PL238697B1

PL238697B1 - Oligonucleotide primers hybridizing within the SdhB gene for detecting the wheat fungal pathogen Zymoseptoria tritici causing septoria leaf blotch, and method of its detection

Info

Publication number: PL238697B1
Application number: PL431160A
Authority: PL
Inventors: Adam Kuzdraliński; Justyna Leśniowska-Nowak; Michał Nowak; Magdalena Kawęcka; Karolina Różaniecka; Anna Kot; Agnieszka Ostrowska; Marta Muszyńska; Hubert Szczerba; Adam WAŚKO; Adam Waśko
Original assignee: Univ Przyrodniczy W Lublinie
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2021-09-27
Also published as: PL431160A1

Description

Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe hybrydyzujące w obrębie genu SdhB do wczesnego wykrywania patogenu grzybowego Zymoseptoria tritici z zastosowaniem łańcuchowej reakcji polimerazy, a także sposób wykrywania obecności tego patogenu.The invention relates to oligonucleotide primers hybridizing within the SdhB gene for the early detection of the fungal pathogen Zymoseptoria tritici using the polymerase chain reaction, as well as a method for detecting the presence of this pathogen.

Straty powodowane przez patogeny roślin zbożowych w niesprzyjających latach sięgają nawet 50% wielkości plonów. Najczęściej w celu ograniczenia populacji grzybów patogennych stosuje się działające nieselektywnie środki ochrony roślin. Niektóre z patogenów, tak jak Zymoseptoria tritici, odpowiadają za większość stosowanych środków dla danej rośliny (tutaj aż 70% rocznego użycia fungicydów w pszenicy zwyczajnej w EU) [Fones i Gurr, 2015]. Z kolei wykorzystywane obecnie metody molekularne, identyfikujące mikroorganizmy jeszcze przed wystąpieniem widocznych objawów chorobowych poprzez wykrycie obecności ich materiału genetycznego, charakteryzują się zmienną specyficznością i czułością. Znakomitym przykładem słabości metod opisanych w literaturze naukowej jest historia testów PCR wykrywających czynnik sprawczy septoriozy paskowanej liści pszenicy tj. patogen Zymoseptoria tritici.Losses caused by pathogens of cereal plants in unfavorable years reach even 50% of the yield. Most often, in order to reduce the population of pathogenic fungi, non-selective plant protection products are used. Some of the pathogens, such as Zymoseptoria tritici, are responsible for most of the agents used for a given plant (here as much as 70% of the annual use of fungicides in common wheat in the EU) [Fones and Gurr, 2015]. In turn, the currently used molecular methods, identifying microorganisms before the onset of visible disease symptoms by detecting the presence of their genetic material, are characterized by variable specificity and sensitivity. An excellent example of the weakness of the methods described in the scientific literature is the history of PCR tests detecting the causative agent of striped septoriosis of wheat leaves, i.e. the pathogen Zymoseptoria tritici.

Beck i Ligon (1995) jako pierwsi zaprojektowali i walidowali oligonukleotydy mające na celu detekcję Z. tritici, w oparciu o region ITS. Amplifikacja ze starterami JB446/ITS1 skutkowała produktem o długości 345 nt. Jednakże, oligonukleotydy te w doświadczeniach przeprowadzonych przez Fraaije i in. (1999) okazały się powielać również inny fragment DNA dając produkt niespecyficzny o długości 280 nt, który okazał się być fragmentem genomu rośliny, na której rozwijał się patogen. Fraaije i in. (1999) zaprojektowali nową parę starterów oligonukleotydowych E1/STSP2R, które miały być pozbawione tej wady. Następnie Fraaije i in. (2001) zaprojektowali i zwalidowali kolejną parę oligonukleotydów STIF2/BAF4ST hybrydyzujące do genu kodującego beta-tubulinę. Niestety Guo i in. (2006) wykazali uzyskiwanie produktów niespecyficznych dla innych patogenów pszenicy z w/w oligonukleotydami. Dlatego też Guo i in. (2006) zaproponowali nowe cztery testy PCR, które miały za zadanie specyficznie wykrywać obecność DNA Z. tritici. Również Consolo i in. (2009) zaproponowali nowe testy DNA. Od 2009 roku nie ma doniesień na temat nowych oligonukleotydów służących wykrywaniu obecności DNA Z tritici w oparciu o konwencjonalną reakcję PCR, która jest znacząco efektywniejsza kosztowo w porównaniu z innymi technikami laboratoryjnymi.Beck and Ligon (1995) were the first to design and validate oligonucleotides for the detection of Z. tritici based on the ITS region. Amplification with JB446 / ITS1 primers resulted in a 345 nt product. However, these oligonucleotides in the experiments performed by Fraaije et al. (1999) also found to duplicate another DNA fragment, resulting in a 280 nt nonspecific product, which turned out to be a fragment of the genome of the plant on which the pathogen was developing. Fraaije et al. (1999) designed a new pair of E1 / STSP2R oligonucleotide primers that were supposed to overcome this drawback. Subsequently, Fraaije et al. (2001) designed and validated another pair of STIF2 / BAF4ST oligonucleotides hybridizing to the gene encoding beta-tubulin. Unfortunately, Guo et al. (2006) showed obtaining products unspecific for other wheat pathogens with the above-mentioned oligonucleotides. Therefore, Guo et al. (2006) proposed four new PCR tests that were designed to specifically detect the presence of Z. tritici DNA. Also Consolo et al. (2009) proposed new DNA tests. Since 2009, there have been no reports of new oligonucleotides detecting the presence of Z tritici DNA based on conventional PCR, which is significantly more cost effective compared to other laboratory techniques.

