PL243777B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego, kaseta ekspresyjna, wektor ekspresyjny, komórka eukariotycznego gospodarza i zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego w terapii chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń typu CAG - Google Patents
Cząsteczka kwasu nukleinowego, kaseta ekspresyjna, wektor ekspresyjny, komórka eukariotycznego gospodarza i zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego w terapii chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń typu CAG Download PDFInfo
- Publication number
- PL243777B1 PL243777B1 PL422094A PL42209413A PL243777B1 PL 243777 B1 PL243777 B1 PL 243777B1 PL 422094 A PL422094 A PL 422094A PL 42209413 A PL42209413 A PL 42209413A PL 243777 B1 PL243777 B1 PL 243777B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- molecule
- cag
- expression
- rna
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 title abstract description 24
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 title abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 24
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title abstract description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title abstract description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 13
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 22
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 14
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 13
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 10
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims description 9
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 4
- 208000002569 Machado-Joseph Disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000036834 Spinocerebellar ataxia type 3 Diseases 0.000 claims description 4
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 3
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 18
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 58
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 40
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 22
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 18
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 14
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 13
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 12
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 8
- 102000007371 Ataxin-3 Human genes 0.000 description 8
- 108010032947 Ataxin-3 Proteins 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 101150043003 Htt gene Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 5
- 208000009415 Spinocerebellar Ataxias Diseases 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 108010032963 Ataxin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000007372 Ataxin-1 Human genes 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010032951 Ataxin2 Proteins 0.000 description 2
- 102000007370 Ataxin2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000806 Atrophin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004321 Atrophin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100028115 Forkhead box protein P2 Human genes 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 101001059881 Homo sapiens Forkhead box protein P2 Proteins 0.000 description 2
- 102000016252 Huntingtin Human genes 0.000 description 2
- 108050004784 Huntingtin Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 2
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 2
- 239000012163 TRI reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 2
- 238000012898 one-sample t-test Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 2
- 125000002223 uridyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031854 60S ribosomal protein L14 Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 102000014461 Ataxins Human genes 0.000 description 1
- 108010078286 Ataxins Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010008025 Cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 101100118093 Drosophila melanogaster eEF1alpha2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034174 Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000704267 Homo sapiens 60S ribosomal protein L14 Proteins 0.000 description 1
- 101000926508 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001039207 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102100040705 Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 Human genes 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710156592 Putative TATA-binding protein pB263R Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 101710145783 TATA-box-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 201000004562 autosomal dominant cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003591 cerebellar nuclei Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001905 globus pallidus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 108091007426 microRNA precursor Proteins 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001743 silencing effect Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Przedmiotami wynalazku są Cząsteczka kwasu nukleinowego, kaseta ekspresyjna, wektor ekspresyjny, komórka eukariotycznego gospodarza, transgeniczny ssak, sposób indukowania interferencji RNA w eukariotycznym gospodarzu i zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego w terapii chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń typu CAG. Rozwiązanie dotyczy nowej koncepcji leczenia dziedzicznych chorób neurologicznych człowieka wywoływanych ekspansją powtórzeń trójnukleotydowych typu CAG, z wykorzystaniem technologii interferencji RNA.
Description
Przedmiotami wynalazku są cząsteczka kwasu nukleinowego, kaseta ekspresyjna, wektor ekspresyjny, komórka eukariotycznego gospodarza i zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego do wytwarzania leku do leczenia chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń typu CAG. Rozwiązanie dotyczy nowej koncepcji leczenia dziedzicznych chorób neurologicznych człowieka wywoływanych ekspansją powtórzeń trójnukleotydowych typu CAG, z wykorzystaniem technologii interferencji RNA.
Przeważająca część ludzkiego genomu składa się z sekwencji powtarzających się różnego typu. Elementy te występują zarówno w sekwencjach kodujących, w niekodujących regionach genów, jak i w obszarach pozagenowych. Ekspansja niestabilnych ciągów powtórzeń trójnukleotydowych w pojedynczych genach jest przyczyną ponad 20 różnych chorób dziedzicznych, znanych pod wspólną angielską nazwą Triplet Repeat Expansion Diseases (TREDs). Są to choroby neurodegeneracyjne, jak dotąd nieuleczalne.
Większość genów związanych z TREDs zawiera powtórzenia trypletu CAG w regionie kodującym, a wywołująca chorobę liczba powtórzeń mieści się najczęściej w zakresie od około 40 do 100. Przykładami takich chorób jest choroba Huntingtona (HD) oraz szereg ataksji rdzeniowo-móżdżkowych, np. ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu 3 (SCA3). W wyniku translacji zmutowanego transkryptu powstaje białko zawierające toksyczny ciąg poliglutaminowy, zmieniający prawidłową funkcję białka. Wydłużone ciągi powtórzeń CAG mogą również aktywować mechanizmy patogenezy na poziomie RNA, w tym konfiskowanie specyficznych białek przez zmutowane transkrypty.
Większość chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń jest warunkowana w sposób autosomalny dominujący. Każda komórka zawiera zarówno wariant normalny genu jak i zmutowany. Produkty zmutowanego genu, transkrypt i białko są toksyczne dla komórki, zatem ich usunięcie powinno przeciwdziałać chorobie. Białko normalne jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania komórki zatem strategie terapeutyczne powinny polegać na allelo-selektywnej eliminacji wariantu zmutowanego. Efekt ten można osiągnąć poprzez celowanie reagentami terapeutycznymi w regiony rozróżniające oba allele genu, polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) lub regiony powtórzeń (STR). Opublikowane dotychczas sposoby eliminacji zmutowanego transkryptu i białka wykorzystują głównie oligonukleotydy antysensowe oraz reagenty technologii interferencji RNA typu siRNA (krótkie interferujące RNA).
