PL240353B1 - 3-azotowe pochodne 2,3-dideoksy-D-rybo-heksopiranozydów metylu do zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1 - Google Patents
3-azotowe pochodne 2,3-dideoksy-D-rybo-heksopiranozydów metylu do zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1 Download PDFInfo
- Publication number
- PL240353B1 PL240353B1 PL430182A PL43018219A PL240353B1 PL 240353 B1 PL240353 B1 PL 240353B1 PL 430182 A PL430182 A PL 430182A PL 43018219 A PL43018219 A PL 43018219A PL 240353 B1 PL240353 B1 PL 240353B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hiv
- reverse transcriptase
- methyl
- dideoxy
- hexopyranoside
- Prior art date
Links
- 101900297506 Human immunodeficiency virus type 1 group M subtype B Reverse transcriptase/ribonuclease H Proteins 0.000 title claims description 19
- 239000003419 rna directed dna polymerase inhibitor Substances 0.000 title claims description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 63
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 claims description 7
- 229960004556 tenofovir Drugs 0.000 claims description 7
- VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N tenofovir disoproxil fumarate Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.N1=CN=C2N(C[C@@H](C)OCP(=O)(OCOC(=O)OC(C)C)OCOC(=O)OC(C)C)C=NC2=C1N VCMJCVGFSROFHV-WZGZYPNHSA-N 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims description 3
- 229930182473 O-glycoside Natural products 0.000 claims description 2
- 150000008444 O-glycosides Chemical class 0.000 claims description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 description 32
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 29
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 25
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 20
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 19
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229960002555 zidovudine Drugs 0.000 description 15
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 14
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 11
- -1 methyl 3-azido-2,3-dideoxy-D-ribohexopyranoside Chemical compound 0.000 description 11
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 9
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 5
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FEOSBRNHHYNQSH-DIWXZTFISA-N COC(C[C@@H]1N)O[C@H](CO)[C@H]1O Chemical compound COC(C[C@@H]1N)O[C@H](CO)[C@H]1O FEOSBRNHHYNQSH-DIWXZTFISA-N 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 4
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 4
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 4
- 238000004313 potentiometry Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 4
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 4
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101000701051 Legionella pneumophila Zinc metalloproteinase Proteins 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 3
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004009 13C{1H}-NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001340 2-chloroethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010953 Ames test Methods 0.000 description 1
- 231100000039 Ames test Toxicity 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000000903 Herpes simplex encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 1
- LLPWGHLVUPBSLP-UTUOFQBUSA-N [(2r,3s,4r)-3,4-diacetyloxy-3,4-dihydro-2h-pyran-2-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)OC[C@H]1OC=C[C@@H](OC(C)=O)[C@@H]1OC(C)=O LLPWGHLVUPBSLP-UTUOFQBUSA-N 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 150000001719 carbohydrate derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Natural products NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000434 field desorption mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910000372 mercury(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N methanesulfonyl chloride Chemical compound CS(Cl)(=O)=O QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YWOITFUKFOYODT-UHFFFAOYSA-N methanol;sodium Chemical compound [Na].OC YWOITFUKFOYODT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002726 nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- PVGBHEUCHKGFQP-UHFFFAOYSA-N sodium;n-[5-amino-2-(4-aminophenyl)sulfonylphenyl]sulfonylacetamide Chemical compound [Na+].CC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 PVGBHEUCHKGFQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960001355 tenofovir disoproxil Drugs 0.000 description 1
- JFVZFKDSXNQEJW-CQSZACIVSA-N tenofovir disoproxil Chemical compound N1=CN=C2N(C[C@@H](C)OCP(=O)(OCOC(=O)OC(C)C)OCOC(=O)OC(C)C)C=NC2=C1N JFVZFKDSXNQEJW-CQSZACIVSA-N 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960003636 vidarabine Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
PL 240 353 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest para anomerów 3-azydo-2,3-dideoksy-D-rybo -heksopiranozydów metylu i para anomerów 3-amino-2,3-dideoksy-D-rybo -heksopiranozydów metylu do zastosowania jako nienukleozydowy (tj. zawierający jedynie glikon i grupę metoksyIową jako aglikon) inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1.
Szybka replikacja wirusa HIV-1 (Human immunodeficiency Virus zwany ludzkim wirusem zespołu nabytego braku odporności) i błędy popełnione podczas tego procesu powodują szybki jego wzrost, a to jest powodem trudności związanych z farmakoterapią. Jak dotąd wiadomo, że jedyną opcją kontroli oraz zapobiegania progresji choroby jest terapia antywirusowa. Niestety, HIV-1 wykazuje oporność na dostępne leki, które dodatkowo wykazują się dużą toksycznością. Dlatego poszukiwanie coraz to nowych farmaceutyków o lepszym indeksie terapeutycznym, mniejszej toksyczności i większej selektywności ciągle jeszcze stanowi wyzwanie.
Miejscami działania znanych leków są trzy enzymy wirusowe: odwrotna transkryptaza (RT), integraza (IN) i proteaza (PR). Do tej pory znane są dwa różne typy inhibitorów RT, jakimi są analogi nukleozydów (NRTI - Zidovudine) i nienukleozydów (NNRTI - Nevirapine), które blokują aktywność polimerazy w RT. Ciągle jednak prowadzone są badania mające na celu lepsze zrozumienie struktury i funkcji RT oraz mechanizmów inhibicji, co skutkować może powstaniem lepszych leków, a w szczególności takich, które będą skuteczne przeciwko obecnym lekoopornym szczepom wirusa HIV-1.
Odwrotna transkryptaza (RT) wirusa HIV-1 jest wielofunkcyjnym enzymem niezbędnym do replikacji tego wirusa. RT składa się z dwóch podjednostek: p66 oraz p51. Enzym posiada DNA- oraz RNAzależną aktywność polimerazy DNA oraz aktywność rybonukleazy H. Za aktywność polimerazy oraz rybonukleazy H odpowiedzialna jest podjednostka p66, natomiast podjednostka p51 pełni rolę strukturalną. Odwrotna transkryptaza HIV-1 służy temu retrowirusowi do przepisywania swojego materiału genetycznego w postaci RNA na cząsteczkę DNA, która jest wbudowywana przez jego integrazę do materiału genetycznego gospodarza, jakim jest jedna z komórek ludzkiego układu odpornościowego.
Tenofowir (TFO) jest związkiem organicznym, znany także pod nazwą PMPA, czyli R-9-(2-(fosforanometoksypropylo)adenina, zaliczany jest do klasy leków antyretrowirusowych jako nukleotydowy analog będący inhibitorem odwrotnej transkryptazy. Tenofowir podawany jest w postaci proleku - dizoproksylu tenofowiru. In vivo prekursor ulega przemianie do substancji czynnej - tenofowiru - analogu monofosforanu nukleozydu (nukleotydu). Połączenie kowalencyjne RT z tenofowirem stanowi zakończenie primera DNA należącego do kompleksu RT i jako fosfonianowy inhibitor primera DNA kompleksu RT stanowi jego analog nukleotydu. Wśród znanych leków przeciwretrowirusowych jest również azydotymindyna AZT, która również ma działanie inhibujące względem odwrotnej transkryptazy HIV i stanowi pochodną nukleotydów ze szkieletem dideoksypiranozylu.
