF YGLKKNGSCK RGtRTHYGOK AILFLPLPYS SD

Sekwencja nr 21 (SEK21)

Homodimer pełnej długości FGF1 (aa 1-155) mutacji z numerem porządkowym M8, w którym dwie Sekwencje nr 10 zostały połączone łącznikiem: GGGGSGGGGSGGGG Ν' koniec-(1-155-łącznik-2-155)-C' koniec. Drugi monomer FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) rozpoczyna się Alaniną (A) w pozycji 170, Metionina (M) została pominięta. FGF1_M8_DIMER(155aa).

sekwencja nr 21 <sek21)

FGF1 tl-155aa»

F’aFi_M8 DIMER^d'

1$ 20 iO 4-j ΐΐ

MAEGEITTFT ALTErThLPF «iYKKPKLLY CSWGGHFLRI DRSDg|HICiLQ '3 Ϊ0 70 ίϊ” ϋφ ig&ESVGEVY IKSTETGQYL AMDTDGLLYG SOTEHEECLF LERLEEK^YH YI^KKHAEK iiS ita17-3

J5WFV6ŁKKH5 SCKRSrRTHY GQKAILFLP@ pySStjSGGGS GGGGSGgGC^ EGEIYTFTAL ;5ξ MO Mi JM740

EEKFHŁPPHY KKPKSŁTCSH WHFLRILFD GITOGSRCRS DgHIQŁOI@L ESVGEVYIKS

MiMO

YETGOYŁAMD TDGŁŁEGSOT PSEECLFŁER LEEN§YSEY1 §ΚΚΗΛΕΚΗΗΓ VGŁKKSGSCK

RGPRTHYGQK AILFLF^-YSSD

Sekwencja nr 22 (SEK22)

Homodimer o skróconej długości FGF1 (aa 22-155), w którym dwie Sekwencje nr 18 zostały połączone łącznikiem GGGGSGGGGSGGGG Ν' koniec-(22-155-łącznik-22-155)-C' koniec. W sekwencji wskazano pogrubieniem pierwsze 2 aminokwasy pierwszego monomeru FGF1(A155aa), oraz pierwszy aminokwas drugiego monomeru FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D), których obecność wynika ze sposobu klonowania skróconej sekwencji FGF1 (aa 22-155) do wektora ekspresyjnego. Metionina (M) kodowana jest przez kodon startowy AUG, od którego rozpoczyna się proces ekspresji białka i której obecność jest konieczna na Ν' końcu, Alanina (A) została dodana do sekwencji w wyniku dodania dwóch nukleotydów do sekwencji flankującej miejsce restrykcyjne w celu zachowania odpowiedniej ramki odczytu w procesie transkrypcji. Dodanie alaniny nie powoduje zmian fizyko-chemicznych białka ze względu na jej niepolarny i alifatyczny charakter. Drugi monomer FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) rozpoczyna się Alaniną (A) w pozycji 170, Metionina (M) została pominięta. FGF1_M16_DIMER(A155aa).

Se<wencja nr 22 (SEK22I ma-------- -NYKKPKLLY C3NGGitFl.Rr LPDGTYDGTR

FGF1 132-1553,1) lQaESVGEVY IKSTETGOYL AMDTDGLLYG SCTPHEECLF LESl>EEN@YR 7Yi§KKHAEK

Kwr/GLKKNG SCKRGPRTHY GQKAILFLpQ ?VSSii(CflCCS GCGGSGGCC^ -------------------ΝΪ KKfKLLYCSN GGHFLRILPD GTVMTR»R5 ESVGEVYIK$

YETGQY1AMD MLLYGSOI PSEECLFLER ŁEEH@YRTYI giUHAEKRW YGLKKKGSCK

RGPRTHTGQK ńILFLF§fVS 5P

Sekwencja nr 23 (SEK23)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q) Q55P i w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S) S62I, w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H) H108G, dodatkowo w pozycji 153 w miejsce Seryny (S) wstawiono Alaninę (A) S153A. Mutacja poczwórna FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S153A). Numer porządkowy mutacji M17.

PL 244541 Β1

Sekwencja (SEK2?I

PcFl <l’155aai

FGF1_H^,:S>'

MAEGErTTFT ALTESFNLFP GNYKKPKLLY CSNGG3FLRI ?; sc oo ioo

φ)λΞίνύΕν'ί IKSTF-TGGYL AMSTDGLLYG 5QT?NEECLF : jo un 150 i r-c

HWFYGLKKNG SCKRGFRTHY GQKAILFLFL ?V§SE

W ω

LPDGTŻDGTP. DRSE^HIpLC u; i!C

LESLEEt^YS TYISKKHAEK

Sekwencja nr 24 (SEK24)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q) Q55P i w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S) S62I oraz w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H) H108G, dodatkowo w pozycji 153 w miejsce Seryny (S) wstawiono Alaninę (A) S153A. Mutacja poczwórna FGF1(A155aa; Q55P/S62l/H108G/S153A). Numer porządkowy mutacji M18.

Sekwencja nr 24 (oEKĆ4)

FGF1

FGFl_H'^J:ł'“ⁱ

HA-------- -----------SYKKPKLLY CSW5GHFLRI LPDGTYDGTR DR5CgHI0LQ

1|1]AES7JEVY IKSTETG2YE AMDTCGLLYG SOTPUEECLF LERLEEt^ES TYZSKKHAEK

NWFYGUCKNG 5CKRG=?T«Y GQKAILFLPL ί'^Ει

Sekwencja nr 25 (SEK25)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q) Q55P i w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S) S62I oraz w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H) H108G, dodatkowo w pozycji 153 w miejsce Seryny (S) wstawiono Argininę (R) S153A. Mutacja poczwórna FGF1(155aa; Q55P/S62l/H108G/S153A). Numer porządkowy mutacji M19.

sekwencja nr 25 (3ΞΚ25)

FGFi (l-155aał li ii 4·? -O<3 «AEGEITTFT ALTSKFNŁPF GBYKKPKLLY CSNGSHFLPT LFDGTYDGTR 3RSE§HIQLQ

SC 1H 1101211

L|j]AESVGEVY IKSTETGOYL AMDTCSLLYG SQ”PHEECLF LERLEŁt^ni TYISKKHAEK ’ 21 HO 550iii

NHFVGŁKKl«G SCKRGPHTHY GOKAILFLPŁ P^SD

Sekwencja nr 26 (SEK26)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q) Q55P i w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S) S62I oraz w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H) H108G dodatkowo w pozycję 153 w miejsce Seryny (S) wstawiono Argininę (R) S153R. Mutacja poczwórna FGF1(A155aa; Q55P/S62l/H108G/S153R). Numer porządkowy mutacji M20.

Sekwencja nr 25 <SEK2>51

MA-------------------NYKKPKLLY CSNGGHFŁRI ŁPDGTTOGTR DRSE§HIQLQ lg|AESVSEVY IKSTETGGYL AMBTOGLLYG SQIPMEECLF LERLEEK@iN TYISKKHAEK

NWFVGLKKiJG SCKRGPsirHY

Sekwencja nr 27 (SEK27)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycję 153 w miejsce Seryny (S) wstawiono Kwas asparaginowy (D) S153D oraz w pozycji 154 w miejsce Seryny (S) wstawiono Kwas asparaginowy (D) S154D. Mutacja podwójna FGF1(155aa;S153D/S154D). Numer porządkowy mutacji M21.

Sekwencja nr 27 (oEK27>

FGF1 1

ΙΊ M li Id 50 55'

MAE^EITTFT ALTEKFMLFP GMYKKPKLLY CSNGGHFLfcł LPDGTVDGTR '=? ΐϊ 4·: i$y no· ΐ2ύ

LSAESVGłVY ikstetcoyl sstfneeclf lsrleenuyn tyiskkhaek iii Md ::WFVGLKK$G SCKRGPRTHY GQKAILFLPL

PL 244541 Β1

Sekwencja nr 28 (SEK28)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 153 w miejsce Seryny (S) wstawiono Kwas asparaginowy (D) S153D oraz w pozycji 154 w miejsce Seryny (S) wstawiono Kwas asparaginowy (D) S154D. Mutacja podwójna FGF1(A155aa;S153D/S154D). Numer porządkowy mutacji M22.

Sekwencja r.r 28 (SEK28)

FGF1 <22-155aaj :o w ϋ w te

MA-------------------jjyKKFKŁLY CS8GGHFLRI LPDGTVDGTR DRSDQHIQLQ

LSAESVGEVY IKSTETGQYL

AMDTDGLLYG SQTFHEECLF LERLEłMHYN TYISKKHAFK !IWFVGLKKHG SCKRGPRTHY GCKAILFLFL

Sekwencja nr 29 (SEK29)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q) Q55P i w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S) S62I, w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H) H108G, dodatkowo w pozycji 153 w miejsce Seryny (S) wstawiono Kwas asparaginowy (D) S153D oraz w pozycji 154 w miejsce Seryny (S) wstawiono Kwas asparaginowy (D) S154D. Mutacja pięciokrotna FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S153D/S154D). Numer porządkowy mutacji M23.

Sekwencja nr 29 (SEK2?)

FGF1 (l-155aa)

MAEGEZTTFT ALTEKFt:LP? GNYKKPKLLY m ti:

LSAESVS£VY JKSTETGQ’« AMDTOGLŁYG iżS 1’jD

NWFVGLKKNG SCKRGPRTHY GQKAtLFLPL

CSNGGHFLRI Ł?DGTVDGTR DRSDQHIQLQ

SGTRWEECLF LERLEEHHYS TYISKKdAEK ?’@D

Sekwencja nr 30 (SEK30)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 55 podstawiono Prolinę (P) w miejsce Glutaminy (Q) Q55P i w pozycji 62 podstawiono Izoleucynę (I) w miejsce Seryny (S) S62I, w pozycji 108 podstawiono Glicynę (G) w miejsce Histydyny (H) H108G, dodatkowo w pozycji 153 w miejsce Seryny (S) wstawiono Kwas asparaginowy (D) S153D oraz w pozycji 154 w miejsce Seryny (S) wstawiono Kwas asparaginowy (D) S154D. Mutacja pięciokrotna FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G/S153D/S154D). Numer porządkowy mutacji M24.

MA-------------------NYKKPKLLY CSSGGHFLRi LFOGT/CGTR DRSDgHIOLG

Sekwencja nr 30 <SEK30)

l]^ESVGEVY IKSTETGOYL AMDTD3LLYG SCTFNEECLr LERLEEt^YM ΤΥΙ3ΚΚΗΛΕΚ

NWFVGLKKM3 SCKRGPRTH? GQKAILFLPL 97¾¾

Sekwencja nr 31 (SEK31)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 153 podstawiono Argininę (R) w miejsce Seryny (S). Mutacja punktowa FGF1(155aa;S153R). Nr porządkowy mutacji M25.

Sekwencja nr 31 (SEK31) ?4AEGEXrTFT ALTEmiLF? CSNFGHFLRI L?DGTVDGT&

$ iii -Y

ŁSAESV3EVY IKSTETGQTL AMLTDGLLYS LEELEENHYN TYI5FKHAEK .1'. χϊύ

WWFVGIKKNG SCKRGPRTHY G2KAILFLFL FVgsD

Sekwencja nr 32 (SEK32)

Zmutowana sekwencja pełnej długości FGF1 (1-155aa), w której w pozycji 153 podstawiono Alaninę (A) w miejsce Seryny (S). Mutacja punktowa FGF1(155aa;S153R). Nr porządkowy mutacji M26.

Sekwencja nr 32 1SEK32}

FSF1 (22-15raai

F8F1 K(£155aa) ii :·: ::· «·

MAEGBITTFT ALTEKFNLFP GHYKKFKLL? CSNGGHFLRI LrDGTMDGTL

ΆΜΏΤΓ 3LLY3 LERLEEmm® TYTEFKHASK .3' .4···

NWrV3LKKNG SCKP.GFETHY 3QKAZLFLFL

PL 244541 Β1

Sekwencja nr 33 (SEK33)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa), w której w pozycji 153 podstawiono Argininę (R) w miejsce Seryny (S). Mutacja punktowa FGF1(A155aa;S153R). Nr porządkowy mutacji M27.

5€Έ7ι-5Γ.£“3 nr (SEK33)

------------------LFDGT7DGTF. IKSTETGQYL AMDTDSLLYS LSFiEEMHYH TilSKKHAEK

NWFYJLiTll·? 3CKR3PRTKY SQFAILFLiL

Sekwencja nr 34 (SEK34)

Zmutowana sekwencja o skróconej długości FGF1 (22-155aa); w której w pozycji 153 podstawiono Alaninę (A) w miejsce Seryny (S). Mutacja punktowa FGF1(A155aa;S153A). Nr porządkowy mutacji M28.