Interferencja RNA (RNAi) jest naturalnym procesem komórkowym uczestniczącym w regulacji ekspresji genów, a także mechanizmem obrony przed wirusami oraz ruchomymi elementami genomu. Podstawą interferencji RNA jest udział krótkich dwuniciowych cząsteczek RNA (dsRNA), długości od 20 do 30 nukleotydów, w selektywnym wyciszaniu ekspresji genów. Cząsteczki te, posiadają sekwencje komplementarne do sekwencji w obrębie mRNA, a w wyniku oddziaływania z nimi, dochodzi w zależności od stopnia komplementarności, do degradacji transkryptu bądź inhibicji translacji. dsRNA uczestniczące w szlaku interferencji RNA powstają w komórce w wyniku obróbki dłuższych cząsteczek prekursorowych, posiadających strukturę typu spinki do włosów, przez endogenną maszynerię enzymatyczną. Technologia RNAi wykorzystuje syntetyczne reagenty typu siRNA (ang. short interfering RNA), reagenty wektorowe typu shRNA (ang. short hairpin RNA, reagenty naśladujące prekursory mikroRNA) czy sh-miR (reagenty naśladujące pierwotne transkrypty mikroRNA). Nić działająca dupleksu siRNA nazywana jest nicią wiodąca (ang. guide strand), natomiast nić komplementarna do niej nicią pasażerską (ang. passenger strand). Zastosowanie odpowiednich wektorów oraz promotorów daje możliwość regulacji ekspresji interferujących RNA typu shRNA i sh-miR, selektywnego dostarczania ich do tkanek docelowych i przede wszystkim długotrwałego efektu wyciszania.
W publikacjach Yu D. et al. [1] oraz Lima WF. et al. [2] wykazano allelo-selektywne wyciszenie zmutowanego genu HTT odpowiedzialnego za chorobę Huntingtona stosując chemicznie modyfikowane oligonukleotydy, celujące w zmutowany ciąg CAG. W publikacjach Hu et al. [3,4] zastosowano krótkie, syntetyczne dupleksy RNA do selektywnej inhibicji zmutowanej huntingtyny przy udziale mechanizmu interferencji RNA.
W zgłoszeniu patentowym WO 2010/014592 (opublikowanym 2010-02-04) opisano metodę selektywnej inhibicji ekspresji białka zawierającego wydłużony ciąg poliglutaminowy z użyciem chemicznie modyfikowanych oligonukleotydów. Opisane analogi kwasów nukleinowych są długości 7-30 zasad i są nacelowane na wydłużony ciąg powtórzeń CAG zmutowanego transkryptu. Zgłoszenie w szczególności dotyczy oligomerów PNA i LNA oraz ich potencjalnego użycia w inhibicji translacji następujących białek związanych z chorobami poliglutaminowymi: huntingtyny, ataksyny-3, ataksyny-1, ataksyny-2 i atrofiny 1.
Zgłoszenie patentowe WO 2011/097641 (opublikowane 2011-08-11) obejmuje chemicznie modyfikowane oligonukleotydy, długości 13-22 zasad i o sekwencji w pełni komplementarnej do regionu powtórzeń CAG. Ujęte w zgłoszeniu cząsteczki mogą mieć modyfikowane wiązanie internukleozydowe lub część cukrową. Obejmuje to możliwość zastosowania szeregu podstawników w dowolnych pozycjach, a w szczególności obejmuje modyfikacje LNA, Cet, ENA, MOE. Ich użycie jest zastrzeżone dla wszystkich chorób poliglutaminowych.
W zgłoszeniu patentowym WO 2011/097388 (opublikowanym 2011-08-11) opisano użycie dwuniciowego RNA do selektywnej inhibicji ekspresji białka zawierającego ciąg poliglutaminowy. Ujęte w zgłoszeniu cząsteczki to dwuniciowe RNA długości 15-30 zasad celujące w wydłużony ciąg powtórzeń CAG. Sekwencja oligonukleotydów jest znamienna tym, że zawiera nie więcej niż jedną substytucję w sekwencji seed oraz od 1 do 5 dowolnie ulokowanych substytucji w pozostałym regionie cząsteczki. Ujęty zgłoszeniem dwuniciowy RNA może zawierać jedną lub więcej modyfikowaną chemicznie zasadę. Zgłoszenie dotyczy potencjalnego użycia tych cząsteczek w inhibicji translacji następujących białek związanych z chorobami poliglutaminowymi: huntingtyny, ataksyny-3, ataksyny-1, ataksyny-2 i atrofiny 1. Zgłoszenie obejmuje stosowanie opisanych cząsteczek do inhibicji poliglutaminowych białek w komórkach oraz różnych metod ich podawania in vivo.
Zgłoszenie patentowe WO 2013/033223 (opublikowane 2013-03-07) dotyczy metody zastosowania pojedynczoniciowych oligonukleotydów o sekwencji komplementarnej do wydłużonego regionu powtórzeń trójnukleotydowych (CAG, CUG, CGG, GCC i GAA). Ujęte zgłoszeniem oligonukleotydy mogą być długości 13-30 zasad oraz zawierać szereg chemicznych modyfikacji (stabilizujących grupę fosforanową 5’-końcowego nukleotydu, podstawników w wiązaniu internukleozydowym oraz części cukrowej). Dodatkowo oligonukleotyd może zawierać od 1 do 5 substytucji w sekwencji, które powodują tworzenie niekanonicznych par zasad w oddziaływaniu z sekwencją docelową ciągu powtórzeń. Wskazane jest wykazywanie co najmniej 5-krotnej selektywności w wyciszaniu ekspresji allelu zmutowanego, w porównaniu do allelu normalnego. Użycie opisanych oligonukleotydów jest zastrzeżone zarówno dla hodowli komórkowych, modeli zwierzęcych jak i pacjentów.
W zgłoszeniach patentowych US2005255086 (opublikowanym 2005-11-17), WO2006031267 (opublikowanym 2006-03-23) przedstawiona została metoda wykorzystująca RNA i in vivo w terapii chorób neurodegeneracyjnych dominujących. Rozwiązanie dotyczy krótkich interferujących RNA skierowanych przeciwko genowi choroby Huntingtona i ataksji rdzeniowo-móźdżkowej typu 1 (SCA1), sposoby wykorzystania i systemy wektorowe dla tych cząsteczek.