Arabinozydy cytozyny i innych związków mają praktyczne zastosowanie przeciwbiałaczkowe, a arabinozyd adeniny przeciwdziała zapaleniu mózgu wywoływanemu przez Herpes. Nukleozydy zawierające resztę sacharydową w postaci 2-deoksy-beta-D-rybo -heksofuranozylu są słabo poznane, jednak ze względu na podobieństwo do naturalnie występujących nukleozydów 2-deoksy-D-rybo-furanozylu (nukleozydy 2-deoksy-D-erytro -pentofuranozylu) znajdują się w centrum zainteresowania. W porównaniu do związków stanowiących przedmiot wynalazku, znane są pento-D-rybo-furanozydy, czyli pentozy, a nie heksozy, które mają zastosowanie np. jako „modyfikatory” antybiotyków czy związków o działaniu terapeutycznym czy też jako np. nośniki leków o działaniu cytotoksycznym. Epimery o konfiguracji D-arabino są znane i opisywane już od lat 80-tych XX w., ale mają zastosowanie np. w terapii nowotworów. Znane są nitrozoureidowe pochodne sacharydów o konfiguracji D-arabino, które zostały zbadane pod względem toksyczności i skuteczności przeciwnowotworowej. Szczególne właściwości wykazuje 3-(2-chloroetylo)-2,3-dideoksy-3-nitrozoureido-alfa-D-arabino -heksopiranozyd metylu, o udowodnionej wzmożonej aktywności w stosunku do nowotworów białaczki L1210, czerniaka B16 i raka płuc.
Wynalazek dotyczy 4 związków: dwóch par anomerów 3-amino-2,3-dideoksy-D-rybo -heksopiranozydów metylu i 3-azydo-2,3-dideoksy-D-rybo -heksopiranozydów metylu, pokazanych na wzorze 1, stanowiących dideoksyheksopiranozowe analogi azydotymidyny AZT, pokazanych na odrębnych wzorach 1a-1d do zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1.
Szczegółowo według wynalazku opracowano związki do zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1:
PL 240 353 BI
3-azydo-2,3-dideoksy-a/fa-D-ryóo-heksopiranozyd metylu, w opisie oznaczany skrótowo jako ARN3OMe.
OH
Wzór Ib
3-amino-2,3-dideoksy-alfa-D-/yóo-heksopiranozyd metylu, w opisie oznaczany skrótowo jako ARNH2OMe.
OH
N3
Wzór Ic
3-azydo-2,3-dideoksy-beta-D-ryóo-heksopiranozyd metylu, w opisie BRN3OMe.
oznaczany skrótowo jako
OH
nh2
Wzór Id
3-amino-2,3-dideoksy-beta-D-ryóo-heksopiranozyd metylu, w opisie oznaczany skrótowo jako BRNH2OMe.
Według wynalazku, zastosowanie medyczne wyżej wymienionych związków dotyczy zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1.
ARNHZOMe
BRN30Me BRNHZOMe
Wzór 1. Związki według wynalazku
Związki te według wynalazku mają zastosowanie w przyłączaniu się do miejsca aktywnego enzymu wirusa HIV - odwrotnej transkryptazy - hamując w ten sposób proces replikacji wirusa w zainfekowanej komórce. Zastosowanie tych związków obejmuje więc działanie jako nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy wirusa HIV na podobieństwo działania AZT. Dokładnie cztery zadokowane
PL 240 353 B1 związki - czyli związki przyłączone do odwrotnej transkryptazy HIV-1 - stanowią pochodne azydowe (ARN3OMe i BRN3OMe) i aminowe (ARNH2OMe i BRNH2OMe), ich zadokowane struktury zostały przedstawione na Fig. 3-6 wraz z ich orientacją względem miejsca aktywnego enzymu HIV-1. Struktury kompleksów zostały uzyskane na drodze dokowania molekularnego modeli tych analogów do znanej struktury krystalograficznej odwrotnej transkryptazy HIV-1 przedstawionej na Fig. 1 - stan techniki.
Na Fig. 1 została przedstawiona ta struktura enzymu, która następnie została użyta podczas procedury dokowania wszystkich związków według wynalazku - zamiennie opisywanych jako analogi AZT. Motywacją do wyboru właśnie tej struktury enzymu były następujące przesłanki: a) jest to kompletna struktura odwrotnej transkryptazy, nie brakuje w niej żadnych współrzędnych atomów, b) zawiera ona oryginalną sekwencję odwrotnej transkryptazy ludzkiego wirusa HIV-1, to znaczy nie zawiera mutacji. Został wykorzystany fragment kwasu nukleinowego składający się z mci wzorca o sekwencji nukleotydowej: 5’-ATGGTCGGCGCCCGAACAGGGACTGTG-3’ oraz z nici primeru o sekwencji nukleotydowej: 5’-ACAGTCCCTGTTCGGGCGCC-3’.
Obecność fragmentu kwasu nukleinowego w tej strukturze jest potrzebna do analizy związków według wynalazku, ponieważ sam enzym, bez kwasu nukleinowego, nie mógłby pełnić swej roli biologicznej. Dodatkowo, obecność fragmentu kwasu nukleinowego oraz inhibitora (w strukturze krystalicznej występuje inhibitor - tenofowir) w centrum aktywnym w strukturze krystalicznej enzymu zapewnia, że mamy do czynienia z formą aktywną tej cząsteczki enzymu. Obecność inhibitora w centrum aktywnym informuje także o tym, gdzie dokładnie w strukturze białka znajduje to centrum (bez potrzeby jego szukania), jest to korzystne gdyż na ogół konkretne położenie centrum aktywnego w danym białku nie jest jednoznaczne. Dodatkowym uzasadnieniem wykorzystania akurat tej struktury jest fakt, że została ona opisana w prestiżowym czasopiśmie (Nature Structural & Molecular Biology 11, 469-474 (2004), https://www.nature.com/articles/nsmb760).
W związku z powyższym w celu opracowania nowych związków mających zastosowanie w terapii zakażeń wirusem HIV-1 - jako inhibitorów odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1 dokonano badań w zakresie modelowania molekularnego oraz syntezy tych nowych związków. Modelowanie molekularne polegające na dokowaniu struktur nowych związków o funkcji hamowania aktywności odwrotnej transkryptazy HIV-1 (RT) zostało wykonane na Międzyuczelnianym Wydziale Biotechnologii UG-GUMed, w Pracowni Symulacji Układów Biomolekularnych, zaś syntezę związków przeprowadzono w Katedrze Chemii Bionieorganicznej Wydziału Chemii Uniwersytetu Gdańskiego. Dokowanie molekularne miało dwa cele: potwierdzenie in silico możliwości bezpośredniego oddziaływania badanych analogów AZT z centrum aktywnym enzymu RT, oraz ilościowe oszacowanie entalpii swobodnej AG oddziaływania każdego analogu z centrum aktywnym RT. Ujemne wartości entalpii swobodnej świadczą o możliwości spontanicznego tworzenia się takich kompleksów w przyrodzie. Wykazano, że badane związki oddziałują z centrum aktywnym odwrotnej transkryptazy HIV-1, blokując jednocześnie to centrum aktywne, stanowiąc konkurencję dla standardowych nukleotydów. Każdy badany analog AZT wykazuje charakterystyczny dla siebie profil oddziaływania (zestaw reszt aminokwasowych i nukleotydów, z którymi bezpośrednio oddziałuje) dokładnie w centrum aktywnym enzymu RT. Na podstawie podobieństwa strukturalnego tych związków do AZT oraz możliwości ich oddziaływania z centrum aktywnym enzymu RT oparto ich postulowane właściwości biologiczne tj. wiązanie do kwasu nukleinowego za pośrednictwem wiązań kowalencyjnych, blokowanie jego rozbudowy, hamowanie działania odwrotnej transkryptazy HIV-1 i w konsekwencji utrudnianie lub całkowite uniemożliwienie tworzenia nowych cząstek wirusa. Każdy z badanych analogów ma potencjalne miejsce fosforylacji warunkującej ich wbudowywanie w strukturę kwasu nukleinowego. Opracowane związki stanowią analogi AZT - inhibitora RT. Dokładne wyniki badania przedstawiono w dalszej części opisu.
