PL240297B1 - Modyfikowane pochodne aminokwasowe do leczenia chorób o podłożu neurologicznym oraz wybranych zaburzeń psychiatrycznych - Google Patents

Description

PL 240 297 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy związków chemicznych, będących pod względem strukturalnym modyfikowanymi pochodnymi aminokwasowymi i ich zastosowania jako substancji czynnej w różnych postaciach leku.

Ujawnione związki wykazują szeroką aktywność protekcyjną w zwierzęcych modelach drgawek padaczkowych, modelach bólu, modelu depresji i leku, a co niezwykle istotne są pozbawione działania sedatywnego, które jest charakterystyczne dla znanych leków przeciwpadaczkowych. Wyniki z badań in vivo wskazują na ich potencjalne zastosowanie w terapii schorzeń o podłożu neurologicznym (padaczki, bólu neuropatycznego i migreny) oraz zaburzeń psychiatrycznych (m.in. lęku i depresji). Mając na uwadze szeroki zakres wskazań terapeutycznych leków przeciwpadaczkowych, związki te mogą być również użyteczne m.in. do terapii zespołu abstynencyjnego, schizofrenii, zaburzeń schizoafektywnych, zaburzeń osobowości i odżywiania oraz stresu pourazowego. Ujawnione związki mogą być również skuteczne w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych (m.in. choroby Parkinsona, Alzheimera, stwardnienia bocznego zanikowego, itp. itp.) oraz uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego spowodowanego niedotlenieniem.

Padaczka jest jedną z najczęstszych i niezwykle wyniszczających chorób neurologicznych. Schorzenie to dotyka 1-2% populacji ludzkiej i w istotnym stopniu obniża jakość życia chorych na wszystkich jego płaszczyznach - osobistej, zawodowej i społecznej. Jednym z głównych czynników decydujących o pogorszeniu jakości życia cierpiących na padaczkę jest depresja, która występuje aż u blisko 55% pacjentów epileptycznych, podczas gdy w populacji ogólnej odsetek ten wynosi ok. 15% (Salpekar et al. Epilepsy Behav. 2018, doi.org/10.1016/j.yebeh.2018.07.023). Dowiedziono również, iż depresja może być istotnym czynnikiem ryzyka wystąpienia padaczki. Wśród chorych na padaczkę notuje się również znacznie częstsze przypadki zaburzeń lękowych i psychoz (Thapar et al. Epilepsy Behav. 2009, 14, 134-140). Aktualnie lecznictwo dysponuje szeregiem leków przeciwpadaczkowych, które, uwzględniając czas ich wprowadzania na rynek farmaceutyczny, zostały podzielone na trzy generacje. Należy podkreślić, iż najnowsze preparaty należące do trzeciej generacji leków (m.in. lakozamid, rufinamid, eslikarbazepina, brywaracetam, perampanel), mimo znacznie rzadszych i słabiej nasilonych działań niepożądanych nie przewyższają swoją skutecznością gorzej tolerowanych leków generacji pierwszej (m.in. fenytoina, kwas walproinowy, karbamazepina). Dodatkowo najnowsze preparaty posiadają w większości wąski zakres wskazań terapeutycznych i dedykowane są jedynie do danego typu padaczki. Dowiedziono również, iż leki wpływające na ośrodkowe przewodnictwo GABAergiczne (m.in. wigabatryna, topiramat, tiagabina) powodują pogorszenie nastroju stosujących je pacjentów. Ponadto wszystkie znajdujące się aktualnie w lecznictwie leki przeciwpadaczkowe w mniejszym lub większym stopniu wykazują niepożądane działanie uspokajające (w przypadku monoterapii efekt ten jest najsłabiej zaznaczony dla gabapentyny (ok. 9% leczonych) i lamotryginy (ok. 10% leczonych), natomiast najsilniej dla fenobarbitalu (ok. 39% leczonych), fenytoiny (ok. 32% leczonych) i lewetyracetamu (ok. 20% leczonych). Zarówno pogorszenie nastroju oraz działanie sedatywne należą do częstych przyczyn dyskontynuacji zaplanowanego leczenia. Należy dodać, iż ze względu na złożoną patofizjologię, padaczka jest chorobą niezwykle heterogenną, tj. charakteryzuje się występowaniem różnych typów napadów (m.in. toniczno-klonicznych, nieświadomości, częściowych, itp.) oraz znaczną lekoopornością, sięgającą ~30-40% diagnozowanych przypadków (Tang et al. Front. Neurol. 2017, 8, 301, doi:

10.3389/fneur.2017.00301).

Mając na uwadze powyższe fakty, przełomem w farmakoterapii padaczki będzie uzyskanie leku skutecznego w różnych typach napadów padaczkowych, działającego efektywnie w odmianie lekoopornej, pozbawionego działania sedatywnego, a także redukującego nasilenie zaburzeń współistniejących z padaczką, tj. lęku i przede wszystkim depresji. Obecnie w lecznictwie brak jest takiego preparatu.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie związków o pożądanej charakterystyce, potwierdzonej co najmniej w badaniach przedklinicznych.

Przedmiotem wynalazku jest pochodna 2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)propanamidu o konfiguracji R centrum stereogenicznego wybrana spośród: (2R)-N-benzylo-2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)propanamidu o wzorze 1 oraz (2 R )-2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)-N-(2-fluorobenzylo)propanamidu o wzorze 2 przedstawionych poniżej:

PL 240 297 BI

Kolejnym przedmiotem jest związek według wynalazku określony powyżej do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu padaczki, padaczki z współtowarzyszącymi zaburzeniami depresyjnymi i lękowymi, depresji, lęku, bólu o podłożu neurologicznym, bólu o podłożu zapalnym lub choroby neurodegeneracyjnej. Korzystnie, chorobą neurodegeneracyjną jest choroba Parkinsona lub choroba Alzheimera lub stwardnienie boczne zanikowe.

Przedmiotem wynalazku są pochodne 2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)propanamidu, przedstawione wzorem 1 i 2 o konfiguracji R centrum stereogenicznego.

