PL241754B1 - Sposób wytwarzania układu zawierającego nanocząstki złota oraz wytworzony tym sposobem układ zawierający nanocząstki złota do zastosowania w terapii przeciwnowotworowej - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania układu zawierającego nanocząstki złota (Au), które w co najmniej 65% wagowych wykazują zasadniczo kształt owalu Cassiniego, o rozmiarach wzdłuż osi podłużnej 55 — 65 nm, wzdłuż osi poprzecznej 24 — 34 nm, a szerokość przewężenia w środkowej części owalu wynosi 22 — 28 nm. Powierzchnia nanocząstek złota jest funkcjonalizowana lekiem przeciwnowotworowym temozolomidem (TMZ), a jako substancję łączącą używa się kwas 16-merkaptoheksadekanowy (MHDA). Wynalazek dotyczy także zastosowania wytworzonego układu w terapii przeciwnowotworowej, zwłaszcza do leczenia nowotworu mózgu o wysokim stopniu złośliwości, jakim jest glejak wielopostaciowy, w połączeniu z radioterapią w zakresie dawek frakcyjnych 0,15 - 15,00 Gy, przy dawce całkowitej do 80 Gy, z uwzględnieniem różnych schematów frakcjonowania. W ciągu całej terapii stosuje się układ w ilości 110 μl na każde 100 - 9000 komórek, a napromienianie prowadzi się do objętości terapeutycznej po upływie 30 minut do 24 godzin od podania układu, przez okres od 15 sekund do 3 godzin.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania układu zawierającego nanocząstki złota funkcjonalizowane temozolomidem, stanowiącego złożony lek chemioterapeutyczny, przeznaczony zwłaszcza do leczenia nowotworu mózgu o wysokim stopniu złośliwości, jakim jest glejak wielopostaciowy.

Przedmiotem wynalazku jest także układ zawierający nanocząstki złota do zastosowania w terapii przeciwnowotworowej, zwłaszcza w leczeniu glejaka wielopostaciowego, w połączeniu z radioterapią.

Glejak wielopostaciowy (łac. glioblastoma multiforme, GBM) to szczególnie złośliwa postać pierwotnego guza mózgu, który cechuje zróżnicowany układ histologiczny i komórkowy. Charakterystyczną cechą GBM jest pleomorfizm komórek nowotworowych, które mogą budować różne niskozróżnicowane formy takie jak np. komórki olbrzymie wielojądrowe, a także bardziej dojrzałe gemistocyty czy astrocyty włókienkowe. W konsekwencji w glejaku wielopostaciowym występują komórki o różnej wielkości, kształcie i stopniu zróżnicowania. GBM szybko rozprzestrzenia się na okoliczne fragmenty mózgu poprzez zwiększony potencjał proliferacyjny, co powoduje jego agresywny rozrost i bardzo niekorzystne rokowania. Jak opisano w publikacji A. Rojek i in. pt. „Wieloletnie przeżycie chorych z glejakiem wielopostaciowym - opisy przypadków”, Polski Przegląd Neurologiczny 2015, 12 (2): 107-115, mediana czasu przeżycia pacjentów z tego rodzaju nowotworem wynosi tylko 5 miesięcy, ponad 80% chorych umiera w ciągu roku od rozpoznania, a 2 lata przeżywa zaledwie około 3-8% chorych.

Aktualnie leczenie chorych z GBM polega na wycięciu chirurgicznym nowotworu, a następnie poddaniu pacjenta chemioterapii lub radioterapii albo też radioterapii w połączeniu z chemioterapią.

Od wielu lat stosowana jest chemioterapia z wykorzystaniem leku temozolomidu (TMZ). Jak opisano m.in. w publikacji Sang Y. Lee, pt. „Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme”, Genes & Diseases (2016) 3, 198-210, TMZ jest dobrze tolerowanym doustnym środkiem, który przechodzi w nienaruszonej postaci przez barierę krew-mózg. Jednak oporność na TMZ jest poważnym problemem w leczeniu złośliwych, nowotworowych komórek glejaka, ponieważ co najmniej 50% pacjentów leczonych TMZ nie odpowiada na to leczenie. W publikacji ujawniono również, że jednoczesna terapia z użyciem zarówno temozolomidu, jak i promieniowania poprawia ogólne przeżycie pacjentów, w stosunku do leczonych samym promieniowaniem. W trakcie leczenia pacjentów z GBM zwykle stosuje się dawkę temozolomidu 75 mg/m² na dobę przez 6 tygodni, jednocześnie z radioterapią ogniskową 60 Gy, a następnie 6 cykli, w których podaje się 150 mg/m² raz dziennie przez 5 dni z rzędu, z 23 dniową przerwą przed następnym cyklem.

Ponieważ tradycyjna strategia terapeutyczna wiąże się często ze znaczną toksycznością i ograniczoną skutecznością, ciągle prowadzone są badania nad nowymi metodami leczenia. Zwłaszcza atrakcyjne możliwości w ostatnich latach oferuje połączenie metod tradycyjnych z metodami opartymi na nanotechnologii, poprzez wykorzystanie w systemach dostarczania leków nanocząstek metali.

Przykładowo, w zgłoszeniu patentowym PL408781 A1, ujawniono zastosowanie nanocząstek metalicznej platyny do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia nowotworów ośrodkowego układu nerwowego, zwłaszcza glejaka. Lek w postaci koloidu jest przeznaczony do podawania drogą bezpośredniej iniekcji do guza i/lub w bezpośrednią okolicę guza i/lub do krwi.

W publikacji międzynarodowego zgłoszenia WO2012089768 A1, ujawniono układ do selektywnego i kontrolowanego uwalniania środka terapeutycznego, który jest przeznaczony m.in. do leczenia nowotworów. Układ zawiera nośnik w postaci nanocząstek metalu z powłoką hydrofilową, który jest związany z co najmniej jednym środkiem terapeutycznym. Nanocząstki wybrano z grupy zawierającej Au, Ag, Pt, Co, Fe, ich tlenki, TiO2 oraz ich mieszaniny, a korzystnie są to nanocząstki złota o wielkości zawartej między 5 a 30 nm. Powłoka hydrofilową składa się z oligomerów kwasu hialuronowego, a środek terapeutyczny jest wybrany z grupy obejmującej środki przeciwzapalne, przeciwciała, antybiotyki, środki przeciwbólowe, środki przeciwnowotworowe, środki immunoterapeutyczne i ich kombinacje. Jako środki przeciwnowotworowe są stosowane liczne związki, takie jak cisplatyna, streptozotocyna, dakarbazyna, temozolomid, bleomycyna, mitomycyna, paklitaksel i wiele innych. Jak wynika z opisu wynalazku, radioterapią może wzmocnić efekt terapeutyczny układu w leczeniu nowotworów.