Przeprowadzono dokowanie molekularne czyli wielokrotne losowe przyłączanie dokowanej cząsteczki do RT i wybieraniu takich konformacji, które mają najniższą entalpię swobodną AG. Ze względu na zastosowaną metodę dokowania (algorytm genetyczny wykorzystujący teorię Lamarcka) każda kolejna znaleziona konfiguracja kompleksu była lepiej zoptymalizowana i bardziej przypominała rzeczywiste kompleksy występujące w przyrodzie. Struktur biopolimerów nie zmieniano, ligandy mogły, w ograniczonym stopniu, zmieniać swoją konformację (kształt). W ligandach zachowano w każdym przypadku konformacje pierścieni. W trakcie dokowania zmieniano przede wszystkim położenie i orientację liganda względem nieruchomego biopolimeru.
Na podstawie badań doświadczalnych opracowano i zsyntezowano nowe związki - cztery pochodne 3-azydo- i 3-amino-2,3-dideoksy-D-rybo -heksopiranozydy metylu, które stanowią analogi AZT.
PL 240 353 B1
Na podstawie badań naukowych wymodelowano ich oddziaływanie z cząsteczką odwrotnej transkryptazy HIV-1, a tym samym działanie jako inhibitorów RT HIV-1.
Wynalazek opisano bliżej w przykładach wykonania oraz zobrazowano na rysunku na którym, poszczególne figury przedstawiają:
Fig. 1.A: schematyczne przedstawienie struktury trzeciorzędowej kompleksu odwrotnej transkryptazy HIV - RT HIV-1,
Fig. 1.B: centrum aktywne odwrotnej transkryptazy HIV (źródło, strona WWW: https://www.rcsb. org/structure/1t03),
Fig. 2: wyniki badania mutagenności - liczba kolonii bakteryjnych wyhodowanych na płytkach wraz z wartościami odchyleń standardowych,
Fig. 3: przestrzenne położenie związku oznaczanego jako ARN3OMe w miejscu aktywnym enzymu RT HIV-1,
Fig. 4: przestrzenne położenie związku oznaczanego jako BRN3OMe w miejscu aktywnym enzymu RT HIV-1,
Fig. 5: przestrzenne położenie związku oznaczanego jako ARNH2OMe w miejscu aktywnym enzymu RT HIV-1,
Fig. 6: przestrzenne położenie związku oznaczanego jako BRNH2OMe w miejscu aktywnym enzymu RT HIV-1,
Fig. 7: przestrzenne położenie AZT w miejscu aktywnym enzymu jako porównanie do właściwości wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Sposób otrzymywania nowych związków i potwierdzenie ich otrzymania
a) otrzymywanie 3-azydo-2,3-dideoksy-alfa-D-rybo-heksopiranozydu metylu i 3-azydo-2,3-di- deoksy-beta-D-rybo -heksopiranozyd u metylu
Naważkę 3,4,6-tri-O-acetylo-1,5-anhydro-2-deoksy-D-arabino-heks-1-enitolu (3 g, 0,01 mola) rozpuszczono w 1,4-dioksanie (15 ml) i nie przerywając mieszania dodano katalityczną ilość HgSO4 (0,15 g) i roztwór H2SO4 (5 mM, 60 ml). Całość mieszano w temperaturze pokojowej przez kolejne 2 godziny. Po tym czasie (cały substrat powinien ulec rozpuszczeniu) do mieszaniny reakcyjnej wprowadzono azydek sodu (7,1 g, 0.1 mola) i lodowaty kwas octowy (15 ml). Po trzech godzinach (kontrola TLC) całą mieszaninę reakcyjną przelano do rozdzielacza i ekstrahowano ją za pomocą CHCI3 (3 x 50 ml). Połączone ekstrakty chloroformowe przemywano nasyconym roztworem NaHCO3 (do odczynu zasadowego) i kolejno wodą (do odczynu obojętnego), a na końcu suszono za pomocą MgSO4. Po odparowaniu do sucha otrzymano mieszaninę czterech izomerycznych 4,6-di-O -acetylo-3-azydo-2,3-dideoksy-D-heksopiranoz (3,95 g) w postaci oleju.
W kolejnym etapie syntezy całą porcję nierozdzielonej mieszaniny związków rozpuszczono w chlorku metylenu (70 ml), a następnie dodano do całości suchą s -kolidynę (12 ml) i chlorek metylosulfonylu (3,5 ml, 0.04 mola) i tak otrzymaną mieszaninę reakcyjną mieszano prze 0,5 godziny w temperaturze pokojowej. Po tym czasie wprowadzono do całości metanol (12 ml) i mieszanie kontynuowano przez kolejne 3 godziny (kontrola TLC). Po zakończeniu reakcji całą mieszaninę reakcyjną przelano do rozdzielacza i rozcieńczono ją CH2CI2 (20 mL). Otrzymany roztwór przemywano kolejno HCl (1M), nasyconym roztworem NaHCO3 i na końcu wodą. Otrzymane ekstrakty chloroformowe połączono i suszono za pomocą MgSO4. Po odparowaniu do sucha otrzymano mieszaninę czterech izomerycznych 4,6-di-O-acetylo-3-azydo-2,3-dideoksy-D-heksopiranozydów metylu (4,1 g) w postaci oleju. Do jej rozdzielenia zastosowano chromatografię kolumnową, w której fazą stacjonarną stanowił żel krzemionkowy (Silica Gel 60, 0.08 mm, E. Merck), a eluentem był układ czterochlorek węgla: aceton (3 : 1 v/v). W wyniku rozdziału otrzymano dwie frakcje stanowiące dwie dwuskładnikowe mieszaniny: 4,6-di-O-acetylo-3-azydo-2,3-dideoksy-D-heksopiranozydów metylu (1,88 g frakcji I i 2,0 g frakcji II).
a1) Do roztworu frakcji I (1,88 g) w absolutnym metanolu (80 mL) dodano świeżo przygotowany roztwór metanolanu sodu (1 M, 0,9 ml). Po upływie 0,5 godziny (kontrola TLC) roztwór zobojętniono za pomocą odpowiedniej porcji żywicy Dowex-50Wx8 (H+), którą kolejno odsączono, a otrzymany roztwór odparowano do niewielkiej objętości. Do tak otrzymanego stężonego roztworu dodawano powoli porcjami mieszaninę octanu etylu i n-heksanu (1 : 3 v/v) (40 mL). Po wytrąceniu i odsączeniu krystalicznego związku stanowiącego D-arabino -izomer otrzymany roztwór odparowano do sucha uzyskując 3-azydo-2,3-dideoksv-e-D-rybo -heksopiranozyd metylu (BRN3OMe) (0,8 g) w postaci syropu.
PL 240 353 BI a2) Do roztworu frakcji II (2,0 g) w absolutnym metanolu (80 mL) dodano świeżo przygotowany roztwór metanolami sodu (1 M, 0,9 ml). Po upływie 0,5 godziny (kontrola TLC) roztwór zobojętniono za pomocą odpowiedniej porcji żywicy Dowex-50Wx8 (H+), którą kolejno odsączono, a otrzymany roztwór odparowano do niewielkiej objętości. Do tak otrzymanego stężonego roztworu dodawano powoli porcjami mieszaninę octanu etylu i n-heksanu (1 : 3 v/v) (40 mL). Otrzymano w ten sposób 3-azydo-2,3-dideoksy-a-D-rybo-heksopiranozyd metylu (ARN3OMe) (0,7 g) w postaci syropu.
