PL242529B1 - Glikokoniugatowa pochodna metotreksatu i glukozy, jej zastosowanie oraz sposób otrzymywania - Google Patents

Glikokoniugatowa pochodna metotreksatu i glukozy, jej zastosowanie oraz sposób otrzymywania Download PDF

Info

Publication number
PL242529B1
PL242529B1 PL426731A PL42673118A PL242529B1 PL 242529 B1 PL242529 B1 PL 242529B1 PL 426731 A PL426731 A PL 426731A PL 42673118 A PL42673118 A PL 42673118A PL 242529 B1 PL242529 B1 PL 242529B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
formula
compound
cancer
methotrexate
cells
Prior art date
Application number
PL426731A
Other languages
English (en)
Other versions
PL426731A1 (pl
Inventor
Siddarth AGRAWAL
Siddarth Agrawal
Marta WOŹNIAK
Marta Woźniak
Wiesław Szeja
Anil Kumar AGRAWAL
Anil Kumar Agrawal
Andrzej Gamian
Monika Krawczyk
Gabriela PASTUCH-GAWOŁEK
Gabriela Pastuch-Gawołek
Sebastian MAKUCH
Sebastian Makuch
Jerzy Wiśniewski
Piotr ZIÓŁKOWSKI
Piotr Ziółkowski
Original Assignee
Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu filed Critical Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu
Priority to PL426731A priority Critical patent/PL242529B1/pl
Publication of PL426731A1 publication Critical patent/PL426731A1/pl
Publication of PL242529B1 publication Critical patent/PL242529B1/pl

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D475/00Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems
    • C07D475/06Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with a nitrogen atom directly attached in position 4
    • C07D475/08Heterocyclic compounds containing pteridine ring systems with a nitrogen atom directly attached in position 4 with a nitrogen atom directly attached in position 2

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest związek będący glikokoniugatową pochodną metotreksatu i glukozy, jak również sposób syntezy tego związku. Nowa pochodna wykazuje działanie przeciwnowotworowe i znajduje zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym i weterynaryjnym, jako element innowacyjnej i selektywnej terapii przeciwnowotworowej.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest związek będący glikokoniugatową pochodną metotreksatu i glukozy, jak również sposób syntezy tego koniugatu oraz jego zastosowanie.
Nowy związek, wykazując działanie przeciwnowotworowe, znajduje zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym i weterynaryjnym, jako element innowacyjnej i selektywnej terapii przeciwnowotworowej.
Związek według wynalazku otrzymuje się w reakcji 1,3-dipolarnej cykloaddycji karbaminianu metotreksatu i 2-azydoetylo β-D-glukopiranozydu. Jako podjednostki strukturalne związek ten zawiera metotreksat i glukokoniugat triazynowy połączone wiązaniem karbamidowym, które w wyniku hydrolizy wiązania uwalniają się w komórce nowotworowej i wykazują synergiczne działanie hamujące proliferację komórek nowotworowych.
Metotreksat, inaczej zwany również ametopteryną, jest powszechnie znanym związkiem organicznym, należącym do antagonistów kwasu foliowego, który znalazł zastosowanie jako lek cytostatyczny. Jako antymetabolit, antagonista kwasu foliowego hamuje aktywność reduktazy dihydrofolianowej katalizującej przemianę dihydrofolianu w tetrahydrofolian. Wiąże się nieodwracalnie z enzymem, uniemożliwiając przyłączenie właściwego substratu - kwasu foliowego.
Metotreksat jest stosowany jako lek przeciwnowotworowy i immunosupresyjny. Hamuje syntezę nukleotydów purynowych oraz tymidynianów niezbędnych do syntezy i naprawy DNA oraz replikacji komórkowej. Działa głównie przez zahamowanie syntezy DNA, pośrednio hamuje również syntezę RNA i białek. Metotreksat działa swoiście na proliferujące komórki, głównie w fazie S cyklu komórkowego. Mechanizm działania leku w przypadku reumatoidalnego zapalenia stawów nie jest do końca poznany.
Metotreksat jest najczęściej stosowany w terapii następujących chorób nowotworowych: ostrej białaczki limfatycznej, nasieniaka, mięsaka kościopochodnego oraz nowotworów litych głowy i szyi.