W zgłoszeniach patentowych W O2004047872 (opublikowanym 2004-06-10), EP2145628 (opublikowanym 2012-03-21) opisano sposób leczenia chorób neurodegeneracyjnych poprzez domózgowe dostarczenie siRNA. W rozwiązaniu przedstawiono metodę, krótkie interferujące RNA oraz procedurę leczenia chorób neurodegeneracyjnych obejmującą etapy chirurgicznego wszczepienia cewnika, tak by jego część uwalniająca ułożona była przylegle do określonego obszaru infuzji w mózgu, i uwalniała poprzez część emitującą cewnika określoną dawkę przynajmniej jednej substancji zdolnej do hamowania wytwarzania przynajmniej jednego białka neurodegeneracyjnego. Niniejszy wynalazek opisuje również wektory kodujące krótkie interferujące RNA oraz sposoby leczenia chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona, Huntingtona, ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 1, 2 i 3 i/lub DRPLA (zanik jądra zębatego, czerwiennego, gałki bladej oraz jądra Luysa).
W zgłoszeniach patentowych US2006270623 (opublikowanym 2006-11-30), US2005277133 (opublikowanym 2005-12-15) opisano oparty o zjawisko RNAi sposób leczenia chorób związanych z ekspansją powtórzeń poliglutaminowych z wykorzystaniem krótkiego interferującego kwasu nukleinowego (siNA). Rozwiązanie to dotyczy związków, ich składu, sposobów badań, diagnozy, leczenia chorób oraz uwarunkowań związanych z różnymi wariantami allelicznymi powtórzeń poliglutaminowych, odpowiadających za modulację ekspresji genu i/lub ich aktywności. W szczególności rozwiązanie to dotyczy cząsteczek krótkich kwasów nukleinowych, takich jak krótkie interferuj ące kwasy nukleinowe (siNA), krótkie interferujące RNA (siRNA), dwuniciowe RNA (dsRNA), mikro-RNA (miRNA) i krótkie spinki RNA (shRNA), cząsteczek zdolnych do pośredniczenia w procesie interferencji RNA nakierowanym na ekspresję genów związanych z chorobami lub alleli kodujących sekwencje poliQ.
W zgłoszeniu patentowym WO2012109667 (opublikowanym 2012-18-16), opisano sposób wprowadzania terapeutycznych reagentów RNAi do komórek dotkniętych patogenezą w chorobie Huntingtona. Szczegółowo opisano sposób konstrukcji kaset ekspresyjnych służących do uwalniania terapeutycznych cząsteczek siRNA z możliwością wprowadzania ich do komórek w postaci wektorów wirusowych. W opisanym podejściu do konstrukcji kaset ekspresyjnych wykorzystano sekwencje naturalnych prekursorów miRNA zapewniających zmniejszenie toksyczności uwalnianych z nich cząsteczek siRNA poprzez obniżenie zdolności wywoływania zależnych od sekwencji efektów ubocznych (ang. off-target effect).
W zgłoszeniach patentowych US2013065298 (opublikowanym 2013-03-14), US2004241854 (opublikowanym 2004-12-02), US2011244561 (opublikowanym 2011-10-06), US8329890 (opublikowanym 2012-12-11) opisano oparty na zjawisku RNAi sposób allelo-selektywnego wyciszania ekspresji zmutowanych wariantów genów będących przyczyną grupy chorób dziedziczonych w sposób dominujący, w tym choroby Huntingtona oraz szeregu ataksji rdzeniowo-móżdżkowych. Opisany wynalazek zakłada wykorzystanie reagentów w postaci siRNA, shRNA lub miRNA celujących w region mRNA oddalony od ciągu powtórzeń trójnukleotydowych, a zawierający polimorficzne nukleotydy (ang. Single Nucleotide Polymorphism - SNP) umożliwiające rozróżnienie allelu zmutowanego od normalnego a następnie preferencyjne wyciszanie jego ekspresji.
W zgłoszeniach patentowych US2011212520 (opublikowanym 2011-09-01) oraz US2008274989 (opublikowanym 2008-11-06) opisano sposób zastosowania reagentów RNAi do terapii chorób neurodegeneracyjnych in vivo. Zgłoszenia te, zawierają opis sposobu zastosowania reagentów RNAi w celu zapobiegania akumulacji zmutowanych białek: huntingtyny oraz ataksyny-1. Rozwiązanie to dotyczy również wprowadzania cząsteczek terapeutycznych, zarówno w postaci RNA jak i wektorów genetycznych (w tym wirusowych -AAV), do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego, w których obserwowane są zmiany chorobowe.
W zgłoszeniu patentowym US2008/0015158 A1 (opublikowanym 2008-01-17) opisano metodę inhibicji ekspresji genu HTT przy użyciu inhibitorów dsRNA, celujących w sekwencję specyficzną genu HTT, znajdującą się tuż przed ciągiem powtórzeń CAG.
Pomimo istniejących do tej pory rozwiązań opisujących sposoby zastosowania reagentów RNAi w terapii chorób neurodegeneracyjnych istnieje ciągła potrzeba dostarczenia rozwiązania dającego możliwość allelo-selektywnego wyciszania genów, zawierających zmutowane ciągi CAG przy zastosowaniu reagentów wektorowych, celujących bezpośrednio w region powtórzeń.
Celem niniejszego wynalazku jest uzyskanie selektywnego wyciszania ekspresji zmutowanych genów, występujących w chorobach poliglutaminowych poprzez celowanie w region powtórzeń CAG w transkryptach (uniwersalny charakter rozwiązania) przy pomocy reagentów wektorowych technologii interferencji RNA (długotrwały efekt terapeutyczny). Rozwiązanie według wynalazku obejmuje inhibitory typu shRNA (krótkie spinki RNA) oraz sh-miR (ang. artificial miRNA), przypominające strukturą cząsteczki prekursorowe miRNA (odpowiednio pre-miRNA oraz pri-miRNA), z których w wyniku komórkowej biogenezy uwalniana jest pula heterogennych interferujących RNA, inhibujących ekspresję zmutowanych genów, takich jak HTT i ATXN3.
