Opis wynalazku

DZIEDZINA TECHNIKI

Przedmiotem wynalazku jest sposób utrwalania mleka kobiecego, który daje możliwość ilościowego ograniczania i likwidacji patogenów mleka kobiecego bez uszkodzenia białek i czynników bioaktywnych zawartych w tymże mleku. Przedmiotem wynalazku jest również mleko kobiece utrwalane tym sposobem.

STAN TECHNIKI

Spośród stosowanych obecnie metod utrwalania mleka kobiecego najczęstszą jest obróbka termiczna (pasteryzacja, sterylizacja). Ten sposób utrwalania redukuje poziom mikroorganizmów, jednak może wywoływać degradację cennych składników, takich jak m.in. przeciwciała, enzymy i witaminy.

Celem w dziedzinie jest zatem stosowanie takiej technologii przetwarzania, która oprócz bezpieczeństwa mikrobiologicznego pozwoliłaby zachować naturalne lub stworzyć nowe, korzystne cechy jakościowe produktu, takich jak, np. bioaktywność lub trwałość, przy jednoczesnym zminimalizowaniu niepożądanych zmian wywołanych obróbką.

Jedną ze stosowanych technik jest oddziaływanie wysokim ciśnieniem, zwane presuryzacją, paskalizacją, obróbką wysokociśnieniową czy ciśnieniowaniem. Technika wysokich ciśnień hydrostatycznych (HPP), będąca nowoczesną technologią utrwalania i zachowania cech sensorycznych żywności, może być alternatywą dla obróbki termicznej wielu produktów spożywczych, jak również mleka kobiecego.

Zastosowanie wysokiego ciśnienia hydrostatycznego w przemyśle mleczarskim znane jest od początku naszego wieku i dotyczyło przede wszystkim efektywnego procesu mieszania mleka, czyli homogenizacji, z wykorzystaniem tłoka wytwarzającego podciśnienie. Bardziej nowoczesne zastosowania HPP w przemyśle mleczarskim dotyczą już możliwości niszczenia szkodliwych mikroorganizmów. Kolejne lata zeszłego wieku przyniosły rozwiązania pozwalające otrzymać żywność o zadanej czystości mikrobiologicznej i zachowanej wartości odżywczej oraz walorach smakowych.

Aktualnie na rynku australijskim pojawił się w sprzedaży produkt mleczarski poddawany wysokim ciśnieniom, bez dodatkowej obróbki termicznej.

Zastosowanie tej technologii w odniesieniu do pokarmu kobiecego wiąże się z rozwojem banków mleka i koniecznością zapewnienia czystości mikrobiologicznej i wartości terapeutycznej zgromadzonego w nich pokarmu kobiecego. Pierwsze doniesienia na temat możliwości uzyskania czystego mikrobiologicznie mleka kobiecego po ciśnieniowaniu pochodzą z początku XXI wieku (J Food Prot. 2008 Jan; 71(1):109-18. Inactivation of bacterial pathogens in human milk by high-pressure processing. Viazis S, Farkas BE, Jaykus LA, High pressure processing of human milk for improved nutrient retention and microbal safety. Master Thesis North Carolina State University, 2006). W kolejnych pracach wykazano, że zastosowanie wysokiego ciśnienia pozwala na zachowanie także cennych składników mleka kobiecego z punktu widzenia terapii najmłodszych pacjentów (Moltó-Puigmartf C, Permanyer M, Castellote Al, López-Sabate MC. Effects of pasteurization and high-pressure processing on on vitamin C, tocopherols and fatty acids in mature human milk. Food Chemistry. 2011:124 (3): 697-702, Viazis S, Farkas BE, Allen JC. Effects of High-Pressure Processing on Immunoglobulin A and Lysozyme Activity in Human Milk. J Hum Lact. 2007; 23(3): 253-261, Permanyer, M., Castellote, C., Ramirez-Santana, C., Audi, C., Perez-Cano, F. J., Castell, M., Lopez-Sabater, M. C. i Franch, A. (2010). Maintenance of breast milk immunoglobulin A after high-pressure processing. J Dairy Sci. 93(3):877-883).

Uzyskanie czystego mikrobiologicznego pokarmu kobiecego, o zachowanej aktywności biologicznej, daje możliwość wdrożenia do praktyki klinicznej żywienia pacjentów gatunkowo specyficznym mlekiem, nawet wtedy gdy matka nie ma wystarczającej ilości mleka lub jej pokarm nie zapewnia potrzeb żywieniowych dziecka. Postępowanie takie polega na suplementacji mleka matczynego mlekiem z banku mleka lub wzmacnianiu mleka własnej matki specjalnymi preparatami o znanej wartości energetycznej i zawartości składników odżywczych (tzw. wzmacniacze „fortifiers”). W działających obecnie bankach mleka (ponad 230 placówek w Europie) stosuje się utrwalanie temperaturą - metodą holder (ang. Iow temperaturo long time, LTLT) polegającą na inkubacji próbek mleka w temperaturze 62,5°C przez 30 minut. Temperatura mierzona jest wewnątrz próbki testowej, a jej utrzymanie zapewnia termostat, przy czym medium zapewniającym przepływ ciepła jest woda lub powietrze. Czas trwania procesu pasteryzacji liczony jest od momentu osiągnięcia zadanej temperatury w próbie końcowej i trwa około 40 minut. Po 30 minutach inkubacji następuje gwałtowne chłodzenie do temperatury 4°C (Wills M.,

PL 238 537 B1

Han V., Harris D., Baum J. (1982). Short-time low-temperature pasteurisation of human milk Early human development 7:71-80). W ten sposób zapewniona jest czystość mikrobiologiczna produktu, ale obserwowane są też liczne straty w jego wartości odżywczej i terapeutycznej. Nieco lepsze wyniki pod tym względem uzyskuje się skracając czas inkubacji do kilkunastu sekund (15 sek.) i podwyższając temperaturę do 75°C (ang. high temperature short time, HTST). Technika holder jest jednak wciąż najbardziej popularną metodą sterylizacji pokarmu matczynego w szpitalach (PeilaCh,Moro GE, Bertino E. The Effect of Holder Pasteurization on Nutrients and Biologically-Active Components in Donor Human Milk: A Review. Nutrients 2016, 8, 477; 2-19).