Istnieje nadal zapotrzebowanie na nowe, udoskonalone chemioterapeutyki nadające się zwłaszcza do stosowania w terapii przeciwnowotworowej.
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 1:
Wzór 1
PL 242529 Β1
Innym przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 1 do stosowania w medycynie.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 1 do stosowania w leczeniu i zapobieganiu nowotworom.
Korzystnie, nowotwór jest wybrany spośród: raka piersi, raka jelita grubego, raka płuc, raka skóry, raka żołądka, raka kolczystokomórkowego i mięsaka kości.
Innym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania związku o wzorze 1, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:
a) prowadzi się reakcję metotreksatu z chloromrówczanem propargilu w obecności aminy trzeciorzędowej, uzyskując karbaminian o wzorze 2;
Wzór 2
b) prowadzi się reakcję 1,3-dipolarnej cykloaddycji azydku cukrowego o wzorze 3
w mieszaninie alkohol i-propylowy-tetrahydrofuran, w obecności wodnego roztworu askorbinianu sodu i CUSO4 5H2O oraz karbaminianu o wzorze 2 otrzymanego w etapie a) i w wyniku reakcji otrzymuje się związek o wzorze 1.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w etapie a) po dodaniu chloromrówczanu propargilu reakcję prowadzi się przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku w etapie b) reakcję 1,3-dipolarnej cykloaddycji prowadzi się przez 24 godziny.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku w etapie b) końcową mieszaninę reakcyjną miesza się, zatęża i oczyszcza uzyskując wyizolowany związek o wzorze 1.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku w etapie b) uzyskany związek o wzorze 1 rozpuszcza się w metanolu i oczyszcza na żelu chromatograficznym.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest również związek o wzorze 2, który może być wykorzystany w syntezie chemicznej, zwłaszcza do otrzymywania związku o wzorze 1.
Związek o wzorze 1 jest prolekiem i znajduje zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej ze względu na to, że posiada wiele nieoczekiwanych zalet, takich jak selektywność, biodostępność i wysoka skuteczność wynikająca z aktywności synergistycznej elementów jego struktury. Aktywność cytotoksyczna koniugatu metotreksatu z glukozą według wynalazku jest silniejsza niż działanie niezmodyfikowanego metotreksatu.
Ponadto związek według wynalazku zapewnia mechanizm selektywnego dostarczania czynnika cytotoksycznego do komórek nowotworowych wykazujących zwiększone zużycie glukozy i nasilenie procesów glikolizy aerobowej. Wykazuje on silne działanie cytotoksyczne nawet w środowisku hipoksji i hipoglikemii, podczas gdy większość chemioterapeutyków nie działa na komórki w tych warunkach.
W wyniku realizacji sposobu według wynalazku, obejmującego reakcję 1,3-dipolarnej cykloaddycji karbaminianu metotreksatu i 2-azydoetylo β-D-glukopiranozydu, otrzymuje się prolek o właściwościach przeciwnowotworowych charakteryzujący się wysoką biodostępnością. Prolek ten zawiera podjednostki strukturalne wykazujące działanie cytotoksyczne: metotreksat i glukokoniugat triazynowy połączone wiązaniem karbamidowym. Jednostki te w wyniku hydrolizy wiązania uwalniają się w komórce nowotworowej i wykazują synergistyczne działanie hamujące proliferację komórek.
Prolek według wynalazku o ukierunkowanym wprowadzaniu do komórek nowotworowych posiada następujące elementy strukturalne:
Prolek zawiera cząsteczkę D-glukozy połączoną wiązaniem glikozydowym o konfiguracji β-poprzez elastyczny łącznik z pierścieniem triazynowym.