MA-------------------HYKKPKLLY CSHGGHFLRI LPDOTWDeTR ER3DQHIQLQ

Sekwencja nr 34 iSEK34>

FPFL <22-155aai = 3FL M(al5Saa>

LSAESWSEWY IKSTBTGQYŁ AMSTŁ-SLLYG SQT?iEECLF LERLEESHYN TTISKKHAEK

HWsTWiLKER'? SCKF.GPRTHY 5QKAiLFLFL ?vgsD

Sekwencja nr 35 (SEK35)

Homodimer pełnej długości FGF1 (1-155) mutacji z numerem porządkowym M29, w którym dwie Sekwencje nr 31 zostały połączone łącznikiem GGGGSGGGGSGGGG N¹ koniec-(1-155-łącznik-2-155)-C koniec. Drugi monomer FGF1(155aa;S153R) rozpoczyna się Alaniną (A) w pozycji 170, Metionina (M) została pominięta. FGF1_M29_DIMER(155aa).

nr 35 (5ΞΚ35]

FGFi (i~15^33) FGF1_DI‘‘EF' ii55aa)

MAEGEITTFT ALTEKFMLP? CSSGGHFLPi L*DGTVDGTR

LSASSVGEVY AMDTDGLLY3 SQT?NEE^F ΕΕΡΧΕΕΒΗΥΝ ΤΪΙ5ΚΚΗΑΕΚ

2· *5/ -'2LtS

IME^SŁKKHS SCKRSFRTHy G^KAILFLPL Sv|e|si|6W96S GGGBSGgG^A EGEITTETAL

TEKEBŁFFSY KKFKLLYCSR SGEEIKILFD <3TVEGTEER5 DQHiqLQŁSA ESVGEVYIK3 ςκ <::<s

TEYQQYLK-n> TMLLYGSQT FHEECLFLEP. LEENHYKYYI SEKHAEKX»F VZLK~SSSZVi

RiPP.THYGiK AILELELPY^i?

Sekwencja nr 36 (SEK36)

Homodimer pełnej długości FGF1 (1-155) mutacji z numerem porządkowym M30, w którym dwie Sekwencje nr 32 zostały połączone łącznikiem GGGGSGGGGSGGGG Ν' koniec-(1-155-łącznik-2-155)-C' koniec. Drugi monomer FGF1(155aa;S153A) rozpoczyna się Alaniną (A) w pozycji 170, Metionina (M) została pominięta. FGF1_M30_DIMER(155aa).

MAEGEITTFT ALTSKFNŁPP GKYKEFKLLY CSSGGHFLPJ LPPGTTOGTR

LSAESVGEVY IE£TETGQYL SQ1P3EECLF LERLEESHYN TYISKKHAFE

2· 1Ϊ? .<22________________212 -20

KWFVGLKKNi SCKRSIMHY %;.KAILFLPL iV^S:[3GGGSjŚGOS^^ EFEIITFTAL

TSKFNŁFPtl? KKPKŁLYCSH .JSHFŁRIŁPr -ΪΤνΜΤίΦΚδ CSKISŁSŁSA ESV-3EV7IK5

TETWLAMj TIGLLYGfi? ?HEE :i?LE= LEEKHYWTYI 5:YC-5AErY3W; 'ZSLKKMjECK

3i.

EGFETHY-jęK AIi.;L:LiV@ 3Z>

Sekwencja nr 37 (SEK37)

Homodimer o skróconej długości FGF1 (2-155), w którym dwie Sekwencje nr 33 zostały połączone łącznikiem GGGGSGGGGSGGGG Ν' koniec-(22-155-łącznik-22-155)-C' koniec. W sekwencji wskazano pogrubieniem pierwsze 2 aminokwasy pierwszego monomeru FGF1(A155aa; S153R), oraz pierwszy aminokwas drugiego monomeru FGF1(A155aa;S153R), których obecność wynika ze sposobu klonowania skróconej sekwencji FGF1 (22-155) do wektora ekspresyjnego. Metionina (M) kodowana jest przez kodon startowy AUG, od którego rozpoczyna się proces ekspresji białka i której obecność jest konieczna na Ν' końcu, Alanina (A) została dodana do sekwencji w wyniku dodania dwóch nukleotydów

PL 244541 Β1 do sekwencji flankującej miejsce restrykcyjne w celu zachowania odpowiedniej ramki odczytu w procesie transkrypcji. Dodanie alaniny nie powoduje zmian fizyko-chemicznych białka ze względu na jej niepolarny i alifatyczny charakter. Drugi monomer FGF1(A155aa;S153R), rozpoczyna się Alanina (A) w pozycji 170, Metionina (M) została pominięta. FGF1_M31_DIMER(A155aa).

Sekwencja nr 37 (SEF.37)

F3F1 (”-155aa>

FGi 1_Ι>ΪΜΞΡ. (Δ155aa)

MA-------- ----------- -JJYKKPKLLY CSMGGHFLP.I Ł?EGTVr-GTR DRSDQHIQLQ LSAESVGEV£ iKSTETS^YL AMDTŁGLLYG S£TfSEECŁF LERLEEMHYN TYISKKHAEK MW?V3LKKN-3 SCKRGFRT8Y FvRsr[ę66GS GSGGSGGGGjft.-----------------KK_?KŁŁyęj_H GGHFLP.ILSD GTYTiSTRDRS DSHięŁ^LSA ESVGEVYIKS TET-S-JYLAMr TOSLLYGSiJT PNEECLFLER LEEKHYNTYI SrJKHAEKilWF YC-LKKHGSCK RWF.THYGSK AILFLFLęvg| SD

Sekwencja nr 38 (SEK38)

Homodimer o skróconej długości FGF1 (2-155), w którym dwie Sekwencje nr 34 zostały połączone łącznikiem GGGGSGGGGSGGGG Ν' koniec-(22-155-łącznik-22-155)-C koniec. W sekwencji wskazano pogrubieniem pierwsze 2 aminokwasy pierwszego monomeru FGF1(A155aa;S153A), oraz pierwszy aminokwas drugiego monomeru FGF1(A155aa;S153A), których obecność wynika ze sposobu klonowania skróconej sekwencji FGF1 (22-155) do wektora ekspresyjnego. Metionina (M) kodowana jest przez kodon startowy AUG, od którego rozpoczyna się proces ekspresji białka i której obecność jest konieczna na Ν' końcu, Alanina (A) została dodana do sekwencji w wyniku dodania dwóch nukleotydów do sekwencji flankującej miejsce restrykcyjne w celu zachowania odpowiedniej ramki odczytu w procesie transkrypcji. Dodanie alaniny nie powoduje zmian fizyko-chemicznych białka ze względu na jej niepolarny i alifatyczny charakter. Drugi monomer FGF1(A155aa;S15A), rozpoczyna się Alanina (A) w pozycji 170, Metionina (M) została pominięta. FGF1_M32_DIMER(A155aa).

ja------------------ -HYKKPKŁLY OSNGGHFLM LFSGTWGTR DR3D2HI2LQ

LSAESV3EVY IKSTETSQYL AMDTDSŁŁY'3 S^TFMEECLF ŁERLEEKHYH TYISKKHAEK n. iS (bEK38ł HWFVGLKKNG SCKFGPRTHY SfiKAILFLFL ?vjfi|SL(GSGGS GflGGSGGGGja.-----------------_KY JCKPKŁLYTSN STWDGTRIRS DQHIQLQL3A eswgbwiks FGF1 SIMEF.(A155aa)

TETGQYLAMD TDSLLYGSQT PHEECLFLER LEEHHYNTYI SKKMAEKHWF WGLKKMSSCK

F.GPRTHYG5K AILFL?LPV@ SD

Krótki opis tigur

Figura 1 przedstawia wyniki testu proliferacji mierzonej metodą MTT przy użyciu komercyjnego zestawu CellTiter 96® Non-Radioactive Celi Proliferation Assay (Promega). Komórki NIH3T3 wysiano w ilości 2000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej z użyciem pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z dodatkiem 10% surowicy cielęcej (CS). Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez CS, następnie dodano białka w podanych stężeniach i inkubowano przez 48 godzin. Test MTT wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały wzrost proliferacji dla obu form FGF1 bez znaczących różnic pomiędzy skróconą formą białka FGF1(A155aa) w porównaniu do pełnej długości białka FGF1(155aa).

Figura 2 przedstawia wyniki testu proliferacji mierzonej metodą MTT przy użyciu komercyjnego zestawu CellTiter 96® Non-Radioactive Celi Proliferation Assay (Promega). Komórki NIH3T3 wysiano w ilości 2000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej z użyciem DMEM z dodatkiem 10% CS. Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez CS, następnie dodano białka w podanych stężeniach i inkubowano przez 48 godzin. Test MTT wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały znaczącą indukcję proliferacji przez pełnej długości formę dziką białka FGF1(155aa), oraz znikomą indukcję proliferacji dla mutanta S114A (o obniżonym powinowactwie do CK2), zarówno w formie skróconej FGF1(A155aa;S114A), jak i pełnej długości FGF1(155aa;S114A).

Figura 3 przedstawia wyniki testu proliferacji mierzonej metodą MTT przy użyciu komercyjnego zestawu CellTiter 96® Non-Radioactive Celi Proliferation Assay (Promega).

Komórki NIH3T3 wysiano w ilości 2000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej z użyciem DMEM z dodatkiem 10% CS. Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez CS, następnie dodano białka w podanych stężeniach i inkubowano przez 48 godzin. Test MTT wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały znaczącą indukcję proliferacji przez pełną formę dzikiego typu białka FGF1(155aa), oraz znikomą indukcję proliferacji dla mutanta L150D (o obniżonym powinowactwie do receptora FGFR1), zarówno w formie skróconej FGF1(A155aa;L150D), jak i pełnej długości FGF1(155aa;L150D).

Figura 4 przedstawia wyniki testu proliferacji mierzonej metodą MTT przy użyciu komercyjnego zestawu CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega). Komórki NIH3T3 wysiano w ilości 2000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej z użyciem DMEM z dodatkiem 10% CS. Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez CS, następnie dodano białka w podanych stężeniach i inkubowano przez 48 godzin. Test MTT wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały znaczącą indukcję proliferacji przez pełną formę dzikiego typu białka FGF1(155aa), oraz znikomą indukcję proliferacji dla mutanta S114A/L150D (o obniżonym powinowactwie do CK2 i receptora FGFR1), zarówno w formie skróconej FGF1(A155aa;S114A/L150D), jak i pełnej długości FGF1(155aa;S114A/L150D).

Figura 5 przedstawia wyniki testu proliferacji mierzonej metodą MTT przy użyciu komercyjnego zestawu CellTiter 96^® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega). Komórki NIH3T3 wysiano w ilości 2000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej z użyciem DMEM z dodatkiem 10% CS. Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez CS, następnie dodano białka w podanych stężeniach i inkubowano przez 48 godzin. Test MTT wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały znaczącą indukcję proliferacji przez pełną formę dziką białka FGF1(155aa), oraz znikomą indukcję proliferacji dla mutanta Q55P/S62I/H108G/s'i14A/L150D (mutant o zwiększonej stabilności termicznej i obniżonym powinowactwie do CK2 i receptora FGFR1) zarówno w formie skróconej FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D), jak i pełnej długości FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D).

Figura 6 przedstawia wyniki testu proliferacji mierzonej metodą MTT przy użyciu komercyjnego zestawu CellTiter 96^® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega). Komórki NIH3T3 wysiano w ilości 2000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej z użyciem DMEM z dodatkiem 10% CS. Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez CS, następnie dodano białka w podanych stężeniach i inkubowano przez 48 godzin. Test MTT wykonano według protokołu producenta. Białka użyte w eksperymencie są mutantami pełnej długości białka FGF 1(155aa). Wyniki eksperymentu wykazały bardzo wysoką indukcję proliferacji dla mutanta o zwiększonej stabilności termicznej FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G). Ponad to, wykazano indukcje proliferacji przez formę dzikiego typu białka FGF1(155aa), oraz znikomą indukcję proliferacji dla mutantów: FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D), ‘ FGF1(155aa;S114A), FGF1(155aa;L150D) i FGF1(155aa;S114A/L150D).

Figura 7 przedstawia wyniki testu proliferacji mierzonej metodą MTT przy użyciu komercyjnego zestawu CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega). Komórki NIH3T3 wysiano w ilości 2000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej z użyciem DMEM z dodatkiem 10% CS. Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez CS, następnie dodano białka w podanych stężeniach i inkubowano przez 48 godzin. Test MTT wykonano według protokołu producenta. Białka użyte w eksperymencie są mutantami pełnej długości formy białka FGF1(155aa). Wyniki eksperymentu wykazały bardzo wysoką indukcję proliferacji dla mutantów o zwiększonej stabilności termicznej FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G), FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S153A), FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S153R). Ponad to, wykazano indukcję proliferacji przez formę dzikiego typu białka FGF1(155aa) oraz mutanty FGF1(155aa;S153A), FGF1(155aa;S153R). Mutant FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) posiadał znikomą indukcję proliferacji.

Figura 8 przedstawia wyniki testu proliferacji mierzonej metodą MTT przy użyciu komercyjnego zestawu CellTiter 96^® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega). Komórki NIH3T3 wysiano w ilości 2000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej z użyciem DMEM z dodatkiem 10% CS. Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez CS, następnie dodano białka w podanych stężeniach i inkubowano przez 48 godzin. Test MTT wykonano według protokołu producenta. Białka użyte w eksperymencie są mutantami formy pełnej długości białka FGF 1(155aa). Wyniki eksperymentu wykazały bardzo wysoką indukcję proliferacji dla mutantów FGF1(155aa;S153R) i FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D). Ponad to, wykazano indukcję proliferacji przez formę dzikiego typu białka FGF 1(155aa) oraz mutanty FGF1(155aa;S153A), FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G). Mutant FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) posiadał znikomą indukcję proliferacji.

Figura 9 przedstawia wyniki testu proliferacji mierzonej metodą MTT przy użyciu komercyjnego zestawu CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega). Komórki NIH3T3 wysiano w ilości 2000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej z użyciem Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z dodatkiem 10% CS. Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez CS, następnie dodano białka w podanych stężeniach i inkubowano przez 48 godzin. Test MTT wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały wzrost proliferacji dla obu form FGF1 bez znaczących różnic pomiędzy skróconą formą białka FGF1(A155aa) w porównaniu do skróconej formy dimerycznej białka FGF1_DIMER(A155aa).