Związki te w badaniach przedklinicznych in vivo ujawniły wysoką skuteczność ochronną w różnych zwierzęcych modelach ludzkich napadów padaczkowych, tj. teście maksymalnego elektroszoku (MES, maximal electroshock seizure test), teście drgawek wywołanych podskórnym podaniem pentetrazolu (scPTZ, subsutaneous pentylenetetrazole sizure test) oraz drgawkach sześcio-hercowych (6-Hz, 32 mA i 44 mA) po podaniu dootrzewnowym myszom. Substancje o takim profilu farmakologicznym są potencjalnie skuteczne w szerokim spektrum napadów padaczkowych u człowieka, mianowicie toniczno-klonicznych przebiegających bez lub z wtórnym uogólnieniem, napadach mioklonicznych, uogólnionych napadach typu nieświadomości (absence), napadach częściowych skroniowych oraz w padaczce lekoopornej. Związki będące przedmiotem wynalazku pozbawione są całkowicie negatywnego wpływu na koordynację ruchową myszy w teście obracającego się pręta (rotarod), która jest miarą neurotoksyczności ostrej substancji. Jest to istotna cecha odróżniająca je od znajdujących się w lecznictwie preparatów, które z nielicznymi wyjątkami (lewetyracetam) prowadzą do upośledzenia koordynacji motorycznej zwierząt w dawkach zbliżonych lub większych w stosunku do dawek działających skutecznie. Tym samym związki według wynalazku posiadają znacznie szersze spektrum aktywności oraz charakteryzują się nieporównywalnie wyższym profilem bezpieczeństwa (w teście rotarod) w porównaniu do wszystkich stosowanych obecnie leków przeciwpadaczkowych. Kolejną unikalną cechą związków według wynalazku jest fakt, iż pozbawione są one całkowicie działania sedatywnego, które jest charakterystyczne dla znanych leków przeciwpadaczkowych (w tym również lewetyracetamu). Efekt ten oceniony został w teście ruchliwości spontanicznej na myszach. Wyniki wspomnianego testu dowiodły ponadto, iż związki według wynalazku nieoczekiwanie nasilają ruchliwości spontaniczną zwierząt w dawkach, w których obserwowano ich działanie przeciwdrgawkowe. Efekt ten ma charakter dawko-zależny i jest to cecha całkowicie unikalna i niespotykana wśród wszystkich stosowanych w lecznictwie leków przeciwpadaczkowych. Zwiększenie ruchliwości spontanicznej myszy świadczyć może m.in. o działaniu przeciwdepresyjnym substancji, a efekt ten został potwierdzony w teście wymuszonego pływania (test Porsolta). Ponadto wykazano również działanie przeciwlękowe (anksjolityczne) w teście czterech płytek (test Arona). Są to kolejne istotne właściwości farmakologiczne odróżniająca związki według wynalazku od aktualnie stosowanych i testowanych leków przeciwpadaczkowych. Stymulacja ruchliwości wskazuje ponadto na potencjalnie nowy mechanizm działania substancji objętych niniejszym wynalazkiem (który do tej pory nie został jednak zdefiniowany). Kolejną wartością dodaną ww. połączeń jest działanie antynocyceptywne w teście formalinowym, modelu bólu indukowanego oksaliplatyną i streptozocyną u myszy, co jednoznacznie wskazuje na potencjalną użyteczność ww. substancji w leczeniu bólu różnego pochodzenia, w tym neuropatii spowodowanej chemioterapią oraz neuropatii cukrzycowej.

Związki będące przedmiotem niniejszego wynalazku są pod względem strukturalnym enancjomerami o konfiguracji absolutnej R ujawnionych wcześniej mieszanin racemicznych - (2RS)-A/-benzylo2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)propanamidu i (2RS)-2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)-A/-(2-fluorobenzylo)propanamidu (Kamiński, et al. Bioorg. Med. Chem. 2015, 23, 2548-2561; Rapacz, et al. Naunyn Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 2017, 6, 567-579). Co nieoczywiste, nieopisane do tej pory enancjomery o konfiguracji absolutnej R wykazały istotnie wyższą aktywność przeciwdrgawkową w porównaniu

PL 240 297 BI do wspomnianych powyżej racematów (RS) i enancjomerów o konfiguracji S. Ponadto związki według wynalazku powodują nasilenie ruchliwości spontanicznej myszy, a działania tego nie obserwowano w przypadku odmiany S oraz ujawnionych wcześniej racematów (Rapacz, et al. Naunyn Schmiedeberg’sArch. Pharmacol. 2017, 6, 567-579). Należy również podkreślić, iż mieszania racemiczna składa się z dwóch związków o odmiennej konfiguracji w obrębie centrum asymetrycznego. Poszczególne enancjomery mogą wykazywać odmienne właściwości farmakodynamiczne, farmakokinetyczne oraz toksykologiczne, dlatego też mieszanina racemiczna nie spełnia kryteriów dla substancji będących kandydatami na lek. Mając na uwadze korzystniejsze właściwości farmakologiczne enancjomerów R, niniejszy wynalazek dotyczy izolowanych związków posiadających konfigurację R centrum stereogenicznego.

Związki o wzorze (1 i 2) posiadają centrum chiralne, zakresem wynalazku objęte są enancjomery o konfiguracji R. Związki te można otrzymać, stosując odpowiednie formy izomeryczne substancji wyjściowej (pochodne aminokwasowe) lub można je rozdzielać po wytworzeniu związku końcowego w formie mieszaniny racemicznej według znanych metod rozdzielania.

Drugim aspektem wynalazku jest zastosowanie związków opisanych wzorem (1 i 2) jako substancji aktywnej w kompozycjach farmaceutycznych do leczenia napadów padaczkowych albo bólu o podłożu neurologicznym i zapalnym albo migreny, albo depresji, albo lęku, albo chorób neurodegeneracyjnych (m.in. choroby Parkinsona, Alzheimera, stwardnienia bocznego zanikowego, itp.), albo uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego spowodowanego niedotlenieniem. Związki według wynalazku posiadają aktywność przeciwdrgawkową, przeciwbólową, przeciwdepresyjną i przeciwlękową w szerokim panelu modeli zwierzęcych i mogą znaleźć zastosowanie jako substancje czynne różnych postaci leku do leczenia padaczki, padaczki z współtowarzyszącymi zaburzeniami depresyjnymi i lękowymi, depresji, lęku, bólu o podłożu neurologicznym, bólu o podłożu zapalnym, chorób neurodegeneracyjnych (m.in. choroby Parkinsona, Alzheimera, stwardnienia bocznego zanikowego, itp.), uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego spowodowanego niedotlenieniem.

Związki o wzorze (1 i 2) według wynalazku można otrzymać wg. czteroetapowego postępowania, stosując jako substancję wyjściową dostępną komercyjne i zabezpieczoną grupą tert-butoksykarbonylową (Boc) D-alaninę (o konfiguracji absolutnej R).

W etapie pierwszym w wyniku reakcji kondensacji odpowiedniej aminy pierwszorzędowej z zabezpieczoną grupą tert-butoksykarbonylową (Boc) D-alaniną uzyskuje się produkt pośredni o wzorze (I), który następnie w wyniku reakcji deprotekcji tworzy żądaną aminę pierwszorzędową o ogólnym wzorze (II). W kolejnym etapie związek o wzorze (II) poddaje się reakcji kondensacji z bezwodnikiem bursztynowym, w wyniku czego uzyskuje się związek o budowie amidokwasowej o wzorze (III). Produkt pośredni (III) poddany reakcji cyklizacji tworzy żądane związki o wzorze (1 i 2). Postępowanie syntetyczne oraz warunki reakcji ilustruje Schemat 1, gdzie R = H lub R = F.

I- DCC, DCM, temp, pok., 4 h

II - TFA, temp, pok., 2 h iii - AcOEt, temp, pok., 30 min /v- HMDS, ZnCI₂, benzen, temp, wrzenia, 24 h

1:R= H

2:R = F

Schemat 1. Synteza związków (1 i 2) według wynalazku.