Pierścień triazynowy podstawiony w pozycji 4 połączony jest z metotreksatem poprzez wiązanie karbamidowe. W proleku według wynalazku D-glukoza pełni funkcję liganda oddziaływującego z białkami przenoszącymi cukier do komórki nowotworowej. Koncepcję syntezy pochodnych D-glukozy oparto na tzw. efekcie Warburga, który wskazuje, że komórki nowotworowe metabolizują wielokrotnie większe ilości cukru w porównaniu z pozostałymi komórkami gospodarza. Wpływa to korzystnie na biodostępność silnie polarnego związku, jakim jest metotreksat, zawierający dwie grupy karboksylowe. Komórki nowotworowe wykazują nadekspresję białek GLUT przenoszących cukier, co powoduje, że koniugaty są w sposób ukierunkowany transportowane i przenoszone do komórek nowotworowych. Konfiguracja 3-wiazania glikozydowego jest preferowania w odniesieniu do receptora, białka GLUT-1.
Nieoczekiwanie ustalono, że koniugat D-glukozy z triazyną zmniejsza szybkość proliferacji komórek nowotworowych, wobec tego po uwolnieniu w komórce nowotworowej zwiększa się cytotoksyczność proleku. Aby proces ten mógł być pierwszym etapem metabolizmu proleku układ triazyny połączono z metotreksatem wiązaniem karbamidowym, ulegającym procesom hydrolizy katalizowanym przez enzymy. Jako farmakofor wybrano metotreksat z uwagi na dobrze udokumentowane właściwości przeciwnowotworowe.
Tak zaprojektowany i syntezowany lek posiada w swojej strukturze jednostki, które wykazują synergiczne działanie przeciwnowotworowe i pozwala na uwalnianie w procesie metabolizmu glukokoniugatu triazyny oraz metotreksatu.
Niniejszy wynalazek zobrazowano za pomocą następujących figur rysunku w przykładach wykonania: na figurze 1 przedstawiono wpływ inhibitora GLUT 1 EDG na wartości IC50 dla komórek raka płuca A427 i dla komórek raka kolczystokomórkowego SCC;
na figurze 2 przedstawiono wpływ Glu-Met i metotreksatu na przeżywalność komórek nowotworowych A427, SCC i WI38 oraz odpowiadających im zdrowych komórek;
na figurze 3 przedstawiono wpływ Glu-Met i metotreksatu w warunkach hypoksji na komórki raka piersi MCF7 (A) oraz komórki raka jelita grubego SW480 (B);
na figurze 4 przedstawiono wpływ Glu-Met i metotreksatu w warunkach hiperglikemii na komórki raka piersi MCF7 (A) oraz komórki raka jelita grubego SW480 (B);
na figurze 5 przedstawiono wpływ Glu-Met i metotreksatu w warunkach hypoksji i hiperglikemii na komórki raka piersi MCF7 (A) oraz komórki raka jelita grubego SW480 (B);
na figurze 6 przedstawiono wyniki analizy MS dla komórek nowotworowych raka jelita grubego SW480 rosnących z MTX oraz z koniugatem według wynalazku;
na figurze 7 przedstawiono zestawienie widm dla obydwu pików uzyskanych w wyniku analizy MS i przedstawionych na figurze 6.
Poniższe przykłady powinny ułatwić realizację zdefiniowanego powyżej wynalazku.
Przykłady
Przykład 1. Synteza glikokoniugatu, pochodnej metotreksatu
Glikokoniugat otrzymano w następującej wieloetapowej syntezie, w reakcji 1,3-dipolarnej cykloaddycji 2-azydoetylo-e-D-glukopiranozydu i propargiloksykarbaminianu metotreksatu.
PL 242529 Β1
Etap 1. Synteza karbaminianu
W kolbie zabezpieczonej przed światłem umieszczono metotreksat (180 mg; 0.40 mmol), dodano bezwodną pirydynę (3 ml), intensywnie mieszając, dodano dietylo-izo-propyloaminę (50 μΙ; 0.30 mmol). Mieszaninę reakcyjną umieszczono w łaźni zawierającej wodę z lodem i po kilkunastu minutach wkroplono chloromrówczan propargilu (50 μΙ; 0.51 mmol). Mieszaninę reakcyjną doprowadzono do temperatury pokojowej i prowadzono reakcję przez 24 godziny. Surowy produkt poddano reakcji dipolarnej cykloaddycji.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.85-2.16 (m, 2H, 2xCHmtx), 2.32 (m, 1H, CHmtx), 2.45 (m, 1H, CHmtx), 3.21 (s, 3H, CH3mtx), 3.52 (m, 2H, 2xCH), 4.35 (m, 1H, CHmtx), 4.62-4.72 (m, 4H, 2xCH2), 4.80 (s, 2H, CH2mtx), 6.80-6.85 (m, 2H, H-PhMTx), 7.68-7.76 (m, 2H, H-PhMTx), 8.20 (m, 1H, ΝΗμτχ), 8.61 (s, 1H, H-7mtx). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 25.31,29.39, 29.71,50.89, 50.97, 51.03, 54.14, 76.93, 77.73, 78.47, 110.36, 120.41, 120.46, 128.23, 146.26, 148.39, 150.20, 152.65, 160.80, 161.99, 165.61, 165.64, 170.95, 173.01, 173.18.