Dostępne na rynku europejskim wzmacniacze wytwarzane są z mleka krowiego. Wyjątkiem jest rynek Stanów Zjednoczonych, na którym dostępne są wzmacniacze firmy Prolacta Bioscience, pochodzące z mleka kobiecego utrwalonego metodą przy zastosowaniu wysokiej temperatury (HTST). Choć ten rodzaj utrwalania prowadzi do znacznych spadków jakości wyjściowego materiału do produkcji wzmacniaczy, badania kliniczne pokazują, że dieta oparta wyłącznie na mleku kobiecym, dodanym jako suplement do mleka matki lub wzmacniacz, przynosi znaczne korzyści kliniczne w grupie najbardziej niedojrzałych wcześniaków (Quigley M, McGuire W. Formula milk versus donor breast milk for feeding preterm or low birth weight infants. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014; Issue 4. Art. No.: CD002971, Kantorowska A, Wei JC, Cohen RS.et. al. Impact of donor milk availability on breast milk use and necrotizing enterocolitis rates. Pediatrics. 2016;137:1-8., Cristofalo EA, Schanler RJ, Blanco CL, Sullivan S. et al. Randomized trial of exclusive human milk versus pre-term formula diets in extremely premature infants. J Pediatr. 2013; 163. 1592-5).

W stanie techniki znane są procesy utrwalania mleka kobiecego z zastosowaniem wysokich ciśnień.

W publikacji Demazeau, Gerard et al. “A New High Hydrostatic Pressure Process to Assure the Microbial Safety of Human Milk While Preserving the Biological Activity of Its Main Components” Frontiers in public health vol. 6 306 z 6 listopada 2018 opisano proces utrwalania mleka kobiecego z pomocą wysokich ciśnień. Stosowano ciśnienie 350 MPa w temperaturze wyjściowej 38°C, z szybkością dekompresji 1 MPa.s^-1 w 4 cyklach po 5 min, z interwałami po 5 min przy ciśnieniu atmosferycznym. Wykazano dobre wyniki w usuwaniu szkodliwych mikroorganizmów (w tym przetrwalników) z równoczesnym dosyć dobrym zachowywaniem aktywności biologicznej składników mleka. Niemniej jednak, wskazano na pewną wadę jaką jest czas procesu (ok. 90 min.) w połączeniu z wysokimi kosztami urządzeń.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe US 2015/0289530 A1 ujawnia sposób traktowania mleka kobiecego, obejmujący proces mający na celu unieczynnienie czynników patogennych i poprawę możliwości przechowywania mleka. W zgłoszeniu tym opisano sposób, który obejmuje poddawanie mleka kobiecego co najmniej dwóm impulsom ciśnienia w zakresie 200 do 400 MPa, przy szybkości dekompresji wynoszącej między 0,5 a 100 MPa/s, przy temperaturze początkowej wynoszącej między 25°C; a 50°C.

W publikacji Wesolowska Aleksandra, Sinkiewicz-Darol Elena, Barbarska Olga, Strom Kamila Rutkowska Malgorzata, Karzel Katarzyna, Rosiak Elzbieta, Oledzka Gabriela, Orczyk-Pawiłowicz Magdalena, Rzoska Sylwester, Borszewska-Kornacka Maria Katarzyna, 2018 New Achievements in HighPressure Processing to Preserve Human Milk Bioactivity. Frontiers in Pediatrics, ujawniono sposób traktowania mleka kobiecego wysokim ciśnieniem, w wariantach: (1) 600 MPa przez 10 minut; (2) 100 MPa przez 10 minut, przerwa 10 minut, 600 MPa przez 10 minut; (3) 200 MPa przez 10 minut, przerwa 10 minut, 400 MPa przez 10 minut; (4) 200 MPa przez 10 minut, przerwa 10 minut, 600 MPa przez 10 minut; w temperaturze 19-21°C. Wykazano, że w dwóch spośród czterech stosowanych wariantów, odpowiednio 200 MPa+400 MPa i 600 MPa, uzyskano zadowalającą czystość mikrobiologiczną tak traktowanego mleka (brak bakterii tlenowych mezofilnych oraz Staphylococcus aureus; nie prowadzono jednakże badań na mleku fortyfikowanym, a tylko na florze natywnej), jednakże jedynie wariant z dwoma cyklami, odpowiednio, w 200 MPa i 400 MPa zapewniał zachowanie wysokiego poziomu aktywności biologicznej, w tym ograniczenie spadku poziomu IgG, laktoferyny, leptyny, HGF i insuliny, IL-6 i erytropoetyny. Spadek zawartości adiponektyny obserwowano we wszystkich wariantach, chociaż najsłabszy w wariancie 200 MPa i 400 MPa.

Twórcy niniejszego wynalazku opracowali nowy sposób obróbki mleka kobiecego, który jest szybszy od znanych w stanie techniki i wymaga mniejszych nakładów energetycznych, ale nieoczekiwanie pozwala na otrzymanie mleka, które jest bezpieczne mikrobiologicznie, a jednocześnie zachowuje bardzo dobre właściwości biologiczne.

PL 238 537 B1

Niniejszy wynalazek dotyczy więc sposobu utrwalania mleka kobiecego, obejmującego etap traktowania mleka podwyższonym ciśnieniem, przy czym wartość ciśnienia zawiera się w zakresie między 400-550 MPa, temperatura zawiera się w zakresie od 15°C do 35°C, a proces traktowania mleka ciśnieniem jest jednoetapowy - stosowany jest jedynie pojedynczy impuls ciśnienia, przy jednoczesnym zastosowaniu czasu dekompresji w zakresie od 80 ms do 1 s.

Przedmiotem wynalazku jest więc sposób utrwalania mleka kobiecego, obejmujący etap traktowania mleka podwyższonym ciśnieniem, w którym wartość ciśnienia zawiera się w zakresie pomiędzy 400 a 550 MPa, temperatura zawiera się w zakresie od 15°C do 35°C, przy czym etap traktowania mleka obejmuje traktowanie mleka jedynie pojedynczym impulsem ciśnienia z czasem dekompresji zawartym w zakresie od 80 ms do 1 s.

Szybka dekompresja (tj. w zakresie od 80 ms do 1 s) stosowana w sposobie według wynalazku zapewnia szczególnie skuteczne działanie eliminujące mikroorganizmy (umożliwiając potencjalnie redukowanie stosowanych ciśnień i skracanie czasu procesu), ale nieoczekiwanie, nie prowadzi do znaczącego zmniejszenia aktywności biologicznej.

Twórcy potwierdzili, że przy zastosowaniu ciśnienia w zakresie 400-550 MPa uzyskuje się doskonałą czystość mikrobiologiczną tak traktowanego mleka, pomimo zastosowania tylko pojedynczego cyklu traktowania ciśnieniem. Co zaskakujące, sposób według wynalazku pozwala na taką samą redukcję poziomów mikroorganizmów patogennych, przy zachowaniu znacznie większej bioaktywności, niż znane w stanie techniki sposoby ciśnieniowania. Nie wiążąc się z żadną teorią można stwierdzić, że bardzo istotny dla sposobu według wynalazku jest krótki czas dekompresji następujący po zakończeniu ciśnieniowania. Nie jest konieczne również jednoczesne stosowanie wysokich temperatur. Równocześnie, sposób według wynalazku zapewnia mleko kobiece o bardzo korzystnych właściwościach biologicznych, ponieważ zachowana jest biologicznie czynna postać istotnych cząsteczek biologicznych, takich jak białka, np. HGF, insuliny, leptyny i/lub lipazy, IL-6, erytropoetyny.

