PL242278B1 - Kompozycja fitozwiązków do zastosowania do wzmacniania aktywności cytotoksycznej w leczeniu ostrych białaczek limfoblastycznych - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja mieszaniny fitozwiązków: kurkuminy, genisteiny, resweratrolu, kwercetyny do zastosowania do wzmacniania aktywności cytotoksycznej w leczeniu ostrych białaczek limfoblastycznych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowa mieszanina fitozwiązków resweratrolu, kwercetyny, genisteiny i kurkuminy stosowana podczas suplementacji chemioterapii w ostrych białaczkach limfoblastycznych.

Ostre białaczki limfoblastyczne (ang. Acute lymphoblastic leukemia, ALL) według aktualnie obowiązującej klasyfikacji Światowej Organizacji Zdrowia, określane są jako nowotwory z prekursorowych komórek limfoidalnych. Heterogenność choroby nakłada na onkologów obowiązek wykonania licznych, dodatkowych badań takich jak np. badanie w kierunku obecności niekorzystnego rokowniczo transkryptu BCR-ABL, czy też identyfikację podtypu immunologicznego. U dzieci ALL jest najczęściej występującym nowotworem złośliwym, a niepowodzenia leczenia i wznowy występują aż u około 20% wszystkich pacjentów. Z uwagi na fakt występowania wznowy choroby u niektórych dzieci oraz występowania oporności na stosowaną sterydo- i chemioterapię, ważny jest rozwój nowych, bardziej skutecznych i obciążonych mniejszą toksycznością metod terapeutycznych.

Dążenie do zaproponowania ulepszonych schematów leczenia dla dzieci z ALL wysokiego ryzyka, to punkt wyjściowy badania podjętego w projekcie. Uwaga skierowana była na - nie w pełni poznaną w onkologii - dziedzinę, jaką jest nauka o substancjach naturalnych i ich przeciwnowotworowym potencjale u dzieci z ALL. Badania naukowe rzadko skupiają się na grupie badanej jaką jest pacjent pediatryczny, dlatego też na podstawie doniesień z badań naukowych przeprowadzonych dla pacjentów dorosłych cierpiących na inne typy nowotworów, w prezentowanym badaniu zweryfikowano działanie przeciwnowotworowe związków pochodzenia roślinnego takich jak: kurkumina, resweratrol, kwercetyna i genisteina, na linie komórkowe ALL. Te związki zwykle jako pojedyncze substancje, albo w kombinacji dwóch związków były weryfikowane pod kątem ich działania przeciwnowotworowego, ale zestawienie czterech związków jednocześnie nie było jeszcze przedmiotem badań w białaczkach ALL.

Udało się nie tylko potwierdzić pozytywne działanie w kierunku przeciwnowotworowym wybranych związków, ale również zastosowanie mieszaniny fitozwiązków pozwoliło ominąć problem związany z kliniczną aplikacją związków naturalnych, jakim jest bioosiągalność (osiąganie w organizmie stężeń terapeutycznych). Kombinacja według wynalazku ma silne działanie synergistyczne oraz mniejszy i - w większości - przejściowy efekt na komórki zdrowe. Badania wykazały, że nawet w niskich dawkach, genisteina i kurkumina działają synergistycznie przeciwnowotworowo na komórki ALL. Co więcej, stosowanie tylko mieszaniny złożonej z resweratrolu i kwercetyny nie wykazywało znaczącego działania na komórki MOLT-4, jednak zastosowanie tej pary łącznie z genisteiną i kurkuminą wzmacniało działanie przeciwnowotworowe. Potwierdzono, że dopiero stosowanie mieszaniny fitozwiązków złożonej z czterech analizowanych substancji, w badanym zakresie stężeń wykazywało działanie przeciwnowotworowe, bez wystąpienia trwałych negatywnych skutków na komórki kontrolne (fibroblasty).

Stwierdzenie synergistycznego efektu przeciwnowotworowego na liniach komórkowych ALL, umożliwiło zaproponowanie dalszych badań związanych z zastosowaniem mieszaniny fitochemicznej u pacjentów pediatrycznych z ALL. Zapoczątkowane przez twórców niniejszego wynalazku badania mogą w przyszłości przyczynić się do zmiany schematów terapeutycznych u pacjentów z grupy wysokiego ryzyka, na bardziej skuteczne, mniej toksyczne i akceptowalne przez chorych.