Etap 2. Synteza glukokoniugatu, pochodnej metotreksatu
PL 242529 Β1
Azydek cukrowy (99 mg; 0.40 mmol) rozpuszczono w mieszaninie alkohol i-propylowy (3 ml) tetrahydrofuran (3 ml) i dodano wodny (3 ml) roztwór askorbinianu sodu (32 mg; 0.16 mmol) i CuSCU ShW (20 mg; 0.08 mmol). Otrzymany roztwór dodano do produktu z wcześniejszego etapu syntezy. Intensywnie mieszano zawartość reaktora w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Mieszaninę reakcyjną zatężono na wyparce rotacyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany olej rozpuszczono w metanolu, dodano żel do chromatografii kolumnowej (1 g) i zatężono na wyparce rotacyjnej. Żel krzemionkowy zawierający zaadsorbowane produkty reakcji wprowadzono na kolumnę chromatograficzną i oczyszczano produkt metodą gradientowej chromatografii, stosując jako eluent mieszaniny chloroformmetanol. Skład frakcji analizowano metodą chromatografii cienkowarstwowej. Wydzielono produkt eluowany przez mieszaninę chloroform-metanol = 1:1. Frakcje zatężono i wydzielono produkt w postaci osadu w kolorze kremowym. Produkt przechowywano w ciemnym naczyniu w temperaturze 0°C-5°C. Strukturę związku określono na podstawie widm magnetycznego rezonansu jądrowego (1H i 13C NMR). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 1.71-2.10 (m, 2H, 2xCHmtx), 2.19-2.39 (m, 2H, 2xCHmtx), 2.96 (dd, 2H, J = 7.8 Hz, J = 8.6 Hz, H-2giu), 3.03 (dd, 2H, J = 9.0 Hz, J = 9.4 Hz, H-4giu), 3.09-3.55 (m, 9H, CH3mtx, H-3giu, H-5giu, H-6aGiu), 3.63-3.79 (m, 4H, 4xCH), 3.68 (dd, 2H, J = 1.6 Hz, J = 11.4 Hz, H-6bGiu), 3.86-3.95 (m, 2H, 2xCH), 4.01-4.12 (m, 2H, 2xCH), 4.22 (d, 2H, J = 7.8 Hz, H-1giu), 4.29 (m, 1H, CHmtx), 4.55-4.61 (m, 4H, 2xCH2), 4.79 (bs, 2H, OH), 5.21 (s, 2H, CH2mtx), 6.80-6.87 (m, 2H, H-PhMTx), 7.66-7.72 (m, 2H, H-PhMTx), 7.95 (d, 1H, J = 7.0 Hz, ΝΗμτχ), 8.25 (s, 2H, H-5tnaz), 8.61 (s, 1H, H-7mtx). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 24.62, 30.33, 31.64, 48.55, 49.72, 54.87, 60.62, 61.05, 67.19, 69.99, 73.26, 76.54, 76.95, 102.87, 111.09, 121.49, 125.84, 128.62, 140.91, 146.75, 149.15, 150.83, 154.04, 163.78,165.39,165.56, 173.56, 174.26.