Potwierdzenie struktury otrzymanego związku a2):
Właściwości otrzymanego związku:
OH
3-azydo-2,3-dideoksy-alfa-D-rybo-heksopiranozyd metylu (akronim ARN3OMe) (MW = 203,2)
Właściwości fizyczne:
Pomiar skręcalności optycznej wykonano za pomocą polarymetru. Roztwór analizowanego związku rozpuszczono w odpowiednim rozpuszczalniku, uzyskując zadane stężenie. Kolejno przeniesiono go do rurki polarymetrycznej i wykonano pomiar za pomocą polarymetru. Obliczono i zmierzono takie parametr jak: temperatura topnienia, wartość skręcalności optycznej mierzoną w chloroformie znaną metodą.
t.t. = 100-102 (heksan:aceton); [a]o+252° (c 1,0 chloroform); [a]o+210° (c 1,0 metanol); R/0,32 (cykloheksan: octan etylu 1 : 1); R/ 0,13 (n-heptan: octan etylu 1 : 2);
Charakterystyka spektroskopowa:
Obecność charakterystycznych grup obecnych w syntezowanych związkach wykazano znaną metodą za pomocą spektroskopii IR.
IR: (chloroform) ϋ [αττ1]: 3629, 3564 (OH), 2127 (N3); (chloroform) ϋ [cm'1]: 3411 υ(ΟΗ), 2104 υ(Ν3); (film) ϋ [cm-1]: 3413,78 υ(ΟΗ), 2933,66 o(CH2), 2104,85 υ(Ν3), 1434,00 5(CH2)+ 5(OCH)+ 5(CCH); 1374,51 5(OCH)+5(COH)+ 5(CCH); 1337,19 5(CCH)+5(OCH); 1190,21 o(CO)+o(CC); 1130,64 o(CO); 984,76 o(CO)+ o(CC);
Molowe współczynniki ekstynkcji zostały wyznaczone znaną metodą.
UV: ελ[ηΓη1 [M-1cm-1]: ε270 38,99 (woda); ε270 42,90 (HCI); ε264 1 45,55 (NaOH);
Struktura otrzymanych związków potwierdzona została za pomocą spektroskopii 1H i 13C NMR (COSY i HSQC).
Ή NMR (300 MHz, CDCI3), δ [ppm]: 4,73 (d, 1H, Ji,2a = 4 Hz, H-1); 4,10 (q, 1H, J3,2e = 4 Hz, J3,2a = 4 Hz, J3,4 = 4 Hz, H-3); 3.85-3.72 (m, 4H, H-4, H-5, H-6, H-6’); 3.37 (s, 3H, CH3-O); 2.22 (m, 1H, J2e,2a = 15 Hz, J2e,3 = 4 Hz, H-2e); 2.01 (m, 1H, J2a,2e = 15 Hz, J2a,i = 4 Hz, J2a,3 = 4 Hz, H-2a).
13C {1H} NMR (700 MHz, CDCI3), δ [ppm]: 96,66 (C-1); 67,83 (C-5); 67,56 (C-6); 62,75 (C-4); 58,40 (C-3); 55,50 (OCH3); 32,37 (C-2);
Wartości pKa zostały wyznaczone znaną metodą.
Stałe deprotonowania (woda) pKa: 4,11; 10,21; 13,52 (met. spektrofotometryczna); 2,94; 7,37; 11,87; 12,34 (met. potencjometryczna).
Wartości Iog8n dla trzech jonów metali zostały wyznaczone jedynie przez autorów patentu
Stałe trwałości log βη: [Cu2+ ARN3OMe] 3,22; 4,12; 6,19; [Ni2+ ARN3OMe] 1,51; 3,37; 5,39; [VO2+ <- ARN3OMe] 4,69; 8,02; 13,22.
Wyniki potwierdzające czystość otrzymanych związków zostały wykonane znaną metodą.
Analiza elementarna dla C?Hi3N3O4 (MW = 203,2):
wyznaczona: C 41,38; H 6,45; N 20,68. Znaleziona: C 41,13; H 6,57; N 20,52; znaleziona: C 39,87; H 6,54; N 19,85.
PL 240 353 BI
Potwierdzenie struktury otrzymanego związku a1):
Właściwości otrzymanego związku:
OH
N3
3-azydo-2,3-dideoksy-beta-D-ryóo-heksopiranozyd metylu (akronim BRN3OMe) (MW = 203,2)
Właściwości fizyczne:
Pomiar skręcalności optycznej wykonano za pomocą polarymetru. Roztwór analizowanego związku rozpuszczono w odpowiednim rozpuszczalniku, uzyskując zadane stężenie. Kolejno przeniesiono go do rurki polarymetrycznej i wykonano pomiar za pomocą polarymetru.
olej; [a]o+10° (c 0,7 chloroform); [a]o-27° (c 0,7 metanol); R/ 0,28 (cykloheksan: octan etylu 1:1), R/ 0,23 (n-heptan: octan etylu 1 : 2);
Charakterystyka spektroskopowa:
Obecność charakterystycznych grup obecnych w syntezowanych związkach wykazano za pomocą spektroskopii IR znaną metodą.
IR: (chloroform) ϋ [cm'1]: 3411 υ(ΟΗ), 2098 υ(Ν3); (film) ΰ [cm'1]: 3398,34 υ(ΟΗ), 2933,41 o(CH2), 2103,92 v(N3), 1433,35 5(CH2)+5(OCH)+5(CCH); 1374,30 5(OCH)+5(COH)+5(CCH); 1336,69 5(CCH)+ 5(OCH); 1190,91 υ (CO)o (CC); 1130,65 o(CO); 984,76 υ (CO) υ (CC);
Molowe współczynniki ekstynkcji zostały wyznaczone znaną metodą.
UV: ελ[ηΓΤ1’ [M-1· cm-1]: ε266 384,25 (woda); ε267 400,45 (HCI); ε264 145,55 (NaOH);
Struktura otrzymanych związków potwierdzona została za pomocą spektroskopii 1H i 13C NMR (COSY i HSOC) znaną metodą.
1H NMR (300 MHz, CDCI3), δ [ppm]: 4,67 (dd, 1H, Ji,2e = 2 Hz, Ji,2a = 9 Hz, H-1); 4,13 (q, 1H, J3,2e = 3,5 Hz, J3,2a = 3.5 Hz, J3,4 = 3.5 Hz, H-3); 3.90-3.79 (m, 3H, H-4, H-6, H-6 ); 3.68 (m, 1H, H-5); 3,49 (s, 3H, CH3O); 2,12 (ddd, 1H, J2e,2a = 14 Hz. J2e,i = 2 Hz, J2e,3 = 3.5 Hz, H-2e); 1,77 (ddd, 1H, J2a,2e = 14 Hz, J2a,i = 9 Hz, J2a,3 = 3.5 Hz, H-2a).
13C {H} NMR (700 MHz, CDCI3), δ [ppm]: 96,70 (C-1); 67.79 (C-5); 67,51 (C-6); 62,57 (C-4); 58,31 (C-3); 55,41 (OCH3); 32,34 (C-2);
LRMS (CI,NH3) m/z 221 [M + NH4 +], 204 [M + H+]; FDMS m/z 203 [M+],
Wartości pKa zostały wyznaczone znaną metodą.
Stałe deprotonowania (woda) pKa: 1,79; 9,43; 11,08; 12,21 (met. spektrofotometryczna); 4,01; 11,46; 12,47 (met. potencjometryczna).