Nieoczekiwanie okazało się, że rozwiązanie według wynalazku dotyczy nowej koncepcji leczenia dziedzicznych chorób neurologicznych człowieka wywoływanych ekspansją powtórzeń trójnukleotydowych typu CAG, z wykorzystaniem technologii interferencji RNA.
Komórkowa biogeneza interferujących RNA typu shRNA i sh-miR obejmuje m.in. transkrypcję przy pomocy polimerazy RNA II lub III i powstawanie cząsteczek o strukturze spinki do włosów. Struktury te są docinane w komórkach przez endogenne białka kompleksu. Mikroprocesora (dotyczy reagentów typu sh-miR), transportowane z jądra do cytoplazmy i docinane przez nukleazę Dicer (dotyczy reagentów typu shRNA, sh-miR) do puli krótkich dupleksów RNA o długości ok. 21-23 par zasad. W następnym etapie krótkie dupleksy RNA są wiązane przez specyficzne białka, a jedna z nici dupleksu (nić wiodąca) służy do rozpoznania sekwencji w docelowym transkrypcje.
Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego, złożona z dupleksu i pętli, w której jedna z nici dupleksu - nić wiodąca zawiera sekwencję określoną sekwencją SEQ. ID No. 2, a druga z nici dupleksu - nić pasażerska jest do niej komplementarna przynajmniej w 80%, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego tworzy w komórce strukturę typu spinki.
Korzystnie, gdy region dupleksu ma 19-30 par zasad długości.
Korzystnie, gdy pierwsza i druga nić dupleksu są połączone za pomocą pętli o długości od 4 do 15 nt.
Korzystnie, gdy pętla określona jest sekwencją SEQ. ID No. 23.
Korzystnie, gdy cząsteczka zawiera w nici wiodącej modyfikowane powtórzenia typu CUG, zawierające 1,2, 3 lub 4 substytucje powodujące powstawanie niekanonicznych par zasad w oddziaływaniu z celowaną sekwencją CAG w transkryptach.
Korzystnie, gdy cząsteczka zawiera sekwencje oskrzydlające 5’ i 3’ pochodzące od naturalnego miRNA, przy czym naturalnej długości sekwencje flankujące prekursora są skrócone lub nie.
Korzystnie, gdy cząsteczka zawiera sekwencję pętli pochodzącą od naturalnego miRNA.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kaseta ekspresyjna zawierająca regulowany lub konstytutywny promotor, charakteryzująca się tym, że jest on powiązany funkcjonalnie z sekwencją kodującą kwas nukleinowy określony powyżej.
Korzystnie, gdy promotorem jest promotor polII albo polIII RNA.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny charakteryzujący się tym, że zawiera kasetę ekspresyjną określoną powyżej.
Korzystnie, gdy stanowi wektor adenowirusowy, lentiwirusowy, adeno-associated (AAV), poliowirus lub HSV.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka eukariotycznego gospodarza charakteryzująca się tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego określonego powyżej.
Korzystnie, gdy komórka zawiera kasetę ekspresyjną określoną powyżej.
Korzystnie, gdy komórka zawiera wektor ekspresyjny określony powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego określonej zastrzeżeniami powyżej, kasety ekspresyjnej określonej powyżej, wektora określonego powyżej lub komórek określonych powyżej do wytwarzania leku do leczenia chorób neurologicznych wywoływanych ekspansją powtórzeń trójnukleotydowych CAG.
Korzystnie, gdy zastosowanie jest w terapii chorób neurodegeneracyjnych człowieka, takich jak choroba Huntingtona i ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu 3, wywoływanych przez mutacje trypletu CAG w pojedynczych genach.
Opisano tu także transgenicznego ssaka zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną powyżej, kasetę ekspresyjną określoną powyżej, wektor określony powyżej.
Opisano tu także sposób indukowania interferencji RNA w eukariotycznym gospodarzu, charakteryzujący się tym, że obejmuje dostarczanie do obiektu badań efektywnej dawki cząsteczki kwasu nukleinowego określonego powyżej, kasety ekspresyjnej określonej powyżej, wektora określonego powyżej.
W celu lepszego zobrazowania wynalazku na rysunku:
Figura 1 przedstawia przykłady sekwencji i struktury interferujących RNA typu shRNA i sh-miR.
Interferujące RNA powstają w komórkach w wyniku transkrypcji. Tworzą one strukturę typu spinki, z dwuniciowym trzonem i pętlą. Interferujące RNA typu shRNA zawierają na końcu 3’ kilka reszt urydylowych a sekwencja nici wiodącej rozpoznającej sekwencję docelową (kolor czerwony) jest umieszczona preferencyjnie w ramieniu 3’ trzonu spinki. Interferujące RNA typu sh-miR zawierają dodatkowo pętlę i sekwencje oskrzydlające 5’ i 3’ naturalnego prekursora mikroRNA.
Figura 2 przedstawia obróbkę interferujących RNA w komórkach HEK293 przez RNazę Dicer. Cząsteczki interferujących RNA nacelowane na zmutowane ciągi CAG w transkryptach są wprowadzane do komórek w postaci kaset ekspresyjnych, zawierających obok sekwencji kodującej shRNA czy sh-miR również sekwencję genów reporterowych, takich jak copGFP i GFP. Metodą wysokorozdzielczej hybrydyzacji typu northern potwierdzono powstawanie transkryptów w komórkach (pre-) oraz ich docinanie przez RNazę Dicer do puli krótkich dupleksów RNA (siRNA). Zarówno powstający transkrypt jak i krótkie dupleksy siRNA są heterogenne. M1 i M2 oznaczają markery długości RNA; siA2 - syntetyczny siRNA transfekowany do komórek.
Figura 3 przedstawia allelo-selektywne wyciszanie białka huntingtyny i ataksyny 3 (Western blot) oraz transkryptu genu HTT (RT-PCR) przez interferujące RNA typu shRNA.
