PL242855B1

PL242855B1 - Method of obtaining a bioactive hemostatic agent based on chitosan and a bioactive haemostatic agent based on chitosan

Info

Publication number: PL242855B1
Application number: PL433975A
Authority: PL
Inventors: Marek PIĄTKOWSKI; Marek Piątkowski; Julia RADWAN-PRAGŁOWSKA; Julia Radwan-Pragłowska; Łukasz JANUS; Łukasz Janus; Aleksandra SIERAKOWSKA; Aleksandra Sierakowska
Original assignee: Politechnika Krakowska Im Tadeusza Kosciuszki
Priority date: 2020-05-14
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2023-05-02
Also published as: WO2021229538A1; PL433975A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania bioaktywnego środka hemostatycznego, który polega na tym, że chitozan poddaje się reakcji sieciowania fizycznego, stosując poli(kwas asparaginowy), a następnie inkorporuje się lizozym w strukturę usieciowanego chitozanu, przy czym reakcję sieciowania prowadzi się w temperaturze pokojowej, pod normalnym ciśnieniem. Stosunek masowy chitozanu : czynnika sieciującego wynosi od 1:0,1 do 1:6, a ilość lizozymu wynosi 12,5 - 25 mg na 1 g chitozanu. Wynalazek dotyczy także bioaktywnego środka hemostatycznego na bazie chitozanu uzyskanego tym sposobem.The subject of the application is a method of obtaining a bioactive hemostatic agent, which consists in the fact that chitosan is subjected to a physical cross-linking reaction using poly(aspartic acid), and then lysozyme is incorporated into the structure of cross-linked chitosan, where the cross-linking reaction is carried out at room temperature under normal pressure. The mass ratio of chitosan: cross-linking agent is from 1:0.1 to 1:6, and the amount of lysozyme is 12.5 - 25 mg per 1 g of chitosan. The invention also relates to a bioactive hemostatic agent based on chitosan obtained by this method.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

DZIEDZINA TECHNIKITECHNICAL FIELD

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania bioaktywnego środka hemostatycznego na bazie chitozanu, nadającego się do zastosowania jako biomateriał hamujący krwawienie o różnym pochodzeniu i różnym nasileniu, a także jako element opatrunków hemostatycznych oraz systemów kontrolowanego dostarczania i uwalniania substancji bioaktywnych, w tym hydrofobowych.The subject of the invention is a method of obtaining a bioactive hemostatic agent based on chitosan, suitable for use as a biomaterial that inhibits bleeding of various origin and intensity, as well as an element of hemostatic dressings and systems for the controlled delivery and release of bioactive substances, including hydrophobic ones.

STAN TECHNIKISTATE OF TECHNOLOGY

Chitozan to biopolimer otrzymywany na drodze reakcji deacetylacji chemicznej lub enzymatycznej chityny, co prowadzi do otrzymania polimeru o stopniu deacetylacji co najmniej 60%. Jego łańcuch tworzą dwa rodzaje merów, N-acetyloaminoglukozy oraz aminoglukozy. Połączone są wiązaniami betaglikozydowymi. Chitozan w swojej strukturze chemicznej zawiera wiele grup hydroksylowych oraz aminowych, dzięki czemu może podlegać szeregu modyfikacji. Biopolimer ten w wyniku reakcji sieciowania fizycznego lub chemicznego tworzy hydrożel o zdolności do chłonięcia dużej ilości wody.Chitosan is a biopolymer obtained by chemical or enzymatic deacetylation of chitin, which leads to a polymer with a degree of deacetylation of at least 60%. Its chain consists of two types of units, N-acetylaminoglucose and aminoglucose. They are linked by beta-glycosidic bonds. Chitosan in its chemical structure contains many hydroxyl and amino groups, thanks to which it can undergo a number of modifications. This biopolymer, as a result of a physical or chemical cross-linking reaction, forms a hydrogel with the ability to absorb large amounts of water.

Dodatkowo, natywny chitozan posiada właściwości hemostatyczne wynikające z obecności wolnych grup aminowych, które oddziałują z erytrocytami i płytkami krwi.In addition, native chitosan has hemostatic properties resulting from the presence of free amino groups that interact with erythrocytes and platelets.

Dzięki temu znajduje zastosowanie jako element środków hemostatycznych, które są biomateriałami stosowanymi do tamowania krwotoków na drodze sorpcji wodnej frakcji krwi, czego konsekwencją jest zatężenie składników odpowiedzialnych za indukcję kaskady krzepnięcia krwi.Thanks to this, it is used as an element of hemostatic agents, which are biomaterials used to stop hemorrhages by sorption of the water fraction of blood, which results in the concentration of components responsible for inducing the blood coagulation cascade.