Badania porównawcze efektu przeciwnowotworowego pojedynczych fitochemikalii oraz ich mieszanin, nie zostały dotychczas przeprowadzone na liniach komórkowych ALL, dlatego wykonano badania in vitro działania pojedynczych związków, jak również ich mieszanin na badane komórki białaczkowe (linia komórkowa MOLT-4). Dzięki zastosowaniu linii komórkowej BJ (kontrolnej, komórki normalne o ograniczonej liczbie podziałów) zweryfikowano również toksyczność wybranych związków w odniesieniu do nie zmienionych nowotworowo komórek (fibroblastów). Obecnie doniesienia naukowe skupiają się niemal wyłącznie na testowaniu fitochemikaliów na liniach komórek nowotworowych, bez równoległego przeprowadzenia doświadczeń na komórkach normalnych. Dzięki przeprowadzeniu badań zarówno na komórkach nowotworowych, jak i normalnych, twórcy ocenili potencjał przeciwnowotworowy badanej mieszaniny z jednoczesną oceną jej potencjalnie negatywnych skutków na komórki normalne. Poprzez zastosowanie różnych stężeń wybranych związków, w zakresie ich bioprzyswajalności, zweryfikowano jak dużą dawkę testowanych fitochemikalii należy zastosować by uzyskać efekt chemioterapeutyczny, bez wywierania trwałego działania szkodliwego na zdrowe komórki.

Wiadomo jest, iż radioterapia czy chemioterapia uszkadzają lub osłabiają odporność immunologiczną pacjenta, w szczególności pacjenta pediatrycznego. Dlatego też ciągle trwają poszukiwania odpowiedniej kompozycji, która wzmocni układ odpornościowy przy leczeniu nowotworów.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja mieszaniny fitozwiązków: kurkuminy, genisteiny, resweratrolu, kwercetyny do zastosowania do wzmacniania aktywności cytotoksycznej w leczeniu ostrych białaczek limfoblastycznych.

Kompozycja, gdzie aktywność cytotoksyczna danego związku we krwi wynosi 2,25 μg/ml dla kurkuminy, 3 μg/ml dla genisteiny, 1,5 μg/ml dla kwercetyny i 0,5 μg/ml dla resweratrolu.

Kompozycja, która jest przeznaczona dla pacjenta pediatrycznego i jest podawana doustnie.

Określenie stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, ma następujące znaczenie:

Pacjent pediatryczny - oznacza pacjenta do 18 roku życia

Fitozwiązki -	substancje/związki pochodzenia roślinnego zawarte w kolorowych owocach i warzywach, jednak nie należące do grupy witamin ani składników mineralnych.
Fitochemikalia GCQR - Opis figur:	synonim fitozwiązków. mieszanina kurkuminy, genisteiny, kwercetyny i resweratolu.

Fig. 1 - Zmiany w procencie żywotnych komórek nowotworowych linii MOLT-4 traktowanych pojedynczymi fitozwiązkami. Zmniejszenie żywotności jest znaczące w przypadku kurkuminy oraz jeszc ze silniejsze w przypadku genisteiny. Stężenia określone jako 0,5x, 1x i 2x określają stężenie danego fitozwiązku w korelacji z jego bioosiagalnością in vivo, przy czym 1x jest to maksymalny poziom bioosiągalności danego związku we krwi (2,25 μg/ml dla kurkuminy, 3 μg/ml dla genisteiny, 1,5 μg/ml dla kwercetyny i 0,5 μg/ml dla resweratrolu). Pomiar żywotności został wykonany za pomocą testu MTT dla czasów 24, 48 i 72 godz. od podania analizowanych związków. Kontrola (K) określona jako 100% żywotności odzwierciedla żywotność populacji, która nie była traktowana fitozwiązkami w każdym punkcie czasowym. Wszystkie punkty przedstawiają średnią wyników 3 niezależnych testów i odchylenia standardowe. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 względem kontroli. Linie przedstawiają różnice między dwiema grupami, ##P<0.01, ###P<0.001.