Figura 10 przedstawia wyniki testu proliferacji mierzonej metodą MTT przy użyciu komercyjnego zestawu CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega). Komórki NIH3T3 wysiano w ilości 2000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej z użyciem DMEM z dodatkiem 10% CS. Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez CS, następnie dodano białka w podanych stężeniach (z dodatkiem heparyny lub bez 10U/ml) i inkubowano przez 48 godzin. Test MTT wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały pozytywny wpływ heparyny na zwiększenie proliferacji dla formy dzikiego typu białka FGF1(A155aa). Brak heparyny, wpłynął na natężenie proliferacji ale jej nie zatrzymał. Wyniki wskazują jednoznacznie, że heparyna nie wpływa na efektywność indukowania proliferacji przez FGF1(A155aa). Ponad to, wykazano znikomą indukcję proliferacji dla mutanta FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D), zarówno z jak i bez dodatku heparyny.

Figura 11 przedstawia wyniki testu wychwytu glukozy (z ang. glucose uptake) mierzony metodą chemiluminescencji przy użyciu komercyjnego zestawu Glucose Uptake-Glo™ Assay (Promega). Do testu użyto adipocytów, zróżnicowanych z mysich fibroblastów 3T3-L1 wg protokołu dostarczonego przez producenta Glucose Uptake-Glo (Promega). Zróżnicowane adipocyty wysiano w ilości 50000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej pokrytej poli-D-lizyną z użyciem DMEM z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (z ang. foetal bovine serum, FBS). Następnego dnia dodano białka w podanych stężeniach w DMEM bez FBS i inkubowano przez 16 godzin. Test wychwytu glukozy wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały wzrost wychwytu glukozy dla obu form FGF1 bez znaczących różnic pomiędzy skróconą formą białka FGF1(A155aa) w porównaniu do pełnej długości białka FGF1(155aa).

Figura 12 przedstawia wynik testu wychwytu glukozy mierzone metodą chemiluminescencji przy użyciu komercyjnego zestawu Glucose Uptake-Glo™ Assay (Promega). Do testu użyto adipocytów, zróżnicowanych z mysich fibroblastów 3T3-L1 wg protokołu dostarczonego przez producenta Glucose Uptake-Glo (Promega). Zróżnicowane adipocyty wysiano w ilości 50000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej pokrytej poli-D-lizyną z użyciem DMEM z dodatkiem 10% FBS. Następnego dnia dodano białka w podanych stężeniach w DMEM bez FBS i inkubowano przez 16 godzin. Test wychwytu glukozy wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały wzrost wychwytu glukozy dla formy dzikiej białka FGF1(155aa), oraz znaczący wzrost wychwytu glukozy (przewyższający działanie FGF1(155aa)) dla mutanta S114A, zarówno w formie skróconej FGF1(A155aa;S114A), jak i pełnej długości FGF1(155aa;S114A).

Figura 13 przedstawia wyniki testu wychwytu glukozy mierzone metodą chemiluminescencji przy użyciu komercyjnego zestawu Glucose Uptake-Glo™ Assay (Promega). Do testu użyto adipocytów, zróżnicowanych z mysich fibroblastów 3T3-L1 wg protokołu dostarczonego przez producenta Glucose Uptake-Glo (Promega). Zróżnicowane adipocyty wysiano w ilości 50000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej pokrytej poli-D-lizyną z użyciem DMEM z dodatkiem 10% FBS. Następnego dnia dodano białka w podanych stężeniach w DMEM bez FBS i inkubowano przez 16 godzin. Test wychwytu glukozy wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały wzrost wychwytu glukozy dla formy dzikiej białka FGF1(155aa), oraz znaczące obniżenie wychwytu glukozy (w porównaniu z FGF1(155aa)) dla mutanta L150D, zarówno w formie skróconej FGF1(A155aa;L150D), jaki pełnej długości FGF1(155aa;L150D).

Figura 14 przedstawia wyniki testu wychwytu glukozy mierzony metodą chemiluminescencji przy użyciu komercyjnego zestawu Glucose Uptake-Glo™ Assay (Promega). Do testu użyto adipocytów, zróżnicowanych z mysich fibroblastów 3T3-L1 wg protokołu dostarczonego przez producenta Glucose Uptake-Glo (Promega). Zróżnicowane adipocyty wysiano w ilości 50000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej pokrytej poli-D-lizyną z użyciem DMEM z dodatkiem 10% FBS. Następnego dnia dodano białka w podanych stężeniach w DMEM bez FBS i inkubowano przez 16 godzin. Test wychwytu glukozy wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały wzrost wychwytu glukozy dla formy dzikiej białka FGF1(155aa), oraz znaczące obniżenie wychwytu glukozy (w porównaniu z FGF1(155aa)) dla mutanta S114A/L150D, zarówno w formie skróconej FGF1(A155aa;S114A/L150D), jak i pełnej długości FGF1(155aa;S114A/L150D).

Figura 15 przedstawia wyniki testu wychwytu glukozy mierzony metodą chemiluminescencji przy użyciu komercyjnego zestawu Glucose Uptake-Glo™ Assay (Promega). Do testu użyto adipocytów, zróżnicowanych z mysich fibroblastów 3T3-L1 wg protokołu dostarczonego przez producenta Glucose Uptake-Glo (Promega). Zróżnicowane adipocyty wysiano w ilości 50000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej pokrytej poli-D-lizyną z użyciem DMEM z dodatkiem 10% FBS. Następnego dnia dodano białka w podanych stężeniach w DMEM bez FBS i inkubowano przez 16 godzin. Test wychwytu glukozy wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały znaczący wzrost wychwytu glukozy dla formy dzikiej białka FGF 1(155aa), oraz wzrost wychwytu glukozy dla dawki 1000 ng/ml mutanta Q55P/S62I/H108G/S114A/L150D, zarówno w formie skróconej FGF1(A155aa;Q55P/S62I/H108G/S114A/L150D), jak i pełnej długości FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G /S114A/L150D).

Figura 16 przedstawia wyniki testu wychwytu glukozy mierzony metodą chemiluminescencji przy użyciu komercyjnego zestawu Glucose Uptake-Glo™ Assay (Promega). Do testu użyto adipocytów, zróżnicowanych z mysich fibroblastów 3T3-L1 wg protokołu dostarczonego przez producenta Glucose Uptake-Glo (Promega). Zróżnicowane adipocyty wysiano w ilości 50000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej pokrytej poli-D-lizyną z użyciem DMEM z dodatkiem 10% FBS. Następnego dnia dodano białka w podanych stężeniach w DMEM bez FBS i inkubowano przez 16 godzin. Test wychwytu glukozy wykonano według protokołu producenta. Białka użyte w eksperymencie są mutantami pełnej długości białka FGF1(155aa). Wyniki eksperymentu wykazały bardzo wysoki wychwyt glukozy dla mutanta o zwiększonej stabilności termicznej FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G). Ponad to, wykazano zwiększony wychwyt glukozy dla FGF1(155aa), FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D ‘ oraz

FGF1(155aa;S114A). FGF1(155aa;L150D) i FGF1(155aa;S114A/L150D) wykazały znikomy lub brak zwiększonego wychwytu glukozy.

Figura 17 przedstawia wyniki testu wychwytu glukozy mierzony metodą chemiluminescencji przy użyciu komercyjnego zestawu Glucose Uptake-Glo™ Assay (Promega). Do testu użyto adipocytów, zróżnicowanych z mysich fibroblastów 3T3-L1 wg protokołu dostarczonego przez producenta Glucose Uptake-Glo (Promega). Zróżnicowane adipocyty wysiano w ilości 50000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej pokrytej poli-D-lizyną z użyciem DMEM z dodatkiem 10% FBS. Następnego dnia dodano białka w podanych stężeniach w DMEM bez FBS i inkubowano przez 16 godzin. Test wychwytu glukozy wykonano według protokołu producenta. Białka użyte w eksperymencie są mutantami pełnej długości białka FGF1(155aa). Wyniki eksperymentu wykazały bardzo wysoką indukcję wychwytu glukozy dla mutantów o zwiększonej stabilności termicznej FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G), FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S153A), FGF1(155aa;Q55P/S62I/H108G/S153R). Ponadto, wykazano zwiększony wychwyt glukozy dla FGF1(155aa) i FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D), zaś FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S153A) i FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S153R) wykazały najwyższą indukcję wychwytu glukozy.

Figura 18 przedstawia wyniki testu wychwytu glukozy mierzonego metodą chemiluminescencji przy użyciu komercyjnego zestawu Glucose Uptake-Glo™ Assay (Promega). Do testu użyto adipocytów, zróżnicowanych z mysich fibroblastów 3T3-L1 wg protokołu dostarczonego przez producenta Glucose Uptake-Glo (Promega). Zróżnicowane adipocyty wysiano w ilości 50000 komórek/dołek na płytce 96 dołkowej pokrytej poli-D-lizyną z użyciem DMEM z dodatkiem 10% FBS. Następnego dnia dodano białka w podanych stężeniach w DMEM bez FBS i inkubowano przez 16 godzin. Test wychwytu glukozy wykonano według protokołu producenta. Wyniki eksperymentu wykazały wzrost wychwytu glukozy dla obu form dimerycznych FGF1 - bez znaczących różnic pomiędzy skróconą formą białka FGF1l_DIMER(A155aa) w porównaniu do pełnej długości formy białka FGF1_DIMER(155aa).

Figura 19 przedstawia wyniki analizy ekspresji białek oraz fosforylacji białek ścieżki zależnej od FGF:FGFR wykonanej metodą WB (z ang. Western Blot), ze skanem membran wykonanym metodą chemiluminescencji za pomocą sprzętu ChemiDock (Bio-Rad). Do testu użyto adipocytów, zróżnicowanych z mysich fibroblastów 3T3-L1 wg protokołu dostarczonego przez producenta Glucose Uptake-Glo (Promega). Zróżnicowane adipocyty wysiano w ilości 500000 komórek/dołek na płytce 6 dołkowej pokrytej poli-D-lizyną z użyciem DMEM z dodatkiem 10% FBS. Kolejnego dnia komórki głodzono przez 5 godzin w DMEM bez FBS, następnie dodano białka w stężeniu 100 ng/ml i inkubowano przez: 10 minut dla badania fosforylacji białek ścieżki FGF:FGFR-zależnej oraz 16 godzin dla badania ekspresji białka Glut1. Po inkubacji, białka odpłukano zimnym PBS, a lizę komórek przeprowadzono za pomocą buforu RIPA z dodatkiem inhibitorów protez i fosfataz. Białka rozdzielono metodą elektroforezy SDS-PAGE i przetransferowano na membranę nitrocelulozową. Zablokowane membrany inkubowano 16 godzin w temperaturze 4 z przeciwciałami pierwszorzędowymi w rozcieńczeniu 1:1000. Przeciwciała drugorzędowe anty-królicze-HRP inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Do uzyskania sygnału chemiluminescencji wykorzystano bufory Clarity Max ECL. Kontrola stężenia białek wykonana została przy pomocy analizy sygnału Stain Free. Wyniki eksperymentu wykazały wzrost fosforylacji receptora FGFR1 oraz białek zależnych od receptora FGFR1 tzn. pErk 1/2 i pFRS2a dla FGF1(155aa), FGF1(155aa;Q55P/S62I/H108G) oraz FGF1(155aa;S114A). FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D aktywował ścieżkę FGF1:FGFR nieznacznie, a brak aktywacji wykazały FGF1(155aa;L150D) i FGF1(155aa;S114A/L150D).

Figura 20 przedstawia wyniki badania efektu obniżenia stężenie glukozy we krwi in vivo u myszy szczepu cukrzycowego db/db (BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd) po podaniu 0,5 mg/kg m.c. dzikiego typu białka FGF1(A155aa) z i bez dodatku heparyny 10 U/ml. Grupa kontrolna to myszy db/db otrzymujące nośnik. Wyniki wskazują jednoznacznie na pozytywny wpływ FGF1(A155aa) na obniżenie glukozy do normoglikemi oraz brak działania heparyny na efektywność obniżania glukozy u myszy db/db.

Figura 21 przedstawia wyniki badania efektu obniżenia stężenie glukozy we krwi in vivo u myszy szczepu cukrzycowego db/db (BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/OlaHsd) po podaniu 1 mg/kg m.c. dzikiego typu białka FGF1(A155aa) oraz mutanta FGF1(A155aa;S114A). Grupa kontrolna to myszy db/db otrzymujące nośnik. Wyniki wskazują na pozytywny wpływ FGF 1(A155aa) oraz mutanta FGF1(A155aa;S114A) na obniżenie glukozy do normoglikemi u myszy db/db.

Figura 22 przedstawia wyniki badania efektu obniżenia stężenie glukozy we krwi in vivo myszy szczepu cukrzycowego db/db (BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd) po podaniu 1 mg/kg m.c. dzikiego typu białka FGF1(A155aa) oraz mutanta FGF1(A155aa;L150D). Grupa kontrolna to myszy db/db otrzymujące nośnik. Wyniki wskazują na pozytywny wpływ FGF1(A155aa) na obniżenie glukozy do normoglikemi u myszy db/db oraz brak efektywności działania mutanta FGF1(A155aa;L150D).