Do najbardziej znanych metod otrzymywania środków hemostatycznych opartych o chitozan zalicza się:The best-known methods of obtaining hemostatic agents based on chitosan include:

1. Rozpuszczanie chitozanu w środowisku wodnym o pH mniejszym niż 6,3 z zastosowaniem kwasu octowego, a następnie jego liofilizację;1. Dissolution of chitosan in an aqueous medium with a pH less than 6.3 using acetic acid, followed by its lyophilization;

2. Fizyczne sieciowanie chitozanu za pomocą związków z grupy polifosforanów, a następnie jego liofilizację;2. Physical cross-linking of chitosan with compounds from the polyphosphate group, followed by its lyophilization;

3. Chemiczne sieciowanie chitozanu za pomocą związku organicznego zawierającego w swojej budowie co najmniej dwie grupy karboksylowe lub aldehydowe np. aldehydu glutarowego, a następnie jego liofilizację;3. Chemical cross-linking of chitosan with an organic compound containing at least two carboxyl or aldehyde groups, e.g. glutaraldehyde, followed by lyophilization;

4. Tworzenie kompozytu chitozanu z polimerem lub związkiem nieorganicznym po uprzednim rozpuszczeniu chitozanu w wodnym roztworze kwasu;4. Creating a chitosan composite with a polymer or an inorganic compound after dissolving the chitosan in an aqueous acid solution;

5. Pokrywanie gazy natywnym chitozanem w postaci proszku.5. Coating gauze with native chitosan powder.

Ze względu na właściwości antybakteryjne oraz biokompatybilność chitozan i jego pochodne stosowane są często w medycynie i farmacji. Wiadomo jest, że pochodne chitozanu do przeznaczenia medycznego i farmaceutycznego muszą cechować się wysoką czystością.Due to their antibacterial properties and biocompatibility, chitosan and its derivatives are often used in medicine and pharmacy. It is known that chitosan derivatives for medical and pharmaceutical purposes must be of high purity.

Znane metody acylowania wymagają stosowania toksycznych substancji, które są bardzo trudne lub wręcz niemożliwe do całkowitego usunięcia z produktu. Z tego względu poszukuje się nowych rozwiązań umożliwiających prostą i krótką syntezę biokompatybilnego acylowanego chitozanu o kontrolowanych właściwościach.Known acylation methods require the use of toxic substances that are very difficult or even impossible to completely remove from the product. For this reason, new solutions are sought for a simple and short synthesis of biocompatible acylated chitosan with controlled properties.

Spośród znanych sposobów otrzymywania środka hemostatycznego na bazie chitozanu najbardziej zbliżony do rozwiązania według niniejszego wynalazku jest sposób przedstawiony w opisie patentowym US 8106030 B2, który ujawnia metodę otrzymywania hemostatyku poprzez rozpuszczenie chitozanu w wodnym roztworze kwasu i utworzenie rozpuszczalnej w środowisku wodnym soli oraz dodanie drugiego składnika, który nie ulega żelowaniu np. celulozy, alginianu, krzemionki lub gliny.Among the known methods of obtaining a haemostatic agent based on chitosan, the closest to the solution according to the present invention is the method presented in the patent description US 8106030 B2, which discloses a method of obtaining a haemostatic by dissolving chitosan in an aqueous acid solution and forming a salt soluble in an aqueous environment and adding a second component, which does not gel, e.g. cellulose, alginate, silica or clay.

W opisie patentowym CN 101053669 B przedstawiono sposób otrzymywania środka hemostatycznego polegający na rozpuszczeniu w wodzie rozpuszczalnych w wodzie pochodnych chitozanu np. karboksymetylochitozanu, a następnie poddaniu liofilizacji przez okres 24-60 godzin.The patent description CN 101053669 B describes a method of obtaining a haemostatic agent consisting in dissolving water-soluble chitosan derivatives, e.g. carboxymethyl chitosan, in water, and then subjecting them to lyophilization for 24-60 hours.

W opisie patentowym US 8715719 B2 opisano metodę otrzymywania środka hemostatycznego polegającą na tym, że przygotowuje się roztwór chitozanu o średniej masie molowej poniżej 600 000 g/mol w rozpuszczalniku innym niż woda, dodaje czynnik sieciujący w postaci kwasu organicznego np. kwasu mlekowego, a następnie poddaje liofilizacji.US 8715719 B2 describes a method of obtaining a hemostatic agent consisting in preparing a solution of chitosan with an average molar mass below 600,000 g/mol in a solvent other than water, adding a cross-linking agent in the form of an organic acid, e.g. lactic acid, and then freeze-dried.

Jak wskazują doniesienia z literatury fachowej i patentowej, obecnie nie jest znana metoda otrzymywania środka hemostatycznego na bazie chitozanu, o zwiększonej bioaktywności, na drodze reakcji sieciowania fizycznego z zastosowaniem poli(kwasu asparaginowego), prowadzonej bez stosowania toksycznych substancji, inkorporowanego lizozymem.As reported in the professional and patent literature, currently there is no known method of obtaining a haemostatic agent based on chitosan, with increased bioactivity, by physical cross-linking reaction with the use of poly(aspartic acid), carried out without the use of toxic substances, incorporated with lysozyme.

CEL WYNALAZKUPURPOSE OF THE INVENTION

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania bioaktywnego środka hemostatycznego opartego o chitozan na drodze reakcji sieciowania fizycznego chitozanu, stosując biokompatybilne substancje modyfikujące, a następnie inkorporację lizozymu i liofilizację otrzymanego środka. Cel ten osiągnięto dzięki sposobowi według wynalazku.The aim of the invention is to develop a method of producing a bioactive hemostatic agent based on chitosan by physical cross-linking of chitosan using biocompatible modifying substances, followed by incorporation of lysozyme and lyophilization of the obtained agent. This object has been achieved by the method according to the invention.