Przykład 2 (porównawczy). Synteza koniugatu D-Glukoza-triazyna
OH
Azydek cukrowy (82 mg; 0.33 mmol) i alkohol propargilowy (20 μΙ; 0.34 mmol) rozpuszczono w mieszaninie alkohol i-propylowy (3 ml) i tetrahydrofuran (3 ml). Intensywnie mieszając zawartość kolby, dodano wodny (3 ml) roztwór askorbinianu sodu (27 mg; 0.14 mmol) i CuSO4-5H2O (16 mg; 0.07 mmol). Reakcję cykloaddycji prowadzono przez 24 godziny, intensywnie mieszając zawartość kolby. Zatężono mieszaninę reakcyjną na wyparce rotacyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany olej rozpuszczono w metanolu, dodano żel do chromatografii kolumnowej (1 g) i zatężono na wyparce rotacyjnej. Żel krzemionkowy zawierający zaadsorbowane produkty reakcji wprowadzono na kolumnę chromatograficzną i wydzielono produkt metodą gradientowej chromatografii, stosując jako eluent mieszaniny chloroform-metanol. Skład frakcji analizowano metodą chromatografii cienkowarstwowej. Wydzielono produkt eluowany mieszaniną chloroform-metanol = 2:1. Frakcje zatężono i wydzielono produkt w postaci osadu w kolorze kremowym. Produkt przechowywano w ciemnym naczyniu w temperaturze 0°C-5°C. Strukturę związku określono na podstawie widm magnetycznego rezonansu jądrowego (1H i 13C NMR). 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ 2.97 (m, 1H, H-2giu), 3.04 (m, 1H, H-4giu), 3.09-3.16 (m, 2H, H-3giu, H-5giu), 3.43 (m, 1H, CH), 3.68 (m, 1H, H-6aGiu), 3.89 (m, 1H, H-6bGiu), 4.07 (m, 1H, CH), 4.23 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1giu), 4.47-4.58 (m, 4H, 2xCH2), 4.91 (d, 1H, J = 5.1 Hz, OH), 4.95 (d, 1H, J = 4.7 Hz, OH), 5.06 (d, 1H, J = 5.1 Hz, OH), 5.15 (dd, 1H, J = 5.5 Hz, J = 5.9 Hz, OH), 8.01 (s, 1H, H-5triaz).
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 49.54, 54.99, 61.05, 67.41, 69.99, 73.29, 76.60, 76.97, 102.93, 123.45, 147.68.
Przykład 3. Analiza aktywności biologicznej.
Analiza cytotoksyczności związku według wynalazku (test MTT)
Komórki w ilości 3-10 χ 103 komórek/studzienkę wysiano na płytkę 96-studzienkową. Po 24 godzinach zlano pożywkę hodowlaną i podano po 100 μΙ świeżej pożywki do studzienek kontrolnych oraz pożywkę z rozpuszczonymi w DMSO badanymi związkami do studzienek badanych. Płytki owinięto w folię i umieszczono w inkubatorze. Po 48 godzinach inkubacji zlano pożywkę i dodano 100 μΙ roztworu żółtego rozpuszczalnego bromku 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazoliowego (MTT) w stężeniu 0,5 mg/ml. Po 4 godzinach inkubacji zlano roztwór MTT i podano 100 μΙ/studzienkę DMSO.
PL 242529 Β1
Po 2 godzinach gęstość optyczną rozpuszczonego formazanu analizowano kolorymetrycznie w czytniku płytek BioTek.
Stężenie DMSO w badanych próbach nie przekroczyło 0,1%.
Ponieważ żywe komórki powodują redukcję MTT dofarmazanu, gęstość optyczna (GO) jest najwyższa w studzienkach kontrolnych (K), które stanowiły 100% przeżywalności komórek. Przeżywalność w studzienkach inkubowanych ze związkiem (Z) wyliczano na podstawie wzoru:
X= 100% x GO Z/ GO K
Podane wyniki stanowią wartość średnią z 3 powtórzeń analizy cytotoksyczności.
Badania oceny przeżywalności za pomocą testu MTT na liniach komórkowych licznych nowotworów w tym: raka piersi, jelita grubego, płuc, żołądka, kolczystokomórkowego oraz mięsaka kości wykazały, że związek o wzorze 1 działa silnie cytotoksycznie in vitro. Na Figurze 1 oraz w Tabeli 1 pokazano porównawcze wyniki badania oceny przeżywalności (ICso) dla różnych linii komórek nowotworowych, na które oddziaływano samym metotreksatem lub pochodną według wynalazku glukoza-metotreksat (związek o wzorze 1). Działanie cytotoksyczne koniugatu metotreksatu z glukozą jest silniejsze niż działanie niezmodyfikowanego metotreksatu. W badaniu zastosowano: Glu-Met 5 μΜ, Metotreksat 20 μΜ; inkubacja 48 godzin; analiza MTT.