Sposób identyfikacji patogenu grzybowego Zymospetoria tritici w badanej próbie opiera się, według wynalazku, na amplifikacji sekwencji DNA przy użyciu zaprojektowanej pary specyficznych gatunkowo oligonukleotydów, a następnie detekcji otrzymanego produktu reakcji PCR, w przypadku kiedy w próbce środowiskowej obecne jest DNA niniejszego mikroorganizmu. Uzyskane oligonukleotydy zaprojektowane zostały w oparciu o autorski algorytm autorów. Kilkanaście zaprojektowanych par starterów przeszło proces walidacji na kilkuset próbach środowiskowych. Nieliczne okazały się w pełni specyficzne dla patogenu, jednocześnie nie amplifikując DNA innych mikroorganizmów obecnych na pszenicy oraz DNA rośliny. Walidację przeprowadzono zarówno posługując się narzędziami bioinformatycznymi, jak i w oparciu o próby środowiskowe z trzech sezonów wegetacyjnych. Ponadto zaprojektowane oligonukleotydy porównano ze znanymi metodami opublikowanymi w literaturze naukowej. Oligonukleotydy będące przedmiotem niniejszego wynalazku wykrywają obecność DNA patogenu we wszystkich próbach środowiskowych gdzie obecność ta została potwierdzona wizualnie, podczas gdy porównywane metody literaturowe osiągają 70-80% poziom wykrywalności (dane uzyskane przez autorów).The method of identifying the fungal pathogen Zymospetoria tritici in the test sample is based, according to the invention, on the amplification of a DNA sequence using a designed pair of species-specific oligonucleotides, and then detection of the obtained PCR reaction product, in the case where the DNA of the present microorganism is present in the environmental sample. The obtained oligonucleotides were designed based on the authors' proprietary algorithm. More than a dozen of the designed primer pairs have undergone the validation process on several hundred environmental tests. Few turned out to be fully pathogen-specific, while failing to amplify the DNA of other microorganisms present in wheat and the DNA of the plant. The validation was carried out both with the use of bioinformatics tools and on the basis of environmental tests from three growing seasons. Moreover, the designed oligonucleotides were compared with known methods published in the scientific literature. The oligonucleotides of the present invention detect the presence of the pathogen DNA in all environmental samples where its presence has been visually confirmed, while the compared literature methods achieve a detection level of 70-80% (data obtained by the authors).

Istotę wynalazku stanowią startery oligonukleotydowe do wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymospetoria tritici o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji.The invention is based on oligonucleotide primers for the detection of the wheat fungal pathogen Zymospetoria tritici having the sequences Nos. 1 and 2 shown in the sequence listing.

Istotą sposobu wykrywania patogenu grzybowego pszenicy Zymospetoria tritici jest zastosowanie w reakcji PCR pary starterów oligonukleotydowych o sekwencjach nr 1 i 2 przedstawionych na liście sekwencji, w wyniku której dochodzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA, po czym dokonuje się detekcji otrzymanego produktu amplifikacji poprzez rozdział elektroforetyczny.The essence of the method of detecting the wheat fungal pathogen Zymospetoria tritici is the use of a pair of oligonucleotide primers with sequences No. 1 and 2 presented in the sequence list in the PCR reaction, which results in the amplification of a specific DNA fragment, followed by detection of the obtained amplification product by electrophoretic separation.