W korzystnym przykładzie wykonania, wartość ciśnienia zawiera się w zakresie 430-550 MPa, korzystniej 450-500 MPa, szczególnie korzystnie 450 MPa.

W korzystnym przykładzie wykonania, temperatura zawiera się w zakresie między 15 a 30°C, bardziej korzystnie między 20 a 25°C, a najbardziej korzystnie wynosi 21 °C.

W korzystnym przykładzie wykonania, czas dekompresji zawiera się zakresie między 87-93 ms, a korzystniej czas dekompresji wynosi 90 ms.

W korzystnym przykładzie wykonania, czas traktowania mleka podwyższonym ciśnieniem zawiera się między 5 a 25 minut, korzystnie między 7 a 20 minut, bardziej korzystnie między 10 a 15 minut, a najbardziej korzystnie czas traktowania mleka podwyższonym ciśnieniem wynosi 15 minut.

Korzystnie, sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje etap liofilizacji.

Korzystnie, sposób pozwala na uzyskanie mleka, dla którego okres przechowywania wynosi co najmniej 3 miesiące w temperaturze od -18°C do 25°C.

Przedmiotem wynalazku jest również mleko kobiece utrwalone sposobem według wynalazku, przy czym mleko wykazuje obecność HGF na poziomie co najmniej 70% zawartości w mleku surowym i/lub insuliny na poziomie co najmniej 90% zawartości w mleku surowym i/lub leptyny na poziomie co najmniej 90% zawartości w mleku surowym i/lub lipazy na poziomie co najmniej 70% zawartości w mleku surowym, a jednocześnie mleko nie wykazuje obecności lub wykazuje poziom poniżej 101 jtk/ml mikroorganizmów z gatunków E. coli i/lub S. aureus i/lub L. monocytogenes i/lub C. sakazakii.

W szczególnie korzystnej postaci wykonania, mleko według wynalazku jest liofilizowane.

DEFINICJE

Określenie „mleko” odnosi się do wydzieliny wytwarzanej przez gruczoły mleczne kobiet i samic zwierząt, o właściwym sobie kolorze, będącego pokarmem dla nowonarodzonego potomstwa.

Przez określenie „liofilizacja” rozumie się suszenie sublimacyjne zamrożonych substancji. W odniesieniu do „żywności liofilizowanej” określenie dotyczy żywności konserwowanej sposobem liofilizacji, czyli suszenia po zamrożeniu z zastosowaniem próżni.

Określenie „podwyższone ciśnienie” w rozumieniu niniejszego wynalazku oznacza ciśnienie wyższe niż atmosferyczne, np. w zakresie kilkuset MPa, np. 10-600 MPa, korzystnie, w sposobie według wynalazku 400-550 MPa.

Określenie „miano bakterii” odnosi się do liczby bakterii w danej objętości i mierzone jest jednostkami tworzącymi kolonie (jtk/ml).

„Czystość mikrobiologiczna” w rozumieniu niniejszego wynalazku oznacza brak wykrywalnej obecności lub odpowiednio niski poziom patogenów, np. mikroorganizmów z gatunków E. coli i/lub

PL 238 537 B1

S. aureus i/lub L. monocytogenes i/lub C. sakazakii w mleku utrwalonym. Przykładowo, dopuszczalna liczba bakterii wynosi <10² jtk/ml, korzystniej <10¹ jtk/ml, liczba gronkowców koagulazododatnich wynosi np. <101 jtk/ml oraz liczba bakterii z grupy E. coli wynosi np. <101 jtk/ml.

„Mleko surowe” oznacza mleko nie poddane obróbce termicznej w podwyższonej temperaturze ani ciśnieniowej, a więc mleko nie poddane procesowi pasteryzacji, paskalizacji itp.

„Mleko fortyfikowane” oznacza mleko celowo zakażane mikroorganizmami w celu wykonania analiz czystości mikrobiologicznej w warunkach obciążenia znanym mianem bakterii.

KRÓTKI OPIS FIGUR RYSUNKU

FIG. 1 przedstawia zawartość HGF (A), insuliny (B), leptyny (C) i adiponektyny (D) w mleku kobiecym traktowanym ciśnieniem, metodą holder lub nietraktowanym (surowym). Wartości dla mleka surowego przyjęto jako 100%.

FIG. 2 przedstawia aktywność enzymatyczną lipazy przedstawioną jako % aktywności w mleku surowym.

FIG. 3 odnosi się do zawartości adiponektyny (A), leptyny (B), insuliny (C), HGF (D), laktoferyny (E) oraz IgG (F) w mleku kobiecym traktowanym ciśnieniem, metodą holder lub nietraktowanym (surowym). Wartości dla mleka surowego przyjęto jako 100%.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Niniejszy wynalazek umożliwia pozyskanie utrwalonego mleka kobiecego, o określonych parametrach czystości mikrobiologicznej (korzystnie, całkowity brak wykrywalnej obecności lub odpowiednio niski poziom patogenów, np. mikroorganizmów z gatunków E. coli i/lub S. aureus i/lub L. monocytogenes i/lub C. sakazakii w mleku utrwalonym, np. poniżej 10¹ jtk/ml), w którym zachowana jest jednak aktywność biologiczna komponentów mleka.

Próbki mleka poddawano działaniom wysokiego ciśnienia w zakresie 400-550 MPa, przykładowo o wartości 450 MPa np. w czasie 15 minut, np. w temperaturze początkowej 20°C, w następujących kontrolowanych parametrach procesu:

• temperatura medium wewnątrz komory ciśnieniowej, • profil ciśnienia, w tym jego stałej wartości przy zadanym ciśnieniu procesu, • profil czasowego narastania i zaniku ciśnienia, wraz z możliwością jego gwałtownego zaniku w czasie rzędu 0,1 s.

W wyniku procesu utrwalania otrzymano materiał o zachowanej wartości terapeutycznej, ocenianej przy zastosowaniu detekcji, niezmienionej w stosunku do mleka nietraktowanego stężeń, następujących czynników: insuliny, leptyny, IL-6, erytropoetyny, HGF, lipazy. Wybrane czynniki stanowią istotne z punktu widzenia znaczenia terapeutycznego składniki mleka, które wspierają rozwój tkanki jelit i wpływają dobroczynnie na proces trawienia poprzez regulację hormonalną.