ISTOTA WYNALAZKUTHE ESSENCE OF THE INVENTION

Istotą rozwiązania według wynalazku jest to, że w sposobie otrzymywania bioaktywnego środka hemostatycznego opartego o chitozan, chitozan poddaje się reakcji sieciowania fizycznego stosując poli(kwas asparaginowy) jako czynnik sieciujący, w środowisku wodnym, a następnie do produktu reakcji dodaje się lizozym i poddaje uzyskany kompozyt liofilizacji.The essence of the solution according to the invention is that in the method of obtaining a bioactive hemostatic agent based on chitosan, chitosan is subjected to a physical cross-linking reaction using poly(aspartic acid) as a cross-linking agent in an aqueous environment, and then lysozyme is added to the reaction product and the obtained composite is subjected to lyophilization.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób otrzymywania bioaktywnego środka hemostatycznego na bazie chitozanu, obejmujący przekształcenie polisukcynimidu na drodze hydrolizy zasadowej, do poli(kwasu asparaginowego), który oczyszcza się przed dalszym wykorzystaniem go w procesie, oraz rozpuszczenie chitozanu w wodnym roztworze kwasu, strącenie chitozanu zasadą, oczyszczenie go i poddanie reakcji sieciowania fizycznego w środowisku wodnym poli(kwasem asparaginowym), a następnie ochłodzenie zawiesiny poreakcyjnej do temperatury nie wyższej niż 5°C i dodanie wodnego roztworu lizozymu, mrożenie i poddanie liofilizacji, polega na tym, że polisukcynimid (PSI) poddaje się hydrolizie poprzez wprowadzenie dodatku wodnego roztworu zasady do wodnej zawiesiny polisukcynimidu, przy stałym mieszaniu i dodawaniu roztworu zasady porcjami, aż do otrzymania pH mieszaniny równego 11.According to the invention, a method for obtaining a chitosan-based bioactive hemostatic agent, comprising converting polysuccinimide by alkaline hydrolysis to poly(aspartic acid), which is purified before further use in the process, and dissolving chitosan in an aqueous acid solution, precipitating the chitosan with alkali, cleaning it and subjecting it to a physical cross-linking reaction in an aqueous environment with poly(aspartic acid), and then cooling the post-reaction suspension to a temperature not higher than 5°C and adding an aqueous solution of lysozyme, freezing and lyophilization, consists in the fact that polysuccinimide (PSI) undergoes is hydrolysed by adding an aqueous base solution to the polysuccinimide aqueous suspension with constant stirring and adding the base solution in portions until the mixture has a pH of 11.

Następnie kationy w otrzymanej soli poli(kwasu asparaginowego) wymienia się na protony, stosując żywicę jonowymienną.The cations in the resulting poly(aspartic acid) salt are then exchanged for protons using an ion exchange resin.

Natomiast, niezależnie od procesu przekształcenia polisukcynimidu w poli(kwas asparaginowy), chitozan o średniej masie molowej wynoszącej od 2 000 do 800 000 g/mol i stopniu deacetylacji wynoszącym 60-100%, rozpuszcza się w wodnym roztworze kwasu o stężeniu 1-5% mas., po czym wytrąca się chitozan wodnym roztworem zasady, dodawanej aż do otrzymania neutralnego pH mieszaniny. Następnie usuwa się z mieszaniny powstałą sól użytego kwasu na drodze dializy membranowej, stosując membrany dializacyjne MWCO.However, regardless of the process of converting polysuccinimide into poly(aspartic acid), chitosan with an average molar mass of 2,000 to 800,000 g/mol and a degree of deacetylation of 60-100% is dissolved in an aqueous acid solution with a concentration of 1-5% wt, after which the chitosan is precipitated with an aqueous solution of alkali, added until a neutral pH of the mixture is obtained. The resulting salt of the acid used is then removed from the mixture by membrane dialysis using MWCO dialysis membranes.

Strącony, oczyszczony chitozan w postaci wodnej zawiesiny umieszcza się w naczyniu reakcyjnym, wprowadza się jako czynnik sieciujący wodny roztwór uzyskanego poli(kwasu asparaginowego), przy zachowaniu ciągłego mieszania, w ilości 0,1 do 6 g poli(kwasu asparaginowego) na 1 g chitozanu, a po usieciowaniu chitozanu obniża się temperaturę mieszaniny do wartości nie wyższej niż 5°C i mieszając dodaje wodny roztwór lizozymu, po czym mieszaninę, zawierającą usieciowany chitozan z inkorporowanym w jego strukturę lizozymem, poddaje się mrożeniu i liofilizacji w temperaturze od -40 do -60°C pod ciśnieniem poniżej 1 mbar.The precipitated, purified chitosan in the form of an aqueous suspension is placed in the reaction vessel, the aqueous solution of the obtained poly(aspartic acid) is introduced as a cross-linking agent, with continuous stirring, in the amount of 0.1 to 6 g of poly(aspartic acid) per 1 g of chitosan , and after chitosan cross-linking, the temperature of the mixture is lowered to a value not higher than 5°C and an aqueous lysozyme solution is added while stirring, then the mixture containing cross-linked chitosan with lysozyme incorporated into its structure is frozen and lyophilized at a temperature of -40 to - 60°C at a pressure below 1 mbar.