Tabela 1
Związek Wartości IC50 (μΜ)
MCF-7 (pierś) SW480 (jelito grube) SCC4 (skóra) A427 (płuco) MG63 (mięsa k kości) HS746 (żołądek ) SW620 (jelito grube)
Glu-Met 6,2±0,3 4 6,8±0,1 7,3±0,04 2,9±0,6 6,4±0,65 14,9±1, 7 9,7±0,49
Metotreks at >40 24,6±2,2 22,12±1,2 6 19,8±0,8 1 >30 >30 >30
Średnia ±OS wyników z trzech niezależnych eksperymentów. Test MTT, inkubacja 48 godz.
Analiza MS
Komórki w ilości 2,5 χ 105 komórek/studzienkę wysiano na płytkę 6-studzienkową w 1ml/studzienkę. Kiedy komórki osiągnęły 80% konfluencji, zlano pożywkę hodowlaną i podano odpowiednio po 1 ml na studzienkę świeżej pożywki do studzienek kontrolnych lub 1 ml na studzienkę badaną pożywki z metotreksatem w stężeniu 10 pM lub pochodną metotreksatu o wzorze 1 w stężeniu 10 pM. Płytkę owinięto folią i inkubowano 8 godzin w inkubatorze. Po tym czasie zlano pożywkę, każdą studzienkę płukano 2 x 1 ml PBS o temperaturze pokojowej. Następnie płytkę ułożono na lodzie i do każdej studzienki podano 500 pi mieszaniny 3 :1 metanolu i ultraczystej wody o temperaturze -20 stopni Celsjusza. W każdej studzience kilkukrotnie pipetowano mieszaninę i pobrano ją do eppendorfki. Następnie procedurę powtórzono i przygotowane próbki (każda o objętości 1 ml) włożono do zamrażarki niskotemperaturowej -80 stopni Celsjusza. Następnego dnia próbki zagęszczano w koncentratorze próżniowym do całkowitego wysuszenia próbki. Przed analizą do próbki dodano rozpuszczalnika do analizy MS (Xevo G2 Q-TOF MS). Na figurze 6 można zauważyć, że pole powierzchni dla ΜΤΧ w komórkach nowotworowych SW480 rosnących z ΜΤΧ wynosi około 333 jednostek, a w przypadku zastosowania związku według wynalazku (określonego na fig. 6 jako 10/4)-17631, czyli jest około 52 mniejsze niż w przypadku koniugatu. Na figurze 7 pokazano zestawienie widm dla obydwu pików.
Ocena biologiczna koniugatu glukozy i triazyny (przykład porównawczy)
Komórki w ilości 1 x 104 komórek/studzienkę wysiano na płytkę 96-studzienkową. Po 24 godzinach zlano pożywkę hodowlaną i dodano po 100 pl świeżej pożywki do studzienek kontrolnych oraz pożywkę z rozpuszczonymi w DMSO badanymi związkami do badanych studzienek. Płytki owinięto w folię i umieszczono w inkubatorze. Po 48 godzinach inkubacji wykonano test MTT. Wyniki pokazują, że związek otrzymany w przykładzie 2 wykazuje działanie cytotoksyczne. Przeprowadzono walidację oceny na liniach dwóch różnych nowotworów, raku piersi MCF-7 oraz raku jelita grubego SW480. IC50 wynosi
PL 242529 Β1 odpowiednio 60 μΜ oraz 75 μΜ. Ustalono, że obserwowana aktywność jest znacznie słabsza niż w przypadku związku o wzorze 1.
