PL242834B1 - Method for obtaining biological implant for regeneration of cartilaginous tissue - Google Patents
Method for obtaining biological implant for regeneration of cartilaginous tissue Download PDFInfo
- Publication number
- PL242834B1 PL242834B1 PL425169A PL42516918A PL242834B1 PL 242834 B1 PL242834 B1 PL 242834B1 PL 425169 A PL425169 A PL 425169A PL 42516918 A PL42516918 A PL 42516918A PL 242834 B1 PL242834 B1 PL 242834B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- chondrocytes
- membrane
- density
- cells
- minutes
- Prior art date
Links
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania biologicznego implantu do regeneracji tkanki chrzęstnej, obejmujący etapy: izolację chondrocytów z tkanki chrzęstnej, hodowlę wyizolowanych chondrocytów, umieszczania i prowadzenia hodowli chondrocytów na powierzchni membrany opartej na pochodnej kwasu hialuronowego. Sposób ten charakteryzuje się tym, że w kolejnym etapie prowadzi się wizualizację chondrocytów za pomocą roztworu trypsyny o stężeniu 0.25% i barwnika fluorescencyjnego silnie wiążącego się do DNA oraz przeprowadza się ocenę zagęszczenia chondrocytów na powierzchni membrany opartej na pochodnej kwasu hialuronowego poprzez zastosowanie trawienia enzymatycznego.The subject of the application is a method for obtaining a biological implant for the regeneration of cartilage tissue, comprising the steps of: isolation of chondrocytes from cartilage tissue, cultivation of isolated chondrocytes, placement and cultivation of chondrocytes on the surface of a membrane based on a hyaluronic acid derivative. This method is characterized in that in the next step chondrocytes are visualized using a trypsin solution with a concentration of 0.25% and a fluorescent dye strongly binding to DNA, and the chondrocyte density on the surface of the membrane based on a hyaluronic acid derivative is assessed by the use of enzymatic digestion.
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Wynalazek dotyczy sposobu określania zagęszczenia chondrocytów w biologicznym implancie składającym się z membrany opartej na estrowej pochodnej kwasu hialuronowego z umieszczonymi na niej chondrocytami. Rozwiązanie według wynalazku znajduje zastosowanie do regeneracji ludzkiej tkanki chrzęstnej.The invention relates to a method for determining the density of chondrocytes in a biological implant consisting of a membrane based on an ester derivative of hyaluronic acid with chondrocytes placed thereon. The solution according to the invention is applicable to the regeneration of human cartilage tissue.
Choroby degeneracyjne oraz urazy mechaniczne tkanki chrzęstnej stawu kolanowego są jedną z przyczyn ograniczających zdolności ruchowe znacznej populacji społeczeństwa, niezależnie od przedziału wiekowego. Rekonstrukcja uszkodzonej tkanki chrzęstnej jest ważnym przedsięwzięciem uzupełnienia uszkodzonej tkanki zarówno stawu kolanowego jak i biodrowego. Obecnie stosowane techniki naprawy ubytków tkankowych w obrębie obu stawów takie jak abrazja, mikrozłamania, mają na celu pobudzenie tkanki chrzęstnej, które powinno prowadzić do jej regeneracji. Ponadto, brak pełnej skuteczności stosowanych metod leczenia oraz wysokie koszty inwazyjnych zabiegów np. zastąpienie uszkodzonego stawu endoprotezą, są inspiracją do prowadzenia badań nad opracowaniem tańszych i wydajniejszych rozwiązań z zakresu hodowli komórek, a w szczególności umieszczania komórek tkanki chrzęstnej - chondrocytów w strukturach przestrzennych. Namnażanie izolowanych chondrocytów w warunkach in vitro w postaci monowarstwy prowadzi do utraty specyficznego dla tych komórek immunofenotypu. Obecnie prowadzone badania zmierzają do umieszczenia chondrocytów na strukturach przestrzennych, w tym celu stosuje się trójwymiarowe konstrukcje (scaffold), które mogą być wykonane z materiałów naturalnych lub materiałów syntetycznych. Wysoka porowatość scaffoldów umożliwia prowadzenie przestrzennych hodowli w warunkach wysokiej gęstości komórek przypadających na określoną objętość powstałego materiału biologicznego.Degenerative diseases and mechanical injuries of the cartilage of the knee joint are one of the reasons that limit the mobility of a large population of the population, regardless of age. Reconstructing damaged cartilage is an important endeavor to replace damaged tissue in both the knee and hip joints. The currently used techniques for repairing tissue defects within both joints, such as abrasion, microfractures, are aimed at stimulating the cartilage tissue, which should lead to its regeneration. In addition, the lack of full effectiveness of the treatment methods used and the high costs of invasive procedures, e.g. replacing a damaged joint with an endoprosthesis, are an inspiration to conduct research on developing cheaper and more efficient solutions in the field of cell culture, in particular placing cartilage cells - chondrocytes in spatial structures. Multiplication of isolated chondrocytes in vitro in the form of a monolayer leads to the loss of the specific immunophenotype for these cells. Current research is aimed at placing chondrocytes on spatial structures, for this purpose three-dimensional constructions (scaffold) are used, which can be made of natural or synthetic materials. The high porosity of scaffolds makes it possible to carry out spatial cultures in conditions of high density of cells per specific volume of the resulting biological material.