Korzystnie, jako źródło poli(kwasu asparaginowego) stosuje się polisukcynimid otrzymany na drodze polikondensacji kwasu asparaginowego albo bezwodnika maleinowego i mocznika.Preferably, polysuccinimide obtained by polycondensation of aspartic acid or maleic anhydride and urea is used as the source of polyaspartic acid.

Korzystnie jako czynnik hydrolizujący polisukcynimid stosuje się wodny roztwór wodorotlenku sodu lub potasu o stężeniu co najmniej 1% mas., a najlepiej 5% mas.Preferably, an aqueous solution of sodium or potassium hydroxide with a concentration of at least 1 wt.% and preferably 5 wt.% is used as the polysuccinimide hydrolysing agent.

Korzystnie w procesie otrzymywania poli(kwasu asparaginowego) stosuje się wodną zawiesinę, która zawiera 10% mas. polisukcynimidu.Preferably, in the process of obtaining poly(aspartic acid) an aqueous suspension is used which contains 10 wt. polysuccinimide.

Korzystnie proces zasadowej hydrolizy polisukcynimidu prowadzi się z ciągłym mieszaniem, stosując mieszadło magnetyczne lub mechaniczne z prędkością 300 rpm.Preferably, the polysuccinimide alkaline hydrolysis process is carried out under continuous agitation using a magnetic or mechanical stirrer at 300 rpm.

Korzystnie roztwór zasady dodaje się do zawiesiny polisukcynimidu podczas mieszania porcjami, aż do osiągnięcia pH mieszaniny 11.Preferably, the base solution is added to the polysuccinimide suspension while mixing in portions until the mixture reaches a pH of 11.

Korzystnie kationy pochodzące od użytej zasady usuwa się z roztworu soli poli(kwasu asparaginowego) stosując silnie kwaśną sulfonową żywicę jonowymienną.Preferably, the cations derived from the base used are removed from the poly(aspartic acid) salt solution using a strongly acidic sulfone ion exchange resin.

Korzystnie, dla otrzymania chitozanu w postaci amorficznej stosuje się wodny roztwór chitozanu o stężeniu od 1 do 10% mas.Preferably, an aqueous solution of chitosan with a concentration of 1 to 10 wt% is used to obtain chitosan in an amorphous form.

Korzystnie chitozan rozpuszcza się w 2-5% mas. roztworze kwasu solnego.Preferably chitosan is dissolved in 2-5 wt. hydrochloric acid solution.

Korzystnie, stosuje się chitozan o średniej masie molowej wynoszącej od 100 000 do 400 000 g/mol.Preferably, chitosan with an average molar mass of 100,000 to 400,000 g/mol is used.

Korzystnie, stosuje się chitozan o stopniu deacetylacji wynoszącym powyżej 75%.Preferably, chitosan with a degree of deacetylation above 75% is used.

Korzystnie, stosuje się chitozan pochodzenia grzybowego.Preferably, chitosan of fungal origin is used.

Korzystnie chitozan wytrąca się 2% mas. roztworem wodnym wodorotlenku sodu lub potasu.Preferably, the chitosan is precipitated at 2% by weight. an aqueous solution of sodium or potassium hydroxide.

Korzystnie zawiesinę chitozanu oczyszcza się z powstałych soli stosując membrany dializacyjne MWCO (Molecular Weight Cut-Off) 10 000-12 000 Da.Preferably, the chitosan suspension is purified from the resulting salts using MWCO (Molecular Weight Cut-Off) 10,000-12,000 Da dialysis membranes.

Korzystnie do chitozanu dodaje się porcjami poli(kwas asparaginowy) stosując ciągłe mieszanie z prędkością 300-400 rpm.Preferably, poly(aspartic acid) is added in portions to the chitosan using continuous mixing at 300-400 rpm.

Korzystnie, sieciowanie fizyczne chitozanu prowadzi się zachowując stosunek 0,5-2,25 g poli(kwasu asparaginowego) na 1 g chitozanu.Preferably, the physical cross-linking of the chitosan is carried out in a ratio of 0.5-2.25 g of poly(aspartic acid) per 1 g of chitosan.

Korzystnie zawiesinę zawierającą usieciowany chitozan ochładza się do temperatury 3°C.Preferably, the suspension containing the cross-linked chitosan is cooled to 3°C.

Korzystnie lizozym dodaje się do zawiesiny z usieciowanym chitozanem w temperaturze 3°C przy stałym mieszaniu.Preferably, the lysozyme is added to the suspension with the cross-linked chitosan at 3°C with constant agitation.

Korzystnie stosuje się od 12,5 do 25 mg lizozymu na 1 g chitozanu.Preferably, 12.5 to 25 mg of lysozyme are used per 1 g of chitosan.

Korzystnie stosuje się lizozym białka jaja kurzego.Preferably, hen egg white lysozyme is used.

Korzystnie mrożenie kompozytu usieciowanego chitozanu z inkorporowanym lizozymem prowadzi się w temperaturze poniżej 0°C, a najlepiej -20°C.Preferably, the freezing of the composite of cross-linked chitosan with incorporated lysozyme is carried out at a temperature below 0°C, preferably -20°C.