W publikacji K. Kalimuthu i in., pt.: „Gold nanoparticles stabilize peptide-drug-conjugates for sustained targeted drug delivery to cancer cel”, J Nanobiotechnol (2018) 16:34, ujawniono układy koniugatów peptyd-lek, przeznaczone do dostarczania leków do komórek rakowych na przykładzie chłoniaka. Ze względu na niską stabilność peptydów we krwi łączono je z nanocząstkami złota jako stabilizatorem. Nanocząstki były powlekane najpierw cytrynianem, potem poli(glikolem etyleno

PL 241 754 B1 wym) (PEG), a następnie koniugatem polipeptyd-lek m.in. chlorambucyl, melfalan i bendamustyna. Nanocząstki złota wytworzono z roztworu chlorku złota, który po dodaniu do dejonizowanej wody ogrzewano do wrzenia, po czym dodano cytrynian sodu i po uzyskaniu ciemnoczerwonego koloru roztworu pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej, a nanocząstki złota oddzielono od wody oraz reszty rozpuszczonych w wodzie substancji przez wirowanie. Następnie połączono je z PEG, który zastąpił miejsce cytrynianu na powierzchni nanocząstek złota. W końcowym etapie dodano koniugat polipeptyd-lek i mieszano całość przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Znany jest z publikacji M. U. Farooq i in., pt.: „Gold Nanoparticles-enabled Efcient Dual Delivery of Anticancer Therapeutics to HeLa Cells, Scientific Reports” (2018) 8:2907, układ przeznaczony do leczenia nowotworu szyjki macicy, zawierający nanocząstki złota o kształcie kulistym i średnicy około 13 nm, z warstwą łączącą w postaci PEG, funkcjonalizowane chemicznymi środkami terapeutycznymi w postaci bleomycyny i doksorubicyny.

W publikacji A. Orza i in., pt.: „Reversing chemoresistance of malignant glioma stem cells using gold nanoparticles”, Int J Nanomedicine. 2013; 8: 689-702, opisano badania, w których złote nanocząstki stabilizowane asparaginianem zastosowano do wiązania temozolomidu w celu utworzenia pożądanego końcowego układu dostarczania leku, przeznaczonego do leczenia glejaka. Przeprowadzone badania wykazały, że układ nanocząstki złota - kwas L-asparaginowy - TMZ dawał lepsze rezultaty niż sam TMZ. Nanostruktury złota miały kształt trójkątów o rozmiarach około 55 nm i zostały zsyntetyzowane poprzez redukcję soli złota HAuCk, w silnym środowisku kwasowym (pH = 2) w obecności cząsteczek kwasu L-asparaginianowego, przy ciągłym mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie odwirowano powstały produkt i oczyszczono go wodą. Do produktu dodano TMZ i mieszano przez 1 godzinę.

Z kolei w publikacji J. Verma, pt.: „Delivery and cytotoxicity of doxorubicin and temozolomide to primary glioblastoma cells using gold nanospheres and gold nanorods”, Eur. J. Nanomed. 2016; 8(1):49-60, opisano powlekane krzemionką nanocząstki złota o wydłużonym kształcie, których długość wynosiła 49-65 nm, a średnica 8,5-14 nm oraz nanocząstki złota w kształcie nanosfer o średnicy 9,5-37 nm, które zostały funkcjonalizowane doksorubicyną lub temozolomidem. Ujawniono również ich działanie przeciwnowotworowe, zwłaszcza w stosunku do komórek glejaka.

W publikacji A. Orza i in., pt.: „Reversing chemoresistance of malignant glioma stem cells using gold nanoparticles”, International Journal of Nanomedicine, 2013, s. 689-702, ujawniono nanocząstki złota funkcjonalizowane temozolomidem (TMZ) przy pomocy linkera L-asparaginianowego. Nanocząstki te mają postać trójkątnych drutów o wielkości drutów 55 nm. Autorzy zaobserwowali synergistyczne wzmocnienie indukującej apoptozę aktywności wektorów GNP-asparaginian-TMZ w porównaniu z samym GNP-asparaginianem lub TMZ.

W publikacji C. Grabinski i in., pt.: „Effect of Gold Nanorod Surface Chemistry on Cellular Response”, ACS NANO, 2011, vol. 5, no. 4, s. 2870-2879 porównano wychwyt komórkowy i toksyczność nanoprętów złota funkcjonalizowanych CTAB, PEG lub MHDA. Wykazano, że funkcjonalizowane poprzez kwas 16-merkaptoheksadekanowy (MHDA) złote nanopręty o rozmiarze 35 nm x 10 nm wykazują wysoki wychwyt komórkowy (w porównaniu z funkcjonalizowanym PEG) i niższą toksyczność (w porównaniu z funkcjonalizowanym CTAB). Zgodnie z opisaną procedurą, nanocząstki złota zsyntetyzowano za pomocą metody wzrostu ziarenkowego, z użyciem bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB), kwasu chlorozłotowego (HAuCk), borowodorku sodu (NaBH4), azotanu srebra (AgNOs) i kwasu askorbinowego (CsHbOs).

Natomiast, jak opisano w publikacji J. Rzeszutek i in. pt.: „Zastosowanie nanocząstek i nanomateriałów w medycynie”, Hygeia Public Health 2014, 49(3): 449-457, pomimo wielu zalet, nanocząstki złota mogą wykazywać działanie toksyczne w stosunku do zdrowych tkanek, a wpływ na to mają ich rozmiar, kształt i modyfikacje powierzchniowe.

Przykładowo, w publikacji Schleh C. i in., pt.: „Size and surface charge of gold nanoparticles determine absorption across intestinal barriers and accumulation in secondary target organs after oral administration”, Nanotoxicology 2012;6(1):36-46, autorzy opisali swoje badania na szczurach, którym podawano doprzełykowo nanocząstki złota o różnej wielkości i ładunku. Stosowano cząstki o średnicy: 1,4 nm, 5 nm, 18 nm, 80 nm lub 200 nm oraz o średnicy 2,8 nm i ładunku dodatnim lub ujemnym. Zwierzęta badano po 24 godzinach. Ogólnie, największą kumulację w narządach wtórnych zaobserwowano w przypadku najmniejszych cząstek 1,4 nm. W mózgu i sercu wykryto jednak najwięcej cząstek o średnicy 18 nm .

PL 241 754 B1

Sun Y.N. i in., pt.: „Shape dependence of gold nanoparticles on in vivo acute toxicological effects and biodistribution”, J. Nanosci. Nanotechnol. 2011, 11 (2):1210-1216, badali wpływ kształtu nanoobiektów złota na efekty toksyczne u myszy, którym wstrzykiwano jednorazową dawkę nanocząstek złota w kształcie kul, sześcianów lub prętów i następnie obserwowano ich rozmieszczenie w wątrobie, śledzionie, płucach i nerkach. Najwięcej skutków toksycznych wywołało nanozłoto w kształcie prętów, natomiast najłagodniej działały kuliste nanocząstki złota.

Jak wynika z analizy stanu techniki, pomimo postępu klinicznego i technologicznego, wciąż nie ma skutecznej metody leczenia glejaka wielopostaciowego, ze względu na jego rozproszenie i naciekający wzorzec wzrostu utrudniający całkowitą resekcją chirurgiczną. Standardowa opieka nad pacjentami, u których zdiagnozowano glejaka o wysokim stopniu złośliwości obejmuje pooperacyjne leczenie temozolomidem oraz stosowanie radioterapii. Taka strategia terapeutyczna wiąże się niestety ze znaczną toksycznością i ograniczoną skutecznością. Złośliwe komórki macierzyste glejaka są bowiem odporne na chemoterapeutyki i promieniowanie jonizujące ze względu m.in. na wysoką zdolność do naprawy uszkodzeń DNA. Dlatego poszukiwane są bardziej złożone, zaawansowane i celowane metody leczenia glejaka wielopostaciowego, przy ciągłym prowadzeniu badań w tym zakresie.