Zastosowanie wyżej wymienionej pary starterów do przeprowadzenia łańcuchowej reakcji polimerazy przebiegającej w ściśle określonych warunkach według wynalazku umożliwia amplifikację fragmentu DNA o długości 200-250 par zasad.The use of the above-mentioned primer pair to carry out the polymerase chain reaction under strict conditions according to the invention allows the amplification of a DNA fragment with a length of 200-250 bp.

Wynalazek jest bliżej pokazany w przykładzie wykonania i na rysunku, na którym:The invention is shown in more detail in the embodiment and in the drawing, in which:

- Fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA amplifikowanego w reakcji PCR przeprowadzonej z zastosowaniem oligonukleotydów o sekwencjach nr 1 i 2;- Fig. 1 shows the nucleotide sequence of a DNA fragment amplified by a PCR reaction carried out with oligonucleotides of sequences No. 1 and 2;

- Fig. 2 przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji przeprowadzonej w obecności starterów o sekwencjach nr 1 i 2 dla wybranej próby izolowanej z liści porażonych patogenem.- Fig. 2 shows the electrophoretic separation of the amplification products performed in the presence of primers sequences Nos. 1 and 2 for a selected sample isolated from pathogen infected leaves.

PL 238 697 B1PL 238 697 B1

Materiał biologiczny wykorzystywany w procesie identyfikacji stanowią fragmenty liści pszenicy zwyczajnej lub fragmenty grzybni/zarodniki mikroorganizmu. DNA uzyskane w wyniku przeprowadzenia procedury izolacji stosowane jest jako matryca do amplifikacji. PCR przeprowadza się w mieszanini e reakcyjnej o następującym składzie: woda dejonizowana, standardowy master mix do reakcji PCR zawierający w składzie polimerazę Taq DNA, kofaktor enzymu - jony Mg²⁺, dNTP oraz bufor, matrycowe DNA oraz parę specyficznych starterów oligonukleotydowych (0,5-0,8 μM) o sekwencjach nr 1 i 2. Amplifikację przeprowadza się z zastosowaniem następującego profilu termicznego (lub zbliżonego): wstępna denaturacja - 95°C przez 5 minut, następnie 40 cykli: denaturacja - 95°C przez 30 sekund, annealing - 55°C przez 30 sekund, elongacja - 72°C przez 1 minutę, ostatni etap reakcji stanowi końcowa elongacja w 72°C przez 8 minut lub innego profilu termicznego umożliwiającego uzyskanie powielania DNA z oligonukleotydami stanowiącymi przedmiot tego wynalazku. Sekwencja zamplifikowanego fragmentu DNA przedstawiona jest na Fig. 1.The biological material used in the identification process are parts of common wheat leaves or fragments of mycelium / spores of the microorganism. The DNA obtained from the isolation procedure is used as the template for amplification. PCR is performed in the reaction mixture with the following composition: deionized water, standard master mix for PCR reactions containing Taq DNA polymerase, enzyme cofactor - Mg ²⁺ ions, dNTP and buffer, template DNA and a pair of specific oligonucleotide primers (0.5 -0.8 μM) with sequences 1 and 2. Amplification is performed using the following thermal profile (or similar): initial denaturation - 95 ° C for 5 minutes, then 40 cycles: denaturation - 95 ° C for 30 seconds, annealing - 55 ° C for 30 seconds, elongation - 72 ° C for 1 minute, the last step of the reaction is a final elongation at 72 ° C for 8 minutes or other thermal profile to obtain amplification of DNA with the oligonucleotides of this invention. The sequence of the amplified DNA fragment is shown in Fig. 1.

Obecność oczekiwanego produktu o długości około 200-250 par zasad potwierdza się poprzez zastosowanie dowolnej metody rozdziału i identyfikacji obecności fragmentów kwasów nukleinowych.The presence of the expected product of about 200-250 bp is confirmed by any method of separation and identification of the presence of nucleic acid fragments.

Sposób stwierdzania obecności materiału genetycznego grzyba Zymoseptoria tritici w badanej próbie według wynalazku ilustruje zamieszczony poniżej przykład.The method of determining the presence of the genetic material of the fungus Zymoseptoria tritici in the test according to the invention is illustrated by the following example.