Bioaktywny środek hemostatyczny na bazie chitozanu, stanowiący produkt realizacji sposobu według wynalazku, oparty o sieciowany fizycznie chitozan inkorporowany lizozymem, cechuje się wysoką zdolnością do sorpcji roztworów wodnych, wykazuje działanie antybakteryjne oraz łatwo ulega biodegradacji, a także nie jest cytotoksyczny.The bioactive haemostatic agent based on chitosan, which is a product of the method according to the invention, based on physically cross-linked chitosan incorporated with lysozyme, is characterized by high sorption capacity for aqueous solutions, has antibacterial activity and is easily biodegradable, and is not cytotoxic.

Rozwiązanie według wynalazku zobrazowano w poniższych przykładach, nie ograniczających zakresu jego ochrony.The solution according to the invention is illustrated in the following examples, which do not limit the scope of its protection.

PRZYKŁADYEXAMPLES

Przykład 1Example 1

Do 5 g polisukcynimidu otrzymanego na drodze polikondensacji kwasu asparaginowego dodano 50 ml wody, roztwór mieszano za pomocą mieszadła mechanicznego, a następnie podczas mieszania wkraplano porcjami 5% mas. roztwór NaOH aż pH roztworu osiągnęło wartość 11. Reakcję hydrolizy prowadzono 1 godzinę. Następnie całość mieszaniny poreakcyjnej przeniesiono na kolumnę jonowymienną w celu usunięcia jonów sodowych z mieszaniny poreakcyjnej i przekształceniu soli sodowej poli(kwasu asparaginowego) do poli(kwasu asparaginowego). Uzyskany roztwór rozcieńczono tak, aby sumaryczna ilość wodnego roztworu poli(kwasu asparaginowego) wynosiła 50 ml. Otrzymany wodny roztwór poli(kwasu asparaginowego) wykazywał pH = 2,6, stężenie jonów sodowych było mniejsze niż 15 mg/l.50 ml of water was added to 5 g of polysuccinimide obtained by polycondensation of aspartic acid, the solution was stirred with a mechanical stirrer, and then 5 wt.% was added dropwise while stirring. NaOH solution until the pH of the solution was 11. The hydrolysis reaction was carried out for 1 hour. Then, the entire post-reaction mixture was transferred to an ion exchange column in order to remove sodium ions from the post-reaction mixture and convert the sodium salt of poly(aspartic acid) to poly(aspartic acid). The resulting solution was diluted so that the total amount of the aqueous poly(aspartic acid) solution was 50 ml. The obtained aqueous poly(aspartic acid) solution had a pH of 2.6, the concentration of sodium ions was less than 15 mg/l.

Aby w międzyczasie przygotować chitozan w postaci amorficznej, 10 g chitozanu o średniej masie molowej wynoszącej 300 000 g/mol, otrzymanego z krewetek, dodano do 2000 ml wody destylowanej (przewodnictwo właściwe 10 mS/cm) oraz podczas mieszania wkraplano małymi porcjami 5% mas. roztwór HCI aż do osiągnięcia pH 5. Mieszaninę ogrzewano do temperatury 50°C aż do całkowitego rozpuszczenia się chitozanu. Następnie, mieszając, do roztworu dodawano 5% mas. roztwór NaOH aż do uzyskania wartości pH równej 7. Otrzymano chitozan w postaci amorficznej, który następnie oczyszczano poprzez zastosowanie membrany dializacyjnej o MWCO z zakresu 10 000-12 000 Da. Końcowe stężenie zawiesiny chitozanu w wodzie wynosiło 10 g/l.In the meantime, to prepare chitosan in amorphous form, 10 g of chitosan with an average molar mass of 300,000 g/mol, obtained from shrimps, was added to 2000 ml of distilled water (conductivity 10 mS/cm) and 5 wt. . HCl solution until pH 5 was reached. The mixture was heated to 50°C until the chitosan was completely dissolved. Then, while stirring, 5 wt.% was added to the solution. NaOH solution until a pH of 7 was obtained. Amorphous chitosan was obtained, which was then purified by using a dialysis membrane with a MWCO in the range of 10,000-12,000 Da. The final concentration of chitosan suspension in water was 10 g/l.

Środek hemostatyczny przygotowano z zastosowaniem mieszadła mechanicznego (400 rpm). Do 40 ml zawiesiny chitozanu o stężeniu 10 g/l dodawano kroplami, podczas mieszania, w czasie 10 minut 4 ml wodnego roztworu poli(kwasu asparaginowego). Utworzony produkt pozostawiono do odstania na 20 minut, a następnie zdekantowano. Wodną zawiesinę tak usieciowanego chitozanu oziębiono do 3°C a następnie dodano, podczas mieszania, 5 mg lizozymu w postaci wodnego roztworu o stężeniu 1 mg/ml. Powstały materiał kompozytowy zamrożono, a następnie poddano liofilizacji w temperaturze od -40 do -60°C pod ciśnieniem poniżej 1 mbar uzyskując gotowy produkt hemostatyczny.The hemostatic agent was prepared using a mechanical stirrer (400 rpm). To 40 ml of chitosan suspension at a concentration of 10 g/l, 4 ml of an aqueous solution of poly(aspartic acid) was added dropwise during 10 minutes while stirring. The product formed was allowed to stand for 20 minutes and then decanted. The aqueous suspension of chitosan thus cross-linked was cooled to 3°C and then 5 mg of lysozyme in the form of a 1 mg/ml aqueous solution was added with stirring. The resulting composite material was frozen and then lyophilized at a temperature of -40 to -60°C under a pressure below 1 mbar to obtain a ready haemostatic product.