Wartości Iog8n dla trzech jonów metali zostały wyznaczone znaną metodą.
Stałe trwałości log βη: [Cu2+ <- BRN3OMe] 2,23; 4,82; 7,57; [Ni2+ <- BRN3OMe] 2,12; 4,74; 7,52; [VO2+ <- BRN3OMe] 3,69; 7,73; 11,91.
Wyniki potwierdzające czystość otrzymanych związków zostały wykonane znaną metodą.
Analiza elementarna dla C?Hi3N3O4 (MW = 203,2):
wyznaczona: C 41,38; H 6,45; N 20,68; znaleziona: C 41,70; H 6,42; N 20,52; znaleziona: C 41,60; H 6,59; N 20,17.
b) Sposób otrzymywania 3-ammo-2,3-dideoksy-alfa-D-/yóo-heksopiranozydu metylu
Naważkę 3-azydo-2,3-dideoksy-alfa-D-/yóo-heksopiranozydu metylu (0,7 g, 3,44 mmola) rozpuszczano w 20 ml suchego metanolu i dodawano katalityczną ilość 10% Pd/C (40 mg). Przez tak przygotowany roztwór przepuszczano początkowo argon (10 minut) i kolejno wodór (z butli). Przebieg reakcji kontrolowano chromatograficznie (TL w układzie octan etylu: eter naftowy 1 : 2 v/v). Po zakończeniu reakcji odsączono węgiel aktywny, a otrzymany metanolowy roztwór odparowano do sucha otrzymując 3-amino-2,3-dideoksy-alfa-D-/yóo-heksopiranozyd metylu (0,65 g; 89%) w postaci syropu.
PL 240 353 BI
Potwierdzenie otrzymanego związku b):
3-amino-2,3-dideoksy-alfa-D-rybo-heksopiranozyd metylu (akronim ARNH2OMe)
Właściwości fizyczne:
Pomiar skręcalności optycznej wykonano za pomocą polarymetru. Roztwór analizowanego związku rozpuszczono w odpowiednim rozpuszczalniku, uzyskując zadane stężenie. Kolejno przeniesiono go do rurki polarymetrycznej i wykonano pomiar za pomocą polarymetru. Wartość skręcalności optycznej została zmierzona znaną metodą.
olej, [a]o+71°C (c 0,6 metanol); R/ 0,22 (chloroform: metanol 1 : 2);
Charakterystyka spektroskopowa:
Obecność charakterystycznych grup obecnych w syntezowanych związkach wykazano za pomocą spektroskopii IR znaną metodą.
IR: ΰ [cm-1]: 3335 υ(ΟΗ, NH2)‘ 1604 u(NH); (film) ϋ [cm'1]: 3368,05 υ(ΝΗ), 3303,14 υ(ΝΗ2), 2931,33 υ(0Η2), 1585,49 δ(ΝΗ), 1432,00 5(CH2)+5(OCH)+5(CCH); 1362,51 5(OCH)+5(COH)+5(CCH); 1315,76 5(CCH)+ 5(OCH); 1208,28 υ (CO)+ υ (CC); 1126,88 υ (CO); 973,62 υ (CO)+o (CC);
Molowe współczynniki ekstynkcji zostały wyznaczone znaną metodą.
UV: ελ[ηΓΤ1’ [M-1cm-1]: s297 50,20 (NaOH); ε306 63,57 (HCI); ε314 26,42 (woda);
Struktura otrzymanych związków potwierdzona została za pomocą spektroskopii 1H i 13C NMR (COSY i HSOC) znaną metodą.
1H NMR (500 MHz, CD3OD), δ [ppm]: 4,77 (d, 1H, Ji,2a = 5,86 Hz, H-1); 4,03 (dd, 1H, J4,5 = 9,28 Hz, H-4); 4,02 (m, 1H, J5,6 = 5,86 Hz, J5,6· = 3,42 Hz, H-5); 3,46 (s, 3H, OCH3); 3,41 (m, 1H, H-6 ); 3,36 (m, 1H, J3,4 = 2,93 Hz, H-3); 3,02 (dd, 1 H, J6,6· = 12,21 Hz, H-6), 2,62 (szerokie, 1H, OH); 2,40 (dd, 1H, J2e,3 = 1,96 Hz, H-2e); 1,70 (dq, 1H, J2a,2e = 14,6 Hz, J2a,3 = 3,9 Hz, H-2a).
13C {1H} NMR (500 MHz, CD3OD), δ [ppm]: 97,89 (C-1); 74,73 (C-4); 69,71 (C-5); 55,58 (OCH3); 52,96 (C-3); 46,54 (C-6); 32,12 (C-2).
Wartości pKa zostały wyznaczone znaną metodą.
Stałe deprotonowania (woda) pKa: 3,18; 7,90; 9,85; 12,29 (met. spektrofotometryczna); 4,59; 8,78; 9,93; 10,32 (met. potencjometryczna).
Wartości Iog8n dla trzech jonów metali zostały wyznaczone znaną metodą.
Stałe trwałości log βη: [Cu2+ ARNH2OMe] 4,89; 7,89, 11,11; [Ńi2+ ARNH2OMe] 3,37; 4,85; 6,06; [VO2+ <- ARNH2OMe] 4,47; 9,82; 10,22.
Wyniki potwierdzające czystość otrzymanych związków zostały wykonane znaną metodą.
Analiza elementarna dla C7H15NO4 (MW = 177,10):
wyznaczona: C 47,45; H 8,53; N 7,90. Znaleziona: N 7,91; znaleziona: C 46,18; H 8,58; N 7,01.
c) Sposób otrzymywania 3-amino-2,3-dideoksy-beta-D-/ybo-heksopiranozydu metylu
Naważkę 3-azydo-2,3-dideoksy-beta-D-/ybo-heksopiranozydu metylu (0,8 g, 3,93 mmola) rozpuszczano w 20 ml suchego metanolu i dodawano katalityczną ilość 10% Pd/C (40 mg). Przez tak przygotowany roztwór przepuszczano początkowo argon (10 minut) i kolejno wodór (z butli). Przebieg reakcji kontrolowano chromatograficznie (TLC w układzie octan etylu: eter naftowy 1 : 2 v/v). Po zakończeniu reakcji odsączono węgiel aktywny, a otrzymany metanolowy roztwór odparowano do sucha otrzymując 3-ammo-2,3-dideoksy-beta-D-/ybo-heksopiranozyd metylu (0,7 g; 96%) w postaci syropu.
Potwierdzenie otrzymanego związku c):
PL 240 353 BI
OH
nh2
3-amino-2,3-dideoksy-beta-D-/ybo-heksopiranozyd metylu (akronim BRNH2OMe)
Właściwości fizyczne:
Wartość R/ została wyznaczona znaną metodą.
R/ 0,23 (metanol);
Charakterystyka spektroskopowa:
Obecność charakterystycznych grup obecnych w syntezowanych związkach wykazano za pomocą spektroskopii IR znaną metodą.
IR: (film) ΰ [cm'1]: 3352,33 υ(ΝΗ), 2923,45 u(CH2), 1450,17 5(CH2)+5(OCH)+5(CCH); 1377,92 5(OCH)+5(COH)+5(CCH); 1209,81 υ (CO)+o (CC); 1128,84 o(CO);
Molowe współczynniki ekstynkcji zostały wyznaczone znaną metodą.