Figura 23 przedstawia wyniki badania efektu obniżenia stężenie glukozy we krwi in vivo u myszy szczepu cukrzycowego db/db (BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd) po podaniu 1 mg/kg m.c. białka FGF1(A155aa) oraz mutanta FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G). Grupa kontrolna to myszy db/db otrzymujące nośnik. Wyniki wskazują na pozytywny wpływ FGF 1(A155aa) i FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G) na obniżenie glukozy do normoglikemi u myszy db/db, przy czym efektywność działania mutanta FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G) jest wyższa w porównaniu z FGF1(A155aa).

Figura 24 przedstawia wyniki badania efektu obniżenia stężenia glukozy we krwi in vivo u myszy szczepu cukrzycowego db/db (BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd) po podaniu 1 mg/kg m.c. białka FGF1(A155aa) oraz mutantów Q55P/S62I/H108G/S114A/L150D. Grupa kontrolna to myszy db/db otrzymujące nośnik. Wyniki wskazują na pozytywny wpływ FGF1(A155aa) oraz mutantów Q55P/S62I/H108G/S114A/L150D na obniżenie glukozy do normoglikemi u myszy db/db bez znaczących różnic pomiędzy formą skróconą FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D)/ jak i pełnej długości FGF1 (155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D).

Figura 25 przedstawia wyniki badania efektu obniżenia stężenia glukozy we krwi in vivo u myszy szczepu cukrzycowego db/db (BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd) po podaniu 1 mg/kg m.c. białka FGF1(A155aa), FGF1(155aa) oraz formy dimerycznej skróconej muteiny FGF1_DIMER(A155aa).

Grupa kontrolna to myszy db/db otrzymujące nośnik. Wyniki wskazują na pozytywny wpływ FGF1(A155aa) oraz FGF1(155aa) na obniżenie glukozy do normoglikemi u myszy db/db oraz brak efektywności działania skróconej formy dimerycznej FGF1_DIMER(A155aa).

Figura 26 przedstawia wyniki badania efektu obniżenia stężenia glukozy we krwi in vivo u myszy szczepu cukrzycowego db/db (BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd) po podaniu 5 mg/kg m.c. białka FGF1(A155aa), mutanta FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) oraz formy dimerycznej FGF1_M8_DIMER(155aa). Grupa kontrolna to myszy db/db otrzymujące nośnik. Wyniki wskazują na pozytywny wpływ FGF1(A155aa) oraz FGF1(155aa;Q55P/S62I/H108G/S114A/L150D) na obniżenie glukozy do normoglikemi u myszy db/db oraz słabszą w porównaniu do wersji monomerycznej efektywność działania formy dimerycznej FGF1_M8_DIMER(155aa).

Figura 27 przedstawia wyniki badania efektu obniżenia stężenie glukozy we krwi in vivo u myszy szczepu cukrzycowego db/db (BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd) po podaniu 1 mg/kg m.c. białka FGF1(A155aa) oraz trzech dawek 1, 2,5, 5 mg/kg m.c. dla FGF1(155aa;Q55P/-

S62l/H108G/S114A/L150D). Grupa kontrolna to myszy db/db otrzymujące nośnik. Wyniki wskazują na pozytywny wpływ FGF1(A155aa) oraz FGF1(155aa;Q55P/S62I/H108G/S114A/L150D) na obniżenie glukozy do normoglikemi u myszy db/db z wyraźną dawko zależnością dla FGF1(155aa; Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D).

Przykłady

Wszystkie opisane poniżej procedury, testy i analizy doświadczalne przeprowadzono z zastosowaniem komercyjnie dostępnych zestawów testowych, odczynników i aparatury, postępując zgodnie z zaleceniami producentów stosowanych zestawów, odczynników i aparatury, o ile nie wskazano tu wyraźnie inaczej, przy czym stosowano standardowe, powszechnie znane metody wykorzystywane w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek.

Przykład 1

Wytwarzanie konstruktów kodujących warianty białek FGF1 według wynalazku i ujawnienia oraz ich ekspresja i oczyszczanie

FGF1 WT wariant dzikiego typu (ang. Wild Type) - cDNA (numer dostępu GenBank NM 001354952.2, 468 p.z., kodujący ludzki czynnik wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) zoptymalizowano do ekspresji w komórkach E. coli i zsyntetyzowano gen oflankowany miejscami restrykcyjnym dla enzymów Ndel na końcu 5' i miejscem dla Xhol na końcu 3' (Gene Synthesis, Thermo Fisher Scientific). Syntetyczny gen sklonowano do zmodyfikowanego wektora ekspresyjnego pCPBT0010 przygotowanego przez Celon Pharma, przy użyciu wymienionych powyżej enzymów restrykcyjnych. Zaprojektowany konstrukt dla białka FGF1(155aa) nie posiadał metek ułatwiających oczyszczanie oraz dodatkowych aminokwasów na N lub C końcach.

Wszystkie muteiny skonstruowane zgodnie z wynalazkiem, tj. zmutowane sekwencje białek FGF1(A155aa) (warianty krótkie) oraz FGF1(155aa) (warianty pełnej długości) zawierające jedną, dwie, trzy, cztery i pięć mutacji punktowych otrzymano w standardowy sposób w reakcji PCR, o ile nie wskazano inaczej, zgodnie z metodologią ukierunkowanej mutagenezy, a następnie transformację do E. coli DH5, zgodnie z metodologią opisaną przez Hanahanh i wsp. (Hanahan, D., Jessee, J., & Bloom, F. R. (1991). Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods in Enzymology, 204, 63-113.

https://doi.org/10.1016/0076-6879(91 )04006-a).

Konstrukcja mutein: FGF1(155aa;L150D), FGF1(155aa;S114A) - pojedyncze mutanty przygotowano na bazie sekwencji FGF1 (1-155 aa, sekwencja nr 1) w reakcji PCR zgodnie z metodologią ukierunkowanej mutagenezy punktowej opisanej przez Stratagene. Wszystkie reakcje amplifikacji (50 μl) zawierały bufor dla polimerazy, dNTP, matrycowy DNA, startery komplementarne do nici sensownych i antysensownych niosących zmutowany kodon oraz polimerazę Q5 Hot Start High-Fidelity (New England Biolab). Mieszaninę reakcyjną transformowano do komórek E. coli DH5 zgodnie z metodologią Hanahah (Hanahan i wsp., 1991).

Konstrukcja muteiny: FGF1(155aa;S114A/L150D), FGF1(155aa;Q55P/S62I/H108G/S114A/L150D) - muteinę z dwiema mutacjami punktowymi przygotowano poprzez modyfikację kodonów cDNA genu dla białka FGF1 (aa 1-155) dzikiego typu. Sekwencje DNA zoptymalizowano do ekspresji w komórkach E. coli, zsyntezowano geny i przygotowano zgodnie z powyższym opisem.

Konstrukcja muteiny: FGF1(155aa;Q55P/S62I/H108G/S114A/L150D) - Muteinę wielokrotną przygotowano poprzez modyfikację kodonów cDNA genu dla białka FGF1 (aa 1 -155) dzikiego typu (sekwencja nr 1). Sekwencje DNA zoptymalizowano do ekspresji w komórkach E. coli, zsyntezowano geny i przygotowano zgodnie z powyższym opisem.

Konstrukcja mutein: FGF1( 155aa;S153A), FGF1 (155aa;S153R) - pojedyncze mutanty przygotowano na bazie sekwencji FGF1 (1-155 aa, sekwencja nr 1) w reakcji PCR zgodnie z metodologią ukierunkowanej mutagenezy punktowej opisanej przez Stratagene. Wszystkie reakcje amplifikacji (50 μl) zawierały bufor dla polimerazy, dNTP, matrycowy DNA, startery komplementarne do nici sensownych i antysensownych niosących zmutowany kodon oraz polimerazę Q5 Hot Start High-Fidelity (New England Biolab). Mieszaninę reakcyjną transformowano do komórek E. coli DH5 zgodnie z metodologią Hanahah (Hanahan iwsp., 1991).

Konstrukcja mutein: FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S153A); FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S153R) - Muteiny wielokrotne przygotowano poprzez modyfikację kodonów cDNA genu dla białka FGF1 (aa 1-155) dzikiego typu (sekwencja nr 1). Sekwencje DNA zoptymalizowano do ekspresji w komórkach E. coli, zsyntezowano geny i przygotowano zgodnie z powyższym opisem.

Konstrukcja muteiny: FGF1(155aa;S153D/S154D) - pojedynczy mutant przygotowano na bazie sekwencji FGF1 (1-155 aa, sekwencja nr 1) w reakcji PCR zgodnie z metodologią ukierunkowanej mutagenezy punktowej opisanej przez Stratagene. Wszystkie reakcje amplifikacji (50 μl) zawierały bufor dla polimerazy, dNTP, matrycowy DNA, startery komplementarne do nici sensownych i antysensownych niosących zmutowany kodon oraz polimerazę Q5 Hot Start High-Fidelity (New England Biolab). Mieszaninę reakcyjną transformowano do komórek E. coli DH5 zgodnie z metodologią Hanahah (Hanahan i wsp., 1991).

Konstrukcja muteiny: FGF1(A155aa:Q55P/S62i/H108G/S153D/S154D) - muteiny wielokrotne przygotowano poprzez modyfikację kodonów cDNA genu dla białka FGF1 (aa 1-155) dzikiego typu (sekwencja nr 1). Sekwencje DNA zoptymalizowano do ekspresji w komórkach E. coli, zsyntezowano geny i przygotowano zgodnie z powyższym opisem.

Konstrukcja mutein: FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G/S153D/S154D): FGF1(A155aa;S114A); FGF1(A155aa; L150D); FGF1(A155aa;S114A/L150D); FGF1(A155aa;Q55P/S62I/H108G/S153A); FGF1(A155aa;Q55P/S62I/H108G/S153R); FGF1(A155aa;S153A), FGF1(A155aa;S153R) - konstrukty dla tych zmutowanych białek zawierały cDNA kodujące informacje dla skróconej na N-końcu formy dzikiej białka FGF1 i jego skróconych mutein. Sekwencje DNA zoptymalizowano do ekspresji w komórkach E. coli, zamówiono syntetyczne geny i przygotowano zgodnie z powyższym opisem.

Ekspresja i oczyszczanie wariantów białek FGF1 według wynalazku i ujawnienia

Białko FGF1 oraz jego warianty w wersji długiej FGF1(155aa) i skróconej FGF1(A155aa) eksprymowano w komórkach E. coli na pożywce TB (Terrific Broth; Sigma) suplementowanym antybiotykami. Pożywkę TB zawierającą kanamycyny zaszczepiano nocną pre-kulturą. Ekspresję białek indukowano IPTG, a następnie hodowle prowadzono przez 20 godz. Hodowle bakteryjne wirowano przez 15 min. przy 6,000 x g w temp. 4°C. Otrzymane pelety zawieszano w buforze do lizy i inkubowano przez 30 min., a następnie poddawano procesowi sonikacji na lodzie przez 5 min. Przefiltrowane frakcje rozpuszczalne (supernatant), uzyskane poprzez zwirowanie próbek przez 30 min przy 20,000 x g w 4°C nakładano na kolumnę zawierającą złoże heparynowe (Heparin 6 FastFlow, Cytiva). Niezwiązane do złoża białka wypłukano buforem A, a elucje FGF1 przeprowadzono za pomocą gradientu w buforze B. Eluowane białka FGF1 poddawano dalszemu procesowi filtracji żelowej (kolumna HiLoad 16/600 Superdex 75 prep grade, Cytivia). Wyprodukowane białka poddawano analizie ilościowej (A280, przy użyciu współczynnika koekstynkcji) oraz analizom jakościowym: czystości przy użyciu SDS/PAGE, elektroforezy kapilarnej, przesunięcia termicznego (ang. Thermal shift), SEC- HPLC,MS. Białka rozporcjowano, zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w -80°C.

Przykład 2

Potwierdzenie efektywności egzogennego rekombinowanego białka ludzkiego FGF1

Przeprowadzone badanie miało na celu potwierdzenie aktywności przeciwcukrzycowej otrzymanego FGF1(A155aa) zgodnie z wynalazkiem. Myszom db/db podano podskórnie 0,5 mg/kg m.c. białka FGF1(A155aa) z dodatkiem heparyny (podawano niezmienione białko FGF1, dlatego została wykorzystana heparyna w celu zabezpieczenia go przed degradacją i inaktywacją). Białko efektywnie obniża stężenie glukozy do 30 godz. od iniekcji. Jako grupę kontrolną zastosowano myszy db/db, które otrzymywały tylko nośnik (Figura 20).

Przykład 3

Potwierdzenie efektywności FGF1(A 155aa) oraz skróconego wariantu FGF1(A155aa; Q55/S62/H108) bez dodatku heparyny. W badaniu tym zbadano efektywność przeciwcukrzycową białka FGF1(A 155aa) bez obecności heparyny oraz efektywność skróconego wariantu

FGF1(A155aa;Q55/S62/H108). Docelowo miały być podawane białka pozbawione obecności heparyny w buforze, ponieważ podawana heparyna powoduje skutki uboczne i dlatego nie może być podawana ludziom.

Przeprowadzono badanie z zastosowaniem białek: FGF1(A 155aa) i wariantu FGF1(A155aa; Q55/S62/H108) o stężeniu 1 mg/kg m.c. Aktywność przeciwcukrzycową wykazały oba białka jednak muteina z mutacjami stabilizującymi (wariant stabilny) FGF1(A155aa;Q55/S62/H108) znacznie dłużej utrzymywała efekt (Figura 23). Na podstawie uzyskanych danych wnioskowano, że ustabilizowanie FGF1 wydłuża aktywność przeciwcukrzycową.