Zastosowanie ciśnienia o wartości w zakresie 400 MPa-550 MPa, korzystniej 430-550 MPa, korzystniej 450-500 MPa, szczególnie korzystnie 450 MPa w układzie jednoimpulsowym pozwalało nieoczekiwanie uzyskać inaktywację celowo wprowadzanych do mleka bakterii S. aureus rzędu 5 rzędów logarytmicznych. Ponadto, co warte jest podkreślenia, przez 24 godziny od przeprowadzenia procesu ciśnieniowania, utrzymywał się efekt braku wytwarzania koagulazy przez badane szczepy S. aureus.

Ciśnieniowanie mleka kobiecego sposobem według niniejszego wynalazku przeprowadza się przy użyciu procesora wytwarzającego wysokie ciśnienie. Urządzenie takie jest znane w dziedzinie i może składać się z komory wysokociśnieniowej, systemu zamykania komory (najczęściej korków wzmocnionych poprzez ramę urządzenia), systemu tłoczącego medium przenoszące ciśnienie poprzez kapilary oraz systemu sterowania i kontroli procesu. Bardzo ważnym elementem układu procesowego jest system stabilizacji temperatury, który umożliwia ciśnieniowanie w stabilnych, powtarzalnych warunkach. Materiał poddawany procesowi pasteryzacji wysokim ciśnieniem musi być umieszczony w szczelnym, elastycznym opakowaniu, umożliwiającym przeniesienie ciśnienia na materiał, w tym wypadku, na mleko kobiece. Opakowanie może stanowić butelka polimerowa lub kompozytowa, woreczek polimerowy gazoszczelny zamykany na korek, lub zgrzewany. Następnie, materiał w opakowaniu umieszczany jest w komorze ciśnieniowej. Po zamknięciu komory rozpoczyna się proces ciśnieniowania według wcześniej założonych parametrów. Kluczowe są szybkie zmiany ciśnienia, które najefektywniej wpływają na błony komórkowe patogenów. Minimalny czas przetrzymania, który umożliwia poprawę parametrów wynosi 10 minut w maksymalnym zadanym ciśnieniu.

Po procesie ciśnieniowania opakowania są myte z zewnątrz, a następnie przetrzymywane w temperaturze poniżej 20°C.

PL 238 537 B1

Utrwalanie sposobem według niniejszego wynalazku realizowano w procesorze wysokociśnieniowym. Dodatkowo opracowano zabezpieczenie, uniemożliwiające wnikanie obcych ciał stałych do systemu procesora, polegające na sterylizacji układu poprzez dodatkowy cykl paskalizacji mający na celu oczyszczenie medium przed właściwym procesem.

W wyniku przeprowadzonych analiz wykazano, że ciśnieniowanie w impulsach (200 MPa 10 minut / przerwa 10 minut / +400 MPa 10 minut oraz 200 MPa 10 minut/ przerwa 10 minut/ +100 MPa przez 10 minut, oraz 400/200 MPa przez 10 minut) nie jest skuteczne dla eliminacji mikroflory bakteryjnej w mleku poddanym fortyfikacji, tj. zakażonym znaną liczbą mikroorganizmów. Poddanie mleka kobiecego ciśnieniom o wartości 600 MPa przez 10 minut nie gwarantuje natomiast detekcji wystarczających stężeń składników o charakterze hormonów i czynników bioaktywnych.

Nieoczekiwanie wykazano natomiast, że mleko utrwalane przy zastosowaniu metody wysokich ciśnień w wariancie w zakresie ciśnień 400-550 MPa, przez stosunkowo krótki okres, np. przez 15 minut i szczególnie korzystnie przy wartości ciśnienia 450 MPa np. przez 15 minut, zachowuje wysokie stężenie składników bioaktywnych, jak również składników o charakterze hormonów i równocześnie zapewnia eliminację patogennych mikroorganizmów. Co zaskakujące, wystarczające jest zastosowanie pojedynczego cyklu traktowania ciśnieniem. Szczególnie korzystne jest stosowanie pojedynczego cyklu przy wartości ciśnienia wynoszącej około 450 MPa, jednakże efekt eliminacji obecnych w mleku mikroorganizmów, zachowania właściwości bakteriostatycznych mleka i zachowania aktywności biologicznej białek przy stosowaniu jedynie pojedynczego cyklu traktowania ciśnieniem uzyskuje się przy ciśnieniu w zakresie 400-550 MPa.

PRZYKŁADY WYKONANIA

P r z y k ł a d 1

Ciśnieniowanie mleka kobiecego

Ciśnieniowanie mleka kobiecego przeprowadzano przy użyciu procesora wytwarzającego wysokie ciśnienie. Urządzenie U4000/65 (Unipress Equipment, Polska), o czynnej objętości do V=2I, obejmuje komorę wysokociśnieniową (0,95 I), system zamykania komory, system tłoczący medium przenoszące ciśnienie poprzez kapilary oraz system sterowania i kontroli procesu. Medium przenoszącym ciśnienie jest mieszanina wody i poli(glikolu propylenowego) w proporcji 1:1. Bardzo ważnym elementem układu procesowego jest system stabilizacji temperatury, który umożliwia ciśnieniowanie w stabilnych, powtarzalnych warunkach. Stosowano zabezpieczenie, uniemożliwiające wnikanie obcych ciał stałych do systemu procesora polegające na sterylizacji układu poprzez dodatkowy cykl paskalizacji, mający na celu oczyszczenie medium przed właściwym procesem.

Materiał poddawany procesowi pasteryzacji wysokim ciśnieniem umieszczano w szczelnym, elastycznym opakowaniu, o objętości kilkunastu ml3, umożliwiającym przeniesienie ciśnienia na materiał pasteryzowany, w tym wypadku, mleko kobiece. Opakowanie może stanowić butelka polimerowa lub kompozytowa, woreczek polimerowy gazoszczelny zamykany na korek, lub zgrzewany. Następnie, materiał w opakowaniu umieszczano w komorze ciśnieniowej. Po zamknięciu komory rozpoczynano proces ciśnieniowania według wcześniej założonych parametrów. Kluczowe są szybkie zmiany ciśnienia, które najefektywniej wpływają na błony komórkowe patogenów. Minimalny czas przetrzymania, który umożliwia poprawę parametrów wynosi 10 minut w maksymalnym zadanym ciśnieniu.

Temperatura wyjściowa znajdowała się w zakresie 19-21°C.

Po procesie ciśnieniowania opakowania myto z zewnątrz, a następnie przetrzymywano w temperaturze poniżej 20°C.

Do badań stosowano różne warianty wysokości ciśnienia, czasu procesu i liczby impulsów (cykli). Traktowane mleko poddawano badaniom mikrobiologicznym (w tym badaniom mleka fortyfikowanego) (Przykład 2 pkt A, C, D) oraz badaniom aktywności bakteriostatycznej (Przykład 2 pkt B) oraz badaniom zawartości biologicznie czynnych białek (Przykład 3).