Duże możliwości aplikacyjne w systemach dostarczania leków ze względu na swoje korzystne właściwości wykazują nanocząstki złota.

Funkcjonalizacja ich powierzchni pozwala wykorzystać je w obszarze zwalczania komórek nowotworowych. Jednakże w znanych ze stanu techniki sposobach połączeniach nanocząstek złota z lekami przeciwnowotworowymi, wykorzystywana jest zwykle pośrednia warstwa łącząca, taka jak np. krzemionka, oligomery kwasu hialuronowego, czy też poli(glikol etylenowy), która zakrywa szczelnie całą powierzchnię nanocząstek złota. Mimo więc swoich właściwości leczniczych, zazwyczaj nanocząstki złota są traktowane w dużej mierze jako nośnik leku, którym są pokryte.

Ponadto kształty i rozmiary nanocząstek złota oraz modyfikacje powierzchniowe wyraźnie wpływają na ich działanie biologiczne, wchłanianie, rozmieszczenie czy oddziaływanie z komórkami nowotworowymi, a co więcej cząstki o niektórych kształtach mogą być również toksyczne w stosunku do tkanek prawidłowych.

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania układu zawierającego nanocząstki złota funkcjonalizowane lekiem przeciwnowotworowym, w którym to układzie działanie leku będzie dodatkowo wzmocnione zachowaniem samych nanocząstek. Zastosowanie układu wraz z radioterapią umożliwi bardziej skuteczne niż dotychczas leczenie glejaka wielopostaciowego, przy jednocześnie stosowanych niższych dawkach leku i ograniczeniu skutków ubocznych terapii.

Istota sposobu wytwarzania układu zawierającego nanocząstki złota, polegającego na wytworzeniu nanocząstek złota, z użyciem bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB), kwasu chlorozłotowego (HAuCk), borowodorku sodu (NaBH4), azotanu srebra (AgNO3) i kwasu askorbinowego (Cs^Os), na drodze redukcji chemicznej rozpuszczonych w wodzie jonów złota oraz funkcjonalizowaniu ich powierzchni lekiem przeciwnowotworowym temozolomidem, poprzez substancję łączącą, którą jest kwas 16-merkaptoheksadekanowy (MHDA), polega na tym, że wytwarza się nanocząstki złota w procesie dwuetapowym, przy czym w pierwszym etapie otrzymuje się roztwór zawierający zarodki złota, w taki sposób, że do wodnego roztworu bromku heksadecylotrimetyloamoniowego CTAB o stężeniu 4,5-10-3-5,5-10^-3 mM, podgrzanego do temperatury 25-35°C dodaje się wodny roztworu kwasu chlorozłotowego HAuCk o stężeniu 0,46-0,50 mM, w stosunku objętościowym 1:1. Następnie po uzyskaniu klarownej mieszaniny dodaje się do niej schłodzony do temperatury 4-8°C wodny roztwór borowodorku sodu NaBH4 o stężeniu 0,10-0,15 mM, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 mieszaniny CTAB i HAuCk przypada 0,06-0,07 NaBH4 i miesza przez kolejne 30-60 minut od momentu zabarwienia roztworu na różowo-fioletowy kolor. Mieszanie prowadzi się w temperaturze 25-35°C z prędkością 500-700 rpm. W drugim etapie następuje wzrost otrzymanych w pierwszym etapie zarodków złota w taki sposób, że do wodnego roztworu CTAB o stężeniu 4,5-10-3-5,5-10^-3 mM, podgrzanego do temperatury 25-35°C dodaje się roztwór azotanu srebra AgNO3 o stężeniu 3,97-4,00 mM, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 CTAB przypada 0,04-0,05 AgNO3. Po dokładnym wymieszaniu dodaje się do tej mieszaniny wodny roztwór HAuCk o stężeniu 0,46-0,50 mM, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 mieszaniny CTAB i AgNO3 przypada 0,96-1,00 HAuCk i dalej prowadzi mieszanie, a następnie dodaje się jeszcze wodny roztwór kwasu askorbinowego C6H8O6 o stężeniu 78,70-79,00 mM, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 mieszaniny wszystkich poprzednich składników przypada 0,014-0,017 C6H8O6. Następnie do całości wprowadza się roztwór zawierający zarodki złota otrzymany w pierwszym etapie, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 całości

PL 241 754 B1 przypada 0,0030-0,0035 roztworu zawierającego zarodki złota i miesza przez co najmniej 3 godziny od momentu zabarwienia roztworu na różowo-fioletowy kolor, w temperaturze 25-35°C, z prędkością 500-700 rpm, przy czym po upływie kolejno 1 minuty, 15 minut, 30 minut i 1 godziny odciąga się po 0,25% objętości roztworu, uzyskując zawiesinę nanocząstek złota, które w co najmniej 65% wagowych wykazują zasadniczo kształt owalu Cassiniego, o rozmiarach wzdłuż osi podłużnej 55-65 nm, wzdłuż osi poprzecznej 24-34 nm, a szerokość zarysu przewężenia w środkowej części owalu wynosi 22-28 nm. Uzyskany kształt nanoczątek wynika z prowadzonego sposobu syntezy. Dodatek CTAB powoduje, że wiąże się on z powierzchnią nanocząstek, złota zmniejszając ich energię. Dzięki temu możliwa jest kontrola ewolucji kształtu i wzrostu nanocząstek. Jednak największy wpływ na uzyskany kształt ma ostatni etap, w którym odciąga się część roztworu według nieoczywistej procedury. W roztworze zawarte są jony srebra Ag+ które odpowiadają za osadzanie atomów złota w miejscu najbardziej korzystnym energetycznie, a więc wzdłuż płaszczyzny krystalograficznej {111}. Stopniowe usuwanie roztworu i zawartych w nim jonów Ag⁺ powoduje, że atomy złota zaczynają się osadzać na płaszczyźnie {111}, a więc nanocząstka zaczyna się poszerzać w kierunku poprzecznym. Otrzymaną zawiesinę nanocząstek złota po uprzednim rozcieńczeniu wodą od 10 do 10000 razy, miesza się z substancją łączącą w postaci kwasu 16-merkaptoheksadekanowego MHDA o stężeniu 5 mM, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 zawiesiny nanocząstek złota przypada 0,05-0,06 MHDA i pozostawia na okres 20-24 godzin w temperaturze 4-8°C, po czym całość odwirowuje do usunięcia nadmiaru MHDA i przepłukuje dimetyloformamidem o stężeniu 20-21 mM. Następnie dodaje się mieszaninę reakcyjną w takim stosunku objętościowym, że na 0,5-1,0 zawiesiny nanocząstek i MHDA przypada 0,5-1,0 mieszaniny reakcyjnej. Mieszanina reakcyjna uaktywnia grupę karboksylową w MHDA. Składa się ona z roztworów: karboksymetylocelulozy o stężeniu 20-21 mM, fosfoenolopirogronianu o stężeniu 20-21 mM, etylodizopropyloaminy o stężeniu 20-21 mM i dimetyloformamidu o stężeniu 20-21 mM, użytych w stosunku molowym 1:1:1:2. Całość pozostawia się w temperaturze pokojowej na okres co najmniej 30 minut. Po tym czasie mieszaninę odwirowuje się i przepłukuje dimetyloformamidem i dodaje lek przeciwnowotworowy temozolomid TMZ o stężeniu 1-20 μM, w stosunku objętościowym 1:1, w odniesieniu do uzyskanej wcześniej rozcieńczonej zawiesiny zawierającej nanocząstki złota. Mieszaninę pozostawia się na okres 25-40 minut w temperaturze pokojowej, po czym odwirowuje ją z prędkością 10000-14000 rpm i przepłukuje wodą destylowaną co najmniej 2 razy. W końcowym etapie dodaje roztwór N-benzoilo-L-arginina estru etylowego o stężeniu 100 mM, rozpuszczony w stosunku molowym 1:1 w buforze karboksylowym o pH = 7-9 i odwirowuje z prędkością 10000-14000 rpm. Dodatek tych ostatnich składników blokuje miejsca wiążące TMZ, zapobiegając tym samym łączeniu się ze sobą sąsiednich cząsteczek TMZ, zarówno w obrębie tej samej nanocząstki złota, jak i sąsiednich nanocząstek, co mogłoby spowodować utratę ich właściwości leczniczych. Otrzymany układ zawiesza się w wodzie, szczelnie zamyka i przechowuje w warunkach sterylnych.