Widmo FT-IR (Fourier-Transform Infrared Spectroscopy) otrzymanego środka hemostatycznego przedstawiono na załączonym rysunku na Fig. 1 (przykład 1). Widmo przedstawia pasma charakterystyczne dla chitozanu pochodzące od wolnych grup hydroksylowych (3351 cm^-1) i aminowych (1585 cm^-1; 1149 cm^-1), pasma typowe dla ugrupowań alifatycznych (2917 cm^-1; 2879 cm^-1) wiązań glikozydowych pomiędzy merami chitozanu (1063 cm^-1) oraz pierścieni glukopiranozy (895 cm^-1). Dodatkowo obecne są pasma pochodzące od grup karboksylowych pochodzących od poli(kwasu asparaginowego) (1706 cm^-1).The FT-IR spectrum (Fourier-Transform Infrared Spectroscopy) of the obtained hemostatic agent is shown in the attached figure in Fig. 1 (Example 1). The spectrum shows bands characteristic of chitosan coming from free hydroxyl (3351 cm ^-1 ) and amino groups (1585 cm ^-1 ; 1149 cm ^-1 ), bands typical of aliphatic groups (2917 cm ^-1 ; 2879 cm ^-1 ) of glycosidic bonds between chitosan units (1063 cm ^-1 ) and glucopyranose rings (895 cm ^-1 ). In addition, there are bands derived from carboxyl groups derived from poly(aspartic acid) (1706 cm ^-1 ).

Przykład 2 ‘Example 2'

Do 5 g polisukcynimidu otrzymanego na drodze polikondensacji mocznika i bezwodnika maleinowego w polu promieniowania mikrofalowego dodano 50 ml wody. Roztwór mieszano za pomocą mieszadła mechanicznego, a następnie wkraplano, podczas mieszania, porcjami 2% mas. roztwór KOH, aż pH roztworu osiągnęło wartość 11. Reakcję hydrolizy prowadzono 1 godzinę i 30 minut. Następnie mieszaninę przeniesiono na kolumnę jonowymienną w celu usunięcia jonów potasowych z mieszaniny poreakcyjnej i przekształceniu soli potasowej poli(kwasu asparaginowego) do poli(kwasu asparaginowego). Uzyskany roztwór rozcieńczono tak, aby sumaryczna ilość wodnego roztworu poli(kwasu asparaginowego) wynosiła 50 ml. Otrzymany wodny roztwór poli(kwasu asparaginowego) wykazywał pH = 2,6, stężenie jonów potasowych było mniejsze niż 15 mg/l.50 ml of water was added to 5 g of polysuccinimide obtained by polycondensation of urea and maleic anhydride in a microwave field. The solution was stirred with a mechanical stirrer and then added dropwise, while stirring, in portions of 2 wt. KOH solution until the pH of the solution was 11. The hydrolysis reaction was carried out for 1 hour and 30 minutes. The mixture was then transferred to an ion exchange column to remove potassium ions from the post-reaction mixture and convert the poly(aspartic acid) potassium salt to poly(aspartic acid). The resulting solution was diluted so that the total amount of the aqueous poly(aspartic acid) solution was 50 ml. The resulting aqueous solution of poly(aspartic acid) had a pH of 2.6, the concentration of potassium ions was less than 15 mg/l.

Aby w międzyczasie przygotować chitozan w postaci amorficznej, 10 g chitozanu o średniej masie molowej wynoszącej 200 000 g/mol, otrzymanego z grzybów (pieczarek), dodano do 2000 ml wody destylowanej (przewodnictwo właściwe 10 mS/cm) oraz mieszając wkraplano małymi porcjami 5% mas. roztwór kwasu octowego aż do osiągnięcia pH 5. Mieszaninę ogrzewano do temperatury 60°C aż do całkowitego rozpuszczenia się chitozanu. Następnie do roztworu, podczas mieszania, dodawano 2% mas. roztwór KOH aż do uzyskania wartości pH równej 7. Otrzymano chitozan w postaci amorficznej, który następnie oczyszczano poprzez zastosowanie membrany dializacyjnej o MWCO z zakresu 10 000-12 000 Da. Końcowe stężenie zawiesiny chitozanu w wodzie wynosiło 10 g/l.In the meantime, to prepare chitosan in an amorphous form, 10 g of chitosan with an average molar mass of 200,000 g/mol, obtained from mushrooms, was added to 2000 ml of distilled water (conductivity 10 mS/cm) and, while stirring, 5 wt.% acetic acid solution until pH 5 was reached. The mixture was heated to 60°C until the chitosan was completely dissolved. Then, 2 wt.% was added to the solution while stirring. KOH solution until a pH of 7 was obtained. Amorphous chitosan was obtained, which was then purified by using a dialysis membrane with a MWCO in the range of 10,000-12,000 Da. The final concentration of chitosan suspension in water was 10 g/l.