PL 240 297 B1

Rozwiązanie według wynalazku posiada szereg zalet. Ujawnione związki o wzorze (1 i 2) charakteryzują się silną i szeroka aktywnością przeciwdrgawkową w różnych zwierzęcych modelach padaczki tj. w teście maksymalnego elektroszoku (MES), teście drgawek indukowanych podskórnym podaniem pentetrazolu (. sc PTZ) oraz modelu drgawek indukowanych prądem o niskiej częstotliwości 6 Hz (32 mA i 44 mA). Związki o takim profilu w badaniach przedklinicznych in vivo mogą działać efektywnie w różnych typach padaczki u człowieka w tym napadach toniczno-klonicznych przebiegających bez lub z wtórnym uogólnieniem, uogólnionych napadach nieświadomości (absence), napadach mioklonicznych, napadach częściowych oraz co istotne padaczce lekoopornej. Inną zaletą związków o wzorze (1 i 2) jest stereospecyficzność działania farmakologicznego, mianowicie istotnie silniejszą aktywność przeciwdrgawkową posiadają związki o konfiguracji absolutnej R w porównaniu do enacjomerów o konfiguracji S i właściwych mieszanin racemicznych. Unikalną cechą związków objętych wynalazkiem jest fakt, iż pozbawione są one całkowicie działania sedatywnego, które zbadane zostało w teście ruchliwości spontanicznej na myszach. Wyniki wspomnianego testu dowiodły ponadto, iż związki będące przedmiotem wynalazku nieoczekiwanie nasilają ruchliwości zwierząt w dawkach, w których obserwowano ich działanie przeciwdrgawkowe. Sugeruje to działanie przeciwdepresyjne i przeciwlękowe, co dowiedzione zostało dla związku 1. Kolejną zaletą związków o wzorze (1 i 2) jest aktywność antynocyceptywna w zwierzęcych testach oceniających to działanie, tj. teście formalinowym, modelu bólu neuropatycznego indukowanego oksaliplatyną oraz modelu bólu neuropatycznego indukowanego hiperglikemią wywołaną jednorazowym podaniem streptozocyny. Z tego względu związki te mogą zaleźć zastosowanie do terapii bólu neuropatycznego spowodowanego chemioterapią, cukrzycą jak również bólu o podłożu zapalnym. Związki wg wzoru (1 i 2) mogą być również potencjalnie użyteczne m.in. do terapii migreny, zespołu abstynencyjnego, schizofrenii, zaburzeń schizoafektywnych, zaburzeń osobowości i odżywiania, lęku, stresu pourazowego, chorób neurodegeneracyjnych (np. choroby Parkinsona, Alzheimera, stwardnienia bocznego zanikowego, itp.) oraz uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego spowodowanego niedotlenieniem. Związki wg wzoru (1 i 2) posiadają korzystne parametry ADME-Tox w badaniach in vitro.

Związki (1 i 2) według wynalazku mogą być podawane różnymi drogami m.in. dojelitowo, miejscowo lub pozajelitowo przy zastosowaniu odpowiedniego preparatu farmaceutycznego przydatnego do wymienionego podawania i zawierającego co najmniej jeden aktywny związek wg wzorów (1 i 2) w farmaceutycznie dopuszczalnych i skutecznych ilościach razem z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami, nośnikami i/lub substancjami pomocniczymi znanymi w dziedzinie. Wytwarzanie takich preparatów farmaceutycznych jest znane w dziedzinie. Dawka terapeutyczna będzie zmienna i uzależniona od substancji, gatunku, płci, wieku, leczonej jednostki chorobowej, drogi i sposobu podania, co wymaga wyznaczenia przez specjalistę w dziedzinie. Proponowana dawka związków według wynalazku wynosi od 0,1 do około 1000 mg na dzień, w dawce pojedynczej lub w dawkach podzielonych. Związki według wynalazku podaje się pacjentowi, jako takie lub w połączeniu z jedną inną substancją czynną lub więcej, każdej w swej własnej kompozycji lub niektórymi bądź wszystkimi substancjami czynnymi połączonymi w pojedynczej kompozycji i/lub odpowiednimi farmaceutycznymi substancjami pomocniczymi. Odpowiednie farmaceutyczne substancje pomocnicze obejmują typowo stosowane substancje pomocnicze i środki ułatwiające formulację, takie jak wypełniacze, środki wiążące, środki rozsadzające, środki poślizgowe, rozpuszczalniki, środki żelotwórcze, emulgatory, stabilizatory, barwniki i/lub środki konserwujące. Związki według wynalazku komponuje się w postacie dawkowania, stosując powszechnie znane farmaceutyczne metody wytwarzania. Postaciami dawkowania mogą być np. tabletki, kapsułki, granulki, czopki, emulsje, zawiesiny lub roztwory. Zależnie od sposobu podawania i formy galenowej, ilość substancji czynnej w preparacie może typowo wahać się w zakresie od 0,01% i 100% (wagowo).

W celu lepszego wyjaśnienia wynalazku niniejszy opis został uzupełniony o załączone figury.

Na Fig. 1 przedstawiona została aktywność analgetyczna związku 1 wg. wynalazku w I i II fazie bólu testu formalinowego. Wyniki przedstawiono jako czas lizania łapy w fazie pierwszej testu (0-5 minut po iniekcji formaliny) i w fazie II testu (15-30 minut po iniekcji formaliny). Wartości przedstawiają średnie ± SEM dla grupy 8-10 zwierząt. Różnica statystycznie znamienna w porównaniu do grupy kontrolnej, której podano sam nośnik (Tween). Jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA, test post hoc Dunnetta): *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. K - grupa kontrolna.

Na Fig. 2 przedstawiona została aktywność analgetyczna związku 1 w modelu bólu neuropatycznego indukowanego oksaliplatyną. Wyniki przedstawiają próg reakcji bólowej (bodziec, przy którym zwierzę cofa łapę) 30 minut po podaniu związku. Wartości przedstawiają średnie ± SEM dla grupy

PL 240 297 B1 zwierząt. Różnica statystycznie znamienna w porównaniu do grupy, której podano jedynie oksaliplatynę (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z powtarzanymi pomiarami, test post hoc Dunnett'a): *p < 0,05, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Na Fig. 3 przedstawiona została aktywność analgetyczna związku 1 w modelu bólu neuropatycznego indukowanego hiperglikemią po podaniu streptozocyny. Wyniki przedstawiają próg reakcji bólowej (bodziec, przy którym zwierzę cofa łapę) 30 minut po podaniu związku. Wartości przedstawiają średnie ± SEM dla grupy 10 zwierząt. Różnica statystycznie znamienna w porównaniu do grupy, której podano nośnik (1% Tween 80) (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z powtarzanymi pomiarami, test post hoc Dunnett'a): *p < 0,05, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Na Fig. 4 przedstawiona została aktywność przeciwdepresyjna związku 1 w teście wymuszonego pływania. Wyniki przedstawiają czas bezruchu w czasie 4 minut obserwacji myszy umieszczonych w cylindrze z wodą. Wartości przedstawiają średnie ± SEM dla grupy 8-10 zwierząt. Różnica statystycznie znamienna w porównaniu do grupy kontrolnej, której podano sam nośnik (1% Tween 80) (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA, test post hoc Dunnett'a): *** p < 0,001.