Istotą wynalazku jest również układ zawierający nanocząstki złota, wytworzony sposobem określonym w niniejszym wynalazku do zastosowania w terapii przeciwnowotworowej, zwłaszcza w leczeniu glejaka wielopostaciowego, w połączeniu z teleradioterapią z wykorzystaniem promieniowania X o energii 3-25 MeV lub wiązkami elektronów o energii do 50 MeV lub promieniowania gamma lub promieniowania X o maksymalnej energii kwantów 300 kVp lub z użyciem wiązki protonowej o energii do 250 MeV, a także w połączeniu z brachyterapią z wykorzystaniem promieniowania gamma lub promieniowania X o maksymalnej energii kwantów 300 kVp, w zakresie dawek frakcyjnych 0,15-15,00 Gy, przy dawce całkowitej do 80 Gy, z uwzględnieniem różnych schematów frakcjonowania. W ciągu całej terapii stosuje się układ w ilości 110 μl na każde 100-9000 komórek, a napromienianie prowadzi się do objętości terapeutycznej, po upływie 30 minut do 24 godzin od podania układu, przez okres od 15 sekund do 3 godzin.

Korzystnie napromienianie prowadzi się jednorazowo, z wykorzystaniem promieniowania X w dawce 2 Gy lub promieniowania protonowego w dawce 2 Gy.

Ze względu na charakterystyczną wielopostaciowość komórek glejaka, nanocząstki złota wytworzone sposobem według wynalazku z uwagi na swój unikalny, nieregularny kształt o zarysie owalu Cassiniego tj. pałeczkowy z wgłębieniem w środkowej części i kulisty na końcach, który wykazuje co najmniej 65% wagowych wszystkich otrzymanych nanocząstek, mogą efektywniej niż stosowane dotychczas nanocząstki tylko kuliste czy w kształcie pałeczek, oddziaływać na tego typu komórki nowotworowe i prowadzić do ich śmierci, z jednoczesnym zachowaniem jak najmniejszej toksyczności nanocząstek w organizmie. Ich kształt i rozmiary pozwalają ponadto na łatwe przenikanie przez barierę

PL 241 754 B1 krew-mózg, co ma niezwykle istotne znaczenie dla leczenia glejaka mózgu. Szczególnie istotną rolę w leczeniu odgrywa wgłębienie powstałe podczas syntezy w środkowej części owalu nanocząsteczek złota, którego rozmiary mogą odpowiadać dopasowaniem do większego rowka DNA komórek nowotworowych, co zwiększa prawdopodobieństwo tworzenia adduktów DNA-nanocząstka-lek, a tym samym zwiększa działanie genotoksyczne tego nanoukładu prowadząc w konsekwencji do śmierci komórek nowotworowych.

Dodatkowo, użycie jako stabilizatora roztworu CTAB, który opłaszcza nanocząstki złota zapobiega ich aglomeracji w trakcie przechowywania i aplikowania. Mechanizm ten opiera się na tworzeniu kompleksu pomiędzy jonami Br^- i Ag⁺, co powoduje zmianę reaktywności powierzchni nanocząstek i wpływa na proces ich wzrostu.

Ważną zaletą całego wytworzonego sposobem według wynalazku układu jest fakt, że użycie pomiędzy nanocząstkami złota, a lekiem przeciwnowotworowym TMZ, kwasu 16-merkaptoheksadekanowego jako substancji łączącej nie blokuje powierzchni nanocząstek i nie separuje jej od środowiska biologicznego, jak to ma miejsce w dotychczas stosowanych układach. MHDA nie przykrywa bowiem dokładnie całej powierzchni nanocząstek, ale łączy się punktowo z ich powierzchnią jednym końcem z grupą tiolową -SH, natomiast drugim końcem, który stanowi grupa karboksylowa, łączy się z TMZ. Dzięki temu nanocząstki złota w odkrytych miejscach mogą się bezpośrednio stykać z błonami biologicznymi i wspomagać proces leczenia, a dodatkowo oddziaływać z promieniowaniem jonizującym. Ze względu na wysoką wartość liczby atomowej Z = 79 nanocząstki złota stanowią doskonały czynnik wspomagający radioterapię, w tym zwłaszcza radioterapię protonową. Główną zaletą radioterapii protonowej jest bardzo duża precyzja z jaką wiązka promieniowania dociera do guza nowotworowego. Dzieje się tak za sprawą właściwości fizycznych samych protonów (pik Bragga) oraz ze względu na korzystny rozkład dawki w tkankach.

Tak więc zachodzi potrójny efekt działania układu, a mianowicie leku przeciwnowotworowego TMZ, samych nanocząstek złota w niezamaskowanych obszarach, gdzie nie jest przyłączony lek i radioterapii protonowej, dodatkowo wspomaganej przez działanie nanocząstek złota w odkrytych miejscach.

Zastosowanie wytworzonego układu poprawia skuteczność terapii przeciwnowotworowych i ogranicza skutki uboczne dla komórek prawidłowych, w porównaniu do dotychczas stosowanych terapii przeciwnowotworowych, m.in. ze względu na znaną np. z publikacji M. Hu i in. pt. „Proton beam therapy for cancer in the era of precision medicine”, J Hematol Oncol. 2018; 11: 136, możliwość dostosowania celowanej dawki promieniowania protonowego do objętości nowotworu, jak również na możliwości obniżenia dawek leku podawanych pacjentom w stosunku do stosowanych obecnie, w wysokości 20-140 μM, wskazanych m.in. w publikacji J. Gaspar i in., pt. „Induction of MGMT expression is associated with temozolomide resistance in glioblastoma xenografts”, Neuro Oncol. 2009 Jun; 11 (3): 281-291 .W rezultacie również długość trwania i koszt takiej terapii może okazać się niższy.

Można również przypuszczać, że układy nanocząstek złota wytworzonych sposobem według niniejszego wynalazku w połączeniu z innymi lekami, dzięki zastosowaniu terapii skojarzonej zwłaszcza z radioterapią protonową będą aktywne wobec pozostałych rodzajów nowotworów.