A) Ludzkie fibroblasty wyprowadzone od pacjenta z chorobą Huntingtona (17/68 CAG) były transdukowane wektorami lentiwirusowymi kodującymi interferujące RNA typu shRNA. Komórki były infekowane ilością MOI 10 wirusa (multiplicity of infection) i badane 7 dni po infekcji. shLuc - kontrola negatywna, shRNA celujący w gen Luc; sh2.4 - kontrola pozytywna, shRNA celujące w sekwencję specyficzną genu HTT; intensywności sygnałów pochodzących od białka huntingtyny zostały znormalizowane do poziomu białka pektyny i kontroli shLuc, do porównań zastosowano analizy statystyczne (one-sample t-test). Słupki błędu przedstawiają odchylenie standardowe. Wartości (p-value) istotne statystycznie zaznaczono gwiazdką.
B) Ludzkie fibroblasty wyprowadzone od pacjenta z ataksją rdzeniowo-móżdżkową typu 3 (18/69 CAG) były transdukowane wektorami lentiwirusowymi kodującymi interferujące RNA typu shRNA (shA2R i shA2R1). Komórki były infekowane dwoma stężeniami wirusa (MOI 1 i 10) i badane 7 dni po infekcji. shLuc - kontrola negatywna, shRNA celujący w gen Luc; K - komórki nie transdukowane wirusem. GAPDH - białko referencyjne
Figura 4 przedstawia analizę selektywności wyciszania interferujących RNA tworzących niesparowania z sekwencją docelową CAG.
a) Analiza Western blot poziomu białek ATXN3, TBP, FOXP2, EIF2AK3, RPL14 i LRP8 w fibroblastach HD 72 h po transfekcji 50 nM dupleksami RNA złożonymi z modyfikowanych powtórzeń CUG, tworzących niesparowania z sekwencją docelową CAG (reagenty referencyjne: d7, P9b i W13/16). Sekwencje nukleotydowe ciągów powtórzeń w genach kodujących analizowane białka obejmują: ciąg w TBP (CAG)3(CAA)3(CAG)9(CAA)(CAG)(CAA)(CAG)20 i FOXP2:(CAG)4(CAA) (CAG)4(CAA)2(CAG)2(CAA)2(CAG)3(CAA)5(CAG)2(CAA)2(CAG)5(CAA)(CAG)5.
C - wartość referencyjna oznaczająca poziom ekspresji w komórkach transfekowanych kontrolnym siRNA. Intensywności sygnałów zostały znormalizowane do poziomu białka referencyjnego GAPDH i porównane testem statystycznym (one-sample t-test). Słupki błędu przedstawiają odchylenie standardowe. Wartość istotne statystycznie zaznaczono gwiazdką (* p < 0.05).
b) w porównaniu do niemodyfikowanych cząsteczek CAG/CUG, modyfikacje ciągu powtórzeń CAG w nici pasażerskiej interferujących RNA, zmniejszyły możliwość ich wiązania się i niespecyficznego działania w ścieżce RNAi na transkrypty CUG; mfe - energia wiązania nici dupleksu (minimum free energy).
W celu lepszego zrozumienia poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania według wynalazku.
Przykłady
Interferujące RNA typu shRNA i sh-miR zawierające modyfikowane sekwencje CAG/CUG w strukturze trzonu spinki są substratami dla RNazy Dicer.
Aby określić, czy interferujące RNA podlegają obróbce w komórkach przez białka szlaku RNAi, komórki HEK293 transfekowano wektorami ekspresyjnymi, kodującymi cząsteczki shRNA i sh-miR (Figura 2). Po 24 h wyizolowano całkowity RNA, rozdzielono go w żelu poliakryloamidowym i przeprowadzono hybrydyzację z sondą w celu wizualizacji transkryptów i produktów ich docinania (analiza northern blot). Stwierdzono, że powstające w komórkach interferujące RNA są docinane przez RNazę Dicer do puli krótkich heterogennych cząsteczek siRNA. Co więcej, powstające spod promotora polimerazy III RNA - H1 cząsteczki shRNA są heterogenne już na etapie transkryptu (oznaczone jako pre-), co wynika głównie z obecności różnej długości reszt urydylowych na końcu 3’.
Interferujące RNA typu shRNA wyciszają allelo-selektywnie zmutowane białka huntingtynę i ataksynę 3.
W celu sprawdzenia efektywności działania interferujących RNA typu shRNA, tworzących selektywne niesparowania z sekwencją docelową CAG skonstruowano wektory lentiwirusowe, kodujące cząsteczki shA2R i shA2R1 (zawierające sekwencje ID. NO.1 i ID. NO.2 z Tabeli). Ludzkie fibroblasty wyprowadzone od pacjentów z chorobą Huntingtona i ataksją rdzeniowo-móżdżkową typu 3 były transdukowane lentiwirusami w stężeniu MOI 10 lub 1 i analizowane 7 dni po transdukcji (Figura 3). Wyizolowane białko poddano analizie typu Western blot i określono stopień wyciszenia wariantu zmutowanego i normalnego względem białka referencyjnego i kontroli negatywnych. Oba analizowane reagent y wyciszają allelo-selektywnie zmutowaną huntingtynę, pozostawiając białko niezmutowane na normalnym poziomie (Figura 3A). Analiza transkryptu genu HTT potwierdziła selektywność wyciszania zmutowanej formy. Sprawdzono również efektywność działania interferujących RNA na innym modelu chorób poliglutaminowych - SCA3 (Figura 3B). Badane cząsteczki wyciszają allelo-selektywnie zmutowaną ataksynę 3 w obu analizowanych stężeniach wirusa (MOI 1 i MOI 10).