Na Fig. 5 przedstawiona została aktywność przeciwlękowa związku 1 w teście czterech płytek. Wyniki przedstawiają całkowitą liczbę karanych bodźcem elektrycznym przejść pomiędzy płytkami w czasie 60 sekund obserwacji myszy umieszczonych w specjalistycznych klatkach. Wartości przedstawiają średnie ± SEM dla grupy 8-10 zwierząt. Różnica statystycznie znamienna w porównaniu do grupy kontrolnej, której podano sam nośnik (1% Tween 80) (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA, test post hoc Dunnett'a): *** p < 0,001.

Na Fig. 6 przedstawiony został wpływ związku 1 oraz 2 na ruchliwość spontaniczną zwierząt. Wyniki przedstawiają liczbę przecięć wiązek promieni podczerwonych w trakcie 30 minut pomiaru. Wartości przedstawiają średnie ± SEM dla grupy 10 zwierząt. Różnica statystycznie znamienna w porównaniu do grupy kontrolnej (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z powtarzanymi pomiarami, test post hoc Dunnett'a): *p < 0,05, ** p < 0,01.

Na Fig. 7A przedstawiony został wpływ referencyjnego inhibitora - ketokonazolu (KE) oraz 1 na aktywność CYP3A4. Na Fig. 7B przedstawiony został wpływ referencyjnego inhibitora - chinidyny (QD) oraz 1 na aktywność CYP2D6. Istotność statystyczną obliczono jednoczynnikową analizą wariancji ANOVA oraz metodą Bonferroniego (***p < 0,001, związki testowane w triplikatach).

Na Fig. 8 przedstawiony został wpływ referencyjnego cytostatyku - doksorubicyny (DX) oraz 1 na żywotność komórek HEK-293 po 72 godzinach inkubacji.

Poniżej przedstawiono przykłady realizacji wynalazku.

P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie związków według wynalazku.

Metody analityczne:

Widma protonowego rezonansu magnetycznego (¹H NMR) oraz magnetycznego rezonansu jądrowego węgla (¹³C NMR) rejestrowano, używając spektrometru JEOL-500 (JEOL USA, Inc. MA, USA), przy odpowiednio 500 MHz i 126 MHz. Przesunięcia chemiczne podano w wartościach δ (ppm) w stosunku do TMS δ = 0 (1H), jako wzorca wewnętrznego. Wartości J wyrażono w hercach (Hz). Jako rozpuszczalnik stosowano deuterowany chloroform (CDCI3). W opisie widm użyto następujące skróty sygnałów: s (singlet), br. s (szeroki singlet), d (dublet), t (tryplet), q (kwartet), m (multiplet). System do analiz UPLC/MS składał się z aparatu Waters ACQUITY® UPLC® (Waters Corporation, Milford, MA, USA) sprzężonego ze spektrometrem masowym Waters TQD, pracującym w trybie jonizacji elektrosprejem (ESI). Rozdziały chromatograficzne zostały przeprowadzone z wykorzystaniem kolumny Acquity UPLC BEH C18 o wymiarach 2,1 χ 100 mm i średnicy ziaren 1,7 μm. Kolumna była utrzymywana w temperaturze 40°C i eluowana w gradiencie od 95% do 0% eluentu A w czasie 10 min, przy przepływie 0,3 ml/min. Eluent A: woda/kwas mrówkowy (0,1%, ν/ν); eluent B: acetonitryl/kwas mrówkowy (0,1%, ν/ν). Chromatogramy zostały zarejestrowane przy użyciu detektora PDA Waters eλ. Spectra były analizowane w zakresie 200-700 nm z rozdzielczością 1,2 nm i częstością próbkowania 20 pkt/s. Czystość enancjomeryczną oznaczono, wykorzystując do tego celu chiralną chromatografię cieczową, wykorzystując do tego celu chromatograf HPLC Smartline (Knauer, Berlin, Niemcy), kolumna Chiralpak AD-H (250 χ 4.6 mm), analiza izokratyczna (faza ruchoma: heksan : izopropanol = 80 : 20 (ν/ν), przepływ: 1 ml/min), detekcja przy λ = 206 nm and λ = 254 nm. Skręcalność właściwą ([a]²⁰D) związków zbadano na polarymetrze Jasco p-2000 (Jasco Inc. Easton, MD, USA). Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) została wykonana na płytkach aluminiowych powlekanych żelem krzemionkowym 60 F254 (Macherey-Nagel, Duren, Niemcy), przy użyciu układów rozwijających, o następującym składzie:

PL 240 297 B1

DCM : MeOH (9 : 0,3; ν/ν), DCM : MeOH (9 : 0,5; ν/ν). Detekcja plam - świato UV (λ = 254 nm). Temperatury topnienia (t. t.) oznaczono z użyciem kapilar otwartych w aparacie Buchi 353 (Buchi Labortechnik, Flawil, Szwajcaria). Konfigurację absolutną potwierdzono metodą krystalograficzną, wykorzystując do tego celu dyfraktometr SuperNova (Rigaku - Oxford Diffraction, UK). Nazwy opisanych poniżej związków chemicznych stanowiących przykładowe realizacje wynalazku uzyskano za pomocą programu ChemBioDraw Ultra 12.0.

Wytwarzanie związków według wynalazku zilustrowano w poniżej zamieszczonych przykładach. Przedstawione w przykładach syntezy nie były optymalizowane pod kątem wydajności, ilości zastosowanych reagentów jak i finalnej postaci otrzymanych związków. Zastosowane skróty: AcOEt - octan etylu, DCM - dichlorometan, DCC - N,N'-dicykloheksylokarbodiimid, Et2O - eter dietylowy, HCl - kwas solny, HMDS - heksametylodisilazan, MeOH - metanol, NaCl - chlorek sodu, NH4OH - wodorotlenek amonu, Na2SO4 - siarczan sodu, TFA - kwas trifluorooctowy, ZnCl2 - chlorek cynku.

Przykłady syntezy oraz dane fizykochemiczne i spektralne produktów pośrednich (I - III) wg Schematu 1):

Produkt pośredni 1 (R = H): Tert-butylo-(R)-(1-(benzyloamino)-1-oksopropan-2-ylo)karbaminian.

Boc-D-alaninę (5,1 g, 27 mmol, 1 eq) rozpuszczono w 20 ml DCM, a następnie dodano DCC (6,68 g, 32,4 mmol, 1,2 eq), całość mieszano, a po 30 minutach wkroplono benzyloaminę (2,89 g, 27 mmol, 1 eq). Reakcję kontynuowano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Po tym czasie DCM oddestylowano do sucha. Produkt pośredni I oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej w układzie eluentów DCM : MeOH (9 : 0,3; ν/ν). Produkt pośredni I otrzymano w postaci jasnego oleju. Wydajność: 91% (6,95 g); TLC: Rf = 0,43 (DCM : MeOH (9 : 0,3; ν/ν)); C15H22N2O3 (278,35), masa monoizotopowa: 278,16. UPLC (czystość 100%): t_R = 5,44 min. (M + H)⁺ 279,3.