Liofilizacja mleka

Proces liofilizacji mleka kobiecego, polegający na wymrażaniu wody na drodze sublimacji lodu, przeprowadzono poprzez zamrożenie świeżego surowca płynnego do -20°C, a następnie liofilizację w temp 30-40°C w próżni. Proces liofilizacji prowadzono w czasie od 24 godz. do 72 godz. w warunkach próżniowych. Próżnię osiągnięto przy użyciu pomp oraz freonu. W wyniku przeprowadzonego procesu uzyskano suchy produkt, w postaci proszku.

PL 238 537 B1

P r z y k ł a d 2

Badania mikrobiologiczne mleka kobiecego poddawanego wysokim ciśnieniom i liofilizacji

A) Mleko traktowane ciśnieniem (pojedynczy impuls ciśnienia 450 MPa, 15 minut) i/lub liofilizowane. Badania czystości mikrobiologicznej.

Próbki mleka kobiecego pobrano od 5 dawczyń, następnie przechowywano w jałowych butelkach polistyrenowych w temperaturze - 20°C. Do doświadczenia użyto próbek mleka rozmrożonego. Mleko łączono w pule o takiej samej objętości od każdej z dawczyń (1600 ml x 5) do końcowej objętości 8000 ml mleka surowego. Do badań mikrobiologicznych wykorzystano 7700 ml mleka. Pozostałe 300 ml stanowiło zapas.

Z ogólnej puli 7700 ml łączonego w pulę mleka surowego, 100 ml pozostawiono do analiz mikrobiologicznych, w celu badania obecności bakterii saprofitycznych oraz potencjalnych patogenów przenoszonych przez żywność.

Badania mikrobiologiczne wykonano zgodnie z europejskimi normami badania produktów żywnościowych, w kierunku: ogólnej liczby bakterii tlenowych, mezofilnych (Plate Agar Count, Merck, EN:ISO 4833:2004), gram-ujemnych bakterii jelitowych E. coli z rodziny Enterobacteriaceae (Crystal-Violet Neutral Red Bile Glucose Agar, EN:ISO 21528:2017), koagulazo-dodatnich gronkowców St aphylococcus aureus (Baird Parker Agar, EN:ISO6888-3:2004), gram-dodatnich pałeczek Listeria monocytogenes (Fraser Broth, EN:ISO 11290:2:2017-2), gram-ujemnych pałeczek Cronobacter sakazakii (ESIA Agar, EN:ISO TS 22964:2017), bakterii przetrwalnikujących Bacillus cereus (MYP Agar, EN:ISO7932:2004). Analizy mikrobiologiczne mleka surowego wykonano w ciągu 30 min od łączenia w pule. Mleko przechowywano w temperaturze 4°C.

Pozostałą objętość łączonego w pule (7600 ml) mleka surowego poddano standardowemu procesowi pasteryzacji długotrwałej w 63°C przez 30 min, w sterylnych butelkach polistyrenowych.

100 ml łączonego w pule mleka pasteryzowanego poddano analizom mikrobiologicznym, pod względem czystości bakteriologicznej mleka, a tym samym kontroli procesu pasteryzacji. W tym celu wykonano pakiet badań dla wykrycia ogólnej liczby bakterii oraz potencjalnych patogenów, zgodnie ze schematem: ogólna liczba bakterii tlenowych, mezofilnych (Plate Agar Count, Merck, EN:ISO 4833:2004), E. coli(Crystal-Violet Neutral Red Bile Glucose Agar, EN:ISO 21528:2017.), Staphylococcus aureus (Baird Parker Agar, EN:ISO 6888-3:2004.), Listeria monocytogenes (Fraser Broth, EN:ISO 11290:2:2017-2), Cronobacter sakazakii (ESIA Agar, EN:ISO TS 22964:2017), Bacillus cereus (MYP Agar, EN:ISO 7932:2004.). Badania mikrobiologiczne wykonano w ciągu 30 min od zakończenia procesu pasteryzacji. Mleko przechowywano w temperaturze 4°C.

Przygotowanie szczepów bakteryjnych

Szczepy bakteryjne przechowywano w temperaturze - 20°C w 20% glicerolu oraz w kriobankach (Argenta). Hodowle szczepów wzorcowych prowadzono w podłożu płynnym Brain Heart Infusion BHI (Oxoid) w temperaturze 37°C przez 24 godz. Następnie wykonano posiewy kontrolne wzrostu szczepów, z hodowli płynnych na podłoża stałe selektywne, zalecane zgodnie z europejskimi normami badań mikrobiologicznych żywności EN:ISO: E. coli(Crystal-Violet Neutral Red Bile Glucose Agar, E. coliChromogenic Medium, 37°C, 24 godz.), S. aureus (Baird Parker Agar, 37°C, 24 godz., BHI Broth 37°C, 24 godz., Koagulaza), L. monocytogenes (Half Fraser Broth 30°C, 24 godz., Faser Broth 37°C, 48 godz, Chromogenic Listeria 37°C, 24 godz., Palcam 37°C, 24 godz., TSEYA Agar 37°C, 48 godz.,

Ramnosa/Ksyloza test, Blood Agar 37°C, 24 godz.), Cronobacter sakazakii (CBS Broth 44°C, 24 godz., ESIA Agar 44°C, 24 godz., TSA Agar 37°C, 24 godz.), Bacillus cereus (MYP Agar, Blood Agar, 37°C, 24 godz.).

Kontaminacja łączonego w pule mleka pasteryzowanego

Pozostałe 7500 ml łączonego w pule mleka pasteryzowanego przechowywano w temperaturze 4°C. Ogólną objętość podzielono na 5 równych frakcji po 1500 ml. Każda porcja mleka została poddana kontaminacji przez bakterie przenoszone przez żywność, w tym mleko kobiece.

Inokulację próbek łączonego w pule mleka pasteryzowanego prowadzono w ciągu 30 min od zakończenia procesu pasteryzacji. Do doświadczenia wybrano patogeny mogące wywoływać u noworodków i niemowląt zakażenia przewodu pokarmowego, oddechowego, skóry, a także ciężkie zakażenia ogólnoustrojowe, w tym zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i posocznice. Zastosowano szczepy referencyjne czterech gatunków bakterii nieprzetrwalnikujących: Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 33862), Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Cronobacter sakazakii (ATCC 51329) oraz jeden gatunek bakterii przetrwalnikujących Bacillus cereus (ATCC 14579). Szczepy

PL 238 537 Β1 sprawdzone pod względem charakterystycznego wzrostu, inkubowano w 500 ml płynnego podłoża BHI w 37°C przez 24 godz. Wzrost bakterii w bulionie określono pomiarem gęstości optycznej hodowli metodą spektrofotometryczną przy długości fali 600 nm. Poszczególnymi hodowlami bakterii zaszczepiono odrębne próbki mleka pasteryzowanego do ostatecznej ilości 10⁶ jtk bakterii w 1 ml mleka. Zakażone mleko inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 godz., do fazy równowagi wzrostu. Po inkubacji z każdej próbki mleka inokulowanego wykonano kontrolne posiewy mikrobiologiczne na podłoża namnażające i selektywne, zgodnie z w/w normami.