Z polskiego opisu patentowego nr PL213865 (B1) znany jest sposób otrzymywania autologicznego przeszczepu chondrocytów w kleju tkankowym na bazie fibrynogenu, złożony z czynności pobrania chrząstki z nieobciążonej części stawu kolanowego oraz przeważnie pobrania krwi od pacjenta, wstępnej obróbki preparatu, rozdrabniania pobranej chrząstki na małe fragmenty, oddzielenia surowicy od pobranej krwi, trawienia chrząstki, wysiewania komórek chrząstki, namnażania hodowlanych komórek chondrocytów i pasażowania namnożonych komórek oraz dalszej obróbki uzyskiwanych komórek chondrocytów, charakteryzuje się tym, że pobrany artroskopowo fragment chrząstki stawowej transportuje się w sterylnej probówce w schłodzonej soli fizjologicznej w temperaturze od +2°C do +8°C, a donację krwi w temperaturze pokojowej, otrzymane fragmenty chrząstki w laboratorium hodowli komórek płucze się kilkakrotnie w pożywce hodowlanej i przechowuje się w lodówce, donację krwi od pacjenta wiruje się, a następnie surowicę ściąga się i zbiera się w probówce, po czym filtruje się, rozpipetowuje się do małych probówek i zamraża w temperaturze -20°C, strawioną chrząstkę przepuszcza się przez filtr nylonowy i płucze się komórki w odżywce, następnie wysiewa się w pożywce DNEM/Ham'sF12, a po osiągnięciu 80% konfluencji komórek przesiewa się je na butelkę hodowlaną i prowadzi się namnażanie w kolejnych butelkach hodowlanych, dalej przed zakończeniem hodowli chondrocytów pobiera się donację krwi, korzystnie od pacjenta, z której przygotowuje się autologiczny fibrynogen, po czym po dwukrotnym płukaniu chondrocytów w pożywce Ham'sF 12 z 10% autologiczną surowicą komórki chondrocytów miesza się z fibrynogenem i aprotyniną w jednej probówce, a w drugiej probówce przygotowuje się trombinę z 10% chlorkiem wapnia i w końcu w formie utworzonej z jednorazowej strzykawki nakłada się kolejno fibrynogen z chondrocytami i aprotyniną, a następnie dodaje się trombiny z chlorkiem wapnia i zaciska się z dwóch stron tłokami do czasu zastygnięcia przeszczepu o grubości 2-3 mm i średnicy 20 mm. Wyhodowane chondrocyty zawiesza się w autologicznym fibrynogenie, który jest składnikiem kleju tkankowego.From the Polish patent description No. PL213865 (B1) there is known a method of obtaining an autologous chondrocyte transplant in fibrinogen-based tissue glue, consisting of the procedure of collecting cartilage from the unloaded part of the knee joint and usually taking blood from the patient, preliminary processing of the preparation, grinding the collected cartilage into small fragments , separation of serum from the collected blood, digestion of the cartilage, seeding of cartilage cells, propagation of cultured chondrocyte cells and passage of the propagated cells, and further processing of the obtained chondrocyte cells, characterized in that the arthroscopically collected fragment of articular cartilage is transported in a sterile tube in cooled saline at a temperature from +2°C to +8°C, and the blood donation at room temperature, the cartilage fragments obtained in the cell culture laboratory are washed several times in culture medium and stored in the refrigerator, the blood donation from the patient is centrifuged, and then the serum is collected and collected in a tube, then filtered, pipetted into small tubes and frozen at -20°C, the digested cartilage is passed through a nylon filter and the cells are washed in nutrient solution, then seeded in DNEM/Ham'sF12 medium, and after reaching 80% confluence of cells, they are screened on a culture bottle and multiplication is carried out in subsequent culture bottles, then before the end of the chondrocyte culture, a blood donation is taken, preferably from the patient, from which autologous fibrinogen is prepared, and then, after washing the chondrocytes twice in the medium Ham'sF 12 with 10% autologous chondrocyte serum is mixed with fibrinogen and aprotinin in one tube, thrombin with 10% calcium chloride is prepared in the other tube and finally fibrinogen with chondrocyte and aprotinin is applied in the form of a disposable syringe, and then thrombin with calcium chloride is added and clamped on both sides with pistons until the graft is solidified, 2-3 mm thick and 20 mm in diameter. The cultured chondrocytes are suspended in autologous fibrinogen, which is a component of tissue glue.
Z polskiego zgłoszenia patentowego nr P373554 (A1) znana jest płynna kompozycja do wszczepiania, zawierająca materiał podporowy, taki jak na przykład różne postacie kolagenowych lub alginianowych paciorków lub nici, które są w stanie ułatwiać przytwierdzanie do nich i wzrost komórek chrzęstnych (chondrocytów), i sposób wytwarzania płynnej kompozycji do wszczepiania, zawierającej materiał podporowy i zatrzymane na nim chondrocyty. Ponadto w/w zgłoszenie ujawnia sposób skutecznego leczenia wchodzącej w obręb stawu chrząstki stawowej przez wszczepienie płynnej kompozycji, zawierającej materiał podporowy i zatrzymane na nim chondrocyty.Polish patent application No. P373554 (A1) discloses a liquid composition for implantation containing a support material, such as, for example, various forms of collagen or alginate beads or threads, which are able to facilitate the attachment and growth of cartilage cells (chondrocytes) and a method of producing a fluid implantable composition comprising a support material and chondrocytes retained thereon. In addition, the above-mentioned application discloses a method of effectively treating articular cartilage within the joint by implanting a fluid composition comprising a support material and chondrocytes retained thereon.
W europejskim opisie patentowym nr EP1201749 (B1) ujawniono sposób wytwarzania implantu chrząstki ludzkiej z chondrocytów hodowanych in vitro, który to proces obejmuje następujące etapy: a) poddanie chrząstki od pacjenta jednemu lub większej liczbie enzymów trawiących zewnątrzkomórkową matrycę, w ten sposób izolując chondrocyty; b) umieszcza się izolowany chondrocyt w naczyniu hodowlanym i prowadzi się hodowlę tych chondrocytów w pożywce zawierającej czynniki wzrostu i co najmniej jedną z surowicy ludzkiej i cielęcej; c) mieszanie chondrocytów w roztworze buforowym zawierającym alginian, w którym chondrocyty kapsułkują się w perełkach alginianu i prowadzi się hodowlę kapsułkowanych chondrocytów w 34-39°C pod cząstkowym ciśnieniem tlenu poniżej 10% objętościowych, w roztworze odżywczym zawierającym jeden lub więcej chondrogennych czynników wzrostu i ludzką surowicę, i izolowanie chondrocytów z alginianu przez działanie roztworem buforowym cytrynianu; d) odwirowanie izolowanych chondrocytów z etapu c) z wytworzeniem agregatu chondrocytów, hodowanie odwirowanych chondrocytów w pożywce zawierającej jeden lub więcej chondrogennych czynników wzrostu i surowicę ludzką, ponowne wcieranie w ten sposób utworzonego agregatu na powierzchni pokrytej agarozą, i hodowanie zagregowanych chondrocytów pod ciśnieniem cząstkowym tlenu 21% objętościowo w pożywce zawierającej jeden lub więcej chondrogennych czynników wzrostu i surowicę ludzką.EP1201749 (B1) discloses a method for producing a human cartilage implant from in vitro cultured chondrocytes, the process comprising the steps of: a) subjecting cartilage from a patient to one or more extracellular matrix digesting enzymes, thereby isolating the chondrocytes; b) placing the isolated chondrocyte in a culture vessel and culturing said chondrocytes in a medium containing growth factors and at least one of human and calf serum; c) mixing the chondrocytes in an alginate-containing buffer solution, wherein the chondrocytes are encapsulated in alginate beads, and culturing the encapsulated chondrocytes at 34-39°C with an oxygen partial pressure of less than 10% by volume, in a nutrient solution containing one or more chondrogenic growth factors, and human serum, and isolating the alginate chondrocytes by treatment with a citrate buffer solution; d) centrifuging the isolated chondrocytes of step c) to form a chondrocyte aggregate, culturing the centrifuged chondrocytes in a medium containing one or more chondrogenic growth factors and human serum, rubbing the thus formed aggregate on an agarose-covered surface, and culturing the aggregated chondrocytes under a partial pressure of oxygen 21% by volume in a medium containing one or more chondrogenic growth factors and human serum.