Produkt pośredni II (R = H): (R)-2-amino-N-benzylopropanamid.

Do roztworu tert-butylo-( R )-(1-(benzyloamino)-1-oksopropan-2-ylo)karbaminianu (6,95 g, 25 mmol, 1 eq) (I) w DCM (40 ml) dodano 10 ml TFA, całość mieszano przez 2 godziny. Następnie TFA zobojętniono 25% roztworem NH4OH, po czym mieszaninę ekstrahowano DCM (3 χ 50 ml). Warstwę organiczną suszono nad bezwodnym Na2SO4, a następnie DCM odparowano do sucha. (R )-2-aminoN-benzylopropanamid (II) otrzymano w postaci jasnego oleju. Wydajność: 89% (3,9 g); TLC: Rf = 0,21 (DCM : MeOH (9 : 0,5; ν/ν)); C10H14N2O (178,24), masa monoizotopowa: 178,11. UPLC (czystość 96,8%): t_R = 2,11 min. (M + H)⁺ 179,2.

Produkt pośredni III (R = H): Kwas (R)-4-((1-(benzyloamino)-1-oksopropan-2-ylo)amino)-4oksobutanowy.

Do roztworu (R )-2-amino-N -benzylopropanamidu (3,9 g, 21 mmol, 1 eq) (II) w AcOEt (40 ml) dodano bezwodnik kwasu bursztynowego (2,19 g, 21 mmola, 1 eq), całość mieszano przez 30 minut. Po tym czasie AcOEt oddestylowano do sucha. Związek otrzymano w postaci stałej, po przemyciu EbO. Biały stały. Wydajność: 95% (5,80 g); 1.1. 129,8-131,4°C; TLC: Rf = 0,34 (DCM : MeOH (9 : 0,5; ν/ν)); C14H18N2O4 (278,31), masa monoizotopowa: 278,13. UPLC (czystość 98,4%): tR = 3,23 min. (M + H)⁺ 279,2.

Synteza oraz dane fizykochemiczne i spektralne związków finalnych 1 i 2:

Związek 1: (2R)-N-benzylo-2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)propanamid.

Do zawiesiny kwasu (R)-4-((1-(benzyloamino)-1-oksopropan-2-ylo)amino)-4-oksobutanowego (2,78 g, 10 mmol, 1 eq) (III, R = H) w suchym benzenie (40 ml) dodano ZnCl2 (1,36 g, 10 mmol, 1 eq), całość ogrzano do 80°C i mieszano. Następnie przez 30 minut wkraplano roztwór HMDS (2,42 g, 3,14 ml, 15 mmol, 1,5 eq) w suchym benzenie (15 ml). Reakcję kontynuowano, mieszając całość w temperaturze wrzenia przez ok. 24 godziny, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Po oddestylowaniu rozpuszczalnika oleistą pozostałość rozpuszczono w DCM (50 ml) i ekstrahowano 0,1 M HCl (3 χ 50 ml), wodą (3 χ 50 ml) i nasyconym roztworem NaCl (3 χ 50 ml). Warstwę organiczną suszono nad bezwodnym Na2SO4, a następnie odparowano do sucha. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej w układzie DCM : MeOH (9 : 0,3; ν/ν). Związek otrzymano w postaci stałej po przemyciu Et2O. Biały stały. Wydajność: 90% (2,34 g); t.t. 138,2-138,9°C; Chiralne HPLC > 99% ee (tR = 32,506 min); [a]²⁰D +51,52° (c 0,1%, DCM); TLC: Rf = 0,39 (DCM : MeOH (9 : 0,3; ν/ν)); C14H16N2O3 (260,29), masa monoizotopowa: 260,12. UPLC (czystość 100%): tR = 3,94 min. (M + H)⁺ 261,1. ¹H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 1,56 (d, J = 7,5 Hz, 3H), 2,66 (s, 4H), 4,39 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 4,76 (q, J = 7,3 Hz, 1H), 6,45 (br s, 1H), 7,22-7,26 (m, 3H), 7,30-7,32 (m, 2H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 14,5, 24,9, 25,6, 28,3, 33,7, 43,8, 49,8, 127,6, 127,7, 128,8, 137,9, 168,6, 177,0.

PL 240 297 B1

Związek 2: (2R)-2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)-N-(2-fluorobenzylo)propanamid.

Związek otrzymano wykorzystując analogiczną procedurę jak w przypadku syntezy związku 1. W reakcji użyto kwas (R)-4-((1-((2-fluorobenzylo)amino)-1-oksopropan-2-ylo)amino)-4-oksobutanowy (2,96 g, 10 mmol, 1 eq) (III, R = F), ZnCl2 (1,36 g, 10 mmol, 1 eq) i HMDS (2,42 g, 3,14 ml, 15 mmol, 1,5 eq). Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej w układzie eluentów DCM : MeOH (9 : 0,3; ν/ν). Biały stały. Wydajność: 89% (2,48 g); t.t. 115,1-115,8°C; Chiralne HPLC > 99% ee (tR = 24,859 min); [α]²⁰υ +27,90° (c 0,1%, DCM); TLC: Rf = 0,43 (DCM : MeOH (9 : 0,3; ν/ν)); C14H15FN2O3 (278,28), masa monoizotopowa: 278,11. UPLC (czystość 100%): tR = 4,08 min, (M + H)⁺ 279,2. ¹H NMR (500 MHz, CDCb) δ 1,56 (d, J = 7,5 Hz, 3H), 2,68 (s, 4H), 4,43 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 4,73-4,76 (m, 1H), 6,50 (br s, 1H), 7,00 (t, J = 9,1 Hz, 1H), 7,08 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,21-7,28 (m, 1H), 7,29-7,31 (m, 1H) ¹³C NMR (126 MHz, CDCI3) δ 14,5, 28,2, 37,9, 37,9, 49,8, 115,3, 115,5, 124,5, 124,5, 124,8, 124,9, 129,4, 129,4, 130,2, 130,2, 160,0, 161,9, 168,8, 176,9

P r z y k ł a d 2. Aktywność biologiczna związków według wynalazku.

Badania in vivo

Badania zostały przeprowadzone na osobnikach męskich myszy białych typu Swiss (CD-1) o wadze 22-26 g. Wszystkie procedury wykonano zgodnie z obowiązującymi polskimi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi etyki badań na zwierzętach, po uzyskaniu stosownej zgody instytucjonalnej. Substancje podawane były dootrzewnowo (i.p.) po uprzednim zawieszeniu w 1% wodnym roztworze Tweenu, jako pojedyncze wstrzyknięcia o objętości 10 ml/kg, 30 minut przed danym testem.