Fig. 2 - Zmiany w procencie żywotnych komórek nowotworowych linii MOLT-4 oraz normalnych fibroblastów BJ traktowanych wybranymi kombinacjami fitozwiązków. Kombinacja kurkuminy i genisteiny wzmacnia znacząco efekt zmniejszający żywotność komórek MOLT4 a dołączenie do kombinacji resweratrolu i kwercytyny znacząco zwiększa ten efekt i obniża dawkę konieczną do osiągnięcia efektu. Sama genisteina ani żadna analizowana kombinacja nie obniża żywotności komórek BJ. Stężenia określone jako 0,5x, 1x i 2x określają stężenie danego fitozwiązku w korelacji z jego bioosiagalnością in vivo, przy czym 1x jest to maksymalny poziom bioosiągalności danego związku we krwi (2,25 μg/ml dla kurkuminy, 3 μg/ml dla genisteiny, 1,5 μg/ml dla kwercetyny i 0,5 μg/ml dla resweratrolu). Pomiar żywotności został wykonany za pomocą testu MTT dla czasów 24, 48 i 72 godz. (MOLT-4) lub 24 i 72 godz. (BJ) od podania analizowanych związków. Kontrola (K) określona jako 100% żywotności odzwierciedla żywotność populacji, która nie była traktowana fitozwiązkami w każdym punkcie czasowym. Wszystkie punkty przedstawiają średnią wyników 3 niezależnych testów i odchylenia standardowe. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 względem kontroli. Linie przedstawiają różnice między dwiema grupami, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.

Fig. 3 - Zmiany w bezwzględnej żywotności komórek nowotworowych linii MOLT-4 traktowanych wybranymi kombinacjami fitozwiązków. W przypadku dawki bioosiągalnej in vivo, 1x, jedynie kombinacja wszystkich 4 fitozwiązków była w stanie efektywnie zahamować przyrost populacji komórek nowotworowych w czasie 48 godzin od podania fitozwiązków. Stężenia określone jako 0,5x, 1x i 2x określają stężenie danego fitozwiązku w korelacji z jego bioosiagalnością in vivo, przy czym 1x jest to maksymalny poziom bioosiągalności danego związku we krwi (2,25 μg/ml dla kurkuminy, 3 μg/ml dla genisteiny, 1,5 μg/ml dla kwercetyny i 0,5 μg/ml dla resweratrolu). Pomiar żywotności został wykonany za pomocą testu MTT dla czasów 24, 48 i 72 godz. (MOLT-4) lub 24 i 72 godz. (BJ) od podania analizowanych związków. Kontrola (K) określona jako 100% żywotności odzwierciedla żywotność populacji, która nie była traktowana fitozwiązkami w każdym punkcie czasowym. Wszystkie punkty przedstawiają średnią wyników 3 niezależnych testów i odchylenia standardowe. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 względem kontroli.

Fig. 4 - Zmiany w potencjale mitochondrialnym (MMP) komórek nowotworowych linii MOLT-4 oraz komórek normalnych BJ traktowanych wybranymi kombinacjami fitozwiązków. Dla komórek MOLT-4 mieszanina fitozwiązków znacząco statystycznie obniżała MMP niezależnie od zastosowanej dawki i osiągała swój maksymalny spadek przy dawce o 2x bioprzyswajalności. Dla komórek BJ zaob serwowano znaczące spadki dla dawek 1x i 2x, jednak tylko w czasie 24h po indukcji dawką 1x oraz 24h i 48h po indukcji dawką 2x zaobserwowano maksymalny spadek poziomów MMP. Stężenia oznaczone jako 0,5x, 1 x i 2x określają stężenie danego fitozwiązku w korelacji z jego bioosiągalnością in vivo, przy czym 1x jest to maksymalny poziom bioosiągalności danego związku we krwi (2,25 μg/ml dla kurkuminy, 3 μg/ml dla genisteiny, 1,5 μg/ml dla kwercetyny i 0,5 μg/ml dla resweratrolu). Pomiar MMP został wykonany przy użyciu cytometru przepływowego dzięki zastosowaniu znacznika fluorescencyjnego JC-1 (Jodku 1,1', 3,3'-tetraetylo-5,5', 6,6-tetrachloroimidakarbocyjaniny) dla czasów 24, 48 i 72 godz. Kontrola (K) odzwierciedla wyjściowy poziom MMP dla populacji komórek, która nie była traktowana fitozwiązkami w każdym punkcie czasowym. Wszystkie punkty przedstawiają średnią wyników dla 3 niezależnych testów, wykonanych w 3 powtórzeniach technicznych dla 10.000 komórek w każdym powtórzeniu oraz odchylenia standardowe. *P<0.05, ***P<0.001 względem kontroli.