Z europejskiego opisu patentowego nr EP1201749 (B1) znany jest sposób hodowli chondrocytów in vitro w monowarstwie w medium hodowlanym zawierającym cielęcą surowicę oraz szereg cytokin i czynników wzrostu. Chondrocyty do hodowli pozyskiwano poprzez trawienie enzymatyczne stawowej tkanki chrzęstnej pobranej od pacjentów. Wstępne namnożone chondrocyty przenoszono do naczynia hodowlanego z warstwą agarozy, co miało inicjować tworzenie się agregatów chondrocytów.The European patent description No. EP1201749 (B1) discloses a method for cultivating chondrocytes in vitro in a monolayer in a culture medium containing calf serum and a number of cytokines and growth factors. Chondrocytes for culture were obtained by enzymatic digestion of articular cartilage tissue taken from patients. The pre-propagated chondrocytes were transferred to a culture dish with a layer of agarose to initiate the formation of chondrocyte aggregates.
Polskie zgłoszenie patentowe nr P380852 (A1) ujawnia kompozycje kwasu hialuronowego (HA), które zawierają usieciowane, nierozpuszczalne w wodzie, uwodnione cząstki żelu HA. HA zawiera struktury sieciowe reprezentowane następującym wzorem strukturalnym: HA'-U-R2-U-HA'. Sposób powiększania tkanki w obiektach obejmuje wprowadzanie igły do obiektu w miejscu, w którym obiekt potrzebuje powiększenia tkanki, w którym igłę przyłącza się do strzykawki zawierającej kompozycję HA i przykłada się siłę do strzykawki, aby dostarczyć kompozycję HA obiektowi. Sposób przygotowania kompozycji HA, który obejmuje formowanie nierozpuszczalnych w wodzie, odwodnionych usieciowanych cząstek HA, oddzielanie nierozpuszczalnych w wodzie, odwodnionych cząstek przez średnią średnicę, wybranie podzbioru cząsteczek przez średnią średnicę oraz uwodnienie podzbioru odwodnionych cząstek fizjologicznie kompatybilnym roztworem wodnym.Polish patent application No. P380852 (A1) discloses hyaluronic acid (HA) compositions that contain cross-linked, water-insoluble, hydrated HA gel particles. HA contains lattice structures represented by the following structural formula: HA'-U-R2-U-HA'. The method of augmenting tissue in objects includes inserting a needle into the object where the object needs tissue augmentation, wherein the needle is attached to a syringe containing the HA composition, and a force is applied to the syringe to deliver the HA composition to the object. A method of preparing an HA composition that comprises forming water-insoluble, dehydrated cross-linked HA particles, separating the water-insoluble, dehydrated particles by mean diameter, selecting a subset of particles by mean diameter, and hydrating the subset of dehydrated particles with a physiologically compatible aqueous solution.
Jednym z istotnych problemów w prowadzeniu hodowli chondrocytów na strukturze przestrzennej wykonanej z estrowej pochodnej kwasu hialuronowego jest brak technik pozwalających na ich uwidocznienie i umożliwiających ocenę zagęszczenia chondrocytów w strukturze trójwymiarowej. Zastosowana struktura to biały włókninowy podkład w skład, którego wchodzą włókna tworzące siatkę. Jedną z przeszkód uwidocznienia chondrocytów w strukturze membrany z zastosowaniem technik immunoenzymatycznych i fluorescencyjnych jest ograniczona zdolność penetracji i wiązania zastosowanych przeciwciał z chondrocytami w poszczególnych warstwach struktury. Ponadto, przy zastosowaniu obu technik obserwuje się reakcje nieswoiste, jakie wykazują włókna estrowej pochodnej kwasu hialuronowego.One of the significant problems in cultivating chondrocytes on a spatial structure made of an ester derivative of hyaluronic acid is the lack of techniques allowing for their visualization and assessment of chondrocyte density in a three-dimensional structure. The structure used is a white non-woven base composed of fibers forming a mesh. One of the obstacles in visualizing chondrocytes in the membrane structure with the use of immunoenzymatic and fluorescent techniques is the limited ability of the antibodies used to penetrate and bind with chondrocytes in individual layers of the structure. In addition, non-specific reactions are observed with both techniques, which are exhibited by the fibers of the ester derivative of hyaluronic acid.
Celem wynalazku było takie opracowanie sposobu określania zagęszczenia chondrocytów w bioimplancie, który pozwala na wizualizację chondrocytów oraz ocenę ich zagęszczenia na powierzchni membrany opartej na estrowej pochodnej kwasu hialuronowego.The aim of the invention was to develop a method for determining the density of chondrocytes in a bioimplant, which allows visualization of chondrocytes and assessment of their density on the surface of the membrane based on an ester derivative of hyaluronic acid.