Sposób wytwarzania układu zawierającego nanocząstki złota funkcjonalizowane temozolomidem oraz zastosowanie tego układu do leczenia glejaka wielopo staciowego objaśniono poniżej w praktycznych przykładach realizacji wynalazku oraz na rysunku, na którym pokazano na fig. 1 obraz nanocząstek złota uzyskany ze skaningowego transmisyjnego mikroskopu elektronowego, na fig. 2 schemat procesu funkcjonalizacji powierzchni nanocząstek złota lekiem przeciwnowotworowym TMZ, poprzez substancję łączącą MHDA, na fig. 3 widma FT-Ramana dla TMZ (a), dla MHDA (b), dla nanocząstek złota połączonych z MHDA (c), dla wytworzonego układu zawierającego nanocząstki złota połączone z MHDA i TMZ (d), na fig. 4 wykresy stabilności temperaturowej wytworzonego układu w funkcji czasu: TGA (a) i DSC (b), na fig. 5 rozdział elektroforetyczny i ocenę integralności RNA, wyizolowanego z komórek linii glejaka U118 i U251, po napromienianiu ich protonami, na fig. 6 rozdział elektroforetyczny i ocenę integralności RNA, wyizolowanego z komórek linii glejaka U118 i U251, potraktowanych ich kolejno TMZ, nanocząstkami złota oraz układem zawierającym nanocząstki złota i TMZ, a następnie napromienianiu prot onami, a na fig. 7 poglądowe zdjęcia komórek linii U251 (powiększenie 400x) poddanych działaniu TMZ (b), nanocząstek złota (c), układu zawierającego nanocząstki złota i TMZ (d), a także dodatkowo napromienianych protonami (f-h) oraz obraz próby kontrolnej prawidłowych komórek linii U251 (a) i po napromienianiu ich protonami (e).

PL 241 754 B1

Przykład 1

Wytworzono nanocząstki złota w procesie dwuetapowym. W pierwszym etapie otrzymano zarodki złota o kształcie sferycznym, a w drugim etapie następował wzrost tych zarodków.

Etap 1 - otrzymanie zarodków złota.

Przygotowano następujące roztwory:

A - roztwór bromku heksadecylotrimetyloamoniowego CTAB o stężeniu 5· 10^-3 mM, otrzymany w taki sposób, że po odważeniu 0,364 g surfaktantu CTAB rozpuszczono go w 5 ml wody jednocześnie lekko ogrzewając do temperatury 30°C, aż do uzyskania transparentnego roztworu.

B - roztwór kwasu chlorozłotowego HAuCk o stężeniu 0,46 mM, otrzymany w taki sposób, że odważono 0,0085 g HAuCl4 i rozpuszczono w 5 ml wody destylowanej.

C - roztwór borowodorku sodu NaBH4 o stężeniu 0,1 mM, otrzymany w taki sposób, że odważono 0,0038 g NaBH4, a następnie rozpuszczono go w 10 ml wody i od razu umieszczono w lodówce, w celu obniżenia jego temperatury do 4°C.

Do 5 ml roztworu A dodano 5 ml roztworu B i dokładnie wymieszano, a po upływie 3 minut i uzyskaniu klarownej mieszaniny dodano 0,6 ml roztworu C i dalej mieszano przez 15 minut, aż do momentu zabarwienia roztworu na różowo-fioletowy kolor i potem jeszcze przez kolejne 30 minut. Mieszanie prowadzono na płytce grzejącej z mieszadłem magnetycznym, w temperaturze 30°C z prędkością mieszania 700 rpm.

Etap 2 - wzrost zarodków złota.

Ponownie przygotowano świeże roztwory A i B, a ponadto:

D - roztwór AgNO3 o stężeniu 3,97 mM, otrzymany w taki sposób, że odważono 0,0135 g AgNO3, a następnie rozpuszczono go w 20 ml wody destylowanej.

E - roztwór kwasu askorbinowego CsHbOs o stężeniu 78,7 mM, otrzymany w taki sposób, że odważono 0,1386 g kwasu askorbinowego, a następnie rozpuszczono go w 10 ml wody destylowanej.

Do 5 ml roztworu A dodano 0,2 ml roztworu D i dokładnie wymieszano, a następnie po upływie 3 minut dodano 5 ml roztworu B ciągle mieszając, po czym po upływie kolejnych 3 minut dodano 70 μl roztworu E. Po uzyskaniu klarownej mieszaniny wprowadzono do niej 30 μl roztworu zawierającego zarodki złota otrzymanego w etapie 1 i dalej mieszano przez 5 minut, aż do momentu zabarwienia roztworu na różowo-fioletowy kolor i potem jeszcze przez kolejne 3 godziny. Mieszanie prowadzono na płytce grzejącej z mieszadłem magnetycznym, w temperaturze 30°C z prędkością mieszania 700 rpm. Po upływie kolejno 1 minuty, 15 minut, 30 minut i 1 godziny odciągano po 0,25% objętości roztworu.

Uzyskano zawiesinę nanocząstek złota, które w co najmniej 65% wagowych wykazywały kształt owalu Cassiniego, o rozmiarach wzdłuż osi podłużnej 55-65 nm, wzdłuż osi poprzecznej 24-34 nm, a szerokość przewężenia w środkowej części owalu wynosiła 22-28 nm.

Zbadano morfologię uzyskanych nanocząstek złota za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) z wykorzystaniem pierścieniowego detektora ciemnego pola pod wysokim kątem, w trybie konwencjonalnym i przy wysokiej rozdzielczości. Do badań wykorzystano mikroskop elektronowy FEI Titan pracujący przy napięciu 300 kV i wyposażony w katodę FEG. Uzyskany obraz STEM nanocząstek przedstawiono na fig. 1.

Następnie 1 ml uzyskanej zawiesiny nanocząstek złota, po uprzednim 1000 - krotnym rozcieńczeniu ich wodą, zmieszano z 50 μl kwasu 16-merkaptoheksadekanowego MHDA o stężeniu 5 mM i pozostawiono na okres 24 godzin w temperaturze 4°C.

Po tym czasie odwirowano nadmiar MHDA, przepłukano nanocząstki roztworem dimetyloformamidu DMF o stężeniu 20 mM i ponownie odwirowano, a następnie dodano 100 μl mieszaniny reakcyjnej składającej się z roztworów: karboksymetylocelulozy o stężeniu 20 mM, fosfoenolopirogronianu o stężeniu 20 mM, etylodizopropyloaminy o stężeniu 20 mM i DMF o stężeniu 20 mM, zmieszane w stosunku molowym 1:1:1:2. Całość pozostawiono w temperaturze pokojowej na okres 30 minut, po czym odwirowano, przepłukano roztworem DMF i ponownie odwirowano, aż do całkowitego usunięcia DMF.

W końcowym etapie do mieszaniny dodano 1 ml TMZ o stężeniu 5 μM i pozostawiono na okres 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym wirowano przez 10 minut z prędkością 14 000 rpm i przepłukano 2 razy wodą destylowaną, a następnie dodano roztwór N-benzoilo-L-arginina estru etylowego o stężeniu 100 mM, rozpuszczony w stosunku molowym 1:1 w buforze karboksylowym o pH = 8 i odwirowano w takich samych jak wcześniej warunkach oraz usunięto nasącz. Otrzymany

PL 241 754 B1 układ zawieszono w wodzie, szczelnie zamknięto i przechowywano w warunkach sterylnych. Proces funkcjonalizacji powierzchni nanocząstek złota przedstawiono schematycznie na fig. 2.