Analiza aktywności koniugatu według wynalazku w warunkach hipoksji
Komórki w ilości 1 χ 104 komórek/studzienkę wysiano na płytki 96-studzienkowe. Płytkę stanowiąca kontrolę hodowano w standardowych warunkach hodowli o stężeniu tlenu 20%. Płytkę badającą wpływ hipoksji hodowano w inkubatorze o stężeniu tlenu 1%. Po 24 godzinach zlano pożywkę hodowlaną i podano po 100 μΙ świeżej pożywki do studzienek kontrolnych oraz pożywkę z rozpuszczonymi w DMSO badanymi związkami do studzienek badanych. Płytki owinięto w folię i umieszczono w odpowiednich inkubatorach. Po 48 godzinach inkubacji wykonano analizę MTT. Wyniki uzyskane podczas badania aktywności związku o wzorze 1 przedstawiono na figurze 3A dla komórek MCF7 i na figurze 3B dla komórek SW480.
Analiza aktywności koniugatu według wynalazku w warunkach hipoglikemii
Komórki w ilości 1 χ 104 komórek/studzienkę wysiano na płytki 96-studzienkowe. Komórki stanowiące kontrolę hodowano w standardowej pożywce hodowlanej zawierającej glukozę. Komórki poddane hipoglikemii hodowano w pożywce bez glukozy. Po 24 godzinach zlano pożywkę hodowlaną z płytek i dodano po 100 μΙ świeżej pożywki do studzienek kontrolnych oraz pożywkę bez glukozy z rozpuszczonymi w DMSO badanymi związkami do studzienek badanych. Po 48 godzinach inkubacji wykonano analizę MTT. Wyniki uzyskane podczas badania aktywności związku o wzorze 1 przedstawiono na figurze 4A dla komórek MCF7 i na figurze 4B dla komórek SW480.
Koniugat według wynalazku (związek o wzorze 1) wykazuje silne działanie cytotoksyczne nawet w środowisku hipoksji i hipoglikemii (Figura 5A i B), podczas gdy większość chemioterapeutyków nie działa na komórki w tych warunkach.

Claims (10)

1. Związek o wzorze 1:
wzór 1
2. Związek o wzorze 1 do stosowania w medycynie.
3. Związek o wzorze 1 do stosowania w leczeniu i zapobieganiu nowotworom.
4. Związek do stosowania według zastrz. 3, znamienny tym, że nowotwórjest wybrany spośród: raka piersi, raka jelita grubego, raka płuc, raka skóry, raka żołądka, raka kolczystokomórkowego i mięsaka kości.
5. Sposób otrzymywania związku o wzorze 1, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
PL 242529 Β1
a) prowadzi się reakcję metotreksatu z chloromrówczanem propargilu w obecności aminy trzeciorzędowej, uzyskując karbaminian o wzorze 2:
wzór 2
b) prowadzi się reakcję 1,3-dipolarnej cykloaddycji azydku cukrowego o wzorze 3:
wzór 3 w mieszaninie alkohol i-propylowy - tetrahydrofuran, w obecności wodnego roztworu askorbinianu sodu i CUSO45H2O oraz karbaminianu o wzorze 2 otrzymanego w etapie a) i w wyniku reakcji otrzymuje się związek o wzorze 1.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie a) po dodaniu chloromrówczanu propargilu reakcję prowadzi się przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie b) reakcję 1,3-dipolarnej cykloaddycji prowadzi się przez 24 godziny.
8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie b) końcową mieszaninę reakcyjną miesza się, zatęża i oczyszcza uzyskując wyizolowany związek o wzorze 1.
9. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie b) uzyskany związek o wzorze 1 rozpuszcza się w metanolu i oczyszcza na żelu chromatograficznym.