Metody
Hodowle komórkowe i transfekcja
Fibroblasty wyprowadzone od pacjentów z HD (GM04281 - 17/68 CAG) i SCA3 (GM06153 18/69 CAG) uzyskano z Coriell Cell Repositories (Camden, New Jersey, USA). Hodowlę prowad zono w pożywce MEM (Lonza; Basel, Switzerland) wzbogaconej w 8% surowicę FBS (Sigma-Aldrich; St. Louis, USA), antybiotyki: penicylina, streptomycyna, amfoterycyna B (Sigma-Aldrich) i aminokwasy (nr. Kat. M7145, Sigma-Aldrich). Transfekcję prowadzono przy użyciu Lipofectaminy 2000 (Life Technologies; Grand Island, NY, USA) zgodnie z zaleceniami producenta.
Western blot
Analiza Western blot dla białka HTT (ciąg 17/68Q). W skrócie, 25 μg całkowitego białka rozdzielano w żelu poliakryloamidowym z SDS (1.5 cm, 4% żel zagęszczający / 4.5 cm, 5% żel rozdzielający, stosunek akrylamidu do bisakrylamidu 35:1) w buforze XT Tricine (Bio-Rad; Hercules, CA, USA) przy 140 V, w łaźni wodnej. Następnie białka były transferowane na membranę nitrocelulozową (Sigma-Aldrich). Wszystkie kroki immunodetekcji były przeprowadzone w systemie SNAPid (Millipore; Billerica, MA, USA) w buforze PBS/0.9% NaCl/0.1% Tween-20 oraz 0.25% mleku odtłuszczonym. Reakcja immunofluorescencyjna była wykrywana przy pomocy substratu ECL Western Blotting Substrate (ThermoScientific, Rockford, IL, USA). Prążki białkowe były skanowane bezpośrednio z membrany przy użyciu kamery i analizowane programem Gel-Pro Analyzer. Analiza Western blot dla białka ATXN3 - 25 μg całkowitego białka rozdzielano w żelu poliakryloamidowym z SDS (5% żel zagęszczający, 12% żel rozdzielający) w buforze Laemmli przy 120V. Pozostałe etapy analizy jak powyżej.
Northern blot
Cząsteczki efektorowe uwalniane z wektorów były wykrywane przy pomocy hybrydyzacji typu northern. Całkowity RNA był izolowany z komórek HEK293T przy pomocy odczynnika TRI Reagent (BioShop; Burlington, Canada) zgodnie z instrukcją producenta. RNA (35 μg) rozdzielano w denaturującym żelu poliakryloamidowym (12% PAA, 19:1 akrylamid/bis, 7.5 M mocznik) w buforze 0.5X TBE. RNA był transferowany na membranę hybrydyzacyjną GeneScreen Plus (PerkinElmer) używając techniki elektrotransferu półsuchego (Sigma-Aldrich). Membrana była hybrydyzowana z radioaktywnie wyznakowaną sondą DNA komplementarną do cząsteczki interferującego RNA. Sygnały radioaktywne były ilościowane przy pomocy skanera laserowego FLA5100 (Multi Gauge v3.0, Fujifilm).
Izolacja RNA i RT-PCR
Całkowity RNA był izolowany z komórek przy pomocy odczynnika TRI Reagent (BioShop; Burlington, Canada) zgodnie z instrukcją producenta. Stężenie RNA mierzono przy użyciu Spektrofotometru NanoDrop. Do odwrotnej transkrypcji używano 500 ng RNA, reakcję prowadzono w 55°C używając zestawu Superscript III (Life Technologies) i randomicznych heksamerów (Promega; Madison, WI, USA). Produkty PCR rozdzielano w 1.5% żelach agarozowych w buforze 0.5XTBE i wybarwiano je bromkiem etydyny.
Plazmidy i wektory wirusowe
Kasety ekspresyjne kodujące interferujący RNA zawierały promotor H1, sekwencję nici sensowej, sekwencję pętli, sekwencję nici antysensowej oraz sekwencję terminatorową składająca się z 5 urydyn. Wektor kodował również sekwencję genu reporterowego copGFP z promotora CMV lub GFP z promotora EF1a. Kasety ekspresyjne kodujące interferujący RNA były wygenerowane przy użyciu oligonukleotydów DNA (Sigma-Aldrich). Pary oligonukleotydów DNA były ligowane do plazmidu ekspresyjnego pGreenPuro (System Biosciences), a sekwencję konstruktu potwierdzano poprzez sekwencjonowanie.
Składanie wirusa i transdukcja fibroblastów
W celu produkcji lentiwirusów plazmidy zawierające kasety ekspresyjne z interferującym RNA były kotransfekowane do komórek HEK293TN z plazmidami pakującymi pPACKH1-GAG, pPACKH1-REV i pVSV-G (System Biosciences). Pożywkę z lentiwirusem zbierano dnia 2 i 3, filtrowano, zagęszczano cząstki lentiwirusowe używając roztworu PEGit Virus Precipitation Solution (System Biosciences). Wektory lentiwirusowe zawieszano w pożywce Opti-MEM (Gibco), i określano ilość cząstek wirusowych (TU/ml) przy pomocy cytometrii przepływowej (Accuri C6, BD Biosciences) bazując na ekspresji genu reporterowego copGFP lub GFP. Fibroblasty były transdukowane stosując MOI (multiplicity of infection) 1 i 10 w obecności polybrenu (4 μg/ml).
Podsumowanie
W opisanych dotychczas publikacjach i patentach brak rozwiązania pokazującego zastosowanie reagentów wektorowych technologii RNAi do selektywnego wyciszania zmutowanych genów zawierających wydłużone ciągi CAG, celując bezpośrednio w region mutacji. W odróżnieniu do rozwiązań proponowanych dotychczas, będące przedmiotem zgłoszenia interferujące RNA działa w sposób wysoce allelo-selektywny, preferencyjnie wyciszając ekspresję alleli zmutowanych, celując w powtórzenia CAG. Efekt ten uzyskano dzięki wprowadzeniu specyficznych substytucji w sekwencję interferujących RNA, co powoduje powstanie niekanonicznych par zasad w oddziaływaniu z docelową sekwencją CAG. Powstająca w wyniku komórkowej biogenezy pula interferujących RNA selektywnie obniża poziom zmuto
PL 243777 BI wanych białek przy pozostawieniu białek niezmutowanych na normalnym poziomie. Proponowane rozwiązanie ogranicza również efekt off-target, polegający na niespecyficznym działaniu interferujących RNA na inne transkrypty zawierające krótkie powtórzenia CAG i CUG. Zastosowanie wektorów wirusowych daje możliwość dostarczenia interferujących RNA do trudnodostępnych tkanek, takich jak mózg. Co więcej, w odróżnieniu do podejść wykorzystujących syntetyczne cząsteczki RNAi, pozwala na długotrwałą ekspresję interferujących RNA w chorej tkance bez potrzeby ich wielokrotnego podawania.