UV: ελ[ηΓΤ1’ [M-1cm-1]: ε264 68,67; ε309 89,54 (HCI); ε271 65,28; ε289 66,79 (NaOH); ε307 68,69 (woda);
Struktura otrzymanych związków potwierdzona została za pomocą spektroskopii 1H i 13C NMR (COSY i HSQC) znaną metodą 1H NMR (700 MHz, CDCh), δ [ppm]: 4,75 (td, 1H, Ji,2a = 8,69 Hz, Ji,2e = 2,39 Hz, H-1); 3,92 (dd, 1 H, Je,6’ = 11,72 Hz, H-6), 3,82 (dd, 1H, H-6 ); 3,71 (m, 1H, J5,e = 7,74 Hz, J5,6· = 5,06 Hz, H-5); 3,63 (dd, 1H, J4,5 = 9,10 Hz, H-4); 3,53 (s, 3H, OCH3); 3,43 (m, 1H, J3,4 = 4,25 Hz, H-3); 1,96 (dq, 1H, J2e,3 = 1,69 Hz, H-2e); 1,80 (dq, 1H, J2a,2e = 12,7 Hz, J2a,3 = 4,02 Hz, H-2a); 1,62 (szerokie, 1H, NH);
13C {Ή} NMR (700 MHz, CD3OD), δ [ppm]: 98,80 (C-1); 74,20 (C-5); 68,3 (C-4); 63,90 (C-6); 56,50 (OCH3); 47,40 (C-3); 37,50 (C-2).
Wartości pKa zostały wyznaczone znaną metodą.
Stałe deprotonowania (woda) pKa: 4,26; 9,26; 11,01 (met. spektrofotometryczna); 7,70; 9,04; 12,33 (met. potencjometryczna).
Wartości Iog8n dla trzech jonów metali zostały wyznaczone znaną metodą.
Stałe trwałości log βη: [Cu2+ <- BRNH2OMe] 5,79; 8,28; 10,84; [Ni2+ <- BRNH2OMe] 2,02; 4,37; 7,03; [VO2+ <- BRNH2OMe] 4,06; 9,32; 16,02.
Wyniki potwierdzające czystość otrzymanych związków zostały wykonane znaną metodą.
Analiza elementarna dla C7H15NCU (MW = 177,10): wyznaczona: C 47,45; H 8,53; N 7,90. znaleziona: C 46,42; H 8,53; N 7,09.
P rzy kład 2
Badanie właściwości biologicznych opracowanych związków
Przygotowanie preparatów i płytek:
Sprzęty laboratoryjne, probówki Eppendorfa, szalki Petriego, głaszczki były wysterylizowane, a roztwory jałowe. Podczas przeprowadzania badań stosowano aseptyki, by nie zakazić bakterii oraz pożywek. Roztwory (pożywki bakteryjne, nocna kolonia Salmonella, histydyna z biotyną) sporządzano według typowych procedur. Do przeprowadzenia badań przygotowano następujące roztwory: roztwór D-(+)-glukozy, roztwór agaru bakteriologicznego, roztwór chlorku sodu NaCI, mieszaninę składników mineralnych (uwodniony siarczan(VI) magnezu MgSO4 H2O, kwas cytrynowy HOOCCH2-C(OH)(COOH)-CH2-COOH, wodorofosforan(V) potasu K2HPO4, wodorofosforan(V) sodowo-amonowy czterowodny NaNH4HPO4-4H2O), roztwór odpowiedniej pożywki bakteryjnej dla tych bakterii np. Nutrient Broth z dodatkiem ampicyliny, roztwory badanych związków ARN3OMe, ARNH2OMe, BRN3OMe i BRNH2OMe.
W celu przygotowania podłoża agarowego mieszano roztwór agaru, mieszaninę składników mineralnych oraz roztwór glukozy. Następnie całość wylewano na płytki umieszczone pod laminatem. Za
PL 240 353 Β1 szczepienie kolonii bakteryjnej wykonano 12 godzin przed posiewem. Do roztworu Nutrient Broth z ampicyliną dodano pobraną kolonię bakteryjną S. typhimurium i hodowano je w wytrząsarce-inkubatorze ES-20 np. firmy Grant-bio w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 100 rpm.
Tabela 1. Zestawienie liczby składników w kolejnych posiewach bakteryjnych.
| C sacharydu | V H2O [μΐ] | V sacharydu i | VNaCl | V bakterii | 1,.,, . 1 ί V całkowita i | |
| i Nr. I | [ug/ płytkę] | W] | | [μΐ] | [pl] | 1 Μ 1 i.................. i | |
| I i i 1 1 i 1 | 2000 | 300 | 150 | 300 | : 750 j 750 | |
| i 2 | 1000 | 150 | 150 | 150 | 300 | |
| 3 | 500 | 225 | 75 | 150 | 300 | ! 750 i L.._______________________ _____________1 |
| 4 | 300 | 255 | 45 | 150 | 300 | i j 750 i |
| i 5 L___________________1...... | 60 | 210 | 90 (10x)* | 150 | 300 | 750 ' |
| I 6 ] ! | 4 | 294 | 6 (10x)* | 150 | 300 | 750 |
| 7 | K- | 300 | 1 | 150 | 300 | 750 |
| i 8 i i i | K + | 282 | 18D0X | 150 | 300 | 750 : |
*(I0x) oznacza 10-krotne rozcieńczenie poprzedniego roztworu sacharydu.
W celu przygotowania posiewów bakteryjnych mieszano składniki pożywki w odpowiedniej kolejności: wodę, roztwór NaCI, roztwór badanego sacharydu na końcu nocną kolonię bakterii. Dla badanych związków wykonano taką samą procedurę testu mutagenności: dwie próby kontrolne (ujemną i dodatnią) oraz sześć posiewów dla różnych stężeń sacharydu w roztworze w zakresie 4-2000 pg/płytkę (Tabela 1). Dla danego stężenia sacharydu (próbki nr 1-8) wykonano po trzy oddzielne posiewy (każdy na oddzielnej płytce). Ilości kolonii dla kolejnych próbek uśredniano z trzech płytek. Do kontroli pozytywnej (K+) zamiast roztworu sacharydu dodawano doksorubicynę (DOX), antybiotyk przeciwnowotworowy wywołujący mutacje powodujące wytwarzanie histydyny w bakteriach Salmonella. Do kontroli negatywnej (K-) nie dodawano ani badanych związków, ani doksorubicyny.
Kolejno roztwory inkubowano przez 4 godziny w wytrząsarce (prędkość wytrząsania 220 rpm, temperatura 37°C). Po inkubacji roztwory wirowano przez 4 minuty z prędkością 13,4 rpm (wirówka miniSpin Eppendorf), zlewano supernatant i zawieszano w wodnym roztworze chlorku sodu. Ponownie wirowano, zlewano supernatant i zawieszano bakterie w mieszaninie składającej się z H2O, NaCI, histydyny i biotyny. Roztwory wysiewano na wcześniej przygotowane pożywki agarowe wykonując posiew standardowy przy pomocy kulek szklanych. Dla każdej z ośmiu próbek wykonano trzy płytki. Po naniesieniu bakterii płytki inkubowano w zaciemnionym pomieszczeniu w czasie 48 godzin w temperaturze 37°C.
Przebieg oznaczeń
Do oceny potencjalnych właściwości mutagennych i genotoksycznych substancji chemicznych stosowane są testy in vivo i in vitro wykonywane na zwierzętach, bakteriach lub komórkach hodowlanych. Mutagenność dwóch par anomerów sprawdzano za pomocą referencyjnego testu Amesa polegającego na ocenie zdolności wywoływania przez badane związki mutacji powrotnej (rewersji) w komórkach auksotroficznych szczepów Salmonella typhimurium. Komórki bakteryjne, w których wystąpiła mutacja powrotna, w przeciwieństwie do komórek mutantów S. typhimurium, wykazują zdolność do wzrostu na podłożu minimalnym pozbawionym czynnika wzrostowego, w tym wypadku histydyny i biotyny. Brak zdolności do syntezy tych aminokwasów sprawia, że komórki nie mogą rosnąć na pożywce minimalnej zawierającej jako źródło węgla glukozę i zestaw soli mineralnych, dopóki histydyna i biotyna nie zostaną dodane do podłoża wzrostowego.