Badania czystości mikrobiologicznej mleka po paskalizacji i liofilizacji

Po zakończonej inkubacji szczególne próbki mleka inokulowanego poddawano trzem procesom: paskalizacji (HPP), liofilizacji (LIO) oraz paskalizacji i następnie liofilizacji (HPP+LIO).

Proces paskalizacji (traktowania ciśnieniem) prowadzono sposobem według niniejszego wynalazku o wartości ciśnienia 450 MPa w czasie 15 minut, w temperaturze początkowej ok. 20°C, profil czasowego narastania i zaniku ciśnienia, wraz z możliwością szybkiej dekompresji w czasie rzędu 0,1 s. Paskalizację prowadzono w komorze Urządzenie U4000/65 (Unipress Equipment, Polska).

Proces liofilizacji mleka kobiecego, polegający na wymrażaniu wody na drodze sublimacji lodu, przeprowadzono poprzez zamrożenie świeżego surowca płynnego do -20°C, a następnie liofilizację w temp 30-40°C w próżni. Proces liofilizacji prowadzono w czasie od 24 godz. do 72 godz. w warunkach próżniowych. Próżnię osiągnięto przy użyciu pomp oraz freonu. W wyniku przeprowadzonego procesu uzyskano suchy produkt, w postaci proszku. Proces prowadzono w aparacie próżniowym TG-30 (Niemcy).

Dla każdego procesu i każdego szczepu bakterii wykonano doświadczenia w pięciu powtórzeniach ([5 x 100 ml] x 15]). Dla każdego z wariantów wykonano analizy mikrobiologiczne po zastosowanym procesie fizycznym. W celu określenia liczby poszczególnych drobnoustrojów w próbkach, wykonano posiew na podłoża płynne oraz stałe, namnażające i selektywne. Posiewy próbek mleka wykonano zgodnie z europejskimi normami badania produktów żywnościowych, w kierunku: ogólnej liczby bakterii tlenowych, mezofilnych (Platę Agar Count, Merck, EN:ISO 4833^-2004), gram-ujemnych bakterii jelitowych E. coli z rodziny Enterobacteriaceae (Crystal-Violet Neutral Red Bile Glucose Agar, Coliform Chromagar, EN:ISO 21528^-2017.), koagulazo-dodatnich gronkowców Staphylococcus aureus (Baird Parker Agar, BHI Broth, Koagulaza, EN:ISO6888-3h-2004), gram-dodatnich pałeczek Listeria monocytogenes (Half Fraser Broth, Fraser Broth, Chromogenie Listeria, Palcam, TSEYA Agar, Ramnosa/Ksyloza test, Blood Agar, EN:ISO 11290^-2:2017-2), gram-ujemnych pałeczek Cronobacter sakazakii (CBS,ESIA Agar, TSA Agar, EN:ISO TS 22964^-2017), bakterii przetrwalnikujących Bacillus cereus (MYP Agar, EN:ISO7932h-2004). Po wykonaniu poszczególnych procesów fizycznych próbki mleka wstępnie rozcieńczano w wodzie peptonowej oraz wykonano wstępne namnażanie bakterii na podłożach płynnych. Posiewy na podłoża selektywne i różnicujące wykonano metodą seryjnych rozcieńczeń, w celu oznaczenia liczby bakterii w 1 ml badanej próbki (jtk/ml). Posiewy mikrobiologiczne mleka po HPP wykonano w ciągu 10 godz. od zakończenia procesu paskalizacji. Badania mleka po LIO oraz HPP+LIO wykonano zgodnie z harmonogramem prac. Do czasu wykonania badań mleko przechowywano w temperaturze 4°C.

Wyniki

Poniżej, w Tabeli 1 przedstawiono miano bakterii (log jtk/ml) w mleku traktowanym po dodaniu inokulum i w tym samym mleku po poddaniu pasteryzacji sposobem według niniejszego wynalazku o wartości ciśnienia 450 MPa w czasie 15 minut, w temperaturze początkowej 20°C, profil czasowego narastania i zaniku ciśnienia, wraz z możliwością jego gwałtownego zaniku w czasie rzędu 0,1 s. Tabela 1. Wyniki mikrobiologicznych testów obciążeniowych dla mleka kobiecego poddawanego paskalizacji (450 MPa, 15 minut).

	S. aureus	E. coli	L. monocytogenes	C. sakazakii
Miano bakterii [log jtk/ml]
przed procesem	6,15	7,07	7,91	5,74
po procesie	0	0	0	0

PL 238 537 Β1

Zastosowanie utrwalania metodą wysokich ciśnień w wariancie ciśnienia 450 MPa przez 15 minut, w połączeniu z następującym po nim procesem liofilizacji powodowało całkowite zniszczenie form wegetatywnych S. aureus, E coli, L. monocytogenes oraz C sakazakii (tabela 2).

Tabela 2. Wyniki mikrobiologicznych testów obciążeniowych dla mleka kobiecego poddawanego paskalizacji (450 MPa, 15 minut) i liofilizacji.

	S. aureus	E. coli	L. monocytogenes	C. sakazakii
Miano bakterii [log jtk/ml]
przed procesem	6,15	7,07	7,91	5,74
po procesie	0	0	0	0

Wykazano, że przeprowadzenie jedynie procesu liofilizacji nie wykazywało wymaganej skuteczności pod względem czystości mikrobiologicznej. Jedynie w przypadku C. sakazakii wykazano całkowite zniszczenie form wegetatywnych. Wyniki przedstawiono w Tabeli 3 poniżej.

Tabela 3. Wyniki mikrobiologicznych testów obciążeniowych dla mleka kobiecego poddawanego liofilizacji

	S. aureus	E. coli	L. monocytogenes	C. sakazakii
Miano bakterii [log jtk/ml]
przed procesem	6,15	7,07	7,91	5,74
po procesie	5,52	4,28	7,41	0

B) Mleko traktowane ciśnieniem i mleko traktowane metoda holder. Badanie właściwości bakteriostatycznych

W celu określenia właściwości bakteriobójczych wykorzystano następujące próbki doświadczalne:

• mleko surowe (niepoddane procesom utrwalania), • mleko poddane tradycyjnej metodzie parteryzacji (metoda holdera), • mleko poddane metodzie pasteryzacji za pomocą wysokich ciśnień w warunkach 450 MPa, 15 minut.