Istota sposobu określania zagęszczenia chondrocytów w biologicznym implancie do regeneracji tkanki chrzęstnej, obejmującego etapy: izolację chondrocytów z tkanki chrzęstnej, hodowlę wyizolowanych chondrocytów, umieszczania i prowadzenia hodowli chondrocytów na powierzchni membrany opartej na estrowej pochodnej kwasu hialuronowego, charakteryzuje się tym, że w kolejnym etapie prowadzi się wizualizację chondrocytów za pomocą roztworu trypsyny o stężeniu 0,25% i barwnika fluorescencyjnego silnie wiążącego się do DNA w postaci DAPI lub błękitu trypanowego oraz prowadzi się ocenę rozmieszczenia i zagęszczenia chondrocytów na powierzchni membrany opartej na estrowej pochodnej kwasu hialuronowego, poprzez zastosowanie trawienia enzymatycznego, przy czym etap wizualizacji polega na usunięciu podłoża hodowlanego w którym znajduje się membrana, dodaniu trypsyny o stężeniu 0,25%, umieszczeniu na 1 minutę w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C, dodaniu barwnika fluorescencyjnego silnie wiążącego się do DNA w ilości 50 μl na fragment powierzchni membrany, a ocena zagęszczenia chondrocytów na powierzchni biodegradowalnej trójwymiarowej membrany polega na tym, że po zakończeniu hodowli, po 2-3 tygodniach usuwa się podłoże hodowlane i dodaje się 0,25% roztworu trypsyny, membranę umieszcza się na 5 minut w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C, dodaje się DMEM/F12, całość wiruje się przy prędkości obrotowej 2000 obr./min., po usunięciu supernatantu znad osadu, roztwór filtruje się przez membranę nylonową o średnicy 40 μm, a otrzymaną zawiesinę chondrocytów wiruje się przy prędkości obrotowejThe essence of the method for determining the density of chondrocytes in a biological implant for the regeneration of cartilage tissue, comprising the steps of: isolation of chondrocytes from cartilage tissue, cultivation of isolated chondrocytes, placement and cultivation of chondrocytes on the surface of a membrane based on an ester derivative of hyaluronic acid, is characterized in that in the next step chondrocytes are visualized using a trypsin solution with a concentration of 0.25% and a fluorescent dye strongly binding to DNA in the form of DAPI or trypan blue, and the distribution and density of chondrocytes on the surface of the membrane based on an ester derivative of hyaluronic acid is assessed by the use of enzymatic digestion, the visualization stage consists in removing the culture medium in which the membrane is located, adding trypsin with a concentration of 0.25%, placing it in a CO2 incubator at 37°C for 1 minute, adding a fluorescent dye strongly binding to DNA in the amount of 50 μl per fragment of the membrane surface, and the assessment of chondrocyte density on the surface of the biodegradable three-dimensional membrane consists in the fact that after the end of the culture, after 2-3 weeks, the culture medium is removed and 0.25% trypsin solution is added, the membrane is placed for 5 minutes in incubator with CO2 flow at 37°C, DMEM/F12 is added, the whole is centrifuged at 2000 rpm, after removing the supernatant from the sediment, the solution is filtered through a nylon membrane with a diameter of 40 μm, and the obtained suspension of chondrocytes spins at rotational speed
2000 obr./min, usuwa supernatant, do osadu dodaje 1 ml PBS, sporządza preparaty i przeprowadza się ocenę zagęszczenia chondrocytów na membranie licząc chondrocyty w komorze Burkera wg. wzoru:2000 rpm, the supernatant is removed, 1 ml of PBS is added to the sediment, preparations are made and the chondrocyte concentration on the membrane is assessed by counting chondrocytes in the Burker chamber according to formula:
Ilość komórek w 1 μl = A x 20 x 250, w którym A oznacza średnią liczbę chondrocytów liczonych w 1 kwadracie komory Burkera, składającego się z 16 pól.Number of cells in 1 μl = A x 20 x 250, where A is the average number of chondrocytes counted in 1 square Burker chamber, consisting of 16 cells.
Korzystnie w etapie wizualizacji przed dodaniem barwnika fluorescencyjnego membranę poddaje się na fragmenty o wymiarach nie większych niż 0,05 x 0,05 cm2, utrwaleniu w metanolu o temperaturze +4°C przez 10 minut, suszeniu preparatów w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Preferably, in the visualization stage, prior to the addition of a fluorescent dye, the membrane is subjected to fragments not larger than 0.05 x 0.05 cm 2 , fixed in methanol at +4°C for 10 minutes, and dried at room temperature for 20 minutes.
Korzystnie przeprowadzenie oceny rozmieszczenia i zagęszczania prowadzi się w mikroskopie odwróconym wyposażonym w system do fluorescencji.Preferably, the assessment of distribution and concentration is carried out in an inverted microscope equipped with a fluorescence system.
Sposobem według wynalazku uzyskuje się biologiczny implant w postaci membrany opartej na estrowej pochodnej kwasu hialuronowego z naniesionymi chondrocytami w wyniku 3-4 tygodniowej hodowli w warunkach in vitro, który może zostać wykorzystany w procedurze regeneracji uszkodzonej tkanki chrzęstnej w obrębie stawu kolanowego lub biodrowego z wykorzystaniem wcześniej pobranej tkanki chrzęstnej pacjenta poddanej procesom obróbki enzymatyczno-biologicznej, jak opisano wyżej. W prowadzonych badaniach ustalono, że komórki zlokalizowane na trójwymiarowej membranie opartej na estrowej pochodnej kwasu hialuronowego wykazują żywotności na poziomie 98% i wartość ta jest zbliżona do wartości kontrolnej (chondrocytów hodowanych, jako monowarstwa przez okres 2-3 tygodni), która wynosiła 99% żywych komórek. Stwierdzenie reakcji dodatniej w znacznym odsetku komórek (70-80% dodatnich komórek) z przeciwciałem wykrywającymi kolagen typu II oraz agrekan, natomiast niska immunoreaktywność komórek z przeciwciałem wykrywającym kolagen typu I (15-20% dodatnich komórek) potwierdza, że hodowane komórki wykazują fenotyp charakterystyczny dla chondrocytów. Udowodniono, że w trakcie hodowli chondrocytów umieszczonych na membranie opartej na pochodnej kwasu hialuronowego dochodzi do reekspresji kolagenu typu II w hodowanych komórkach, co zostało potwierdzone wzrostem odsetka komórek wykazujących jego obecność z 40% do 85% dodatnich komórek. Stwierdzenie obecności antygenu Ki-67 w znacznym odsetku chondrocytów hodowanych na membranie opartej na estrowej pochodnej kwasu hialuronowego wskazuje na ich wysoką aktywność proliferacyjną.With the method according to the invention, a biological implant is obtained in the form of a membrane based on an ester derivative of hyaluronic acid with chondrocytes applied as a result of a 3-4 week in vitro culture, which can be used in the procedure of regeneration of damaged cartilage within the knee or hip joint using previously the collected cartilage tissue of the patient subjected to enzymatic-biological treatment processes as described above. In the conducted research, it was found that cells located on a three-dimensional membrane based on an ester derivative of hyaluronic acid show viability at the level of 98% and this value is close to the control value (chondrocytes grown as a monolayer for 2-3 weeks), which was 99% viable cells. The positive reaction of a significant percentage of cells (70-80% of positive cells) with the antibody detecting type II collagen and aggrecan, while the low immunoreactivity of cells with the antibody detecting type I collagen (15-20% of positive cells) confirms that the cultured cells show a characteristic phenotype for chondrocytes. It has been proven that during the culture of chondrocytes placed on a membrane based on a derivative of hyaluronic acid, re-expression of type II collagen occurs in the cultured cells, which was confirmed by an increase in the percentage of cells showing its presence from 40% to 85% of positive cells. The presence of the Ki-67 antigen in a significant percentage of chondrocytes cultured on a membrane based on an ester derivative of hyaluronic acid indicates their high proliferative activity.
Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładzie wykonania oraz na rysunku na którym:The subject of the invention is presented in more detail in an embodiment and in the drawing where:
fig. 1 przedstawia przyżyciowy obraz chondrocytów rosnących na membranie przed dodaniem trypsyny, fig. 2 przedstawia rozmieszczenie chondrocytów na membranie po dodaniu trypsyny, fig. 3 przedstawia membranę po dodaniu trypsyny oraz po wybarwieniu barwnikiem DAPI, fig. 4 przedstawia rozmieszczenie chondrocytów na pojedynczych włóknach membrany po dodaniu trypsyny oraz po wybarwieniu barwnikiem błękit trypanowy, fig. 5 przedstawia rozmieszczenie chondrocytów na pojedynczych włóknach membrany po dodaniu trypsyny oraz po wybarwieniu barwnikiem DAPI, fig. 6 przedstawia zagęszczenie chondrocytów rosnących na membranie po dodaniu trypsyny i wybarwieniu barwnikiem błękit trypanowy, fig. 7 przedstawia zagęszczenie i żywotność chondrocytów rosnących na membranie po dodaniu trypsyny i wybarwieniu barwnikiem błękit trypanowy.Fig. 1 shows the in vivo picture of chondrocytes growing on the membrane before trypsin addition, Fig. 2 shows the distribution of chondrocytes on the membrane after trypsin addition, Fig. 3 shows the membrane after trypsin addition and after staining with DAPI dye, Fig. 4 shows the distribution of chondrocytes on the single fibers of the membrane after adding trypsin and after staining with trypan blue dye, Fig. 5 shows the distribution of chondrocytes on single fibers of the membrane after adding trypsin and after staining with DAPI dye, Fig. 6 shows the density of chondrocytes growing on the membrane after adding trypsin and staining with Trypan blue dye, Fig. 7 shows the density and viability of chondrocytes growing on a membrane after adding trypsin and staining with trypan blue dye.
Przykład realizacjiExample of implementation
Etap 1. Przygotowanie tkanki chrzestnej do trawienia enzymatycznego.Stage 1. Preparation of cartilage for enzymatic digestion.
Fragment tkanki chrzęstnej w ilości około 300-400 mg (0,5 cm2) umieszcza się w szalce Petriego o średnicy 5,5 cm z dodatkiem 4 ml podłoża DMEM/F12 (bez surowicy płodowej). Następnie w warunkach jałowych tkanka jest cięta przy użyciu skalpela na mniejsze fragmenty około 1-2 mm3. Rozdrobniona tkanka chrzęstna poddawana jest trawieniu enzymatycznemu celem uwolnienia chondroblastów/chondrocytów.Approximately 300-400 mg (0.5 cm 2 ) of cartilage tissue is placed in a 5.5 cm diameter Petri dish with 4 ml of DMEM/F12 medium (without fetal serum). Then, under sterile conditions, the tissue is cut using a scalpel into smaller fragments of about 1-2 mm 3 . The shredded cartilage is subjected to enzymatic digestion to release chondroblasts/chondrocytes.
Etap 2. Trawienie enzymatyczne rozdrobnionej tkanki chrzestnej.Stage 2. Enzymatic digestion of fragmented cartilage tissue.
Pociętą na fragmenty tkankę chrzęstną przenosi się do szalki Petriego o średnicy 3,5 cm, dodaje 0,25% roztwór trypsyny w ilości 2 ml i umieszcza na 30 minut w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C. Po 30 minutach do szalki dodaje się 2 ml podłoża hodowlanego DMEM/F12, zawiesinę wraz z rozdrobnioną tkanką przenosi się do probówki, wiruje przez 4 minuty przy prędkości obrotowejThe fragmented cartilage is transferred to a 3.5 cm diameter Petri dish, 2 ml of 0.25% trypsin solution is added and placed in a CO 2 incubator at 37°C for 30 minutes. After 30 minutes, 2 ml of DMEM/F12 culture medium is added to the dish, the suspension together with the fragmented tissue is transferred to a test tube, centrifuged for 4 minutes at
1800 obr./min., po czym zlewa supernatant. Do osadu dodaje się 3 ml jałowego PBS bez jonów Ca++, Mg++ i wiruje przy tych samych parametrach wirowania. Następnie zlewa się supernatant, a osad z probówki przenosi się do nowej szalki Petriego, dodaje roztwór 0,8 mg/ml kolagenazy II w ilości 2 ml, umieszcza się na 4 godziny w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C. Po 2 godzinach szalkę wraz z tkanką umieszcza się na stoliku mikroskopu odwróconego i ocenia się efektywność trawienia tkanki chrzęstnej. Jeżeli widoczne są fragmenty tkanki chrzęstnej, w której znajdują się chondroblasty/chondrocyty proces trawienia enzymatycznego przedłużany jest o 2 godziny, przy czym wcześniej należy z szalki Petriego zlać roztwór zawierający chondroblasty/chondrocyty do probówki o pojemności 15 ml i dodać DMEM/F12 w ilość 5 ml celem inaktywacji kolagenazy II. Zawartość probówki jest wirowana przez 10 minut przy prędkości obrotowej 2000 obr./min., supernatant jest usuwany, a do osadu dodawany jest jałowy PBS bez jonów Ca++, Mg++ w ilości 3 ml i ponownie wirowany przy zachowaniu parametrów wirowania. Następnie usuwa się supernatant z nad osadu komórkowego, dodaje 0,5 ml DMEM/F12 i przeprowadza się ocenę liczby chondroblastów/chondrocytów wyizolowanych z tkanki chrzęstnej w komorze Burkera według podanej wcześniej procedury. Wyizolowane chondroblasty/chondrocyty w ilości 5 x 105 - 1 x 106 (zależnej od ilości tkanki pobranej od pacjenta) zawieszone w 8 ml DMEM/F12 przenosi się do butelki hodowlanej o pojemności 75 cm2, którą umieszcza się w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C na okres 3-4 tygodni. Szalka Petriego z tkanką chrzęstną o przedłużonym działaniu kolagenazy II (do 4 godzin) jest oceniana w mikroskopie odwróconym. Po stwierdzeniu obecności w szalce Petriego uwolnionych z tkanki komórek powtarzana jest procedura jak opisano powyżej. Z części chondroblastów/chondrocytów pochodzących z obu etapów procedury przygotowuje się zawiesinę zawierającą 2 miliony chondroblastów/chondrocytów na 1 ml PBS i sporządza się preparaty do immunohistochemicznej oceny występowania kolagenu typu I, II, agrekanu oraz czynnika transkrypcyjnego SOX9.1800 rpm, then decant the supernatant. 3 ml of sterile PBS without Ca ++ , Mg ++ ions are added to the pellet and centrifuged at the same centrifugation parameters. The supernatant is then decanted and the sediment from the test tube is transferred to a new Petri dish, 0.8 mg/ml collagenase II solution is added in the amount of 2 ml, placed in a CO 2 incubator at 37°C for 4 hours. After 2 hours, the dish with the tissue is placed on the stage of the inverted microscope and the effectiveness of cartilage digestion is assessed. If fragments of cartilage tissue with chondroblasts/chondrocytes are visible, the enzymatic digestion process is extended by 2 hours, but before that, pour the solution containing chondroblasts/chondrocytes from the Petri dish into a 15 ml tube and add DMEM/F12 in the amount of 5 ml to inactivate collagenase II. The contents of the tube are centrifuged for 10 minutes at 2000 rpm, the supernatant is removed, and sterile PBS without Ca ++ ions, Mg ++ in the amount of 3 ml is added to the pellet and centrifuged again while maintaining the centrifugation parameters. The cell supernatant is then removed, 0.5 ml of DMEM/F12 is added, and the number of chondroblasts/chondrocytes isolated from the cartilage is assessed in a Burker chamber according to the procedure outlined above. Isolated chondroblasts/chondrocytes in the amount of 5 x 105 - 1 x 106 (depending on the amount of tissue collected from the patient) suspended in 8 ml of DMEM/F12 are transferred to a 75 cm2 culture bottle, which is placed in a CO2 flow incubator at 37°C for 3-4 weeks. A petri dish with collagenase II-extended cartilage tissue (up to 4 hours) is evaluated under an inverted microscope. After determining the presence of cells released from the tissue in the Petri dish, the procedure as described above is repeated. A portion of chondroblasts/chondrocytes from both steps of the procedure are used to prepare a suspension containing 2 million chondroblasts/chondrocytes per 1 ml of PBS, and preparations are made for immunohistochemical assessment of collagen type I, II, aggrecan and transcription factor SOX9.