Fig. 5 - Zmiany w przepuszczalności błony komórkowej komórek nowotworowych linii MOLT-4 oraz komórek normalnych BJ traktowanych wybranymi kombinacjami fitozwiązków. Dla obu testowanych linii komórkowych mieszanina fitozwiązków w dawce 2x zwiększała ilość komórek ze zwiększoną przepuszczalnością błony komórkowej. Dla linii nowotworowej również dawki 0,5x oraz 1x powodowały statystycznie znaczący wzrost ilości komórek ze zwiększoną przepuszczalnością błony komórkowej w porównaniu z komórkami kontrolnymi. W przypadku komórek BJ w populacji ilość komórek ze zwiększoną przepuszczalnością błony komórkowej zwiększała się do nieznaczących poziomów zarówno dla dawki 0,5x oraz 1x.

Stężenia oznaczone jako 0,5x, 1x i 2x określają stężenie danego fitozwiązku w korelacji z jego bioosiagalnością in vivo, przy czym 1x jest to maksymalny poziom bioosiągalności danego związku we krwi (2,25 μg/ml dla kurkuminy, 3 μg/ml dla genisteiny, 1,5 μg/ml dla kwercetyny i 0,5 μ/ml dla resweratrolu).

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia.

1. Wykonanie

Przeprowadzono testy mające na celu ocenę działania przeciwnowotworowego wybranych związków pochodzenia naturalnego na komórki ALL:

1.1. Test żywotności obejmujący użycie linii komórkowej testowej (hodowle w obecności pojedynczych fitochemikalii lub ich mieszaniny) oraz linii kontrolnej

Test ten opiera na ocenie aktywności enzymatycznej mitochondriów z użyciem MTT, bromku (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego. Żywe i aktywne metabolicznie komórki redukują MTT do kryształów formazanu. W teście tym komórki wysiewane są w ilości 3x10⁴ komórek na dołek 96-dołkowej płytki w objętości 50 μl standardowej pożywki hodowlanej a następnie seryjne rozcieńczenia analizowanych związków dodawano w objętości 50 μl pożywki hodowlanej uzyskując końcową objętość 100 μl. Do dołków kontrolnych dodawana jest analogiczna objętość rozpuszczalnika bez analizowanych fitozwiązków. Fitozwiązki przechowywane były w formie rozpuszczonej w 100% DMSO, dlatego każde rozcieńczenie oraz pożywki dodawane do kontroli uzupełniano DMSO do nietoksycznego końcowego stężenia 0,05%. Po określonym czasie inkubacji (24, 48 lub 72 godz.) oceniano żywotność komórek poprzez dodanie do każdego dołka 20 μl żółtego roztworu MTT, a po 2-3 godzinach inkubacji oceniano kolorymetryczną zmianę MTT do purpurowych kryształów formazanu poprzez rozpuszczenie kryształów z użyciem kwaśnego izopropanolu i pomiar spektrofotometryczny przy długości fali 570 nm.

Pomiary żywotności komórek z użyciem tego testu wykonano na liniach: MOLT-4 (linia ludzkiej białaczki ALL, standardowo stosowana do oceny działania związków farmaceutycznych na ten typ białaczek) oraz BJ (ludzkie fibroblasty napletkowe, komórki pierwotne, hodowane w sposób krótkotrwały).

Wpływ analizowanych fitozwiązków oceniano w korelacji z ich bioosiągalnością in vivo, stosując dawki 0,5x, 1x i 2x, przy czym 1x było maksymalnym poziomem bioosiągalności danego związku we krwi (2,25 μg/ml dla kurkuminy, 3 μg/ml dla genisteiny, 1,5 μg/ml dla kwercetyny i 0,5 μg/ml dla resweratrolu).

1.2. Analiza potencjału mitochondrialnego przy użyciu cytometrii przepływowej

Analiza ta opierała się na oznaczaniu fluorescencji znacznika JC-1 (Jodku 1,1',3,3'-tetraetylo,5,5',6,6'-tetrachloroimidakarbocyjaniny) dodawanego do zawiesiny komórek. Jako kontrolę niskiego potencjału stosowano CCCP (karbonylocyjanek m-chlorofenylohydrazonu), który rozprzęgał mitochondria i uniemożliwiał agregację JC-1. Komórki nie traktowane fitochemikaliami lub ich mieszaninami były kontrolą wysokiego potencjału mitochondrialnego.