Do przeprowadzenia oznaczeń wykorzystano metodologię opisaną wcześniej przez Silvestre i wsp. (Effect of pasteurization on the bactericidal capacity of human milk. Journal of Humań Lactation. 2008; 24(4):371-6.). W badaniu użyto szczepu Escherichia coli NCTC 9111 ((serotyp O111: K58 (B4): H-, Ogundele, 2002 - de la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT, Burjassot, Valencia)).

Bakterie hodowano przez noc na agarze odżywczym, następnie zawieszano w wodzie peptonowej uzyskując miano 10⁸ jtk/ml. Do 0,8 ml poszczególnych próbek dodawano 0,2 ml roztworu bakterii, worteksowano i inkubowano 2 godziny w temperaturze 37°C. Próbki kontrolne stanowiło 0,8 ml pożywki BHI (ang. brain heart infusion), do której dodano 0,2 ml roztworu bakterii a następnie poddano inkubacji 2 godziny w temperaturze 37°C. Każdą próbkę i próbki kontrolne przygotowano w dwóch powtórzeniach. Po inkubacji próbki wysiano w odpowiednich rozcieńczeniach na VBRA (ang. violet red bile agar), zliczono po inkubacji 24 godziny w 37°C. Właściwości bakteriobójcze wyliczono jako różnice pomiędzy próbką a próbką kontrolną i wyrażono w procentach.

NO - Nf % redukcji =------* 100

NO

NO - próbka kontrolna

Nf - próbka badana

PL 238 537 Β1

Wyniki przedstawiono w Tabeli 4, poniżej jako wartości procentowe w stosunku do próbki kontrolnej (% redukcji wzrostu E. coli). Do oceny istotności statystycznej wykorzystano test U Manna-Whitneya, przyjmując istotność statystyczną p<0,05. Do analizy danych użyto programu STATISTICA wersja 13.1 (Stat Soft. Inc.).

Wyniki:

Wykazano że pasteryzacja metodą holder istotnie statystycznie obniża właściwości bakteriobójcze mleka kobiecego względem mleka surowego (12,12% vs 46,60%). Obniżenie właściwości bakteriobójczych mleka kobiecego poddanego pasteryzacji metodą wysokich ciśnień nie było istotne statystycznie co oznacza że mleko paskalizowane ma zachowane właściwości bakteriobójcze.

Tabela 4. Właściwości bakteriobójcze mleka traktowanego sposobem według wynalazku (pojedynczy impuls ciśnienia 450 MPa, 15 minut) i mleka traktowanego metodą holder

	Redukcja wzrostu E.coli (%)	test U Manna-Whitneya w odniesieniu do surowego mleka
Z	P
Surowe	46,60	-	-
Holder	12,12	2,985	0,003
450 MPa	29,60	-0,965	0,335

C) Mleko traktowane ciśnieniem w kilku wariantach jedno i dwuimpulsowych.

Materiał do badań stanowiło mrożone, niepasteryzowane mleko kobiece pozyskane z Regionalnego Banku Mleka Kobiecego w Warszawie w 2016 roku. Przed skażeniem mleko rozmrażano w łaźni wodnej w temperaturze 40°C (Danlab). Po rozmrożeniu mleko pozyskane od 3 dawczyń łączono w pule.

Wybór szczepów Staphylococcus aureus

Jako drobnoustroje wskaźnikowe wybrano trzy szczepy bakterii Staphylococcus aureus·. ATCC 25923 powszechnie wykorzystywany w badaniach inaktywującego wpływu wysokiego ciśnienia, 4.4. izolowany z żywności pochodzący z Kolekcji Katedry Mikrobiologii Przemysłowej Żywności Uniwersytetu Warmińsko Mazurskiego, HM01 szczep izolowany z nieutrwalonego mleka kobiecego w Zakładzie Higieny Żywności SGGW w Warszawie. Celem zastosowania koktajlu różnych szczepów bakterii S. aureus było sprawdzenie wpływu wysokiego ciśnienia hydrostatycznego na mikroflorę potencjalnie występującą w mleku pochodzącym od kilku kobiet. Przed zakażaniem mleka każdy ze szczepów S. aureus pasażowano trzykrotnie, uzyskując za każdym razem hodowlę 18-24 godzinną w temperaturze 37°C. Komórki bakterii wirowano dwukrotnie przy prędkości 12 000 x g przez 4 min a następnie zawieszano w 0,1% wodzie peptonowej. Otrzymana zawiesina drobnoustrojów miała końcowe zagęszczenie rzędu 10⁹ jtk/ml.

Zakażanie mleka

Skażanie mleka przeprowadzano w jałowych warunkach dodając po 3 ml każdego ze szczepów do rozmrożonej porcji 150 ml mleka uzyskując końcowe zagęszczenie rzędu jtk10⁷ jtk/ml. Skażone mleko rozlano do jałowych butelek używanych na co dzień podczas procesu pasteryzacji (Sterifeed) oraz butelek o pojemności 30 ml wykonanych z polietylenu wysokiej gęstości odpornego na warunki ciśnieniowania (Βίοηονο). Równolegle z utrwalanymi próbami mleka prowadzono próbę kontrolną K (mleko nieutrwalone skażone koktajlem bakterii S. aureus). Wykonano trzy powtórzenia 14 dniowego cyklu przechowalniczego mleka kobiecego skażonego koktajlem bakterii S. aureus inaktywowanych przez pasteryzację i wysokie ciśnienie w kilku wariantach ciśnienia i czasu.

Metody badawcze

Analizy mikrobiologiczne

Analizy mikrobiologiczne prowadzono z wykorzystaniem klasycznej metody płytkowej wg EN ISO 6888-2:1999. Do badań wykorzystywano pożywki: Barid-Parker z suplementem (Labo) oraz Agar Odżywczy przygotowane zgodnie z instrukcją producenta. Niezbędne dziesiętne rozcieńczenia prób wykonywano z wykorzystaniem 0,1% wody peptonowej. Po posiewie mikrobiologicznym płytki inkubowano

PL 238 537 Β1 w temperaturze 37°C przez 24-48 godzin. Wyrosłe drobnoustroje liczono z wykorzystaniem licznika kolonii (PoEco). Liczono czarno-stalowe kolonie otoczone przezroczystą strefą zgodnie z instrukcją producenta (Labo).

Zastosowano 14 dniowy okres przechowalńiczy mleka poddanego utrwalaniu różnymi metodami. Dzień skażania mleka oraz poddawania utrwalaniu przez pasteryzację i ciśnieniowanie oznaczono jako dzień „0”. Następnie analizy mikrobiologiczne wykonywano po 1,2, 4, 9 oraz 14 dniach przechowywania. Po badaniu wszystkie próby badane i kontrolne przechowywano w warunkach chłodniczych (temperatura 4°C) z zachowaniem ciągu chłodniczego podczas transportu próbek z laboratorium do Regionalnego Banku Mleka Kobiecego oraz Instytutu Wysokich Ciśnień PAN.