A. Izolacja DNA z fragmentów liści pszenicy zwyczajnej.A. DNA isolation from common wheat leaf fragments.

Izolację DNA przeprowadzono w wykorzystaniem komercyjnego zestawu do izolacji kolumienkowej, przeznaczonego dla roślin i grzybów (Plant and Fungi DNA Purification Kit - EURx). Fragmenty tkanki zamrażano w ciekłym azocie i homogenizowano mechanicznie poprzez rozcieranie w moździerzu. Otrzymane w ten sposób homogenaty przenoszono do probówek 2 ml typu Eppendorf i dodawano 400 μl buforu ekstrakcyjnego, a następnie 3 μl RNazy i 10 al proteinazy K. Mieszaniny po dokładnym zworteksowaniu inkubowano w temperaturze 65°C przez 30 minut. W kolejnych etapach dokonano ekstrakcji przy użyciu 130 μl buforu AC oraz precypitacji (350 μl buforu Sol P, 250 μl etanolu 96%). Uzyskany po wirowaniu (1 min., 14 000 x g) supernatant nanoszono dwukrotnie na minikolumny umieszczone w probówkach odbierających, każdorazowo wylewając przesącz po zwirowaniu (1 min., 14 000 x g). Złoże minikolumny płukano dwukrotnie buforem płuczącym (Wash PX, 500 μl). Minikolumny umieszczono w nowych probówkach 2 ml typu Eppendorf i dokonano elucji DNA ze złoża z zastosowaniem 100 μl ogrzanego do 70°C buforu Elution. Dla określenia stężenia i jakości wyizolowanego DNA przeprowadzono pomiar spektrofotometryczny przy użyciu spektrofotometru NanoDrop2000 (Thermo Scientific).DNA isolation was carried out using a commercial column isolation kit for plants and fungi (Plant and Fungi DNA Purification Kit - EURx). Tissue pieces were frozen in liquid nitrogen and mechanically homogenized by grinding in a mortar. The homogenates obtained in this way were transferred to 2 ml Eppendorf tubes and 400 µl of extraction buffer was added, followed by 3 µl of RNase and 10 µl of proteinase K. After thorough vortexing, the mixtures were incubated at 65 ° C for 30 minutes. In subsequent stages, extraction was performed with 130 μl of AC buffer and precipitation (350 μl of Sol P buffer, 250 μl of ethanol 96%). The supernatant obtained after centrifugation (1 min., 14,000 x g) was applied twice to the minicolumns placed in collecting tubes, each time pouring out the filtrate after centrifugation (1 min., 14,000 x g). The minicolumn bed was washed twice with washing buffer (Wash PX, 500 μl). The minicolumns were placed in new 2 ml Eppendorf tubes and DNA was eluted from the bed with 100 µl of heated to 70 ° C Elution buffer. In order to determine the concentration and quality of the isolated DNA, spectrophotometric measurement was performed using a NanoDrop2000 spectrophotometer (Thermo Scientific).

B. Przygotowanie prób do amplifikacjiB. Preparation of Samples for Amplification

DNA wyizolowane według powyższej procedury wykorzystano jako matrycę dla reakcji PCR. Do każdej probówki o pojemności 0,2 ml dodano po 20 ng DNA. PCR przeprowadzono w objętości 25 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej: wodę dejonizowaną, standardowy master, mix 2xPCR Master Mix (Thermo Scientific, Litwa), parę specyficznych starterów, oligonukleotydowych (0,5-0,8 μM). Próby nałożono na blok termocyklera stosując następujący profil termiczny: wstępna denaturacja - 95°C przez 5 minut, następnie 40 cykli: denaturacja - 95°C przez 30 sekund, annealing - 55°C przez 30 sekund, elongacja - 72°C przez 1 minutę, ostatni etap reakcji, stanowiła końcowa elongacja w 72°C przez 8 minut.DNA isolated according to the above procedure was used as a template for the PCR reaction. 20 ng of DNA was added to each 0.2 ml tube. PCR was performed in a volume of 25 µl of the reaction mixture containing: deionized water, standard master, 2xPCR Master Mix (Thermo Scientific, Lithuania), a pair of specific primers, oligonucleotide (0.5-0.8 µM). The samples were applied to a thermal cycler block using the following thermal profile: initial denaturation - 95 ° C for 5 minutes, then 40 cycles: denaturation - 95 ° C for 30 seconds, annealing - 55 ° C for 30 seconds, elongation - 72 ° C for 1 minute the last step of the reaction was a final extension at 72 ° C for 8 minutes.