1.3. Analiza przepuszczalności błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Ocena przepuszczalności błony komórkowej opierała się na zjawisku wnikania do wnętrza komórki barwnika Trypan blue (3Z, 3'Z)-3,3'-[(3,3'-dimetylobifenylo-4,4'-diylo)di(1Z)hydrazyn-2-ylo-1-ylideno]bis (5-amino-4-okso-3,4-dihydronaftaleno-2,7-disulfonowy), który wykazuje właściwości fluorescencyjne. Jako kontrolę (komórki z ciągłą błoną komórkową) użyto komórek nie traktowanych fitochemikaliami lub ich mieszaninami. Wynik podawany był jako procent populacji ze zwiększoną przepuszczalnością błony komórkowy.

Pomiar ciągłości błony został wykonany przy użyciu cytometru przepływowego dzięki zastosowaniu znacznika wykazującego fluorescencję Trypan blue (3Z, 3'Z)-3,3'-[(3,3'-dimetylobifenylo-4,4'-diylo)di(1Z)hydrazyn-2-ylo-1-ylideno]bis(5-amino-4-okso-3,4-dihydronaftaleno-2,7-disulfonowy) dla czasów 24, 48 i 72 godz. Kontrola (K) odzwierciedla wyjściowy poziom fluorescencji odpowiadającej populacji komórek, która nie była traktowana fitozwiązkami w każdym punkcie czasowym. Wszystkie punkty przedstawiają średnią wyników dla 3 niezależnych testów, wykonanych w 3 powtórzeniach technicznych dla 10.000 komórek w każdym powtórzeniu oraz odchylenia standardowe. ***P<0.001 względem kontroli.

2. Wyniki:

Wstępne analizy fitozwiązków (Fig. 1) wykazały, że w przypadku dawki bioosiągalnej jedynie genisteina zmniejszała żywotność komórek nowotworowych MOLT-4 po 48 godzinach, gdy kurkumina wymagała 72 godz. przy analogicznej dawce do osiągnięcia efektu. Natomiast kwercetyna i resweratrol nie wpływały na żywotność tych komórek, nawet przy dawkach osiągalnych jedynie in vitro (2x), które były w przypadku genisteiny i kurkuminy stosunkowo wysoko cytotoksyczne.

Analizowano następnie różnorodne kombinacje fitozwiązków, po dwa, trzy związki oraz kombinację wszystkich czterech analizowanych związków. W przypadku dwóch związków kombinacja kurkuminy z genisteiną w tych samych dawkach dawała najsilniejszy efekt (Fig. 2). W przypadku dawki bioosiągalnej wzmocnienie tego efektu było widoczne już po 24 godzinach i utrzymywało się do 48 godzin, natomiast udało się uzyskać po 48 godzinach także efekt biologiczny dla dawki 0,5 x, która dla pojed ynczych związków była efektywna tylko w przypadku genisteiny po 72 godzinach. Wzmocnienie dawek bioosiągalnych in vivo utrzymywało się do 48 godzin od podania związków, gdy dla dawek wyższych, osiągalnych in vitro utrzymywał się do 72 godzin. Natomiast dołączenie resweratrolu i kwercetyny do tej mieszaniny (GCQR) znacząco zwiększyło efekt cytotoksyczny już po 24 godz. dla wszystkich dawek (Fig. 2). Efekt ten utrzymywał się dla wszystkich dawek po 48 godz. oraz dla dawki 1x i 2x po 72 godzinach. Oznacza to znaczące wzmocnienie działania tych fitozwiązków i to w zakresie dawek bioosiagalnych in vivo. Dodatkowo analiza wzrostu bezwzględnego hodowli (Fig. 3) wykazała, że mieszanina QCQR w dawce bioosiągalnej in vivo (1 x) jest w stanie efektywnie zablokować wzrost populacji komórek MOLT-4 w ciągu 48 godzin od podania.

Ocena potencjalnego efektu cytotoksycznego w stosunku zdrowych komórek organizmu za pomocą testu na normalnych fibroblastach płodowych BJ, standardowo używanych do tego typu analiz, wykazała, że mieszanina QCQR nie zmniejsza żywotności komórek BJ, nawet w dawce przekraczającej dwukrotnie dawkę bioosiągalną in vivo (2x). Potencjalnie więc nie wpływa toksycznie na komórki nienowotworowe organizmu (Fig. 2).