PL 240 353 B1
Mutagen, działając na taki szczep, wywołuje mutację powrotną (rewersję mutacji istniejącej) do formy „dzikiej” - prototroficznej, przywracając komórkom zdolność do syntezy histydyny i biotyny oraz wzrostu.
Test mutagenności, przeprowadzono z wykorzystaniem szczepu bakterii Salmonella typhimurium TA102, w których można odwrócić mutację, prowadzącą do uzależnienia się szczepu bakterii od obecności histydyny w środowisku. Bakterie hodowano na pożywce minimalnej z dodatkiem glukozy, histydyny, biotyny i ampicyliny. Na 12 godzin przed posiewem bakterii zaszczepiona została hodowla nocna w pożywce Nutrient Broth z dodatkiem ampicyliny. Bakterie Salmonella utrzymywano przez 4 h w temperaturze pokojowej, a następnie przez 8 h hodowano w Environmental Saker-Incubator ES-20 w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 100 rpm. Dla każdego badanego związku wykonano dwie próby kontrolne: dodatnią (gdzie jako wzorcowy mutagen zastosowano antybiotyk przeciwnowotworowy doksorubicynę (DOX), ujemną oraz sześć prób dla różnych stężeń każdego badanego związku. Roztwory stosowane w badaniach (histydyna z biotyną, pożywki bakteryjne, nocna kolonia Salmonella) sporządzano według typowej procedury.
Kolonie bakterii, jakie wyrosły na wszystkich pożywkach, były okrągłe i miały barwę jasnożółtą. Ich rozmieszczenie było równomierne co wskazywało na poprawność wysiewania S. typhimurium przy zachowaniu zasad aseptyki w pracy z bakteriami (na żadnej z wykorzystywanych płytek z pożywkami nie pojawiły się inne kolonie bakteryjne). Płytki kontroli ujemnej (K-), nie zawierające mutagennej doksorubicyny ani monosacharydu, posiadały niewielką ilość kolonii. Brak histydyny uniemożliwia dynamiczny rozwój bakterii. Pojawienie się kilku kolonii w tej kontroli, było spowodowane tym, że niewielka ilość Salmonelli ma zdolność do samoistnego mutowania i uzyskania zdolności do syntezy histydyny. W kontroli pozytywnej (K+), gdzie znajdowała się bardzo duża ilość kolonii bakterii dodano DOX (0,1 μg/płytkę). Wywołał on mutację powodując u bakterii możliwość samodzielnej syntezy histydyny. Warunki prowadzenia eksperymentów były takie same dla każdego sacharydu. Różnicę w wyrośniętych koloniach można wytłumaczyć tym, że badania przeprowadzono w długim przedziale czasowym, co było niekorzystne dla wzrostu spoczywających bakterii.
Wyniki
Liczbę wyrośniętych kolonii bakteryjnych, dla rozpatrywanych stężeń badanych związków przedstawiono w postaci diagramów jako uśrednienie ilości kolonii z trzech prób, co pokazano na fig. 2.
Z przeprowadzonych badań wynika, że żadne zsyntezowane związki nie wykazywały właściwości mutagennych w badanym przedziale stężeń. Ilości kolonii bakteryjnych były na poziomie kontroli ujemnej, co pokazano na fig. 2.
Z przeprowadzonych badań wynika, że: a) ARN3OMe nie wykazywał właściwości mutagennych w badanym przedziale stężeń. Ilości kolonii bakteryjnych były na poziomie kontroli ujemnej; b) BRN3OMe nie wykazywał właściwości mutagennych w badanym przedziale stężeń. Ilości kolonii bakteryjnych były na poziomie kontroli ujemnej; c) ARNH2OMe nie wykazywał właściwości mutagennych w badanym przedziale stężeń. Ilości kolonii bakteryjnych były na poziomie kontroli ujemnej; d) BRNH2OMe nie wykazywał właściwości mutagennych w badanym przedziale stężeń. Ilości kolonii bakteryjnych były na poziomie kontroli ujemnej.
P r z y k ł a d 3
Wyniki badania dokowania molekularnego związków według wynalazku
Anomery 3-azydo-2,3-dideoksy-D- rybo -heksopiranozydów metylu i anomery 3-amino-2,3-dideoksy-D- rybo-heksopiranozydów metylu (O- glikozydy) badano pod kątem właściwości biologicznych.
Poniższy opis obejmuje wyniki dokowania dwóch par zsyntezowanych anomerów 3-amino-2,3-dideoksy-D-rybo -heksopiranozydów metylu według wynalazku w tej części opisywane jako: ARNH2OMe, BRNH2OMe i ich azydowych prekursorów ARN3OMe, BRN3OMe, stanowiących łącznie związki według wynalazku zamiennie nazywane analogami AZT.
Wyniki zobrazowano na fig. 3-6.
Przeprowadzone zostało dokowanie molekularne obejmujące poszukiwanie 44000 niskoenergetycznych konfiguracji kompleksów odwrotnej transkryptazy HIV z każdą z czterech zsyntezowanych pochodnych zilustrowanych na wykresie oraz także dodatkowo dokowany był (dla porównania) AZT - fig. 7.
PL 240 353 Β1
W sumie zostało uzyskane 220000 modeli struktur kompleksów. Dla każdego z czterech zsyntezowanych związków i dla AZT zostały znalezione najniżej energetyczne (to znaczy charakteryzujące się najniższą wartością entalpii swobodnej oddziaływania białko-ligand) konformacje kompleksów. Ich zbiory zostały podzielone na rodziny zawierające podobne wzajemne ułożenia. Dla każdej pochodnej deoksysacharydu i dla AZT została wybrana jedna konformacja kompleksu do szczegółowej analizy. Wyniki analizy zostały podsumowane w Tabeli 2.
Tabela 2. Lista reszt aminokwasowych bezpośrednio zaangażowanych w oddziaływanie z O-metylowymi glikozydami.