Wyznaczenie aktywności przeciwdrgawkowej w badaniach in vivo na myszach

Badania przesiewowe wykonano na grupach złożonych z 4 myszy. Średnią dawkę efektywną (ED50) W danym teście oszacowano na podstawie wyników uzyskanych na 4 grupach zwierząt złożonych z co najmniej 6 osobników. Wszystkie testy zostały przeprowadzone w oparciu o procedury opisane w literaturze specjalistycznej: test maksymalnego elektroszoku (Kamiński et al. Bioorg. Med. Chem. 2015, 23, 2548-2561; Castel-Branco et al. Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 2009, 31, 101-106); test drgawek psychomotorycznych (test 6 Hz, 32 i 44 mA) (Barton et al. Epilepsy Res. 2001,47, 217-227; Wojda et al. Epilepsy Res. 2009, 86, 163-174); test drgawek wywołanych podskórnym podaniem pentetrazolu (.scPTZ) (Ferreri et al. Pharmacol. Biochem. Behav. 2004, 77, 85-94).

Oznaczenie aktywności antynocyceptywnej w badaniach in vivo na myszach

Wszystkie testy/modele zostały przeprowadzone w oparciu o procedury opisane w literaturze specjalistycznej: test formalinowy (Beirith et al. Eur. J. Pharmacol. 1998, 345, 233-245), model bólu neuropatycznego indukowanego oksaliplatyną - test von Frey’a (Sałat et al. Pharmacol. Biochem. Behav. 2014,122, 173-181), model bólu neuropatycznego indukowanego hiperglikemią wywołaną jednorazowym podaniem streptozocyny - cukrzycą streptozocynową (Sałat et al. Neuropharmacology 2017, 125, 181-188; Tanabe et al. J. Pharmacol. Sci. 2008, 107, 213-220). Grupa badana składała się z 8-10 zwierząt.

Test wymuszonego pływania (test Porsolta)

W celu oceny potencjalnego działania przeciwdepresyjnego przeprowadzono test wymuszonego pływania zgodnie z metodyką opisaną w literaturze naukowej (Pytka et al. Behav Brain Res. 2017, 333, 54-66). Grupa badana składała się z 8-10 zwierząt.

Test czterech płytek (test Arona)

Ocenę potencjalnej aktywności przeciwlękowej badanych związków wykonano przy zastosowaniu testu czterech płytek zgodnie z metodologią opisaną w literaturze specjalistycznej (Pytka et al. Front. Pharmacol. 2018, 9, 627-13). Grupa badana składała się z 8-10 zwierząt.

Test ruchliwości spontanicznej

Ocenę wpływu badanych związków na ruchliwość spontaniczną zwierząt (ocena wpływu sedatywnego lub aktywizującego) wykonano zgodnie z metodologią opisaną w literaturze naukowej (Mogilski et al. Inflamm. Res. 2017, 66, 79-95). Grupa badana składała się z 10 zwierząt.

Ocena wpływu na koordynację ruchową myszy w teście pręta obrotowego (rotarod)

Wpływ badanych związków na koordynację ruchową, oceniano w teści e rotarod (wykorzystano aparat - May Commat, RR 0711 Rota Rod, Turcja) zgodnie z procedu rą opisaną w literaturze (Dunham et al. J. Am. Pharm. Assoc. 1957, 46, 64-66). Średnią dawkę toksyczną w teście obracającego się pręta (TD50) oszacowano na podstawie wyników uzyskanych na 4 grupach zwierząt złożonych z co najmniej 6 osobników.

PL 240 297 B1

Analiza statystyczna

Wartości ED50 (dawka efektywna) i TD50 (dawka toksyczna) wraz z odpowiadającymi im 95% przedziałami ufności obliczono w oparciu o metodę Litchfielda i Wilcoxona. W celu przeprowadzenia oceny statystycznej wyników, wykorzystano jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA oraz test post hoc Dunnett’a (test porównań wielokrotnych). Wartość przy poziomie istotności p < 0,05 uznawano za istotną statystycznie.

Badania in vitro

Wpływ na CYP3A4 i CYP2D6 cytochromu P-450

Badania zostały przeprowadzone wykorzystując komercyjne testy luminescencyjne CYP3A4 P450-Glo™ oraz CYP2D6 P450-Glo™ firmy Promega (Madison, WI, USA). Szczegółową metodykę opisano w literaturze (Socała et al. ACS Chem. Neurosci. 2018, doi: 10.1021/acschemneuro. 8b00476).

Ocena działania cytotoksycznego wobec linii komórkowej HaCaT

Hodowla komórkowa. Materiał badawczy stanowiły ludzka linia komórkowa HaCaT (unieśmiertelniona linia keratynocytów) firmy American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, USA). Komórki hodowano odpowiednio w medium DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Biowest SAS, Francja) z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej, penicyliny (100 U/ml), streptomycyny (100 ug/ml) i HEPES (20 mM) w temperaturze 37°C przy 5% nasyceniu CO2, aż do momentu osiągnięcia 80% konfluencji. Następnie komórki zebrano przy użyciu 0,25% trypsyny-0,02% EDTA (Gibco Life Technologies, USA) i wysiano na 96-dołkowe płytki (1 χ 10⁴ na dołek) w celu sprawdzenia cytotoksyczności badanych związków testem MTT.

Test cytotoksyczności MTT. Test MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy) opiera się na metabolicznej redukcji soli tetrazolowej (MTT) do formazanu, która zachodzi pod wpływem mitochondrialnej dehydrogenazy bursztynianowej aktywnej w żywych komórkach. Badane komórki preinkubowano przez 24 godziny w 37°C przy 5% nasyceniu CO2, następnie usunięto medium i dodano medium z dodatkiem badanych związków w zakresie stężeń od 140 uM do 20 uM. Kontrole stanowiły komórki HaCaT hodowane w odpowiednim medium bez badanego związku. Po 72 h inkubacji medium usunięto i dodano roztwór MTT (0,5 mg/ml) rozpuszczony w medium bez surowicy w objętości 200 ul/na dołek. Po 4 godzinnej inkubacji w 37°C komórki zalewano mieszaniną DMSO (dimetylosulfotlenek) z izopropanolem w stosunku 1 : 1 w celu uwolnienia i rozpuszczenia kryształków formazanu. Gęstość optyczną rozpuszczonych kryształków formazanu zmierzono za pomocą czytnika UVM 340 (ASYS Hitech GmbH, Austria) przy długości fali 570 nm. Wartość IC50 została oszacowana przy użyciu programu CompuSyn w wersji 1.0.