W celu weryfikacji procesu funkcjonalizacji, przeprowadzono badania otrzymanego układu przy użyciu spektrometru FT-Raman Nicolet NXR 9650 wyposażonego w laser Nd: YAG (1064 nm) i detektor germanowy. Pomiary przeprowadzono w zakresie od 150 do 3700 cm^-1 przy mocy lasera o mocy 1 W. Zastosowano nieostrą wiązkę laserową o średnicy około 100 μm i rozdzielczości spektralnej 8 cm^-1. Każde pojedyncze widmo zbierano przy użyciu 128 skanów. Widma Ramana zostały zanalizowane przy wykorzystaniu oprogramowanie OPUS 7.0.129. Uzyskane wyniki pokazano na fig. 3, na której oznaczono widmo FT- Ramana czystego TMZ (a), czystego MHDA (b), nanocząstek połączonych z MHDA (c) oraz nanocząstek złota połączonych z MHDA i TMZ (d). MHDA jest związkiem chemicznym, który na jednym końcu łańcucha posiada grupę tiolową -SH, natomiast na drugim końcu grupę karboksylową -COOH. Na fig. 3 zaznaczono przesunięcia Ramana dla tych dwóch grup. Drganie grupy tiolowej znajduje się przy przesunięciu Ramana równym 2900 cm^-1. Natomiast drganie przy przesunięciu Ramana 1680 cm^-1 jest charakterystyczne dla grupy C=O. Na widmie FT-Ramana charakterystycznym dla czystego MHDA widać sygnały od w/w grup funkcyjnych, podczas gdy na widmie dla nanocząstek złota połączonych z MHDA nie zaobserwowano sygnału pochodzącego od grupy tiolowej, co potwierdza, że MHDA połączyło się poprzez grupę tiolową z powierzchnią nanocząstek złota. Z kolei na widmie dla nanocząstek złota połączonych z MHDA i TMZ nie zaobserwowano ani drgania pochodzącego z grupy -SH, ani też pochodzącego od grupy C=O. Potwierdza to, że MHDA swoim drugim końcem połączyło się z lekiem przeciwnowotworowym TMZ.

Zbadano również stabilność temperaturową otrzymanego układu, a uzyskane wyniki przedstawiono na fig. 4. Pomiary przeprowadzono za pomocą różnicowego kalorymetru skaningowego DSC 2500 firmy TA Instruments wyposażonego w pompę ciekłego azotu LN2P. Próbki o masie około 1-3 mg umieszczono w aluminiowych szalkach i zaciśnięto hermetycznymi pokrywkami. Zachowanie termiczne próbek badano przy suchym przedmuchiwaniu czystym azotem N5.0 (25 ml/min) w zakresie temperatur od 10°C do 200°C przy szybkości ogrzewania 5°C i 10°C/min, i przy szybkości chłodzenia 5°C/min. Do obliczenia temperatur szczytowych i wartości entalpii zarejestrowanych zdarzeń termicznych wykorzystano oprogramowanie TRIOS. Wyniki eksperymentów TGA (a) i DSC (b) wskazują, że układ pozostaje stabilny termicznie aż do temperatury 100°C przy szybkości ogrzewania wynoszącej 5°C/min. Kształt sygnału TGA wskazuje na silne odparowanie rozpuszczalnika z próbki cieczy, widoczny między około 68°C (5% ubytek masy) i 119°C (59,7% ubytek masy), a następnie jego rozkład chemiczny w zakresie temperatur od 120°C do 138°C (utrata masy 40,03%). Termogram DSC nie wykazuje żadnych znaczących anomalii termicznych do 110°C. Anomalie zarejestrowane powyżej tej temperatury, a także przesunięcie linii podstawowej, są skutkami szybkiego wrzenia i rozkładu próbki lub destabilizacji MHDA.

Przykład 2

Układ wytworzony sposobem opisanym w przykładzie 1 zastosowano do dwóch linii komórkowych glejaka wielopostaciowego klasyfikowanych jako IV stopień złośliwości według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO, z ang. World Health Organization):

1) U 118 MG (ATCC® HTB-15TM) zakupionej w The American Type Culture Collection (ATCC);

2) U 251 MG, zakupionej w Public Health England (PHE) Culture Collections, nr kat.

09063001.

Hodowlę komórek U 118 MG prowadzono wg procedury ATCC. Do wysiewania używano komórki z pasażu w zakresie 9-11.

Hodowlę komórek U 251 MG prowadzono wg. procedury dołączonej przez PHE. Do wysiewania używano komórki z pasażu w zakresie 7-8.

Komórki wysiewano w ilości 2-3 tys. komórek na każde 200 μl medium pełnego hodowlanego składającego się z Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (ATCC, Nr kat. 30-2002) w stosunku 9:1 z surowicą cielęcą (Sigma-Aldrich, Nr kat. F9665). Komórki hodowano w temp. 37°C, w atmosferze 5% CO2.

Po upływie 72 godzin od założenia hodowli wymieniono medium hodowlane na świeże i następnie dodano do pojedynczych hodowli, o liczebności 6-9 tysięcy komórek każda, po 110 μl układu, zawierającego TMZ o stężeniu 5 pM oraz nanocząstki złota w postaci zawiesiny 0 stężeniu 0,01487 μM.

PL 241 754 B1

Po upływie 2 godzin od dodania układu, hodowle każdej linii komórkowej podzielono na dwie części. Jednorazowo naświetlano przez 1 minutę: jedną część wiązką promieniowania X o maksymalnej energii kwantów 250 kVp w dawce 2 Gy, a drugą część wiązką protonową o energii 70 MeV, również w dawce 2 Gy.

Napromieniania promieniowaniem X zostały przeprowadzone przy użyciu aparatu rentgenowskiego z lampą MCN 323 firmy Philips, pracującym pod napięciem 250 kVp, przy natężeniu 10 mA, z filtrem o grubości 2,5 mm. Odległość lampy od napromienianych próbek wynosiła 21 cm. Dawki określono przy zastosowaniu zestawu PTW Freiburg UNIDOS z komorą jonizacyjną 0,125 cm³ na poziomie 50 cGy/min.

Napromieniania wiązką protonową zostały przeprowadzone w Centrum Cyklotronowym Bronowice, w Instytucie Fizyki Jądrowej w Krakowie, na stanowisku gantry umożliwiającym napromienianie wiązką protonową z wykorzystaniem cyklotronu Proteus C-235 (IBA PT, Louvain-la-Neuve, Belgia) za pomocą techniki skanującej. Użyto monoenergetycznego pola o energii 70 MeV oraz wymiarach 15 cm x 15 cm. Napromienienie było przeprowadzone na głębokości 1,1 cm ekwiwalentu wody.

Na fig. 5 pokazano rozdział elektroforetyczny i ocenę integralności RNA (RIN - RNA Integrity Number) wyizolowanego z linii komórkowych glejaka wielopostaciowego U118 i U251, napromienianych dawką 2 Gy promieniowania protonowego oraz komórek nienaświetlanych (kontrola), po 3 godzinach od zakończenia napromieniania. Izolacja RNA została wykonana zgodnie z protokołem OIAGEN, RNeasy Mini Kit, nr kat. 74104. Pomiar integralności RNA wykonano z 1,5 μl próbki przy długości fali 260 nm i 280 nm za pomocą spektrofotometru Tecan SPARK 10M.

Zastosowana metoda pozwala na określenie całościowego RNA w systemie numerowym od 1-10, gdzie 1 oznacza RNA najbardziej zdegradowane, a 10 najlepszej jakości. Linie komórkowe są numerowane od 1, począwszy od lewej strony, a symbol „nt” na wykresie oznacza liczbę nukleotydów.