Podejścia terapeutyczne wykorzystujące celowanie w sekwencje powtórzeń w chorobach poliQ są bardziej uniwersalne w porównaniu do celowania w sekwencje specyficzne genów, a tym bardziej w sekwencje polimorficzne SNP. Uniwersalność wynalazku polega na tym, że interferujące RNA są nacelowane na zmutowane sekwencje powtórzeń CAG, występujące przynajmniej w 9 chorobach poliglutaminowych.
Lista sekwencji
| SEQ. ID No. | Sekwencja nici wiodącej 5’-3’ | Liczba niesparowań z docelowa sekwencją CAG | Rodzaj niesparowania z sekwencją docelową |
| 1 | CUGCUGCAGCUGCUGCUGCUGC | 1 | A:A |
| 2 | GCUGCUGCAGCUGCUGCUGCU | 1 | A:A |
| 3 | CUGCUGCAGCUGCUGCAGCUGC | 2 | A:A |
| 4 | GCUGCUGCAGCUGCAGCUGCU | 2 | A:A |
| 5 | GCUGCUGCUGCAGCAGCUGCU | 2 | A:A |
| 6 | UGCUGCUGCUGCAGCAGCUG | 2 | A:A |
| 7 | GCUGCUGCUAAAGCAGCUGCU | 4 | A:A |
| 8 | CUGCUGCGGCUGCUGCUGCUGC | 1 | A:G |
| 9 | GCUGCUGCGGCUGCUGCUGCU | 1 | A:G |
| 10 | CUGCUGCAGCUGCUGCGGCUGC | 2 | A:G |
| 11 | GCUGCUGCGGCUGCGGCUGCU | 2 | A:G |
| 12 | GCUGCUGCUGCGGCGGCUGCU | 2 | A:G |
| 13 | UGCUGCUGCUGCGGCGGCUG | 2 | A:G |
| 14 | CUGCUGCGGCGGCUGCGGCUGC | 3 | A:G |
| 15 | GCUGCUGCGGCUGCGGCGGCU | 3 | A:G |
| 16 | UGCUGCUGCGGCGGCGGCUG | 3 | A:G |
| 17 | GCUGCUGCUGCGGCGGCGGCU | 3 | A:G |
| 18 | UGCUGCUGCUGCGGCGGCGG | 3 | A:G |
| 19 | CUGCUGCUGCUGCGGCGGCGGC | 3 | A:G |
| 20 | UGCUGCUGCGGCGGCGGCGG | 4 | A:G |
| 21 | CUGCUGCUGCGGCGGCGGCGGC | 4 | A:G |
| 22 | GCUGCUGCUGGGGCGGCUGCU | 4 | A:G |
SEQ. ID No. 23
5’CUUCCUGUCA3’
PL 243777 BI
WYKAZ SEKWENCJI < 110> Instytut Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk < 120> Cząsteczka kwasu nukleinowego, kaseta ekspresyjna, wektor ekspresyjny, komórka eukariotycznego gospodarza i zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego w terapii chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń typu CAG < 130> 17P47017PL00 < 140> PLP.422094 < 141> 2013-09-02 < 160> 23 < 170> BiSSAP 1.3.6 < 210> 1 < 211> 22 < 212> RNA < 213> Homo sapiens <400> 1 cugcugcagc ugcugcugcu go < 210> 2 < 211> 21 < 212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcugcugcag cugcugcugc u <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens
PL 243777 Β1 <400> 3 cugcugcagc ugcugcagcu gc <210> 4 <211> 21 < 212> RNA < 213> Homo sapiens < 400> 4 gcugcugcag cugcagcugc u <210 5 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 gcugcugcug cagcagcugc u <210> 6 <2U> 20 < 212> RNA < 213> Homo sapiens < 40 0 6 ugcugcugcu gcagcagcug <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens
PL 243777 BI <400> 7 gcugcugcua aagcagcugc u <210 8 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 cugcugcggc ugcugcugcu gc <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 gcugcugcgg cugcugcugc u <210 10 <2U> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400 10 cugcugcagc ugcugcggcu gc <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens
PL 243777 Β1 <4C0> 11 gcugcugcgg cugcggcugc u <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 gcugcugcug cggcggcugc u <210> 13 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 ugcugcugcu gcggcggcug <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 cugcugcggc ggcugcggcu gc <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15
PL 243777 BI gcugcugcgg cugcggcggc u <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 ugcugcugcg gcggcggcug <210 17 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 gcugcugcug cggcggcggc u <210 18 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 ugcugcugcu gcggcggcgg <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 cugcugcugc ugcggcggcg gc
PL 243777 Β1 <210> 20 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400 20 ugcugcugcg gcggcggcgg <210> 21 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400 21 cugcugcugc ggcggcggcg gc <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <4C0> 22 gcugcugcug gggcggcugc u <210 23 <211> 10 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 cuuccuguca
Referencje:
1. Yu D. Pendergraff H. Liu J, et al, Single-Stranded RNAs Use RNAi to Potently and Allele-Selectively Inhibit Mutant Huntiingtin Expression. Cell 2012; 150:895-908,.
2. Lima WF, Prakash TP. Murray HM. el al. Single-stranded siRNAs activate RNAi in animals. Cell 2012;150:883-894.
3. Hu J, Liu J, Corey DR. Allele-selective inhibition of huntingtin expression by switching to an miRNA-like RNAi mechanism, Chem Biol. 2010 Nov 24; 17(11): 1183-8.