Spadek potencjału mitochondrialnego (MMP) był obserwowany zarówno w komórkach nowotworowych MOLT-4 oraz w normalnych BJ (Fig. 4). Obie linie komórkowe traktowane były kombinacją fitozwiązków (kurkumina, genisteina, kwercetyna i resweratrol). W porównaniu do kontroli tj. komórek nietraktowanych każdej linii, pomiędzy komórkami nowotworowymi MOLT-4 i komórkami normalnymi BJ były widoczne różnice w spadku MMP. Dla komórek MOLT-4 obserwowano statystycznie znaczący spadek potencjału mitochondrialnego po 24 h we wszystkich sosowanych stężeniach mieszaniny fitozwiązków, ów spadek zależny był od zastosowanej dawki. Spadek MMP osiągnął swoje maksimum dla dawki 2x bioosiągalnej we wszystkich obserwowanych punktach czasowych. Wyniki te wskazują na znaczne obniżenie możliwości funkcjonowania tych komórek, szczególnie komórek traktowanych dawką 1x i 2x bioosiągalną, co wynika z maksymalnego obniżenia możliwości produkcji xATP przez mitochondria tych komórek. Zjawisko to odzwierciedlają również wyniki wskazujące na większą przepuszczalność błony komórkowej dla tej linii komórek w stosowanych dawkach i punktach czasowych (Fig. 5).

Dla komórek BJ nie zaobserwowano znaczącego spadku MMP dla dawki 0,5x. Dla komórek traktowanych mieszaniną fitozwiązków w dawce L i 2x bioosiągalnej zaobserwowano statystycznie znaczący spadek MMP, jednak był on zależny od czasu indukcji. Dla dawki 1x statystycznie znaczący spadek obserwowany był w czasie 24 h (osiągnął swoje maksimum) oraz w czasie 72 h gdzie obserwowano około 40% poziom MMP w porównaniu do kontroli. Dla dawki 2x bioosiągalnej spadek MMP obserwowany był w czasie 24 h i 48 h, po czym zaobserwowano wzrost MMP po 72 h do około 50% poziomu kontroli. Wyniki te wskazują na duże potencjał normalnych komórek do odzyskania pełnej funkcjonalności.

Znaczący statystycznie wzrost przepuszczalności błony komórkowej komórek nowotworowych MOLT-4 zaobserwowano dla wszystkich dawek mieszaniny fitozwiązków we wszystkich punktach czasowych (Fig. 5). Dla komórek BJ dla dawki 0,5x oraz F w czasie 72 h nie obserwowano znaczącego statystycznie wzrostu ilości komórek ze zwiększoną przepuszczalnością błony komórkowej, co wskazuje na mniejszą wrażliwość tych komórek na działanie mieszaniny fitozwiązków w wymienionych dawkach i punktach czasowych.

3. Podsumowanie

Podsumowując, mieszanina fitozwiązków (genisteina, kurkumina, kwercetyna, resweratrol) prowadzi do zaburzenia funkcji mitochondriów, co zaobserwowano w postaci spadku potencjału mitochondrialnego. W komórkach nowotworowych MOLT-4 spadek MMP obserwowany było już po 24 h dla wszystkich stosowanych dawek mieszaniny, nasilenie tego spadku było zależne od stosowanej dawki, niezależne od czasu indukcji. Dla komórek normalnych BJ spadki MMP również były również obserwowane (dla dawek 1x i 2x), jednak osiągnęły swoje maksima tylko w punktach czasowych 24 h (dawka 1x) oraz 24 h i 48 h (2x). Niższe spadki MMP wraz z dość niską ilością komórek ze zwiększoną przepuszczalnością błony komórkowej dla komórek normalnych w dawkach 1x i 2x w czasie 72 h mogą wskazywać na słabsze działanie analizowanej mieszaniny fitozwiązków na te komórki.

Wykonane eksperymenty pozwoliły też na opracowanie optymalnego składu mieszaniny fitozwiązków mających działanie przeciwnowotworowe koniecznej do uzyskania efektywnego działania przeciwnowotworowego.

Claims (4)

1. Kompozycja mieszaniny fitozwiązków: kurkuminy, genisteiny, resweratrolu, kwercetyny do zastosowania do wzmacniania aktywności cytotoksycznej w leczeniu ostrych białaczek limfoblastycznych.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że aktywność cytotoksyczna danego związku we krwi wynosi 2,25 μg/ml dla kurkuminy, 3 μg/ml dla genisteiny, 1,5 μg/ml dla kwercetyny i 0,5 μg/ml dla resweratrolu.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jest przeznaczona dla pacjenta pediatrycznego.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jest podawana doustnie.