Etap 3. Zwielokrotnienie liczby chondrocytów poprzez prowadzenie 3-4 tygodniowej hodowli in vitro.Stage 3. Multiplying the number of chondrocytes by conducting a 3-4 week in vitro culture.
Do dwóch butelek o pojemności 75 cm2 dodaje się po 8 ml podłoża hodowlanego (w skład którego wchodzą: DMEM/F12, 10% surowica płodowa, gentamycyna, Fungizone) następnie dodaje się chondrocyty/chondroblasty w ilości około 1,5 x 104/cm2 zawieszone w DMEM/F12. Hodowlę chondrocytów prowadzi się w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C. Po 4 dniach od założenia hodowli przeprowadza się pierwszą zmianę podłoża, którą powtarza się co trzy dni. Pierwszą trypsynizację przeprowadza się wówczas, gdy chondrocyty pokryją dno butelki (10-12 dni od założenia hodowli). Trypsynizację prowadzi się po zlaniu podłoża z butelki hodowlanej, przez dodanie 4 ml 0,25% roztworu trypsyny o temperaturze 25°C do chondrocytów przylegających do dna butelki, po czym wstawia się butelkę do inkubatora z przepływem CO2 w temperaturze 37°C na 5-10 minut, w zależności od tempa odklejania się chondrocytów, co sprawdza się w mikroskopie odwróconym. Następnie do butelki zawierającej chondrocyty i roztwór trypsyny dodaje się 4 ml podłoża DMEM/F12, zawiesinę chondrocytów przenosi się do jałowej probówki o pojemności 15 ml i wiruje przez 5 minut przy prędkości obrotowej 1800 obr./min., następnie zlewa supernatant, a do osadu chondrocytów dodaje się 3 ml jałowego PBS bez jonów Ca++, Mg++ i przeprowadza płukanie jak opisano wcześniej. Do dwóch nowych butelek hodowlanych o pojemności 75 cm2 dodaje się po około 1,5 x 104/cm2 chondrocytów (po pierwszej trypsynizacji oraz przefiltrowane przez membranę nylonową o średnicy porów 80 μm) zawieszonych w 8 ml podłoża DMEM/F12 i prowadzi dalszą hodowlę przez następne 14 dni oraz trypsynizację w zależności od tempa wzrostu chondrocytów z zachowaniem tych samych parametrów jak opisano powyżej. Po zakończeniu hodowli uzyskany osad chondrocytów płucze się według procedury opisanej wcześniej. Do probówki zawierającej chondrocyty dodaje się 1 ml jałowego PBS bez jonów Ca++, Mg++ delikatnie mieszając. Następnie poprzez pobranie 50 μl zawiesiny komórkowej, umieszczeniu ich na szkiełku podstawowym i dodaniu 50 μl odczynnika Trypan Blue przeprowadza się ocenę ich żywotności w mikroskopie świetlnym. Ocenę liczebności chondrocytów wykonuje się według wzoru podanego powyżej.To two 75 cm 2 bottles, 8 ml of culture medium (consisting of: DMEM/F12, 10% fetal serum, gentamicin, Fungizone) are added, then chondrocytes/chondroblasts are added in an amount of approximately 1.5 x 10 4 / cm 2 suspended in DMEM/F12. The chondrocytes are cultured in a CO2 flow incubator at 37°C. After 4 days from the establishment of the culture, the first change of the substrate is carried out, which is repeated every three days. The first trypsinization is carried out when the chondrocytes cover the bottom of the bottle (10-12 days from the establishment of the culture). Trypsinization is carried out after decanting the medium from the culture bottle by adding 4 ml of a 0.25% trypsin solution at 25°C to the chondrocytes adjacent to the bottom of the bottle, and then the bottle is placed in a CO2 incubator at 37°C for 5- 10 minutes, depending on the rate of chondrocyte detachment, which is checked in an inverted microscope. Then, 4 ml of DMEM/F12 medium is added to the bottle containing the chondrocytes and trypsin solution, the chondrocyte suspension is transferred to a sterile 15 ml tube and centrifuged for 5 minutes at 1800 rpm, then the supernatant is decanted and the pellet is chondrocytes, 3 ml of sterile PBS without Ca ++ , Mg ++ ions are added and washing is performed as described previously. Approximately 1.5 x 10 4 /cm 2 of chondrocytes (after first trypsinization and filtered through a nylon membrane with a pore diameter of 80 μm) suspended in 8 ml of DMEM/F12 medium are added to two new 75 cm2 culture bottles and further culture for the next 14 days and trypsinization according to the growth rate of the chondrocytes with the same parameters as described above. Upon completion of the culture, the obtained chondrocyte pellet is washed according to the procedure described earlier. 1 ml of sterile PBS without Ca ++ , Mg ++ ions is added to the test tube containing the chondrocytes with gentle stirring. Then, by taking 50 μl of cell suspension, placing them on a glass slide and adding 50 μl of Trypan Blue reagent, their viability is assessed under a light microscope. The assessment of the number of chondrocytes is performed according to the formula given above.
Etap 4. Umieszczenie chondrocytów na trójwymiarowej membranie i prowadzenie ich 2-3 tygodniowej hodowli.Stage 4. Placing chondrocytes on a three-dimensional membrane and cultivating them for 2-3 weeks.