Ocena działania cytotoksycznego wobec linii komórkowej HEK-293

Do testów bezpieczeństwa użyto również linii komórkowej ludzkiej embrionalnej nerki (Human Embryonic Kidney) HEK-293, ATCC CRL-1573. Linię HEK-293 hodowano w pożywce DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (FBS) firmy Gibco, (Carlsbad, CA, USA) w temperaturze 37°C oraz atmosferze zawierającej 5% CO2. Przed przystąpieniem do testu komórki wysiewano na transparentne 96-dołkowe płytki hodowlane Nunc™ firmy Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) w stężeniu 1,5 χ 10⁴ komórek na dołek i inkubowano przez 24 godziny. Następnie 10 mM roztwór wyjściowy badanego związku był rozcieńczany w medium hodowlanym i dodawany do komórek w stężeniach końcowych w zakresie 0,1-100 μM (stężenie DMSO we wszystkich dołkach wynosiło 1%). Związek referencyjny - doksorubicyna (DX) był nakładany w stężeniu 1 μM. Po 72 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C i atmosferze zawierającej 5% CO2 medium ze związkiem usuwano, a następnie dodawano świeżą pożywkę z rozcieńczonym odczynnikiem MTS (CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay) dostarczonym przez firmę Promega (Madison, WI, USA). Płytki ponownie inkubowano przez 2 godziny, a następnie prowadzono pomiar absorbancji przy długości fali 490 nm czytnikiem EnSpire firmy PerkinElmer (Waltham, MA USA). Istotność statystyczną obliczono jednoczynnikową analizą wariancji ANOVA oraz metodą Bonferroniego. Związki testowane były w czterech powtórzeniach.

Wyniki badań in vivo

Aktywności przeciwdrgawkowa

Związki 1 i 2 według wynalazku wykazują szeroką aktywność przeciwdrgawkową działając skutecznie w teście MES, 6 Hz (32 mA/44 mA) oraz scPTZ po ich dootrzewnowym podaniu myszom. Otrzymane wyniki ujawniły, iż substancje o konfiguracji absolutnej R (związki (R)-1 i (R)-2, Tabela 1), stanowiące przykłady realizacji wynalazku, wykazały silniejszą aktywność przeciwdrgawkową w zastosowanych

PL 240 297 Β1 modelach drgawek padaczkowych w porównaniu do enancjomerów S (związki (S)-1 i (S)-2, Tabela 1) i odpowiednich mieszanin racemicznych (związki (RS)-1 i (RS)-2, Tabela 1)). Dane dla enancjomerów R i S oraz mieszanin racemicznych przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Wartości parametrów EDso, TDso i PI dla związków 1 i 2 (o konfiguracji R), enancjomerów S i mieszanin racemicznych (RS) oraz referencyjnego leku przeciwpadaczkowego (kwasu walproinowego) po dootrzewnym podaniu myszom.

Związek	ED5o [mg/kg]	TDS0 [mg/kg]	PI
MES	6 Hz (32 mA)	6 Hz (44 mA)	scPTZ	Test rotarod	TD50/ED50
(^)-i	66,3	15,6	41,6	36,3	>500	>7,5 (MES) >32,0 (6 Hz, 32 mA) >12,0 (6 Hz,44mA) >13,8 (scPTZ)
(5)-l	87,5	28,8	115,1	52,7	>500	>5,7 (MES) >17,4 (6 Hz, 32 mA) >4,3 (6 Hz, 44 mA >9,5 (scPTZ)
	67,6	24,6	BD	42,8	347,6	5,1 (MES) 14,1 (6 Hz, 32mA) 8,1 (scPTZ)
(^)-2	33,0	14,1	37,2	33,2	298,8	9,0 (MES) 21,2 (6 Hz, 32 m A) 8,0 (6 Hz, 44 mA 9,0 (wPTZ)
(5)-2	65,0	62,9	BD	78,8	310,2	4,8 (MES) 4,9 (6 Hz, 32 mA) 3,9 (scPTZ)
(Λ5)-2*	54,9	33,8	BD	50,3	300,9	5,5 (MES) 8,9 (6 Hz, 32 mA) 6,0 (scPTZ)
Kwas walproinowy	252,7	130,6	183,1	239,4	430,7	1,7 (MES) 3,3(6 Hz, 32 mA) 2,4 (6 Hz, 44 mA 1,8 (scPTZ)

Substancje badano 30 min. po podaniu dootrzewnym; MES - test maksymalnego elektroszoku; 6 Hz (32 mA) i 6 Hz (44 mA) - testy drgawek wywołanych prądem o niskiej częstotliwości (6 Hz) i niskim natężeniu odpowiednio 32 mA i 44 mA; scPTZ - test drgawek indukowanych podskórnym podaniem pentetrazolu; Test rotarod - test obracającego się pręta; PI - indeks ochronny (TD50/ED50). BD - brak danych. *Wyniki dla (RS)-1 i (RS)-2 ujawniono w publikacjach: Kamiński, et al. Bioorg. Med. Chem. 2015, 23, 2548-2561; Rapacz, etal. Naunyn Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 2017, 6, 567-579).

Otrzymane rezultaty potwierdziły, iż związki 1 i 2 (o konfiguracji R) posiadają silniejsze działanie przeciwdrgawkowe oraz korzystniejsze indeksy ochronne (PI) w porównaniu do enancjomerów S i mieszanin racemicznych (RS). Ponadto związki 1 i 2 wykazały znacznie wyższą aktywności i korzystniejszy profil bezpieczeństwa (wartości PI) niż kwas walproinowy, będący modelowym lekiem przeciwpadaczkowym o szerokim wachlarzu wskazań terapeutycznych (napady padaczkowe uogólnione: napady miokloniczne, napady toniczno-kloniczne, napady atoniczne, napady nieświadomości; napady padaczkowe częściowe: napady proste lub złożone, napady wtórnie uogólnione, zespół Lennoxa-Gastauta; leczenie epizodów maniakalnych w chorobie afektywnej dwubiegunowej; migrena).

Aktywność antynocyceptywna

Test formalinowy: Związek 1 wg. wynalazku wykazał wyraźną aktywność przeciwbólową w obu fazach testu. Średni czas reakcji nocyceptywnej w grupie kontrolnej wynosił 92,25 ± 9,46 sekund

PL 240 297 B1 i 200,60 ± 18,28 sekund, odpowiednio w pierwszej i drugiej fazie testu. Związek 1 we wszystkich badanych dawkach zmniejszał czas reakcji nocyceptywnej w I fazie testu formalinowego, odpowiadającej bólowi ostremu, przy czym efekt znamienny statystycznie zaobserwowano dla dwóch najwyższych dawek - 60 i 90 mg/kg. W przypadku drugiej fazy testu odpowiadającej tonicznemu bólowi zapalnemu związek 1 w sposób znamienny statystycznie skracał czas reakcji nocyceptywnej w dawkach 30, 60 i 90 mg/kg. (Fig. 1.).

Model bólu neuropatycznego indukowanego oksaliplatyną - test von Frey’a: Jednorazowe podanie oksaliplatyny skutkowało obniżeniem progu bólowego u zwierząt w odpowiedzi na bodziec mechaniczny. Reakcję obserwowano zarówno 3 godziny od podania oksaliplatyny (faza wczesna), jak i 7 dni od jej podania (faza późna). Badany związek 1 podany w dawkach 60 mg/kg i 90 mg/kg w sposób zależny od dawki prowadził do podniesienia progu bólowego w porównaniu do pomiaru wykonanego przed podaniem związku. Związek ten w dawce 30 mg/kg zwiększał próg bólowy jedynie w fazie wczesnej. Uzyskane wyniki wskazują, że związek 1 posiada aktywność analgetyczną (zmniejsza allodynię mechaniczną) w modelu bólu neuropatycznego indukowanego jednorazowym podaniem oksaliplatyny (Fig. 2.).