Środek hemostatyczny przygotowano z zastosowaniem mieszadła mechanicznego (300 rpm). Do 40 ml zawiesiny chitozanu o stężeniu 10 g/l dodawano, podczas mieszania, kroplami w czasie 10 minut 4 ml wodnego roztworu poli(kwasu asparaginowego). Utworzony produkt pozostawiono do odstania na 20 minut, a następnie zdekantowano. Wodną zawiesinę tak usieciowanego chitozanu oziębiono do 5°C, a następnie dodano, podczas mieszania, 10 mg lizozymu w postaci wodnego roztworu o stężeniu 2 mg/ml. Powstały materiał kompozytowy zamrożono, a następnie poddano liofilizacji w temperaturze od -40 do -60°C pod ciśnieniem poniżej 1 mbar uzyskując gotowy produkt hemostatyczny.The hemostatic agent was prepared using a mechanical stirrer (300 rpm). To 40 ml of a 10 g/l chitosan suspension, 4 ml of an aqueous solution of poly(aspartic acid) was added dropwise over 10 minutes with stirring. The product formed was allowed to stand for 20 minutes and then decanted. The aqueous suspension of chitosan thus cross-linked was cooled to 5°C, and then 10 mg of lysozyme was added in the form of a 2 mg/ml aqueous solution with stirring. The resulting composite material was frozen and then lyophilized at a temperature of -40 to -60°C under a pressure below 1 mbar to obtain a ready haemostatic product.

Widmo FT-IR otrzymanego środka hemostatycznego przedstawiono na załączonym rysunku na Fig. 2 (przykład 2). Widmo przedstawia pasma charakterystyczne dla chitozanu pochodzące od wolnych grup hydroksylowych (3350 cm^-1) i aminowych (1525 cm^-1; 1156 cm^-1), pasma typowe dla ugrupowań alifatycznych (2957 cm^-1; 2880 cm^-1) wiązań glikozydowych pomiędzy merami chitozanu (1061 cm^-1) oraz pierścieni glukopiranozy (901 cm^-1). Dodatkowo obecne są pasma pochodzące od grup karboksylowych pochodzących od poli(kwasu asparaginowego) (1705 cm^-1).The FT-IR spectrum of the obtained hemostatic agent is shown in the accompanying figure in Fig. 2 (Example 2). The spectrum shows bands characteristic of chitosan coming from free hydroxyl groups (3350 cm ^-1 ) and amino groups (1525 cm ^-1 ; 1156 cm ^-1 ), bands typical of aliphatic groups (2957 cm ^-1 ; 2880 cm ^-1 ) of glycosidic bonds between chitosan units (1061 cm ^-1 ) and glucopyranose rings (901 cm ^-1 ). In addition, there are bands derived from carboxyl groups derived from poly(aspartic acid) (1705 cm ^-1 ).

KORZYSTNE SKUTKI WYNALAZKUBENEFITS OF THE INVENTION

Wynalazek pozwala na otrzymanie bioaktywnego środka hemostatycznego na bazie chitozanu zawierającego lizozym, charakteryzującego się korzystniejszymi właściwościami biologicznymi, zwiększoną biodegradowalnością, zdolnościami sorpcyjnymi i antybakteryjnymi w porównaniu ze środkami hemostatycznymi opartymi o chitozan natywny.The invention allows to obtain a bioactive haemostatic agent based on chitosan containing lysozyme, characterized by more favorable biological properties, increased biodegradability, sorption and antibacterial abilities in comparison to haemostatic agents based on native chitosan.

W procesie prowadzonym sposobem według wynalazku fizyczne sieciowanie chitozanu przeprowadzane jest z użyciem nietoksycznego, ale niestety niestabilnego w czasie czynnika sieciującego, tj. poli(kwasu asparaginowego), co wymagało takiego poprowadzenia całego procesu wytwarzania środka hemostatycznego, aby możliwe było praktycznie równoczesne uzyskanie chitozanu w postaci amorficznej oraz poli(kwasu asparaginowego), w dwóch niezależnych od siebie etapach procesu. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie hydrożelu chitozanowego, który ma niezmodyfikowaną chemicznie strukturę, posiada wolne grupy aminowe odpowiedzialne za korzystne właściwości biologiczne chitozanu i nie wykazuje negatywnego wpływu na żywe komórki eukariotyczne.In the process carried out by the method according to the invention, the physical cross-linking of chitosan is carried out using a non-toxic, but unfortunately unstable in time cross-linking agent, i.e. poly(aspartic acid), which required the entire process of producing the haemostatic agent to be practically simultaneous to obtain chitosan in the form of amorphous and poly(aspartic acid), in two independent process steps. Thanks to this, it is possible to obtain chitosan hydrogel, which has a chemically unmodified structure, has free amino groups responsible for the beneficial biological properties of chitosan and does not have a negative effect on living eukaryotic cells.

Usieciowany chitozan wytworzony sposobem według wynalazku zawiera enzym - lizozym, który stabilizowany jest w trójwymiarowej strukturze usieciowanego chitozanu wiązaniami wodorowymi. Modyfikacja chitozanu poprzez wprowadzenie lizozymu pozwala na zwiększenie szybkości biodegradacji materiału chitozanowego. Sposób według wynalazku pozwala modyfikować stopień usieciowania hydrożelu chitozanowego przez zmianę ilości czynnika sieciującego oraz szybkość biodegradacji produktu finalnego przez zmianę ilości lizozymu.The cross-linked chitosan produced by the method according to the invention contains an enzyme - lysozyme, which is stabilized in the three-dimensional structure of the cross-linked chitosan with hydrogen bonds. Modification of chitosan by introducing lysozyme allows to increase the rate of biodegradation of chitosan material. The method according to the invention allows to modify the degree of cross-linking of chitosan hydrogel by changing the amount of cross-linking agent and the biodegradation rate of the final product by changing the amount of lysozyme.