Uzyskano następujące wyniki:

Linia 1 - wzorzec długości fragmentów

Linia 2 - linia U118, bez napromieniania (kontrola) RIN9,8

Linia 3 - linia U118 + promieniowanie protonowe RIN9,2

Linia 4 - linia U251, bez napromieniania (kontrola) RIN9,3

Linia 5 - linia U251 + promieniowanie protonowe RIN9,8

Uzyskane wartości RIN wskazują na brak wyraźnej degradacji materiału genetycznego, zarówno dla kontroli jak i komórek glejaka traktowanych samym promieniowaniem protonowym. Świadczy to o niewielkiej skuteczności uszkodzenia materiału genetycznego poprzez aplikowanie samej radioterapii na ten typ komórek nowotworowych.

Na fig. 6 pokazano rozdział elektroforetyczny i ocenę integralności RNA (RIN) wyizolowanego z linii komórkowych glejaka wielopostaciowego U118 i U251, traktowanych kolejno TMZ, nanocząstkami złota oraz układem, a następnie napromienianych dawką 2 Gy promieniowania protonowego.

Ocena była dokonywana po 3 godzinach od zakończenia napromieniania. Linie komórkowe są numerowane od 1, począwszy od lewej strony, a symbol „nt” na wykresie oznacza liczbę nukleotydów.

Uzyskano następujące wyniki:

Linia 1 - wzorzec długości fragmentów

Linia 2 - Linia U118, TMZ + promieniowanie protonowe RIN8,4

Linia 3 - Linia U118, nanocząstki złota + promieniowanie protonowe RIN5,3

Linia 4 - Linia U118, układ + promieniowanie protonowe RIN3,4

Linia 5 - Linia U251, TMZ 5pM + promieniowanie protonowe RIN9,1

Linia 6 - Linia U251,3 h, nanocząstki złota + promieniowanie protonowe RIN 10,0

Linia 7 - linia U251, układ + promieniowanie protonowe RIN 5,0

Uzyskane wartości RIN wskazują na działanie układu wraz z promieniowaniem protonowym, prowadząc do degradacji RNA dla obu badanych linii komórek glejaka, uniemożliwiając tym samym prowadzenie dalszych badań z zakresu ekspresji genów. Ma to istotne znaczenie dla terapii, gdyż układ w połączeniu z promieniowaniem działa w stosunku do różnych typów glejaka. Przeciwnie niż układ, stosowanie samego TMZ o stężeniu 5 μM wraz z promieniowaniem protonowym nie doprowadzało do tak drastycznych zmian integralności RNA. Także same nanocząstki złota wraz z promieniowaniem protonowym doprowadziły do dezintegracji tylko dla linii U 118, nie działając na linie U 251.

W tabeli 1 pokazano procent komórek żywych wraz z odchyleniem standardowym oznaczonych dla linii glejaka U251 oraz U118, napromienianych dawką 2 Gy promieniowania X oraz taką sama dawką promieniowania protonowego. Pomiar żywotności komórek był wykonany po 48 oraz 72 godzi

PL 241 754 Β1 nach od zakończenia napromieniania. Po 24 godzinach nie odnotowano istotnych zmian w żywotności komórek, w odniesieniu do kontroli. Oznaczanie cytotoksyczności zostało wykonane w oparciu o metodę ilościową określania aktywności metabolicznej komórek - test MTT (In Vitro Toxicology Assay Kit, MTT based, Sigma Aldrich, Nr kat. ΤΟΧ1-1ΚΤ). Do odczytu wykorzystano czytnik płytek Tecan SPARK 10M.

Tabela 1

	Po 48 h	Po 72 h
Linia U251
Promieniowanie X	99,29±3,44	94,68±3,67
Promieniowanie protonowe	88,37±0,79	86,45±1,50
Linia U118
Promieniowanie X	97,04+2,61	94,59±2,46
Promieniowanie protonowe	91,53+3,59	79,34±0,94

Otrzymane rezultaty pokazują, że samo promieniowanie nie powoduje drastycznych zmian w żywotności komórek glejaka nawet po upływie 48 i 72 h. Najskuteczniej działało promieniowanie protonowe na linię U118, niemniej jednak spowodowało śmiertelność tylko dla około 20% komórek.

W tabeli 2 pokazano procent komórek żywych wraz z odchyleniem standardowym oznaczonych dla linii glejaka wielopostaciowego U251 oraz U118. Komórki były traktowane kolejno TMZ, nanocząstkami złota oraz układem, a następnie napromieniane dawką 2 Gy promieniowania X lub dawką 2 Gy promieniowania protonowego. Pomiar żywotności komórek był wykonany po 24 godzinach od napromieniania oraz po 26 godzinach od podania TMZ lub nanocząstek złota lub układu, bez napromieniania. Oznaczanie cytotoksyczności zostało wykonane w oparciu o metodę ilościową określania aktywności metabolicznej komórek - test MTT (In Vitro Toxicology Assay Kit, MTT based, Sigma Aldrich, Nr kat. ΤΟΧ1 -1KT). Do odczytu wykorzystano czytnik płytek Tecan SPARK 10M.

Tabela 2

	Linia U251	Linia U118
TMZ	93,58±4,32	93,18±6,02
TMZ + promieniowanie X	92,97±2,36	93,46±1,79
TMZ + promieniowanie protonowe	93,14±3,75	92,09±1,40
Nanocząstki złota	73,95±6,37	68,41 ±3,02
Nanoczątki złota + promieniowanie X	47,73±4,69	55,08±2,25
Nanocząstki złota + promieniowanie protonowe	40,63±3,99	43,46±1,55
Układ	63,90±2,06	59,88±1,12
Układ + promieniowanie X	35,71 ±5,92	39,25±5,77
Układ + promieniowanie protonowe	7,47±1,61	5,46±1,23

Uzyskane wartości wyraźnie potwierdzają, że już sam układ powoduje spadek żywotności komórek dla obu badanych typów komórek GBM. Promieniowanie jonizujące wzmaga działanie układu, a zabicie największej liczby komórek nowotworowych obserwuje się po zastosowaniu układu w połą

PL 241 754 B1 czeniu z promieniowaniem protonowym. Najsłabsze działanie obserwowano dla aktualnie stosowanej terapii tj. połączenia TMZ z radioterapią lub samego TMZ.

Na fig. 7 pokazano poglądowe zdjęcia komórek linii U251, wykonane za pomocą mikroskopu Leica DMi8, przy powiększeniu 400x po upływie 24 godzin od zakończenia napromieniania komórek. Obraz komórek prawidłowych przedstawiono na fig. 7a. Komórki traktowano kolejno TMZ (fig. 7b), nanocząstkami złota (fig. 7c) oraz układem (fig. 7d). Również wykonano zdjęcia po napromienianiu komórek dawką 2 Gy promieniowania protonowego, po 2 godzinach od podania ww. substancji. Na fig. 7f pokazano obraz komórek poddanych działaniu TMZ i promieniowania, na fig. 7g komórek poddanych działaniu nanocząstek złota i promieniowania, na fig. 7h komórek poddanych działaniu układu i promieniowania, a na fig. 7e komórek poddanych działaniu samego promieniowania (kontrola).