Wprowadzając do zmutowanego białka ludzkiego FGF1 według wynalazku poznane i opisane w literaturze mutacje stabilizujące, korzystnie wszystkie trzy takie mutacje stabilizujące jak opisano powyżej, otrzymano białko ustabilizowane termicznie, które jednocześnie posiada także wysoki potencjał przeciwcukrzycowy. Zwiększa to również użyteczność farmakologiczną tego białka, ponieważ stabilne białko można wydajnie produkować w dużej skali.

Natomiast nadal nie został zniwelowany efekt mitogenny, jeden z głównych czynników limitujących stosowanie kliniczne rhFGFI.

Przykład 4

Zmniejszenie potencjału mitogennego ludzkiego białka FGF1

Zbadano potencjał mitogenny skróconego ludzkiego białka FGF1 z wprowadzoną mutacją S114A w układzie bez heparyny na linii komórkowej NIH 3T3 w sposób opisany przez Skjerpen i wsp (Skjerpen i wsp., 2002). W przeprowadzanych eksperymentach na linii komórkowej NIH 3T3 białko FGF1(A155aa;S114A) nie stymuluje proliferacji komórek w porównaniu do niezmienionego FGF1 (Figura 2). Uzyskane wyniki są odmienne niż wyniki uzyskane przez Skjerpen i wsp. Należy wziąć pod uwagę dwie zmienne, które różnią oba eksperymenty. Po pierwsze, w pracy Skjerpen i wsp. eksperymenty były przeprowadzone w układzie, w którym była również heparyna, która stabilizowała białko. W eksperymentach Zgłaszającego efekt zaobserwowano dla białka, które nie było dodatkowo stabilizowane heparyną, ponieważ in vivo białko jest podawane bez heparyny z uwagi na jej toksyczny dla organizmu charakter. Ponadto Zgłaszający wykazał, że obecność heparyny nie jest konieczna, aby wykazać potencjał mitogenny białka dzikiego (Figura 10). Po drugie, Skjerpen i wsp. pracowali na białku o pełnej długości, natomiast Zgłaszający przeprowadził eksperyment na obu wersjach: skróconej FGF1(A155aa) oraz pełnej długości FGF1(155aa).

Przykład 5

Zaburzenie oddziaływania z receptorem FGFR1 poprzez wprowadzenie mutacji w miejscu innym niż miejsce wiązania do heparyny

Aktywacja i dimeryzacja receptora FGF1 (FGFR1) jest niezbędna do wywołania odpowiedzi mitogennej. Zaburzenie wiązania ligandu do receptora osłabia oddziaływanie, zmniejsza przekazywanie sygnału i nie pobudza komórek do proliferacji.

Wygenerowano warianty FGF-1 charakteryzujące się zaburzonym wiązaniem do receptora FGFR1. Mutacja powstała w obrębie domeny odpowiadającej za powinowactwo do receptora, ale zmodyfikowana reszta nie jest kluczowa do tego wiązania. Podstawienie dotyczy reszty leucyny (L) na C-końcu łańcucha na kwas asparaginowy (D) (L150D). Następnie sprawdzono czy uzyskane tak białko, które słabo wiąże się z receptorem, ma słabszy potencjał mitogenny. W tym celu wykonano eksperyment na komórkach NIH 3T3, które były eksponowane na działanie badanych białek przez 48 godzin. Następnie do komórek dodano odczynnik MTT i zmierzono poziom absorbancji. Obserwowano obniżoną proliferację komórek traktowanych FGF1(A155aa;L150D), FGF1(A155aa;L150D) w stosunku do tych traktowanych FGF1(155aa) (Figura 3).

Uzyskując efekt osłabionej mitogenności, sprawdzono, czy białko to nadal charakteryzuje się wysoką aktywnością przeciwcukrzycową. W testach in vitro, zróżnicowane do adipocytów komórki 3T3-L1 potraktowano białkami FGF1 lub wariantem FGF1(A155aa;L150D), FGF1(155aa;L150D). Po 16 godzinach od podania wykonano test wychwytu glukozy zgodnie z protokołem producenta (Glucose Uptake Glo Assay, Promega). W teście in vitro bez dodatku heparyny białko to wywołało nieznacznie zwiększony wychwyt glukozy (Figura 13).

Wyniki in vitro okazały się być bardzo obiecujące, zarówno w ocenie potencjału mitogennego jak i efektywności przeciwcukrzycowej nowego wariantu FGF1(A155aa;L150D). Dlatego też, nowe białko z mutacją L150D zostało przetestowane pod kątem zdolności obniżania poziomu glukozy we krwi in vivo, na modelu zwierzęcym myszy db/db. Myszom podano podskórnie białko w dawce 1 mg/kg. Następnie, w kilku punktach czasowych, zwierzętom mierzono poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru poprzez nakłucie koniuszka ogona. Niestety, wariant FGF1(A155aa;L150D) in vivo nie obniżył glukozy we krwi (Figura 22).

Przyczyną braku efektu prawdopodobnie są właściwości fizyczne białka - ten mutant charakteryzuje się niską stabilnością, jego temperatura denaturacji wynosi ok 28°C. Zatem białko to podane drogą podskórną od razu jest rozfałdowane, a naturalnie występujące heparany na powierzchni komórek nie wystarczają, aby białko ustabilizować. W fizjologicznej temperaturze organizmu myszy (ok. 37°C) białko ulega denaturacji i traci swoją aktywność.

Przykład 6

Aktywność wariantów białka FGF1 z mutacją podwójną (FGFl(155aa;S114A/L150D))

W eksperymencie tym zbadano aktywność mutanta zawierającego mutację S114A oraz L150D na komórkach NIH 3T3 w teście MTT. Stwierdzono, że taki mutant podwójny wykazuje zmniejszone działanie mitogenne (Figura 4). Zarówno mutacja S114A jak i L150D oraz ich połączenie obniżają proliferację względem białka dzikiego. Co ciekawe, najbardziej zredukowany efekt mitogenny obserwowano dla białka ustabilizowanego, tj. zawierającego dodatkowo trzy mutacje stabilizujące według wynalazku FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G) jak zostanie to pokazane poniżej. Dodatkowo białko z pięcioma mutacjami FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) według wynalazku wykazuje aktywność przeciwcukrzycową, w przeciwieństwie do wariantów L150D oraz S114A/L150D bez mutacji stabilizujących.

W eksperymencie zbadania kaskady sygnałowej, odpowiadającej za uruchomienie ścieżki proliferacyjnej, warianty FGF1(A155aa;L150D), FGF1(A155aa;S114A/L150D) słabiej aktywują receptor FGFR1 co skutkuje słabszym przekazem sygnału i mniejszą fosforylacją kinaz Akt/PKB oraz ERK (Figura 19).

W teście wychwytu glukozy, kluczowego w kontekście aktywności przeciwcukrzycowej białka FGF-1, warianty FGF1(A155aa;L150D), FGF1(A155aa;S114A/L150D) według wynalazku nie wywołują wychwytu glukozy przez adipocyty mysie, nawet w najwyższej zadanej dawce 1000 ng/ml (Figura 14). Nie są one skuteczne przeciwcukrzycowo bez mutacji stabilizujących, dlatego też otrzymano warianty z wieloma mutacjami punktowymi, w szczególności z pięcioma mutacjami punktowymi, zarówno dwoma mutacjami obniżającymi mitogenność (S114A/L150D), jak i trzema mutacjami stabilizującymi (Q55P/S62I/H108G), które są skuteczne przeciwcukrzycowo.

Przykład 7

Aktywność mutein FGF-1 z mutacjami wielokrotnymi

Wariant FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) i FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/ L150D)

Białko to łączy wszystkie pożądane właściwości: jest stabilne (temperatura denaturacji wynosi powyżej 60°C), posiada obniżoną mitogenność względem typu dzikiego. Dzikiego typu białko FGF1, nawet nieustabilizowane dodatkiem heparyny do roztworu stymuluje komórki NIH 3T3 do proliferacji. Wariant FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) w badanych stężeniach nie wykazuje tego efektu, bez względu na zawartość lub brak heparyny (Figura 10). Ponadto mutanty wykazują aktywność przeciwcukrzycową, zarówno in vitro (na zróżnicowanych do adipocytów mysich komórkach 3T3-L1) (Figury 15, 16,17), jak i in vivo. Efekt obniżenia glukozy we krwi u myszy db/db utrzymywał się przez kolejne 30 godz. od podania wariantu FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) i przez 48 godz. od podania białka dzikiego. Białko zmutowane jest efektywne, natomiast działa krócej niż białko dzikie (podane w tej samej dawce zwierzętom). Wynika to prawdopodobnie z mechanizmu działania FGF1 i roli receptora FGFR1 w efekcie obniżenia glukozy we krwi (mutant ma zaburzone wiązanie do FGFR1 przez obecność mutacji L150D). Podwyższenie dawki muteiny do 5 mg/kg m.c. powoduje osiągnięcie czasu aktywności porównywalnej do FGF1 dzikiego podawanej w dawce 1 mg/kg m.c. przedstawiono zestawienie wyników przeprowadzonych testów aktywności przeciwcukrzycowych (Figury 24, 26, 27).

Przykład 8

Modyfikacje wariantów pełnej długości FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D).

Opracowany wariant FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) na pełnej sekwencji FGF1 (155 aa) oraz wariant dzikiego typu FGF1(155aa) w pełnej długości poddano analizie w celu zbadania, czy fragment 19 aa na N-końcu białka ma wpływ na aktywność biologiczną białka i jego mutein.

N-końcowa delecja aminokwasów E3-G21 w sekwencji pełnej długości nie zmieniła efektu obniżenia glukozy in vivo (Figura 24) i efekt ten był podobny jak w przypadku analogicznych mutein pełnej długości (Figura 15).

Przykład 9

Białka dimeryczne wariantu skróconego FGF1_DIMER(A155aa) i wariantu pełnej długości FGF1_DIMER(155aa)

Dwie cząsteczki FGF1 połączono łącznikiem aminokwasowym w standardowy sposób. Dimeryzacji dokonano zarówno w przypadku sekwencji białka krótkiego jak i pełnej długości. Aktywność wszystkich tych form jest podobna w warunkach in vitro (Figura 18), jednak in vivo wersja dimeryczna FGF1_DlMER(A155aa) była mniej efektywna (Figura 25).

Przykład 10

Wyniki przedstawiające aktywność wariantów białka FGF1 z mutacją pojedynczą: FGF1(155aa;S114A), FGF1(155aa;L150D) oraz podwójną: FGF1(155aa;S114A/L150D)

Mutacje FGF1(155aa;S114A) i FGF1(155aa;L150D) ograniczają działanie mitogenne komórek. Dane zostały przedstawione na komórkach NIH 3T3 w teście MTT: zarówno mutacja FGF1(155aa;S114A) i FGF1(155aa;L150D) oraz ich kombinacja FGF1(155aa;S114A/L150D) obniżają proliferację względem białka dzikiego, czyli obniżają potencjał mitogenny zmutowanego białka (Figury 2, 3, 4, 6). Co ciekawe, najbardziej zredukowany efekt mitogenny zaobserwowano dla białka dodatkowo ustabilizowanego, czyli zawierającego dodatkowo mutacje stabilizujące według wynalazku FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) (Figury 6, 7, 8, 10). Dodatkowo takie ustabilizowane białko FGF1(155aa;Q55P/S62l/H108G/S114A/L150D) wykazuje aktywność przeciwcukrzycową, w przeciwieństwie do wariantów z pojedynczymi mutacjami FGF1(155aa;S114A), FGF1(155aa;L150D) oraz podwójnymi FGF1(155aa;S114A/L150D) (Figury 21,22, 24). W eksperymencie zbadania kaskady sygnałowej, odpowiadającej za uruchomienie ścieżki proliferacyjnej, warianty FGF1(155aa;S114A), FGF1(155aa;L150D) oraz FGF1(155aa;S114A/L150D) słabiej aktywują receptor FGFR1 co skutkuje słabszym przekazem sygnału i mniejszą fosforylacją kinaz Akt/PKB oraz ERK (Figura 19).

W teście wychwytu glukozy, kluczowego w kontekście aktywności przeciwcukrzycowej białka FGF1, warianty FGF1(155aa;S114A), FGF1(155aa;L150D) oraz FGF1(155aa;S114A/L150D) według wynalazku nie wywołują wychwytu glukozy przez adipocyty mysie, nawet w najwyższej zadanej dawce 1000 ng/ml (Figury 12, 13, 14, 16). Nie są one skuteczne przeciwcukrzycowo bez mutacji stabilizujących, dlatego też otrzymano warianty z wieloma mutacjami punktowymi, w szczególności z pięcioma mutacjami punktowymi, zarówno dwoma mutacjami obniżającymi mitogenność (S114A/L150D), jak i trzema mutacjami stabilizującymi (Q55P/S62I/H108G), które nieoczekiwanie wykazują dodatkowo aktywność przeciwcukrzycową.

Przykład 11

Aktywność mutein FGF1 z mutacjami pojedynczymi w pozycji S153 hFGF1

Badaniu poddano aktywność opracowanych mutein zawierających mutację punktową zlokalizowaną w pozycji S153 w domenie odpowiedzialnej za powinowactwo ligandu FGF1 do receptora, w tym w kombinacji z mutacjami stabilizującymi według wynalazku (Q55P, S62I i H108G). Wyniki przeprowadzonych badań wykazały, że opracowane muteiny w pozycji S153 cechują się zarówno obniżoną mitogennością, jak i efektem obniżania poziomu glukozy we krwi ((S153A i S153R - Figury 7, 8, 17). Ponadto warianty wielokrotne, zawierające ponadto trzy mutacje stabilizujące, cechują się ponadto wysoką stabilnością termiczną, opornością na degradację proteolityczną, a w rezultacie wydłużonym okresem półtrwania w organizmie.