W szalce Petriego o średnicy 35 mm umieszcza się trójwymiarową membranę opartą na estrowej pochodnej kwasu hialuronowego, o wymiarach 0,5 x 0,5 cm2, na którą równomiernie nanosi się chondrocyty w ilości 8 x 106 w 250 μl DMEM/F12. Szalkę Petriego z membraną umieszcza się na 4 godziny w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C. Następnie szalkę z membraną przenosi się pod laminar z jałowym przepływem powietrza, dodaje 3 ml podłoża DMEM/F12 i ponownie umieszcza w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C na okres 2-3 tygodni. Dwa razy w tygodniu zmienia się podłoże hodowlane przez usunięcie starego i dodanie nowego DMEM/F12 w ilości 3 ml.In a Petri dish with a diameter of 35 mm, a three-dimensional membrane based on an ester derivative of hyaluronic acid, with dimensions of 0.5 x 0.5 cm 2 is placed, on which 8 x 106 chondrocytes are evenly applied in 250 μl of DMEM/F12. The Petri dish with the membrane is placed in a CO2 incubator at 37°C for 4 hours. The dish with the membrane is then moved under a sterile air flow laminar, 3 ml of DMEM/F12 medium is added and placed back in a flowing CO2 incubator at 37°C for 2-3 weeks. Twice a week, the culture medium is changed by removing the old one and adding 3 ml of new DMEM/F12.
Etap 5. Wizualizacja chondrocytów na trójwymiarowej membranie opartej na pochodnej kwasu hialuronowegoStage 5. Visualization of chondrocytes on a three-dimensional membrane based on a hyaluronic acid derivative
Po 2-3 tygodniach prowadzenia hodowli chondrocytów umieszczonych na membranie opartej na estrowej pochodnej kwasu hialuronowego przeprowadza się ich wizualizację w strukturze membrany (fig. 1). Z szalki Petriego, w której znajduje się membrana usuwa się podłoże hodowlane i dodaje 3 ml 0,25% roztworu trypsyny, umieszcza na 1 minutę w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C, celem uwidocznienia komórek przyklejonych do membrany poprzez uzyskanie przez chondrocyty kształtu kulistego (fig. 2).After 2-3 weeks of cultivation of chondrocytes placed on a membrane based on an ester derivative of hyaluronic acid, their visualization is carried out in the structure of the membrane (fig. 1). The culture medium is removed from the Petri dish containing the membrane and 3 ml of a 0.25% trypsin solution is added, placed in a CO2 incubator at 37°C for 1 minute, in order to visualize the cells adhered to the membrane by the chondrocyte shape spherical (fig. 2).
Pierwszy sposób wizualizacji chondrocytów na membranie przebiega poprzez usunięcie podłoża hodowlanego z szalki Petriego, w której znajduje się membrana, następnie pocięcie membrany na fragmenty o wymiarach nie większych niż 0,05 x 0,05 cm2, umieszczenie ich na szkiełkach podstawowych, utrwalenie w metanolu o temperaturze +4°C przez 10 minut, suszenie preparatów w temperaturze pokojowej (około 25°C) przez okres 20 minut, dodanie odczynnika o symbolu DAPI w ilości 50 μl na fragment powierzchni membrany, nakrycie szkiełkiem podstawowym i przeprowadzenie oceny w mikroskopie fluorescencyjnym z wykorzystaniem światła wzbudzonego UV lub wybarwia się chondrocyty barwnikiem błękit trypanowy (fig. 4, 5).The first way to visualize chondrocytes on the membrane is by removing the culture medium from the Petri dish in which the membrane is located, then cutting the membrane into fragments no larger than 0.05 x 0.05 cm2, placing them on glass slides, fixing them in methanol at temperature of +4°C for 10 minutes, drying the preparations at room temperature (about 25°C) for 20 minutes, adding the DAPI reagent in the amount of 50 μl per fragment of the membrane surface, covering with a glass slide and carrying out the evaluation in a fluorescence microscope using UV-excited light or chondrocytes are stained with trypan blue dye (Fig. 4, 5).
Drugi sposób wizualizacji chondrocytów polega na usunięciu podłoża hodowlanego DMEM/F12 z szalki, w której znajduje się membrana po zakończeniu hodowli. Następnie na wilgotną membranę znajdującą się w szalce Petriego nanosi się odczynnik DAPI w ilości umożliwiającej pokrycie powierzchni membrany i przeprowadzeniu oceny w mikroskopie odwróconym wyposażonym w system do fluorescencji (fig. 3).The second way to visualize chondrocytes is to remove the DMEM/F12 culture medium from the dish containing the membrane after the culture is complete. Then, an amount of DAPI reagent is applied to the wet membrane in the Petri dish to cover the surface of the membrane and to be evaluated in an inverted microscope equipped with a fluorescence system (Fig. 3).
Etap 6. Ocena zagęszczenia i żywotności chondrocytów zlokalizowanych na trójwymiarowej membranie po zakończeniu hodowli.Step 6. Evaluation of the density and viability of chondrocytes located on a three-dimensional membrane after the end of culture.
Po zakończeniu hodowli (2-3 tygodnie) z szalki Petriego, w której znajduje się membrana usuwa się podłoże hodowlane i dodaje 3 ml 0,25% roztworu trypsyny, umieszcza na 5 minut w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C, po czym szalkę z membraną przenosi się pod laminar i delikatnymi ruchami wytrząsania przy użyciu pęsety, uwalniane są chondrocyty z włókien/struktury membrany (fig. 6). Następie szalkę z membraną zanurzoną w 0,25% roztworze trypsyny ponowie umieszcza się na 2-3 minuty w inkubatorze z przepływem CO2 w temperaturze 37°C, po czym do szalki z membraną dodaje się 3 ml DMEM/F12, całość przenosi się do probówki o pojemności 15 ml, wiruje przez 5 minut przy prędkości obrotowej 2000 obr./min., zlewa supernatant, a osad dwukrotnie płucze przez dodanie 2 ml jałowego PBS bez jonów Ca++, Mg++ i wiruje przez 5 minut przy prędkości obrotowej 2000 obr./min. Po usunięciu supernatantu znad osadu, dodaniu czystego PBS w ilości 3 ml, wymieszaniu zawartości w probówce, roztwór filtruje się przez membranę nylonową o średnicy 40 μm. Otrzymaną zawiesinę chondrocytów wiruje się z zachowaniem parametrów wirowania, usuwa supernatant, do osadu dodaje 1 ml PBS, sporządza preparaty (jak podano wcześniej) i przeprowadza ocenę zagęszczenia chondrocytów na membranie licząc chondrocyty w komorze Burkera (wg. wzoru).After the culture is completed (2-3 weeks), the culture medium is removed from the Petri dish containing the membrane and 3 ml of 0.25% trypsin solution is added, placed for 5 minutes in a CO2 incubator at 37°C, and then the dish with the membrane is moved under the laminar and with gentle shaking movements using tweezers, the chondrocytes are released from the fibers/structure of the membrane (Figure 6). Then the plate with the membrane immersed in a 0.25% trypsin solution is again placed for 2-3 minutes in a CO2 incubator at 37°C, then 3 ml of DMEM/F12 is added to the plate with the membrane, the whole thing is transferred to a test tube with a capacity of 15 ml, centrifuged for 5 minutes at a rotational speed of 2000 rpm, drain the supernatant and rinse the sediment twice by adding 2 ml of sterile PBS without Ca ++ , Mg ++ ions and centrifuge for 5 minutes at a rotational speed of 2000 rpm After removing the supernatant from the sediment, adding 3 ml of pure PBS, mixing the contents in the tube, the solution is filtered through a nylon membrane with a diameter of 40 μm. The obtained chondrocyte suspension is centrifuged using the centrifugation parameters, the supernatant is removed, 1 ml of PBS is added to the pellet, slides are made (as described above) and the chondrocyte density on the membrane is assessed by counting the chondrocytes in the Burker chamber (according to the formula).