| ARN30Me | ARNH20Me | BRNSOMe | BRNH20Me | AZT |
| AG= - 6,0 kcal/mol | AG- -6,2 kcal/mol | AG- -6,0 kcal/mol | AG= -5,8 kcal/mol | AG=-10,0 kcal/mol |
| DNA | ||||
| DA T 705 | DA T 705 | DA T 705 | DA T 705 | DA T 705 |
| DT T 706 | DTT706 | DT T 706 | DT T 706 | DT T 706 |
| DG T 707 | DGT707 | DG T 707 | DGT 707 | DG T 707 |
| DG T 708 | - | - | - | DG T 708 |
| - | - | - | - | DC T 709 |
| - | - | - | - | DGT 710 |
| - | - | - | - | DCP818 |
| - | - | - | - | DGP 819 |
| - | - | - | - | DC P 820 |
| DC P 821 | DC P 821 | DC P 821 | DC P 821 | DC P 821 |
| białko | ||||
| TYRA 115 | TYRA 115 | TYRA115 | TYRA115 | - |
| - | PRO A 157 | PRO A 157 | PRO A 157 | - |
| TYRA 183 | - | TYRA 183 | TYRA 183 | - |
| META 184 | META 184 | MET A 184 | MET A 184 | MET A 184 |
| - | ASP A 185 | ASP A 185 | - | - |
W Tabeli 2 są przedstawione reszty aminokwasowe występujące w miejscu aktywnym odwrotnej transkryptazy HIV, które znajdują się w odległości nie większej niż 5A (angstremów) od zadokowanej pochodnej deoksysacharydu z grupą O-metylową jako aglikonem. Zastosowane oraz używane oznaczenia literowe i numeryczne stanowią przyjętą arbitralną konwencję (zostały wzięte bezpośrednio z pliku struktur białkowych o kodzie PDB: 1T03). Tabela 2 zawiera kolejno: entalpię swobodną AG oddziaływania dla najniżej energetycznej konfiguracji kompleksu, informacje o nazwie reszty aminokwasowej lub nukleotydu, nazwie łańcucha peptydowego lub nukleinowego oraz numerze reszty lub nukleotydu. W ostatniej kolumnie przedstawione są listy reszt aminokwasowych i nukleotydów znajdujących się w odległości nie większej niż 5A (angstremów) od cząsteczki AZT, także dokowanej (dla porównania na Fig. 8). Warto zwrócić uwagę na nieco odmienny sposób dokowania AZT niż pozostałych związków w tej grupie. Różnice wynikają przede wszystkim z obecności w cząsteczce AZT względnie dużej grupy
Claims (4)
- PL 240 353 BI (tyminy) oraz trzech reszt fosforanowych. Kilka różnic można także zaobserwować w grupie czterech pochodnych deoksysacharydów z grupą O-metylową jako aglikonem. Związek BRN3OMe oddziałuje z największą liczbą reszt aminokwasowych w miejscu aktywnym białka, natomiast najmniej takich oddziaływań obserwujemy dla związku ARN3OMe. Pozostałe dwa kompleksy zachowują się podobnie (z drobną różnicą dla pojedynczych reszt aminokwasowych). Wszystkie niskoenergetyczne kompleksy pochodnych deoksysacharydów (i AZT) charakteryzują ujemne wartości entalpii swobodnych oddziaływania tych związków z odwrotną transkryptazą HIV, co daje podstawy spontanicznego tworzenia kompleksów oraz potwierdza na wykorzystanie tych zsyntezowanych O-glikozydów jako inhibitorów badanego enzymu.Warto także zwrócić uwagę na fakt, że zarówno ujemne wartości entalpii swobodnych oddziaływania wszystkich analogów z białkiem jak i konfiguracje wszystkich kompleksów przypominające konfigurację tenofowiru z odwrotną transkryptazą HIV świadczą o możliwości spontanicznego tworzenia się tych kompleksów w przyrodzie jak i o możliwości wykorzystania badanych analogów jako inhibitorów badanego enzymu.Zastrzeżenia patentowe1. 3-azydo-2,3-dideoksy-a/fa-D-ryóo-heksopiranozyd metylu o wzorze strukturalnym:do zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1.
- 2. 3-azydo-2,3-dideoksy-beta-D-ryóo-heksopiranozyd metylu o wzorze strukturalnym:N3 do zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1.
- 3. 3-amino-2,3-dideoksy-alfa-D-ryóo-heksopiranozyd metylu o wzorze strukturalnym:OHdo zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1.
- 4. 3-amino-2,3-dideoksy-beta-D-ryóo-heksopiranozyd metylu o wzorze strukturalnym:OHnh2 do zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL430182A PL240353B1 (pl) | 2019-06-07 | 2019-06-07 | 3-azotowe pochodne 2,3-dideoksy-D-rybo-heksopiranozydów metylu do zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL430182A PL240353B1 (pl) | 2019-06-07 | 2019-06-07 | 3-azotowe pochodne 2,3-dideoksy-D-rybo-heksopiranozydów metylu do zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL430182A1 PL430182A1 (pl) | 2020-12-14 |
| PL240353B1 true PL240353B1 (pl) | 2022-03-21 |
Family
ID=73727738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL430182A PL240353B1 (pl) | 2019-06-07 | 2019-06-07 | 3-azotowe pochodne 2,3-dideoksy-D-rybo-heksopiranozydów metylu do zastosowania jako inhibitor odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL240353B1 (pl) |
-
2019
- 2019-06-07 PL PL430182A patent/PL240353B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL430182A1 (pl) | 2020-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2012223012B2 (en) | Phosphoramidate derivatives of 5 - fluoro - 2 ' - deoxyuridine for use in the treatment of cancer | |
| DE602005005240T2 (de) | 4'-C-substituierte 2-Haloadenosinderivate | |
| Pankiewicz et al. | A synthesis of 9-(2-deoxy-2-fluoro-. beta.-D-arabinofuranosyl) adenine and-hypoxanthine. An effect of C3'-endo to C2'-endo conformational shift on the reaction course of 2'-hydroxyl group with DAST | |
| WO2003062256A1 (en) | 2'-beta-modified-6-substituted adenosine analogs and their use as antiviral agents | |
| SK151896A3 (en) | Lipid ester of nucleoside monophosphates, preparation method thereof and pharmaceutical composition containing same | |
| HU199871B (en) | Process for producing deazapurine nucleoside derivatives and antiviral compositions comprising said compounds | |
| Clivio et al. | (3′-5′)-Cyclic dinucleotides: synthetic strategies and biological potential | |
| Zhang et al. | Uridine binding motifs of human concentrative nucleoside transporters 1 and 3 produced in Saccharomyces cerevisiae | |
| Montgomery et al. | 9-(2-Deoxy-2-fluoro-. beta.-D-arabinofuranosyl) guanine: a metabolically stable cytotoxic analogue of 2'-deoxyguanosine | |
| Mehellou et al. | Phosphoramidates of 2′-β-D-arabinouridine (AraU) as phosphate prodrugs; design, synthesis, in vitro activity and metabolism | |
| Rosenqvist et al. | The role of the maleimide ring system on the structure-activity relationship of showdomycin | |
| US6900308B2 (en) | α-modified nucleoside triphosphates | |
| US11214590B2 (en) | Photoresponsive nucleotide analog capable of photocrosslinking in visible light region | |
| Kandil et al. | ProTides of BVdU as potential anticancer agents upon efficient intracellular delivery of their activated metabolites | |
| WO2023041786A1 (en) | 5-fluorouracil derivatives as prodrugs for cancer treatment | |
| JP7266896B2 (ja) | β修飾リン酸化合物前駆体、β修飾リン酸化合物、反応阻害剤及びこれを含む医薬並びに反応阻害方法 | |
| NZ542011A (en) | Nucleotide lipid ester derivatives | |
| Koomen | Synthesis and biological properties of selected nucleoside analogues | |
| US20140309276A1 (en) | Pharmaceutical Composition Comprising a Mixture of Carboxylated Oligonucleotides | |
| Stazzoni | Design and synthesis of clickable nucleic acid analogues for cancer therapy and diagnosis | |
| Berrío Escobar et al. | Synthesis and cytotoxic activity of per-acetylated and halogenated derivatives of nucleosides in breast cancer cells | |
| Bhattacharya et al. | Studies on the synthesis of furo [3, 2-d] pyrimidine C-nucleosides: new inosine analogues with antiprotozoan activity | |
| URATA et al. | Design and racemic synthesis of conformationally restricted carbocyclic pyrimidine nucleoside analogs based on the structure of the L-nucleoside residue in heterochiral DNA | |
| Jastrzębska et al. | Biologically relevant morpholino nucleoside thio-and dithiophosphates via an oxathiaphospholane approach | |
| Congiatu | Design, synthesis and biological evaluation of some novel nucleotide prodrugs as potential anticancer agents |