PL 244541 Β1

WYKAZ SEKWENCJI <110> Celon Pharma S.A., Uniwersytet Wrocławski <120> Muteiny hFGF~l <130> 17P46380PLOO <160> 38 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 155 < 212> PRT < 213> Homo sapiens <220>

< 223> FGF1 WT (l-155aa) <400> 1

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His

Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

1015

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

2530

Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Ile Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

PL 244541 Β1

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys

70

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu

100

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys

115 120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro

130 135

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val

Ser Thr Glu

Tyr Gly Ser 90

Glu Glu Asn 105

Asn Trp Phe

Arg Thr His

Thr Gly Gin Tyr Leu

Gin Thr Pro Asn Glu

His Tyr Asn Thr Tyr

110

Val Gly Leu Lys Lys

125

Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Ser Ser Asp

145 150 155 <210> 2 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1 (22-155aa) - FGFl(A155aa} - FGF_AWT <400> 2

Met

Ala Asn

Tyr

Lys

Pro

Lys

Leu

Leu Tyr

Cys

Ser Asn

Gly

1

5

10

15

His

Phe Leu

Arg

Ile

Leu

Pro

Asp

Gly

Thr Val

Asp

Gly Thr

Arg

Asp

PL 244541 Β1

Arg Ser Asp Gin His

Glu Val Tyr Ile Lys

Thr Asp Gly Leu Leu 65

Phe Leu Glu Arg Leu

Lys His Ala Glu Lys

100

Cys Lys Arg Gly Pro

115

Leu Pro Leu Pro Val

130

Ile Gin Leu Gin Leu

Ser Thr Glu Thr Gly 55

Tyr Gly Ser Gin Thr 70

Glu Glu Asn His Tyr

Asn Trp Phe Val Gly

105

Arg Thr His Tyr Gly

120

Ser Ser Asp

135

Ser Ala Glu Ser Val Gly

Gin Tyr Leu Ala Met Asp

Pro Asn Glu Glu Cys Leu

80

Asn Thr Tyr Ile Ser Lys

Leu Lys Lys Asn Gly Ser

110

Gin Lys Ala Ile Leu Phe

125 <210> 3 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(155aa;S114A) (Ml) <400> 3

PL 244541 Β1

Met Ala GLu Gly Glu Ile Thr Thr

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys

6570

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu

100

Ile Ala Lys Lys His Ala Glu Lys

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro

130135

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val

Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

1015

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

2530

Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Ile Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

7580

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

9095

Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr

105110

Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Ser Ser Asp

145 150 155 <210> 4 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 244541 Β1 <220>

<223> FGF1(155aa;Ł150D) (M2) <400> 4

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys

6570

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu

100

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro

130135

Ile Leu Phe Leu Pro Asp Pro Val

Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

1015

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

2530

Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Ile Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

7580

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

9095

Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr

105110

Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Ser Ser Asp

145

150

155

PL 244541 Β1 <210> 5 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(155aa;S114A/L150D) (M3) <400> 5

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr

5

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin

55

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile

70

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg

100

Ile Ala Lys Lys His Ala Glu

Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

1015

Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

2530

Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

4045

His Ile Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

7580

Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

9095

Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr

105110

Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

115

120

125

PL 244541 Β1

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro

130 135

Ile Leu Phe Leu Pro Asp Pro Val

145 150 <210> 6 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(155aa;Q55P) (M4) <400> 6

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Pro His

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys

6570

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu

Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Ser Asp

155

Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

15

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

80

Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

PL 244541 Β1

Glu Cys Leu Phe 100

Ile Ser Lys Lys

115

Asn Gly Ser Cys

130

Ile Leu Phe Leu

145

Leu Glu Arg Leu

His Ala Glu Lys

120

Lys Arg Gly Pro

135

Pro Leu Pro Val

150

Glu Glu Asn His 105

Asn Trp Phe Val

Arg Thr His Tyr

140

Ser Ser Asp

155

Tyr Asn Thr Tyr 110

Gly Leu Lys Lys 125

Gly Gin Lys Ala <210> 7 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(155aa;S62l) (M5) <400> 1

Met Ala Glu Gly Glu Ile

5

Asn Leu Pro Pro Gly Asn

Asn Gly Gly His Phe Leu

Thr Thr Phe Thr Ala

Tyr Lys Lys Pro Lys

Arg Ile Leu Pro Asp

Leu Thr Glu Lys Phe

Leu Leu Tyr Cys Ser

Gly Thr Val Asp Gly

PL 244541 Β1

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His

55

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys

70

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu

100

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro

130135

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val

145150 <210> 8 <211> 155 < 212> PRT < 213> Sekwencja sztuczna <220>

< 223> FGF1(155aa;H108G) (M6) < 400> 8

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

Gin Leu Gin Leu Ile Ala Glu

Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

80

Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

95

Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr

110

Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Ser Asp

155

Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

PL 244541 Β1

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys

6570

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu

100

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro

130135

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

2530

Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Ile Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

7580

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

9095

Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr

105110

Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Ser Ser Asp

145 150 155 <210> 9 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 244541 Β1 <220>

<223> FGFl(155aa;Q55?/S62l/H108G) (M7) <400> 9

Met Ala Glu Gly Glu

5

Asn Leu Pro Pro Gly 20

Asn Gly Gly His Phe 35

Thr Arg Asp Arg Ser 50

Ser Val Gly Glu Val 65

Ala Met Asp Thr Asp 85

Glu Cys Leu Phe Leu 100

Ile Ser Lys Lys His 115

Asn Gly Ser Cys Lys 130

Ile Leu Phe Leu Pro

145

Ile Thr Thr Phe Thr Ala

Asn Tyr Lys Lys Pro Lys

Leu Arg Ile Leu Pro Asp

Asp Pro His Ile Gin Leu

Tyr Ile Lys Ser Thr Glu

75

Gly Leu Leu Tyr Gly Ser

Glu Arg Leu Glu Glu Asn

105

Ala Glu Lys Asn Trp Phe

120

Arg Gly Pro Arg Thr His

135

Leu Pro Val Ser Ser Asp

150 155

Leu Thr Glu Lys Phe

Leu Leu Tyr Cys Ser

Gly Thr Val Asp Gly

Gin Leu Ile Ala Glu

Thr Gly Gin Tyr Leu

BO

Gin Thr Pro Asn Glu

Gly Tyr Asn Thr Tyr

110

Val Gly Leu Lys Lys

125

Tyr Gly Gin Lys Ala

140 <210> 10

PL 244541 Β1 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(155aa;Q55P/S62I/H108G/S114A/L150D) (M8) <400> 10

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys

2025

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Pro His Ile

Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

15

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly 45

Gin Leu Gin Leu Ile Ala Glu

55 60

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys

70

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu

100

Ile Ala Lys Lys His Ala Glu Lys

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro

Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

7580

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

9095

Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr

105110

Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

130

135

140

PL 244541 Β1

Ile Leu Phe Leu Pro Asp Pro Val Ser Ser Asp

145 150 155 <210> 11 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(ńl55aa;S114A) (M9) <400> 11

Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys

His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp

Arg Ser Asp Gin His Ile Gin Leu

3540

Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu

5055

Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser

6570

Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn

Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

1015

Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp

2530

Gin Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly

Thr Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp

Gin Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu

80

His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ala Lys

PL 244541 Β1

Lys

His

Ala

Glu Lys 100

Asn Trp

Phe

Val 105

Gly

Leu

Lys

Asn 110

Gly

Ser

Cys

Lys

Arg

Gly

Pro

Arg

Thr

His

Tyr

Gly

Gin

Lys

Ala

Ile

Leu

Phe

115

120

125

Leu

Pro

Leu

Pro

Val

Ser

Asp

130 135 <210> 12 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(A155AA;L150D) (M10) <400> 12

Met Ala Asn Tyr Lys

5

His Phe Leu Arg Ile

Arg Ser Asp Gin His

Glu Val Tyr Ile Lys

Thr Asp Gly Leu Leu

Lys Pro Lys Leu Leu

Leu Pro Asp Gly Thr

Ile Gin Leu Gin Leu

Ser Thr Glu Thr Gly

Tyr Gly Ser Gin Thr

Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

Val Asp Gly Thr Arg Asp

Ser Ala Glu Ser Val Gly

Gin Tyr Leu Ala Met Asp

Pro Asn Glu Glu Cys Leu

80

PL 244541 Β1

Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn

Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe

100

Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His

115120

Leu Pro Asp Pro Val Ser Ser Asp

130135

His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys 9095

Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser

105110

Tyr Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe

125 <210> 13 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(A155aa;S114A/L150D) (Mil) <400> 13

Met Ala Asn Tyr Lys Lys

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

His Phe Leu Arg Ile

Arg Ser Asp Gin His

Leu

Ile

Pro Asp

Gin Leu

Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp

30

Gin Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly

PL 244541 Β1

Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu

55

Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser

70

Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn

Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe

100

Thr Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp

Gin Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu

7580

His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ala Lys

9095

Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser

105110

Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His

Tyr Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe

115 120 125

Leu Pro Asp Pro Val Ser Ser Asp

130 135 <210> 14 <211> 136 < 212> PRT < 213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(fiI55aa;Q55P) (M12) < 400> 14

Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu

5

His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly

Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

15

Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp

PL 244541 Β1

Arg

Ser

Asp 35

Pro

His

Ile

Gin

Leu 40

Gin

Leu

Ser

Ala

Glu 45

Ser

Val

Gly

Glu

Val

Tyr

Ile

Lys

Ser

Thr

Glu

Thr

Gly

Gin

Tyr

Leu

Ala

Met

Asp

50

55

60

Thr

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gly

Ser

Gin

Thr

Pro

Asn

Glu

Cys

Leu

65

70

75

80

Phe

Leu

Glu

Arg

Leu

Glu

Asn

His

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ile

Ser

Lys

85

90

95

Lys

His

Ala

Glu

Lys

Asn

Trp

Phe

Val

Gly

Leu

Lys

Asn

Gly

Ser

100

105

110

Cys

Lys

Arg

Gly

Pro

Arg

Thr

His

Tyr

Gly

Gin

Lys

Ala

Ile

Leu

Phe

115

120

125

Leu

Pro

Leu

Pro

Val

Ser

Asp

130 135 <210> 15 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(A155aa;S62I) (M13) <400> 15

PL 244541 Β1

Met Ala Asn Tyr 1

His Phe Leu Arg

Arg Ser Asp Gin

Glu Val Tyr Ile

Thr Asp Gly Leu 65

Phe Leu Glu Arg

Lys His Ala Glu

100

Cys Lys Arg Gly 115

Leu Pro Leu Pro

130 <210> 16 <2U> 136 <212> PRT <213> Sekwencja

Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

1015

Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp

2530

His Ile Gin Leu Gin Leu Ile Ala Glu Ser Val Gly

4045

Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp

5560

Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu

7580

Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys

9095

Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser

105110

Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe

120125

Val Ser Ser Asp

135 sztuczna <220>

PL 244541 Β1 <223> FGF1(A155aa;H108G) (M14) <400> 16

Met Ala Asn Tyr Lys

5

His Phe Leu Arg Ile

Arg Ser Asp Gin His

Glu Val Tyr Ile Lys 50

Thr Asp Gly Leu Leu 65

Phe Leu Glu Arg Leu

Lys His Ala Glu Lys

100

Cys Lys Arg Gly Pro

115

Leu Pro Leu Pro Val

130

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr

Leu Pro Asp Gly Thr Val

Ile Gin Leu Gin Leu Ser

Ser Thr Glu Thr Gly Gin

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro

75

Glu Glu Asn Gly Tyr Asn

Asn Trp Phe Val Gly Leu

105

Arg Thr His Tyr Gly Gin

120

Ser Ser Asp

135

Cys Ser Asn Gly Gly

Asp Gly Thr Arg Asp

Ala Glu Ser Val Gly

Tyr Leu Ala Met Asp 60

Asn Glu Glu Cys Leu

Thr Tyr Ile Ser Lys 95

Lys Lys Asn Gly Ser

110

Lys Ala Ile Leu Phe

125 <210> 17 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 244541 Β1 <220>

<223> FGF1(A155aa;Q55P/S62l/H108G) (M15) <400> 17

Met Ala Asn Tyr 1

His Phe Leu Arg

Arg Ser Asp Pro 35

Glu Val Tyr Ile 50

Thr Asp Gly Leu 65

Phe Leu Glu Arg

Lys His Ala Glu

100

Lys Lys Pro Lys Leu 5

Ile Leu Pro Asp Gly

His Ile Gin Leu Gin

Lys Ser Thr Glu Thr

Leu Tyr Gly Ser Gin 70

Leu Glu Glu Asn Gly 85

Lys Asn Trp Phe Val

105

Leu Tyr Cys 10

Thr Val Asp

Leu Ile Ala

Gly Gin Tyr

Thr Pro Asn

Tyr Asn Thr 90

Gly Leu Lys

Ser Asn Gly Gly 15

Gly Thr Arg Asp 30

Glu Ser Val Gly 45

Leu Ala Met Asp

Glu Glu Cys Leu 80

Tyr Ile Ser Lys 95

Lys Asn Gly Ser

110

Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

Ile Leu Phe

115

120 125

Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp

130

135 <210> 18

PL 244541 Β1 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1(A155aa;Q55P/S62I/H108G/S114A/L150D) (M16) <400> 18

Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

1015

His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp

2530

Arg Ser Asp Pro His Ile Gin Leu Gin Leu Ile Ala Glu Ser Val Gly

4045

Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp

5560

Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu Glu CysLeu

70 7580

Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ile AlaLys

9095

Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser

100 105110

Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe

115 120125

Leu Pro Asp Pro Val Ser Ser Asp

130

135

PL 244541 Β1 <210> 19 <211> 322 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGFl_DIMER(155aa) (FGF1_WT_DIMER) <400> 19

Met Ala Glu Gly Glu

Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

5

Asn Leu Pro Pro Gly

Asn Gly Gly His Phe

Thr Arg Asp Arg Ser

Ser Val Gly Glu Val

Ala Met Asp Thr Asp

Glu Cys Leu Phe Leu

Asn Tyr Lys Lys Pro Lys 25

Leu Arg Ile Leu Pro Asp

Asp Gin His Ile Gin Leu 55

Tyr Ile Lys Ser Thr Glu

75

Gly Leu Leu Tyr Gly Ser

Glu Arg Leu Glu Glu Asn

Leu Leu Tyr Cys Ser

Gly Thr Val Asp Gly

Gin Leu Ser Ala Glu

Thr Gly Gin Tyr Leu

Gin Thr Pro Asn Glu

His Tyr Asn Thr Tyr

100

105

110

PL 244541 Β1

Ile Ser Lys Lys His

115

Asn Gly Ser Cys Lys

130

Ile Leu Phe Leu Pro

145

Gly Gly Gly Gly Ser

165

Phe Thr Ala Leu Thr

180

Pro Lys Leu Leu Tyr

195

Pro Asp Gly Thr Val

210

Gin Leu Gin Leu Ser

225

Thr Glu Thr Gly Gin

245

Gly Ser Gin Thr Pro

260

Glu Asn His Tyr Asn

275

Trp Phe Val Gly Leu

290

Thr His Tyr Gly Gin

305

Ala Glu Lys Asn Trp 120

Arg Gly Pro Arg Thr 135

Leu Pro Val Ser Ser 150

Gly Gly Gly Gly Ala

170

Glu Lys Phe Asn Leu

185

Cys Ser Asn Gly Gly 200

Asp Gly Thr Arg Asp

215

Ala Glu Ser Val Gly 230

Tyr Leu Ala Met Asp

250

Asn Glu Glu Cys Leu 265

Thr Tyr Ile Ser Lys 280

Lys Lys Asn Gly Ser

295

Lys Ala Ile Leu Phe 310

Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Asp Gly Gly Gly Gly Ser

155 160

Glu Gly Glu Ile Thr Thr

175

Pro Pro Asn Tyr Lys Lys

190

His Phe Leu Arg Ile Leu

205

Arg Ser Asp Gin His Ile

220

Glu Val Tyr Ile Lys Ser

235 240

Thr Asp Gly Leu Leu Tyr

255

Phe Leu Glu Arg Leu Glu

270

Lys His Ala Glu Lys Asn

285

Cys Lys Arg Gly Pro Arg

300

Leu Pro Leu Pro Val Ser

315 320

PL 244541 Β1

Ser Asp <210> 20 <211> 285 <212> ?RT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGFl_DIMER(L155aa) (FGF1_AWT_DIMER) <400> 20

Met Ala Asn Tyr Lys

5

His Phe Leu Arg Ile

Arg Ser Asp Gin His

Glu Val Tyr Ile Lys 50

Thr Asp Gly Leu Leu 65

Phe Leu Glu Arg Leu

Lys His Ala Glu Lys

Lys Pro Lys Leu Leu

Leu Pro Asp Gly Thr

Ile Gin Leu Gin Leu

Ser Thr Glu Thr Gly

Tyr Gly Ser Gin Thr 70

Glu Glu Asn His Tyr

Asn Trp Phe Val Gly

Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

Val Asp Gly Thr Arg Asp

Ser Ala Glu Ser Val Gly

Gin Tyr Leu Ala Met Asp

Pro Asn Glu Glu Cys Leu

80

Asn Thr Tyr Ile Ser Lys

Leu Lys Lys Asn Gly Ser

100

105

110

PL 244541 Β1

Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr

115120

Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp Gly

130135

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Asn Tyr

145150

Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg

165

Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin

180185

Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile

195200

Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu

210215

Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg

225230

Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu

245

Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly

260265

Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro

Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe

125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

140

Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr

155 160

Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val

170 175

His Ile Gin Leu Gin Leu Ser

190

Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin

205

Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro

220

Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn

235 240

Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu

250 255

Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin

270

Val Ser Ser Asp

275 280285 <210> 21 <211> 322

PL 244541 Β1 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGFl_M8_DIMER(155aa) <400> 21

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys

2025

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Pro His Ile

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser

6570

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu

100105

Ile Ala Lys Lys His Ala Glu Lys Asn

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg

Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

15

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Gin Leu Gin Leu Ile Ala Glu

Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

80

Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

95

Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr

110

Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

130

135

140

PL 244541 Β1

Ile Leu Phe Leu Pro Asp Pro Val

145 150

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

165

Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

180

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn

195200

Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr

210215

Gin Leu Gin Leu Ile Ala Glu Ser

225230

Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu Ala

245

Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu Glu

260

Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ile

275280

Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn

290295

Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala Ile

Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser

155160

Gly Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

170175

Asn Leu Pro Pro Asn Tyr Lys Lys

185190

Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu

205

Arg Asp Arg Ser Asp Pro His Ile

220

Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser

235240

Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr

250255

Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu

265270

Ala Lys Lys His Ala Glu Lys Asn

285

Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg

300

Leu Phe Leu Pro Asp Pro Val Ser

305 310 315 320

Ser Asp <210> 22

PL 244541 Β1 <211> 285 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGFl_M16_DIMER(A155aa) <400> 22

Met Ala Asn Tyr Lys 1 5

His Phe Leu Arg Ile

Arg Ser Asp Pro His 35

Glu Val Tyr Ile Lys

Thr Asp Gly Leu Leu 65

Phe Leu Glu Arg Leu

Lys His Ala Glu Lys

100

Cys Lys Arg Gly Pro

115

Leu Pro Asp Pro Val

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr

Leu Pro Asp Gly Thr Val

Ile Gin Leu Gin Leu Ile

Ser Thr Glu Thr Gly Gin

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro

75

Glu Glu Asn Gly Tyr Asn

Asn Trp Phe Val Gly Leu

105

Arg Thr His Tyr Gly Gin

120

Ser Ser Asp Gly Gly Gly

Cys Ser Asn Gly Gly

Asp Gly Thr Arg Asp

Ala Glu Ser Val Gly 45

Tyr Leu Ala Met Asp 60

Asn Glu Glu Cys Leu

Thr Tyr Ile Ala Lys

Lys Lys Asn Gly Ser

110

Lys Ala Ile Leu Phe

125

Gly Ser Gly Gly Gly

130

135

140

PL 244541 Β1

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Asn

145 150

Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu

165

Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp

180

Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr

195200

Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly

210215

Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu

225230

Thr Tyr Ile Ala Lys Lys His Ala

245

Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg

260

Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Asp

Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr

155160

Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val

170175

Pro His Ile Gin Leu Gin Leu Ile

185190

Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin

205

Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro

220

Arg Leu Glu Glu Asn Gly Tyr Asn

235240

Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu

250255

Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin

265270

Pro Val Ser Ser Asp

275

280 285 <210> 23 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 244541 Β1 <220>

<223> FGF1_M(155aa) <400> 23

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg He

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Pro His

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys

6570

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu

100

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro

130135

Phe Thr Ala Leu Thr GLu Lys Phe

1015

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

2530

Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Ile Gin Leu Gin Leu Ile Ala Glu

Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

7580

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

9095

Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr

105110

Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ala Ser Asp

145

150

155 <210> 24

PL 244541 Β1 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGFl_M(A155aa) <400> 24

Met Ala Asn Tyr Lys 1 5

His Phe Leu Arg Ile

Arg Ser Asp Pro His 35

Glu Val Tyr Ile Lys

Thr Asp Gly Leu Leu 65

Phe Leu Glu Arg Leu

Lys His Ala Glu Lys

100

Cys Lys Arg Gly Pro

115

Leu Pro Leu Pro Val

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr

Leu Pro Asp Gly Thr Val

Ile Gin Leu Gin Leu Ile

Ser Thr Glu Thr Gly Gin

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro

75

Glu Glu Asn Gly Tyr Asn

Asn Trp Phe Val Gly Leu

105

Arg Thr His Tyr Gly Gin

120

Ala Ser Asp

Cys Ser Asn Gly Gly

Asp Gly Thr Arg Asp

Ala Glu Ser Val Gly

Tyr Leu Ala Met Asp 60

Asn Glu Glu Cys Leu

Thr Tyr Ile Ser Lys

Lys Lys Asn Gly Ser

110

Lys Ala Ile Leu Phe

125

130

135

PL 244541 Β1 <210> 25 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGFl_M(155aa) <400> 25

Met Ala

Glu

Gly

Glu

Ile

Thr

Phe

Thr

Al ci

Leu

Thr

Glu

Lys

Phe

1 Asn Leu

Pro

5 Gly

Asn

Tyr

Lys

10 Pro

Lys

Leu

Tyr

15 Cys

Ser

Asn Gly

Gly

20 His

Phe

Leu

Arg

Ile

25 Leu

Pro

Asp

Gly

Thr

30 Val

Asp

Gly

Thr Arg

35 Asp

Arg

Ser

Asp

Pro

40 His

Ile

Gin

Leu

Gin

45 Leu

Ile

Ala

Glu

50 Ser Val

Gly

Glu

Val

Tyr

55 Ile

Lys

Ser

Thr

Glu

60 Thr

Gly

Gin

Tyr

Leu

65 Ala Met

Asp

Thr

Asp

70 Gly

Leu

Tyr

Gly

75 Ser

Gin

Thr

Pro

Asn

80 Glu

Glu Cys

Leu

Phe

85 Leu

Glu

Arg

Leu

Glu

90 Glu

Asn

Gly

Tyr

Asn

95 Thr

Tyr

100

105 no

PL 244541 Β1

Ile Ser Lys Lys His

115

Asn Gly Ser Cys Lys

130

Ile Leu Phe Leu Pro

145

Ala Glu Lys Asn Trp Phe

120

Arg Gly Pro Arg Thr His

135

Leu Pro Val Arg Ser Asp

150 155

Val Gly Leu Lys Lys

125

Tyr Gly Gin Lys Ala

140 <210> 26 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGFl_M(fll55aa) <400> 26

Met Ala Asn Tyr Lys Lys

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

His Phe Leu

Arg Ser Asp

Glu Val Tyr

Thr Asp Gly

Arg Ile Leu Pro Asp

Pro His Ile Gin Leu

Ile Lys Ser Thr Glu

Leu Leu Tyr Gly Ser

Gly Thr Val Asp 25

Gin Leu Ile Ala

Thr Gly Gin Tyr

Gin Thr Pro Asn

Gly Thr Arg Asp 30

Glu Ser Val Gly 45

Leu Ala Met Asp

Glu Glu Cys Leu

PL 244541 Β1

Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu

Lys His Ala Glu Lys Asn Trp

100

Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr

115

Leu Pro Leu Pro Val Arg Ser

130 135 <210> 27 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1_M(155aa) <400> 27

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr

5

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg

Gly Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys

95

Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser

105 110

Tyr Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe

125

Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

15

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

30

Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

PL 244541 Β1

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His Ile Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr

100

105

110

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

115

120

125

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

130

135

140

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Asp Asp Asp

145

150

155 <210> 28 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGFl_M(A155aa) <400> 28

Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

PL 244541 Β1

His Phe

Arg Ser

Glu Val·

Thr Asp 65

Phe Leu

Lys His

Cys Lys

Leu Pro

130

Leu Arg

Asp Gin 35

Tyr Ile

Gly Leu

Glu Arg

Ala Glu

100

Arg Gly 115

Leu Pro

Ile Leu

His Ile

Lys Ser

Leu Tyr

Leu Glu 85

Lys Asn

Pro Arg

Val Asp

Pro Asp

Gin Leu

Thr Glu 55

Gly Ser

Glu Asn

Trp Phe

Thr His

120

Asp Asp 135

Gly Thr 25

Gin Leu

Thr Gly

Gin Thr

His Tyr

Val Gly

105

Tyr Gly

Val Asp

Ser Ala

Gin Tyr

Pro Asn 75

Asn Thr

Leu Lys

Gin Lys

Gly Thr

Glu Ser 45

Leu Ala

Glu Glu

Tyr Ile

Lys Asn

110

Ala Ile 125

Arg Asp

Val Gly

Met Asp

Cys Leu

Ser Lys 95

Gly Ser

Leu Phe <210> 29 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGFl_M(155aa)

PL 244541 Β1 <400> 29

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys

6570

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu

100

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro

130135

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val

Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

1015

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

2530

Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Ile Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

7580

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

9095

Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr

105110

Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Asp Asp Asp

145 150 155 <210> 30 <211> 136 <212> PRT

PL 244541 Β1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGFl_M(A155aa) <400> 30