Ponadto korzystną cechą sposobu według wynalazku jest brak szkodliwych produktów ubocznych.Moreover, an advantage of the process according to the invention is the absence of harmful by-products.

Claims

1. A method for obtaining a bioactive hemostatic agent based on chitosan, in which polysuccinimide is converted to poly(aspartic acid) and purified by alkaline hydrolysis, and chitosan is dissolved in an aqueous acid solution, precipitated with alkali, purified and reacted physical cross-linking with poly(aspartic acid) in an aqueous medium, after which the post-reaction suspension is cooled, an aqueous lysozyme solution is added, frozen and lyophilized, characterized in that the polysuccinimide, obtained by polycondensation of aspartic acid or maleic anhydride and urea, is subjected to alkaline hydrolysis by introducing the addition of an aqueous base solution into the aqueous suspension of polysuccinimide, with constant stirring and adding the base solution in portions until the pH of the mixture is 11, obtaining a poly(aspartic acid) salt, in which cations are then exchanged for protons using an ion exchange resin, and in during this time, chitosan with an average molar mass of 2,000 to 800,000 g/mol and a degree of deacetylation of 60-100% is dissolved in 1 to 5 wt. an aqueous acid solution, precipitates with an aqueous alkali solution, and then removes the formed salt from the post-reaction suspension by membrane dialysis, using MWCO dialysis membranes, and subjects the chitosan to a physical cross-linking reaction, introducing the aqueous solution of the obtained poly(aspartic acid) into the purified chitosan suspension as a cross-linking agent, with a weight ratio of chitosan : crosslinking agent ranging from 1:0.1 to 1:6, the chitosan crosslinking reaction is carried out with continuous stirring, and after crosslinking the mixture is cooled to a temperature not higher than 5°C and lysozyme is added in the form of of an aqueous solution, in the amount of at least 12.5 mg per 1000 mg of cross-linked chitosan, and then the mixture containing cross-linked chitosan with lysozyme incorporated into its structure is subjected to freezing and lyophilization at a temperature of -40 to -60°C under a pressure below 1 mbar.

2. The method of claim The method according to claim 1, characterized in that the hydrolysis of polysuccinimide is carried out using an aqueous alkali solution with a concentration of at least 1% by weight, and preferably with a NaOH or KOH solution with a concentration of 5% by weight.

3. The method of claim The method according to claim 1, characterized in that the process of obtaining poly(aspartic acid) uses an aqueous suspension containing 10 wt. polysuccinimide.

4. The method of claim The process according to claim 1, characterized in that the hydrolysis of polysuccinimide is carried out with continuous stirring, using a magnetic or mechanical stirrer, at a speed of 300 rpm.

5. The method of claim The method of claim 1, wherein during the hydrolysis of the polysuccinimide, the aqueous base solution is introduced in portions while stirring.

6. The method of claim The method of claim 1 or 5, wherein the addition of the base solution in the polysuccinimide hydrolysis process is carried out until the pH of the mixture is 11.

7. The method of claim The method of claim 1, wherein the cations in the poly(aspartic acid) salt are exchanged for protons using a strongly acidic sulfone ion exchange resin.

8. The method of claim The process according to claim 1, characterized in that an aqueous solution of chitosan with a concentration of 1 to 10% by mass is used.

9. The method of claim The method according to claim 1, characterized in that the chitosan is dissolved using 2 to 5 wt. hydrochloric acid solution.

10. The method of claim The method according to claim 1, characterized in that chitosan with an average molar mass of 100,000 to 400,000 g/mol is used.

11. The method of claim The process according to claim 1, characterized in that chitosan with a degree of deacetylation above 75% is used, preferably of fungal origin.

12. The method of claim The method according to claim 1, characterized in that the dissolved chitosan is precipitated with an aqueous solution of alkali, especially 2 wt. NaOH or KOH solution.

13. The method of claim The method of claim 1, characterized in that the chitosan solution is purified from salts using 10,000-12,000 Da MWCO dialysis membranes.

14. The method of claim The process according to claim 1, characterized in that an aqueous solution of poly(aspartic acid) is added in portions to the aqueous suspension of chitosan while maintaining constant stirring at a speed of 300-400 rpm.

15. The method of claim The method according to claim 1, characterized in that the physical cross-linking of chitosan is carried out with a ratio of 0.5-2.25 g of poly(aspartic acid) per 1 g of chitosan.

16. The method of claim The process according to claim 1, characterized in that the suspension of cross-linked chitosan is cooled to 3°C.

17. The method of claim The process according to claim 1, characterized in that an aqueous solution of lysozyme is added portionwise to the physically cross-linked chitosan while stirring, maintaining a mass ratio of chitosan to lysozyme of 1000:12.5-25.

18. The method of claim The method of claim 1, characterized in that hen egg white lysozyme is used.

19. The method of claim The method according to claim 1, characterized in that the composite of cross-linked chitosan with incorporated lysozyme is frozen at a temperature below 0°C, preferably -20°C.

20. The method according to claim 19, characterized in that the frozen composite is lyophilized at a temperature of -40 to -60°C and a pressure below 1 mbar.