Model bólu neuropatycznego indukowanego hiperglikemią po jednorazowym podaniu streptozocyny - test von Frey’a

Jednorazowe podanie streptozocyny skutkowało rozwojem hiperglikemii (stężenie osoczowe glukozy przekraczało 300 mg/dl) oraz obniżeniem progu bólowego u zwierząt w odpowiedzi na bodziec mechaniczny (allodynia mechaniczna). Reakcję badano 3 tygodnie od iniekcji streptozocyny. Badany związek 1 podany w dawkach 30 mg/kg, 60 mg/kg i 90 mg/kg w sposób znamienny statystycznie i zależny od dawki prowadził do podniesienia progu bólowego w porównaniu do pomiaru wykonanego przed podaniem związku. Związek w dawce 90 mg/kg zwiększał próg bólowy do wartości obserwowanych przed indukcją cukrzycy streptozocynowej, a więc całkowicie znosił objawy rozwijającej się neuropatii czuciowej. Uzyskane wyniki wskazują, że związek 1 wykazuje aktywność analgetyczną (zmniejsza allodynię mechaniczną) w modelu bólu neuropatycznego indukowanego cukrzycą streptozocynową (Fig. 3.).

Test wymuszonego pływania (test Porsolta) - ocena działania przeciwdepresyjnego

Badany związek 1 podany w dawkach 30 mg/kg, 45 mg/kg i 60 mg/kg w sposób znamienny statystycznie skracał czas bezruchu w teście wymuszonego pływania. Uzyskane wyniki jednoznacznie wskazują na potencjalną aktywność przeciwdepresyjną badanego związku (Fig. 4.).

Test czterech płytek (test Arona) - ocena działania przeciwlękowego

Badany związek 1 podany w dawkach 60 mg/kg i 90 mg/kg w sposób znamienny statystycznie zwiększał ilość przejść karanych impulsem elektrycznym. Podanie badanego związku w dawce 30 mg/kg nie skutkowało istotną statystycznie różnicą w porównaniu do grupy kontrolnej otrzymującej nośnik. Uzyskane wyniki wskazują na działanie przeciwlękowe związku. Efekty podania 60 mg/kg i 90 mg/kg nie różnią się istotnie, co sugeruje, że działanie przeciwlękowe związku ma charakter pułapowy (Fig. 5.).

Ocena wpływu na ruchliwość spontaniczną zwierząt

Związek 1 podany w dawkach 30 mg/kg, 60 mg/kg oraz 90 mg/kg w sposób znamienny statystycznie zwiększył liczbę przecięć wiązek promieniowania podczerwonego w aktometrach w trakcie 30 minut pomiaru. Uzyskany wynik wskazuje, iż badany związek w wyżej wymienionym zakresie dawek zwiększa spontaniczną aktywność lokomotoryczną zwierząt. W przypadku związku 2 statystycznie znamienne nasilenie ruchliwości spontanicznej zwierząt obserwowano po podaniu dawki 90 mg/kg (Fig. 6).

Wyniki badań in vitro

Wpływ na izoformy CYP3A4 i CYP2D6 cytochromu P-450

Badania zostały przeprowadzone wykorzystując komercyjne testy luminescencyjne CYP3A4 P450-Glo™ oraz CYP2D6 P450-Glo™ firmy Promega (Madison, WI, USA). Wybrane do badań izoformy CYP odpowiadają za metabolizm około 40-50% dostępnych na rynku leków, a ich pobudzenie lub hamowanie decyduje o większość metabolicznych interakcji lekowych. Otrzymane wyniki wskazują na brak wpływu związku 1 na aktywność CYP3A4 i CYP2D6 w wysokim stężeniu 10 μM. Podsumowując, otrzymane wyniki wskazują na niskie prawdopodobieństwo potencjalnych metabolicznych interakcji wywołanych przez związek 1 (Fig. 7.)

Ocena działania cytotoksycznego wobec linii komórkowej HaCaT w teście MTT

Aktywność cytotoksyczną związku 1 oszacowano przez określenie stężenia hamującego IC50 (stężenie związku, które odpowiada 50% żywotności komórek w porównaniu z kontrolą). Jako związek

Claims (3)

1. PL 240 297 Β1 referencyjny użyto doksorubicynę - lek o potwierdzonym działaniu cytotoksycznym. Niezależne eksperymenty przeprowadzono trzy razy w trzech powtórzeniach. Badany związek 1 wykazał znacznie mniejszą toksyczność w porównaniu z doksorubicyną, co potwierdza jego bardzo niski potencjał cytotoksyczny (Tabela 2).

   Tabela 2. Aktywność cytotoksyczna (ICso, pM) badanych związków przy użyciu testu MTT.

   Związek IC50 [μΜ] komórki HaCaT*

   1 239,8 ± 0,6

   Doksorubicyną 0,23 ± 0,03 *Dane wyrażono jako średnią ± SD; ICso (pM) - stężenie związku, które odpowiada 50% zahamowaniu wzrostu linii komórkowej (w porównaniu z kontrolą) po inkubacji komórek przez 72 godziny z poszczególnym związkiem; Ludzka unieśmiertelniona linia komórkowa keratynocytów (HaCaT); Doksorubicyną - lek referencyjny o działaniu cytotoksycznym powszechnie stosowany w leczeniu nowotworów.

   Ocena działania cytotoksycznego wobec linii komórkowej HEK-293 w teście MTS

   Bezpieczeństwo związku 1 oszacowano również przy użyciu linii komórkowej ludzkiej embrionalnej nerki (HEK-293). Do zbadania wpływu związku 1 na żywotność i proliferację komórek zastosowano kolorymetryczny test MTS firmy Promega (Madison, Wl, USA). Związek był testowany w czterech stężeniach w zakresie 0.1-100 pM. Doksorubicyną w stężeniu 1 pM została użyta jako cytostatyk referencyjny. Analiza testem MTS, przeprowadzona po 72 godzinach inkubacji linii HEK-293 ze związkiem 1 nie wykazała istotnego statystycznie wpływu tego związku na żywotność komórek w zakresie stężeń 1-100 pM (Fig. 8.).

   Zastrzeżenia patentowe

   1. Pochodna 2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)propanamidu o konfiguracji R centrum stereogenicznego wybrana spośród: (2R)-N-benzylo-2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)propanamidu o wzorze 1 oraz (2R)-2-(2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)-N-(2-fluorobenzylo)propanamidu o wzorze 2:
2. 2. Związek określony w zastrz. 1 do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu padaczki, padaczki z współtowarzyszącymi zaburzeniami depresyjnymi i lękowymi, depresji, lęku, bólu o podłożu neurologicznym, bólu o podłożu zapalnym lub choroby neurodegeneracyjnej.
3. 3. Związek do stosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że chorobą neurodegeneracyjną jest choroba Parkinsona, choroba Alzheimera lub stwardnienie boczne zanikowe.