Met Ala Asn Tyr 1

His Phe Leu Arg

Arg Ser Asp Pro

Glu Val Tyr Ile

Thr Asp Gly Leu 65

Phe Leu Glu Arg

Lys His Ala Glu

100

Cys Lys Arg Gly

115

Leu Pro Leu Pro

Lys Lys Pro Lys 5

Ile Leu Pro Asp

His Ile Gin Leu

Lys Ser Thr Glu

Leu Tyr Gly Ser

Leu Glu Glu Asn 85

Lys Asn Trp Phe

Pro Arg Thr His

120

Val Asp Asp Asp

Leu Leu Tyr Cys

Gly Thr Val Asp 25

Gin Leu Ile Ala

Thr Gly Gin Tyr

Gin Thr Pro Asn

Gly Tyr Asn Thr 90

Val Gly Leu Lys

105

Tyr Gly Gin Lys

Ser Asn Gly Gly

Gly Thr Arg Asp

Glu Ser Val Gly 45

Leu Ala Met Asp

Glu Glu Cys Leu

Tyr Ile Ser Lys 95

Lys Asn Gly Ser

110

Ala Ile Leu Phe

125

130

135

PL 244541 Β1 <210> 31 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> FGF1 (l-155aa) FGF1_M(155aa) <400> 31

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys

657 0

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu

100

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys

Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

15

Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

30

Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Ile Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

7580

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

9095

Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr

105110

Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

115

120

125

PL 244541 Β1

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

130 135 140

Ile Len Phe Leu Pro Leu Pro Val Arg Ser Asp

145 150 155 <210> 32 <211> 155 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1 (22-155aa) FGF1_M(A155aa) <400> 32

Met Ala Glu Gly 1

Asn Leu Pro Pro

Asn Gly Gly His

Thr Arg Asp Arg 50

Ser Val Gly Glu 65

Ala Met Asp Thr

Glu Ile Thr Thr Phe

Gly Asn Tyr Lys Lys

Phe Leu Arg Ile Leu

Ser Asp Gin His Ile

Val Tyr Ile Lys Ser

Asp Gly Leu Leu Tyr

Thr Ala Leu Thr 10

Pro Lys Leu Leu

Pro Asp Gly Thr

Gin Leu Gin Leu

Thr Glu Thr Gly 75

Gly Ser Gin Thr 90

Glu Lys Phe

Tyr Cys Ser 30

Val Asp Gly

Ser Ala Glu

Gin Tyr Leu

Pro Asn Glu

PL 244541 Β1

Glu Cys

Ile Ser

Asn Gly

130

Ile Leu

145

Leu Phe

100

Lys Lys 115

Ser Cys

Phe Leu

Leu Glu

His Ala

Lys Arg

Pro Leu

150

Arg Leu

Glu Lys

120

Gly Pro 135

Pro Val

Glu Glu 105

Asn Trp

Arg Thr

Ala Ser

Asn His

Phe Val

His Tyr

140

Asp

155

Tyr Asn

110

Gly Leu 125

Gly Gin

Thr Tyr

Lys Lys

Lys Ala <210> 33 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1 (22-155aa) FGF1_M(A155aa) <400> 33

Met

Ala

Asn

Tyr

Lys

Pro

Lys

Leu

Tyr

Cys

Ser

Asn Gly

Gly

1

5

10

15

His

Phe

Leu

Arg

Ile

Leu

Pro

Asp

Gly

Thr

Val

Asp

Gly

Thr Arg

Asp

20

25

30

Arg

Ser

Asp

Gin

His

Ile

Gin

Leu

Gin

Leu

Ser

Ala

Glu

Ser Val

Gly

PL 244541 Β1

Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu

55

Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser

70

Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn

Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe

100

Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His

115120

Leu Pro Leu Pro Val Arg Ser Asp

130135

Thr Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp

Gin Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu

7530

His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys

9095

Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser

105110

Tyr Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe

125 <210> 34 <211> 136 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1 (22-155aa) FGF1_M(hl55aa) <400> 34

Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly

10 15

His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp

PL 244541 Β1

Arg Ser Asp Gin His 35

Glu Val Tyr Ile Lys

Thr Asp Gly Leu Leu 65

Phe Leu Glu Arg Leu

Lys His Ala Glu Lys

100

Cys Lys Arg Gly Pro

115

Leu Pro Leu Pro Val

130

Ile Gin Leu Gin Leu Ser

Ser Thr Glu Thr Gly Gin

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro

75

Glu Glu Asn His Tyr Asn

Asn Trp Phe Val Gly Leu

105

Arg Thr His Tyr Gly Gin

120

Ala Ser Asp

135

Ala Glu Ser Val Gly 45

Tyr Leu Ala Met Asp 60

Asn Glu Glu Cys Leu

Thr Tyr Ile Ser Lys

Lys Lys Asn Gly Ser

110

Lys Ala Ile Leu Phe

125 <210> 35 <211> 322 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1 (l-155aa) FGF1 DIMER(155aa) <400> 35

PL 244541 Β1

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys

2025

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His Ile

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser

6570

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu

100105

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg

130135

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Arg

145150

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

165

Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe Asn

180185

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly

Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

15

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

80

Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

95

Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr

110

Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser

155 160

Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

170 175

Leu Pro Pro Asn Tyr Lys Lys

190

Gly His Phe Leu Arg Ile Leu

195

200

205

PL 244541 Β1 <400> 36

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys

2025

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His Ile

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser

6570

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu

100105

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg

130135

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ala

145150

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

165

Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe Asn

180185

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly

Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

15

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

80

Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

95

Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr

110

Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser

155 160

Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

170 175

Leu Pro Pro Asn Tyr Lys Lys

190

Gly His Phe Leu Arg Ile Leu

195

200

205

PL 244541 Β1 <400> 36

Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe

Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys

2025

Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu

3540

Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His Ile

5055

Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser

6570

Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr

Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu

100105

Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn

115120

Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg

130135

Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ala

145150

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

165

Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe Asn

180185

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly

Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe

15

Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser

Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly

Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu

Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu

80

Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu

95

Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr

110

Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys

125

Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala

140

Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser

155 160

Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr

170 175

Leu Pro Pro Asn Tyr Lys Lys

190

Gly His Phe Leu Arg Ile Leu

195

200

205

PL 244541 Β1

Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr

210 215

Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu Ser

225 230

Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu Ala

245

Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu Glu

260

Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile

275280

Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn

290295

Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala Ile

305310

Ser Asp

Arg Asp Arg Ser Asp Gin His Ile

220

Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser

235240

Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr

250255

Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu

265270

Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn

285

Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg

300

Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ala

315 320 <210> 37 <211> 285 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1 (22-155aa) FGF1 DIMER(A155aa)

PL 244541 Β1 <400> 37

Met Ala Asn Tyr

His Phe Leu Arg

Arg Ser Asp Gin

Glu Val Tyr Ile

Thr Asp Gly Leu

Phe Leu Glu Arg

Lys His Ala Glu Lys

100

Cys Lys Arg Gly Pro 115

Leu Pro Leu Pro Val

130

Gly Ser Gly Gly Gly 145

Cys Ser Asn Gly Gly

165

Asp Gly Thr Arg Asp

Lys Lys Pro Lys

Ile Leu Pro Asp

His Ile Gin Leu

Lys Ser Thr Glu

Leu Tyr Gly Ser

Leu Glu Glu Asn

Asn Trp Phe

Arg Thr His

120

Arg Ser Asp Gly Gly Gly

135

Gly Ala Asn Tyr Lys Lys

150 155

His Phe Leu Arg Ile Leu

170

Arg Ser Asp Gin His Ile

Leu Leu Tyr Cys

Gly Thr Val Asp

Gin Leu Ser Ala

Thr Gly Gin Tyr

Gin Thr Pro Asn

His Tyr Asn Thr

Val Gly Leu Lys

105

Tyr Gly Gin Lys

Ser Asn Gly Gly

Gly Thr Arg Asp

Glu Ser Val Gly 45

Leu Ala Met Asp

Glu Glu Cys Leu

Tyr Ile Ser Lys

Lys Asn Gly Ser 110

Ala Ile Leu Phe

125

Gly Ser Gly Gly Gly

140

Pro Lys Leu Leu Tyr

160

Pro Asp Gly Thr Val

175

Gin Leu Gin Leu Ser

180

185

190

PL 244541 Β1

Ala Glu Ser Val Gly

195

Tyr Leu Ala Met Asp

210

Asn Glu Glu Cys Leu

225

Thr Tyr Ile Ser Lys

245

Lys Lys Asn Gly Ser

260

Lys Ala Ile Leu Phe

275

Glu Val Tyr Ile Lys

200

Thr Asp Gly Leu Leu

215

Phe Leu Glu Arg Leu

230

Lys His Ala Glu Lys

250

Cys Lys Arg Gly Pro

265

Leu Pro Leu Pro Val

280

Ser Thr Glu Thr Gly Gin

205

Tyr Gly Ser Gin Thr Pro

220

Glu Glu Asn His Tyr Asn

235 240

Asn Trp Phe Val Gly Leu

255

Arg Thr His Tyr Gly Gin

270

Arg Ser Asp

285 <210> 38 <211> 285 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> FGF1 (22-155aa) FGF1_DIMER (A155aa) <400> 38

Met

Ala

Asn Tyr

Lys

Pro

Lys

Leu

Tyr

Cys

Ser

Asn

Gly

1

5

10

15

His

Phe

Leu Arg

Ile

Leu

Pro

Asp

Gly

Thr

Val

Asp

Gly

Thr

Arg

Asp

PL 244541 Β1

Arg Ser Asp Gin His Ile Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly

4045

Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp

5560

Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu Glu CysLeu

70 7580

Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile SerLys

9095

Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser

100 105110

Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala Ile Leu Phe

115 120125

Leu Pro Leu Pro Val Ala Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu LeuTyr

145 150 155160

Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly ThrVal

165 170175

Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His Ile Gin Leu Gin Leu Ser

180 185190

Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin

195 200205

Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro

210 215220

Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn

225

230

235

240

PL 244541 Β1

Thr Tyr Ile Ser

Lys Lys Asn Gly

260

Lys Ala Ile Leu

275

Lys Lys His Ala

245

Ser Cys Lys Arg

Phe Leu Pro Leu

280

Glu Lys Asn Trp

250

Gly Pro Arg Thr

265

Pro Val Ala Ser

Phe Val Gly Leu

255

His Tyr Gly Gin

270

Asp

285

Claims

1. Muteina ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności, znamienna tym, że zawiera dwie mutacje punktowe: w pozycji aminokwasowej S114 oraz w pozycji aminokwasowej L150, przy czym numeracja pozycji aminokwasowych oparta jest na pełnej długości sekwencji białka FGF-1 dzikiego typu jak przedstawiono w Sekwencji nr 1, przy czym mutację punktową w pozycji S114 stanowi mutacja S114A, zaś mutację punktową w pozycji L150 stanowi mutacja L150D.

2. Muteina FGF-1 według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto zawiera co najmniej jedną mutację stabilizującą w pozycji aminokwasowej wybranej spośród: Q55, S62 i H108.

3. Muteina FGF-1 według zastrz. 2, znamienna tym, że co najmniej jedną mutację stabilizującą w pozycji aminokwasowej Q55, S62 lub H108 stanowi mutacja punktowa wybrana odpowiednio spośród: Q55P, S62I i H108G.

4. Muteina FGF-1 według dowolnego z zastrz. 1 do 3, znamienna tym, że zawiera trzy mutacje stabilizujące: Q55P, S62I i H108G.

5. Muteina FGF-1 według zastrz. 4, znamienna tym, że ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 10.

6. Muteina FGF-1 według dowolnego z zastrz. 1 do 5, znamienna tym, że dodatkowo zawiera N-końcową delecję co najmniej 19 kolejnych aminokwasów białka FGF-1 pełnej długości.

7. Muteina FGF-1 według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera N-końcową delecję aminokwasów E3 do G21 białka FGF-1 pełnej długości.

8. Muteina FGF-1 według dowolnego z zastrz. 1 do 7, znamienna tym, że zawiera mutację punktową S114A, mutację punktową L150D i N-końcową delecję aminokwasów E3 do G21 białka FGF-1 pełnej długości.

9. Muteina FGF-1 według dowolnego z zastrz. 8, znamienna tym, że ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 18.

10. Dimer mutein ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności jak określono w dowolnym z zastrz. 1 do 9.

11. Dimer według zastrz. 10, znamienny tym, że stanowi homodimer.

12. Dimer według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że muteiny tworzące dimer połączone są łącznikiem, korzystnie łącznikiem aminokwasowym.

13. Dimer według zastrz. 12, znamienny tym, że łącznik stanowi sekwencja aminokwasowa GGGGSGGGGSGGGG.

14. Dimer według zastrz. 13, znamienny tym, że ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 21.

15. Dimer według zastrz. 13, znamienny tym, że ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 22.

16. Muteina ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności jak określono w dowolnym z zastrz. 1 do 9 do zastosowania w obniżaniu poziomu glukozy we krwi.

17. Muteina ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności jak określono w dowolnym z zastrz. 1 do 9 do zastosowania w leczeniu cukrzycy, w szczególności cukrzycy typu 2.

18. Muteina FGF-1 do zastosowania według zastrz. 16 albo 17, znamienna tym, że ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 10.

19. Muteina FGF-1 do zastosowania według zastrz. 16 albo 17, znamienna tym, że ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 18.

20. Dimer zmutowanych białek ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF-1) o obniżonej mitogenności jak określono w dowolnym z zastrz. 10 do 15 do zastosowania w obniżaniu poziomu glukozy we krwi.

21. Dimer zmutowanych białek ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-1) o obniżonej mitogenności jak określono w dowolnym z zastrz. 10 do 15 do zastosowania w leczeniu cukrzycy, w szczególności cukrzycy typu 2.

22. Dimer zmutowanych białek FGF-1 do zastosowania według zastrz. 20 albo 21, znamienny tym, że ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 21.

23. Dimer zmutowanych białek FGF-1 do zastosowania według zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, że ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Sekwencji nr 22.