10. Związek o wzorze 2:
wzór 2
PL426731A 2018-08-20 2018-08-20 Glikokoniugatowa pochodna metotreksatu i glukozy, jej zastosowanie oraz sposób otrzymywania PL242529B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL426731A PL242529B1 (pl) 2018-08-20 2018-08-20 Glikokoniugatowa pochodna metotreksatu i glukozy, jej zastosowanie oraz sposób otrzymywania

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL426731A PL242529B1 (pl) 2018-08-20 2018-08-20 Glikokoniugatowa pochodna metotreksatu i glukozy, jej zastosowanie oraz sposób otrzymywania

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL426731A1 PL426731A1 (pl) 2020-02-24
PL242529B1 true PL242529B1 (pl) 2023-03-06

Family

ID=84701908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL426731A PL242529B1 (pl) 2018-08-20 2018-08-20 Glikokoniugatowa pochodna metotreksatu i glukozy, jej zastosowanie oraz sposób otrzymywania

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL242529B1 (pl)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL243572B1 (pl) * 2021-06-11 2023-09-11 Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu Glikokoniugatowa pochodna metotreksatu i glukozy oraz sposób jej otrzymywania i jej zastosowanie w leczeniu i zapobieganiu nowotworom
PL243573B1 (pl) * 2021-06-11 2023-09-11 Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu Koniugat metotreksatu i glukozy do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu chorób autoimmunologicznych

Also Published As

Publication number Publication date
PL426731A1 (pl) 2020-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rahim et al. Synthesis, in vitro alpha-glucosidase inhibitory potential of benzimidazole bearing bis-Schiff bases and their molecular docking study
JP5719770B2 (ja) 塩酸イコチニブ、合成物、結晶学的形態、併用薬及びその用途
Kassem et al. Novel pyridine-thiazolidinone-triazole hybrid glycosides targeting EGFR and CDK-2: Design, synthesis, anticancer evaluation, and molecular docking simulation
EP3632906B1 (en) Azaaryl derivative, preparation method therefor, and application thereof for use in pharmacy
EP2781520B1 (en) Three-ring pi3k and/or mtor inhibitor
Giri et al. Cytotoxic effect of levoglucosenone and related derivatives against human hepatocarcinoma cell lines
Li et al. [1, 2, 3] Triazolo [4, 5-d] pyrimidine derivatives incorporating (thio) urea moiety as a novel scaffold for LSD1 inhibitors
Alotabi Synthesis, characterization, anticancer activity, and molecular docking of some new sugar hydrazone and arylidene derivatives
Efeoglu et al. Novel urea-thiourea hybrids bearing 1, 4-naphthoquinone moiety: Anti-inflammatory activity on mammalian macrophages by regulating intracellular PI3K pathway, and molecular docking study
PL242529B1 (pl) Glikokoniugatowa pochodna metotreksatu i glukozy, jej zastosowanie oraz sposób otrzymywania
Mahmoodi et al. Efficient synthesis of new azo-sulfonamide derivatives and investigation of their molecular docking and cytotoxicity results
EP2647637B1 (en) Purinylpyridinylamino-2,4-difluorophenyl sulfonamide derivative, pharmaceutically acceptable salt thereof, preparation method thereof, and pharmaceutical composition with inhibitory activity against raf kinase, containing same as active ingredient
Lu et al. Preparation of Rhodium (III) complexes with 2 (1H)-quinolinone derivatives and evaluation of their in vitro and in vivo antitumor activity
El Malah et al. Synthesis of Some 1, 2, 3-triazole-bridged glycosides with benzoquniline-3-carbonitriles via click chemistry for anticancer, and docking evaluation
Jia et al. Design, synthesis and antitumor activity evaluation of novel indole acrylamide derivatives as IMPDH inhibitors
Aqeel et al. Novel hydantoin derivatives: Synthesis and biological activity evaluation
KR102394934B1 (ko) Akt 억제제로서의 염 형태 및 이의 결정 형태
Jha et al. Cytostatic activity of novel 4′-aminochalcone-based imides
Sorg et al. Synthesis and NMR characterization of hydroxyurea and mesylglycol glycoconjugates as drug candidates for targeted cancer chemotherapy
da Silva et al. Synthesis and antitumor evaluation of hybrids of 5, 8-dioxo-5, 8-dihydroisoquinoline-4-carboxylates and carbohydrates
Al-Sahaly et al. Synthesis, Molecular Docking and Anticancer Activity of New Substituted Pyridine-1, 2, 3-Triazole Hybrid N-Glycosides Via Click Chemistry
Agrawal et al. Insulin and novel thioglycosides exert suppressive effect on human breast and colon carcinoma cells
CN112500447A (zh) 新型糖基化二价铂抗肿瘤化合物制备方法
EP1847546A1 (en) Imidazopyridine derivative
Juszczak et al. Evaluation of the antiproliferative activity of 2-(monohalogenophenylamino)-5-(2, 4-dihydroxyphenyl)-1, 3, 4-thiadiazoles