4. Hu J. Liu J, Yu D, Chu Y, Corey DR. Mechanism of allele-selective inhibition of huntingtin expression by duplex RNAs that target CAG repeats: function through the RNAi pathway. Nucleic Acids Res. 2012 Dec; 40(22):11270-80.
Claims (15)
1. Cząsteczka kwasu nukleinowego, złożona z dupleksu i pętli, w której jedna z nici dupleksu nić wiodąca zawiera sekwencję określoną sekwencją SEQ. ID No. 2, a druga z nici dupleksu - nić pasażerska jest do niej komplementarna przynajmniej w 80%, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego tworzy w komórce strukturę typu spinki.
2. Cząsteczka według zastrz. 1 znamienna tym, że region dupleksu ma 19-30 par zasad długości.
3. Cząsteczka według zastrz. 2, znamienna tym, że pierwsza i druga nić dupleksu są połączone za pomocą pętli o długości od 4 do 15 nt.
4. Cząsteczka według zastrz. 2, znamienna tym, że pętla określona jest sekwencją SEQ. ID No. 23.
5. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencje oskrzydlające 5’ i 3’ pochodzące od naturalnego miRNA, przy czym naturalnej długości sekwencje flankujące prekursora są skrócone lub nie.
6. Cząsteczka według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera sekwencję pętli pochodzącą od naturalnego miRNA.
7. Kaseta ekspresyjna zawierająca regulowany lub konstytutywny promotor, znamienna tym, że jest on powiązany funkcjonalnie z sekwencją kodującą kwas nukleinowy określony zastrzeżeniami 1 do 6.
8. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 7, znamienna tym, że promotorem jest promotor polII albo polIII RNA.
9. Wektor ekspresyjny znamienny tym, że zawiera kasetę ekspresyjną określoną zastrzeżeniami 7 do 8.
10. Wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że stanowi wektor adenowirusowy, lentiwirusowy, adeno-associated (AAV), poliowirus lub HSV.
11. Komórka eukariotycznego gospodarza znamienna tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego określonego zastrzeżeniami 1 do 6.
12. Komórka według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera kasetę ekspresyjną określoną zastrzeżeniami 7 do 8.
13. Komórka według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny określony zastrzeżeniami 9 do 10.
14. Zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego określonego zastrzeżeniami 1 do 6, kasety ekspresyjnej określonej zastrzeżeniami 7 do 8, wektora określonego zastrzeżeniami 9 do 10 lub komórki określonej zastrzeżeniami 11 do 13 do wytwarzania leku do leczenia chorób neurologicznych wywoływanych ekspansją powtórzeń trójnukleotydowych CAG.
15. Zastosowanie według zastrz. 14 w terapii chorób neurodegeneracyjnych człowieka, wybranych spośród choroby Huntingtona i ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 3, wywoływanych przez mutacje trypletu CAG w pojedynczych genach.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL422094A PL243777B1 (pl) | 2013-09-02 | 2013-09-02 | Cząsteczka kwasu nukleinowego, kaseta ekspresyjna, wektor ekspresyjny, komórka eukariotycznego gospodarza i zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego w terapii chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń typu CAG |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL422094A PL243777B1 (pl) | 2013-09-02 | 2013-09-02 | Cząsteczka kwasu nukleinowego, kaseta ekspresyjna, wektor ekspresyjny, komórka eukariotycznego gospodarza i zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego w terapii chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń typu CAG |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL422094A1 PL422094A1 (pl) | 2017-10-09 |
| PL243777B1 true PL243777B1 (pl) | 2023-10-09 |
Family
ID=59996986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL422094A PL243777B1 (pl) | 2013-09-02 | 2013-09-02 | Cząsteczka kwasu nukleinowego, kaseta ekspresyjna, wektor ekspresyjny, komórka eukariotycznego gospodarza i zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego w terapii chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń typu CAG |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL243777B1 (pl) |
-
2013
- 2013-09-02 PL PL422094A patent/PL243777B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL422094A1 (pl) | 2017-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6663859B2 (ja) | ハンチントン病の治療化合物 | |
| ES2739804T3 (es) | Compuestos terapéuticos | |
| AU2008260103B2 (en) | Reduction of off-target RNA interference toxicity | |
| JP4936343B6 (ja) | ｍｉｃｒｏＲＮＡの機能阻害法 | |
| US10329566B2 (en) | Nucleic acid molecule, expression cassette, expression vector, eukaryotic host cell, induction method of RNA interference in eukaryotic host and use of the nucleic acid molecule in therapy of diseases induced by expansion of trinucleotide CAG repeats | |
| JPWO2010047216A6 (ja) | ｍｉｃｒｏＲＮＡの機能阻害法 | |
| Ruberti et al. | Targeting microRNAs in neurons: tools and perspectives | |
| US20220133774A1 (en) | Modulation of micrornas against myotonic dystrophy type 1 and antagonists of micrornas therefor | |
| Jenquin et al. | Furamidine rescues myotonic dystrophy type I associated mis-splicing through multiple mechanisms | |
| PL243777B1 (pl) | Cząsteczka kwasu nukleinowego, kaseta ekspresyjna, wektor ekspresyjny, komórka eukariotycznego gospodarza i zastosowanie cząsteczki kwasu nukleinowego w terapii chorób wywoływanych ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń typu CAG | |
| WO2008103060A1 (en) | A sirna sequence, vector, a molecular target for sirna reagents and vectors introduced into cells and tissues, a method of evaluating the specificity of the silencing of the mutated transcript, a method of examining the interactions of enzymes on the rnai pathway with transcripts as well as the application of the sirna sequ | |
| Dumitrescu et al. | MicroRNAs in CAG Trinucleotide Repeat Expansion Disorders: an Integrated Review of the Literature | |
| WO2024036343A2 (en) | Synergistic nucleic acid based therapeutics and methods of use for treating genetic disorders |