Ilość komórek w 1 μl = A x 20 x 250Number of cells in 1 μl = A x 20 x 250
A - średnia liczba chondrocytów liczonych w 1 kwadracie komory Burkera, składającego się z 16 pól.A - the average number of chondrocytes counted in 1 square of the Burker chamber, consisting of 16 fields.
Przeprowadza się ocenę żywotności chondrocytów przez wybranie komórek barwnikiem błękit trypanowy (fig. 7).Chondrocyte viability is assessed by selecting the cells with trypan blue dye (Figure 7).
Etap 7. Sprawdzenie immunofenotypu komórek po 2-3 tygodniowej hodowli na membranieStep 7. Checking the immunophenotype of cells after 2-3 weeks of culture on the membrane
Z osadu chondrocytów, uzyskanych po zakończeniu ich hodowli na membranie opartej na estrowej pochodnej kwasu hialuronowego, sporządza się preparaty do oceny immunohistochemicznej poprzez umieszczenie 50 μl zawiesiny zawierającej około 1 min komórek na szkiełko podstawowe, utrwalenie w zimnym acetonie (+4°C) przez 10 minut i suszenie w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Ocenę immunofenotypu komórek przeprowadza się z wykorzystaniem techniki immunoenzymatycznej i przeciwciał monoklonalnych wykrywających kolagen typu I i II, agrekanu oraz czynnik transkrypcyjny SOX9.From the pellet of chondrocytes, obtained after their cultivation on a membrane based on an ester derivative of hyaluronic acid, preparations for immunohistochemical evaluation are prepared by placing 50 μl of a suspension containing about 1 min of cells on a glass slide, fixation in cold acetone (+4°C) for 10 minutes and drying at room temperature for 30 minutes. The assessment of the immunophenotype of cells is carried out using the immunoenzymatic technique and monoclonal antibodies detecting type I and II collagen, aggrecan and the SOX9 transcription factor.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL425169A PL242834B1 (en) | 2018-04-10 | 2018-04-10 | Method for obtaining biological implant for regeneration of cartilaginous tissue |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL425169A PL242834B1 (en) | 2018-04-10 | 2018-04-10 | Method for obtaining biological implant for regeneration of cartilaginous tissue |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL425169A1 PL425169A1 (en) | 2019-10-21 |
| PL242834B1 true PL242834B1 (en) | 2023-05-02 |
Family
ID=68238637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL425169A PL242834B1 (en) | 2018-04-10 | 2018-04-10 | Method for obtaining biological implant for regeneration of cartilaginous tissue |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL242834B1 (en) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10042484A1 (en) * | 2000-08-29 | 2002-03-28 | Merck Patent Gmbh | Preparing human cartilage implants, useful for repairing damaged joints, comprises culturing autologous chondrocytes in alginate gel at reduced oxygen partial pressure |
| CA2483660A1 (en) * | 2002-05-01 | 2003-11-13 | Verigen Ag | Injectable chondrocyte implant |
| WO2006045330A1 (en) * | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Tetec-Tissue Engineering Technologies Aktiengesellschaft | Implant for repairing a cartilage defect |
| PL213865B1 (en) * | 2007-09-03 | 2013-05-31 | Regionalne Ct Krwiodawstwa I Krwiolecznictwa | The manner of obtaining of autogeneous explant of chondrocites in tissue glue based on fibrinogen |
-
2018
- 2018-04-10 PL PL425169A patent/PL242834B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL425169A1 (en) | 2019-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yin et al. | Induction of mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and functional cartilage microtissue formation for in vivo cartilage regeneration by cartilage extracellular matrix-derived particles | |
| JP5483035B2 (en) | Method for producing porous three-dimensional support using animal tissue powder and porous three-dimensional support produced using the same | |
| US7887843B2 (en) | Method for in vitro production of three-dimensional vital cartilage tissue and use thereof as transplant material | |
| JP6687757B2 (en) | Methods for preparing 3D cartilage organoid blocks | |
| CN112280734A (en) | Preparation method of exosome and stem cell proliferation reagent containing exosome | |
| KR20060110637A (en) | Transplantation of differentiated immature adipocytes and biodegradable scaffold for tissue augmentation | |
| EA025532B1 (en) | Method for isolation of precursor cells from human umbilical cord | |
| CN110478528B (en) | Preparation method and application of novel tissue repair promoting material | |
| KR101178153B1 (en) | New stem cell lines, their application and culture methods | |
| CN113677700A (en) | Cell structure and method for producing cell structure | |
| WO2005014774A1 (en) | Carrier for culturing animal cell, and method for culturing or transplanting animal cell using said carrier for culture | |
| JP2022501118A (en) | Biomaterials containing adipose-derived stem cells and gelatin and methods for producing them | |
| US9434923B2 (en) | Preparation of parental cell bank from foetal tissue | |
| PL242834B1 (en) | Method for obtaining biological implant for regeneration of cartilaginous tissue | |
| CN115404209A (en) | Bone marrow mesenchymal stem cell extracellular vesicle and acquisition and application thereof | |
| KR20110032433A (en) | The method of manufacturing the transplantable spheroids of mixed cellular complexes for cell transplantation and the usage of the same | |
| CN114848895A (en) | 3D printing titanium alloy porous support loaded double-factor shell-core microsphere slow release system | |
| RU2716577C1 (en) | Method of producing tissue-specific matrix for tissue engineering of cartilage | |
| CN100406071C (en) | Method for preparing HAP/beta-TCP structured tissue engineering bone | |
| CN111793601A (en) | Method for increasing retention time of stem cells in vivo by using fibronectin-loaded porous scaffold | |
| CN115040693B (en) | Containing CD56 + Biological material of exosome from subcellular group and preparation method thereof | |
| CN112569408B (en) | Tissue engineering patch and preparation method thereof | |
| KR100522457B1 (en) | Cultivation method of Osteoblast and The composition | |
| WO2016088373A1 (en) | Cultured cell sheet for transplantation use, method for producing cultured cell sheet for transplantation use, and method for producing bone tissue for transplantation use | |
| AU2020350127B2 (en) | Method for in-vitro production of a cohesive cartilage construct |