Po zastosowaniu układu (fig. 7d i fig. 7h) widać charakterystyczną zmianę morfologii (kształtu komórek), które nie są rozpłaszczone i przyklejone do szalki jak komórki prawidłowe (fig. 7a), tylko poprzez działanie cytotoksyczne odkleiły się od podłoża, tworząc zawiesinę i zmieniły kształt na okrągły. Potwierdza to działanie układu, który doprowadził do zabicia komórek nowotworowych GBM.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania układu zawierającego nanocząstki złota, polegający na wytworzeniu nanocząstek złota, z użyciem bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB), kwasu chlorozłotowego (HAuCk), borowodorku sodu (NaBH4), azotanu srebra (AgNO3) i kwasu askorbinowego (C6H8O6), na drodze redukcji chemicznej rozpuszczonych w wodzie jonów złota oraz funkcjonalizowaniu ich powierzchni lekiem przeciwnowotworowym temozolomidem, poprzez substancję łączącą, którą jest kwas 1 6-merkaptoheksadekanowy (MHDA), znamienny tym, że wytwarza się nanocząstki złota w procesie dwuetapowym, przy czym w pierwszym etapie otrzymuje się roztwór zawierający zarodki złota w taki sposób, że do wodnego roztworu bromku heksadecylotrimetyloamoniowego CTAB o stężeniu 4,5-10-3-5,5-10^-3 mM, podgrzanego do temperatury 25-35°C dodaje się wodny roztworu kwasu chlorozłotowego HAuCk o stężeniu 0,46-0,50 mM, w stosunku objętościowym 1:1, a następnie po uzyskaniu klarownej mieszaniny dodaje się do niej schłodzony do temperatury 4-8°C wodny roztwór borowodorku sodu NaBH4 o stężeniu 0,10-0,15 mM, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 mieszaniny CTAB i HAuCk przypada 0,06-0,07 NaBH4 i miesza przez kolejne 30-60 minut od momentu zabarwienia roztworu na różowo-fioletowy kolor, przy czym mieszanie prowadzi się w temperaturze 25-35°C z prędkością 500-700 rpm, natomiast w drugim etapie następuje wzrost otrzymanych w pierwszym etapie zarodków złota w taki sposób, że do wodnego roztworu CTAB o stężeniu 4,5-10-3-5,5-10^-3 mM, podgrzanego do temperatury 25-35°C dodaje się roztwór azotanu srebra AgNO3 o stężeniu 3,97-4,00 mM, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 CTAB przypada 0,04-0,05 AgNO3, a po dokładnym wymieszaniu dodaje się do tej mieszaniny wodny roztwór HAuCI4 o stężeniu 0,46-0,50 mM, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 mieszaniny CTAB i AgNO3 przypada 0,96-1,00 HAuCk i dalej prowadzi mieszanie, a następnie dodaje się jeszcze wodny roztwór kwasu askorbinowego C6H806 o stężeniu 78,70-79,00 mM, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 mieszaniny wszystkich poprzednich składników przypada 0,014-0,017 C6H8O6, po czym do całości wprowadza się roztwór zawierający zarodki złota otrzymany w pierwszym etapie, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 całości przypada 0,0030-0,0035 roztworu zawierającego zarodki złota i miesza przez co najmniej 3 godziny od momentu zabarwienia roztworu na różowo-fioletowy kolor, w temperaturze 25-35°C, z prędkością 500-700 rpm, przy czym po upływie kolejno 1 minuty, 15 minut, 30 minut i 1 godziny odciąga się po 0,25% objętości roztworu, uzyskując zawiesinę nanocząstek złota, które w co najmniej 65 % wagowych wykazują zasadniczo kształt owalu Cassiniego, o rozmiarach wzdłuż osi podłużnej 55-65 nm, wzdłuż osi poprzecznej 24-34 nm, a szerokość zarysu przewężenia w środkowej części owalu wynosi 22-28 nm, po czym otrzymaną zawiesinę nanocząstek złota po uprzednim rozcieńczeniu wodą od 10 do 10000 razy, miesza się z substancją łączącą w postaci kwasu 16-merkaptoheksadekanowego MHDA o stężeniu 5 mM, w takim stosunku objętościowym, że na 0,9-1,0 za

   PL 241 754 B1 wiesiny nanocząstek złota przypada 0,05-0,06 MHDA i pozostawia na okres 20-24 godzin w temperaturze 4-8°C, po czym całość odwirowuje do usunięcia nadmiaru MHDA i przepłukuje dimetyloformamidem o stężeniu 20-21 mM, a następnie dodaje mieszaninę reakcyjną w takim stosunku objętościowym, że na 0,5-1,0 zawiesiny nanocząstek i MHDA przypada 0,5-1,0 mieszaniny reakcyjnej, która to mieszanina reakcyjna składa się z roztworów: karboksymetylocelulozy o stężeniu 20-21 mM, fosfoenolopirogronianu o stężeniu 20-21 mM, etylodizopropyloaminy o stężeniu 20-21 mM i dimetyloformamidu o stężeniu 20-21 mM, użytych w stosunku molowym 1:1:1:2 oraz pozostawia w temperaturze pokojowej na okres co najmniej 30 minut, a po tym czasie mieszaninę odwirowuje się i przepłukuje dimetyloformamidem i dodaje lek przeciwnowotworowy temozolomid TMZ o stężeniu 1-20 μM, w stosunku objętościowym 1:1, w odniesieniu do uzyskanej wcześniej rozcieńczonej zawiesiny zawierającej nanocząstki złota, pozostawia na okres 25-40 minut w temperaturze pokojowej, po czym odwirowuje z prędkością 10000-14000 rpm i przepłukuje wodą destylowaną co najmniej 2 razy, a w końcowym etapie dodaje roztwór N-benzoilo-L-arginina estru etylowego o stężeniu 100 mM, rozpuszczony w stosunku molowym 1:1 w buforze karboksylowym o pH = 7-9 i odwirowuje z prędkością 10000-14000 rpm, a otrzymany układ zawiesza się w wodzie, szczelnie zamyka i przechowuje w warunkach sterylnych.
2. 2. Układ zawierający nanocząstki złota, wytworzony sposobem określonym w zastrzeżeniu 1 do zastosowania w terapii przeciwnowotworowej, zwłaszcza w leczeniu glejaka wielopostaciowego, w połączeniu z teleradioterapią z wykorzystaniem promieniowania X o energii 3-25 MeV lub wiązkami elektronów o energii do 50 MeV lub promieniowania gamma lub promieniowania X o maksymalnej energii kwantów 300 kVp lub z użyciem wiązki protonowej o energii do 250 MeV, a także w połączeniu z brachyterapią z wykorzystaniem promieniowania gamma lub promieniowania X o maksymalnej energii kwantów 300 kVp, w zakresie dawek frakcyjnych 0,15-15,00 Gy, przy dawce całkowitej do 80 Gy, z uwzględnieniem różnych schematów frakcjonowania, przy czym w ciągu całej terapii stosuje się układ w ilości 110 μl na każde 100-9000 komórek, a napromienianie prowadzi się do objętości terapeutycznej po upływie 30 minut do 24 godzin od podania układu, przez okres od 15 sekund do 3 godzin.
3. 3. Układ zawierający nanocząstki złota do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że napromienianie prowadzi się jednorazowo, z wykorzystaniem promieniowania X w dawce 2 Gy lub promieniowania protonowego w dawce 2 Gy.