C. Wizualizacja wyników amplifikacji za pomocą elektroforezy agarozowejC. Visualization of amplification results by agarose electrophoresis

Produkty reakcji PCR po zmieszaniu z 3 μl bufora obciążającego 6xLoading Dye (Thermo Scientific) rozdzielano na 2% żelu agarazowym w obecności 0,01% barwnika do wizualizacji DNA SimplySafe (EURx) w buforze TAE, przy napięciu 120 V, natężeniu 200 mA, w czasie 1 godziny. Otrzymane wzory rozdziałów obserwowano w świetle UV w archiwizatorze żeli.The PCR reaction products after mixing with 3 μl of 6xLoading Dye loading buffer (Thermo Scientific) were run on a 2% agarase gel in the presence of 0.01% SimplySafe DNA stain (EURx) in TAE buffer at 120 V, 200 mA at time of 1 hour. The obtained separation patterns were observed under UV light in a gel archiver.

Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem oligonukleotydów i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawia Fig. 2.The identification result obtained for the tested material with the use of oligonucleotides and the method according to the invention is shown in Fig. 2.

PL 238 697 Β1PL 238 697 Β1

Literatura:Literature:

Beck JJ. & Ligon L.M. (1995), Polymerase Chain reaction assays for detection of Stagonospara nodorum and Septoria tritici in wheat. Phytopatology, 85, 319-324.Beck JJ. & Ligon L.M. (1995), Polymerase Chain reaction assays for detection of Stagonospara nodorum and Septoria tritici in wheat. Phytopatology, 85, 319-324.

Consolo, V, F., Albani, C. M., Berón, C. M., Salerno, G. L., & Cordo, C. A. (2009). A conventional PCR technique to detect Septoria tritici in wheat seeds. Australasian Plant Pathology, 38(3), 222-227.Consolo, V, F., Albani, C. M., Berón, C. M., Salerno, G. L., & Cordo, C. A. (2009). A conventional PCR technique to detect Septoria tritici in wheat seeds. Australasian Plant Pathology, 38 (3), 222-227.

Fones, H., & Gurr, S. (2015). The impact of Septoria tritici Blotch disease on wheat: An EU perspective. Fungal Genetics and Biology, 79, 3-7Fones, H., & Gurr, S. (2015). The impact of Septoria tritici Blotch disease on wheat: An EU perspective. Fungal Genetics and Biology, 79, 3-7

Fraaije, B. A., Lovell, D. J., Coelho, J. M., Baldwin, S., & Hollomon, D. W. (2001).Fraaije, B. A., Lovell, D. J., Coelho, J. M., Baldwin, S., & Hollomon, D. W. (2001).

PCR-based assays to assess wheat varietal resistance to blotch (Septoria tritici and Stagonospora nodorum) and rust (Puccinia striiformis and Puccinia recondita) diseases. European Journal of Plant Pathology, 107(9), 905-917.PCR-based assays to assess wheat varietal resistance to blotch (Septoria tritici and Stagonospora nodorum) and rust (Puccinia striiformis and Puccinia recondita) diseases. European Journal of Plant Pathology, 107 (9), 905-917.

Fraaije, B. A., Lovell, D. J., Rohei, E. A., & Hollomon, D. W. (1999). Rapid detection and diagnosis of Septoria tritici epidemics in wheat using a polymerase Chain reaction/PiecoGreen assay. Journal of applied Microbiology, 86(4), 701-708.Fraaije, B. A., Lovell, D. J., Rohei, E. A., & Hollomon, D. W. (1999). Rapid detection and diagnosis of Septoria tritici epidemics in wheat using a polymerase Chain reaction / PiecoGreen assay. Journal of applied Microbiology, 86 (4), 701-708.

Guo, J. R., Schnieder, F., & Verreet, J. A. (2006). Presymptomatic and quantitative detection of Mycosphaerella graminicola development in wheat using a real-time PCR assay. FEMS Microbiology Letters, 262(2), 223-229.Guo, J. R., Schnieder, F., & Verreet, J. A. (2006). Presymptomatic and quantitative detection of Mycosphaerella graminicola development in wheat using a real-time PCR assay. FEMS Microbiology Letters, 262 (2), 223-229.

Claims

1. Oligonucleotide primers hybridizing within the SdhB gene for the detection of the wheat fungal pathogen Zymoseptoria tritici having sequences Nos. 1 and 2 shown in the sequence listing.

A method for detecting the wheat fungal pathogen Zymoseptoria tritici, wherein a PCR reaction with a pair of primers amplifies a specific DNA fragment followed by detection of the resulting product, characterized in that the primer pair is oligonucleotide primers as defined in claim 1. 1.