Wyniki

Przeprowadzono badania porównawcze w następujących wariantach doświadczalnych:

a. jednoimpulsowego ciśnienia o wartości 400 MPa albo 450 MPa przez 10 min.

b. ciśnienia w układzie dwuimpulsowym, kolejno o wartości 200 MPa i 400 MPa oraz kolejno 400 MPa i 200 MPa przez 10 min., z 10 min. interwałem

Wyniki przedstawiono w Tabeli 5 poniżej.

Tabela 5. Wyniki mikrobiologicznych testów dla fortyfikowanego mleka kobiecego poddawanego paskalizacji w różnych wariantach ciśnienia.

	200+400 [MPa]	400+200 [MPa]	400 [MPa]/10min	450 [MPa]/10min
Miano bakterii [log jtk/ml]
S. aureus	3,09	4,45	2,0	0

W przypadku jednoimpulsowego ciśnienia o wartości 400 MPa, 10 min po procesie utrwalania mleka, oznaczano średnio log 2 log jtk/ml koktajlu szczepów S. aureus wykorzystywanych do kontaminacji.

W odniesieniu do mleka ciśnieniowanego w warunkach ciśnienia o wartości 450 MPa przez 10 min, po procesie utrwalania mleka, jak również w trakcie okresu przechowywania, nie wykrywano bakterii S. aureus i Cronobacter spp. (mikroflora natywna).

W kolejnym wariancie doświadczalnym, ciśnienia dwuimpulsowego o wartości ciśnienia kolejno 200 MPa, 10 min, przerwa 10 min i 400 MPa, 10 min uzyskano całkowitą inaktywację mikroflory natywnej mleka, jednakże wykazano inaktywację jedynie 58,6% szczepów S. aureus.

I podobnie, wariant doświadczalny obejmujący ciśnienie dwuimpulsowe o wartości ciśnienia kolejno 400 MPa,10 min, przerwa 10 min i 200 MPa 10 min skutkował inaktywacją 40,4% szczepów S. aureus zastosowanych do uprzedniej kontaminacji.

D) Mleko traktowane ciśnieniem w kilku wariantach jedno i dwuimpulsowych. Badania skuteczności eliminacji endogennej flory bakteryjnej

Próbki mleka kobiecego od 80 dawczyń z Regionalnego Banku Mleka Kobiecego w Warszawie (~50 ml) przechowywano w temperaturze 4°C. Dla uzyskania minimalnej objętości 125 ml do badania, próbki od 2-4 dawczyń łączono w pule. Każdą pulę dzielono na porcje i poddawano ciśnieniowaniu jak opisano w Przykładzie 1, w 4 wariantach wymienionych poniżej. Temperatura wyjściowa wynosiła 19-21°C. Czas generowania ciśnienia wynosił 15-25 sekund, czas dekompresji 1-4 s. Badano następujące warianty:

(1) 600 MPa, 10 minut;

(2) 200 MPa, 10 min; przerwa 10 minut; 400 MPa, 10 minut;

(3) 100 MPa, 10 min; przerwa 10 minut; 600 MPa, 10 minut;

(4) 200 MPa, 10 min; przerwa 10 minut; 600 MPa, 10 minut.

Jako kontrolę, porcje mleka poddawano pasteryzacji metodą holderw urządzeniu Sterifeed S90 ECO Pasteurise (Medicare Colgate Ltd.), w 62,5°C przez 30 min.

Analizy mikrobiologiczne

Analizę mikrobiologiczną prowadzono w celu potwierdzenia czystości mikrobiologicznej próbek. Analizę wykonywano w trzech powtórzeniach, pod kątem całkowitej liczby tlenowych mikroorganizmów mezofilnych (PN-EN ISO 7218: 2008 / A1 : 2013, PN-EN ISO 6887-5: 2010) oraz liczby Staphylococcus aureus (PN-EN ISO 6888-1: 2001 / A1 : 2004).

PL 238 537 Β1

Wyniki

Wyniki badań czystości mikrobiologicznej dla próbek mleka poddawanych traktowaniu, jak w przykładzie 1 przedstawiono w Tabeli 6.

Tabela 6. Czystość mikrobiologiczna próbek mleka kobiecego poddawanego paskalizacji w różnych wariantach ciśnienia.

	TVMC [log jtk/ml]	S. aureus [log jtk/ml]
Surowe mleko (przed procesem)	3,3±0,90	1,57±0,65
Mleko po pastę ry zacj i/paskal izacj i	0	0

Mleko poddane obróbce ciśnieniowej w każdym z wariantów, jak również mleko kontrolne (poddane pasteryzacji) było czyste mikrobiologicznie.

Należy jednak zauważyć, że wariant (2), 200 MPa, 10 min /10 min przerwa/ +400 MPa, 10 min testowano również w testach obciążeniowych, z celowym zakażaniem próbek mleka przed procesem ciśnieniowania (zob. Tabela 5 powyżej) i nie uzyskano wówczas całkowitej eliminacji patogennych mikroorganizmów. Nieoczekiwanie, wyraźnie skuteczniejsze okazuje się traktowanie ciśnieniem w zaledwie jednym cyklu.

Przykład 3

Określenie aktywności biologicznej mleka poddanego wysokim ciśnieniom i liofilizacji

A) Mleko traktowane ciśnieniem i mleko traktowane metoda holder. Oznaczanie aktywności biologicznej.

W próbkach mleka poddawanych traktowaniu ciśnieniem, według metodologii opisanej w poprzedzających przykładach, wykonywano oznaczenia zawartości i aktywności biologicznej dla kilku istotnych składników mleka kobiecego:

i ) oznaczenie zawartości HGF, insuliny, leptyny, adiponektyny oraz i i) badanie aktywności lipazy w próbkach mleka ciśnieniowego 450 MPa, przez okres 15 minut i liofilizowanego.

W celu określenia aktywności biologicznej wykorzystano 6 próbek łączonego w pule mleka od dawczyń. Każdą próbkę stanowiło mleko łączone od 3-4 dawczyń, które następnie zostało podzielone na mniejsze porcje i poddane różnym procesom utrwalania. Doświadczenie powtórzono 6 razy. Dla potwierdzenia przydatności wariantu doświadczalnego przy wartości ciśnienia 450 MPa przeprowadzono analizę 6 próbek w 3 różnych wariantach:

• mleko surowe (niepoddane procesom utrwalania), • mleko poddane tradycyjnej metodzie pasteryzacji (metoda holder: w urządzeniu Sterifeed S90 ECO Pasteurise (Medicare Colgate Ltd.), w 62,5°C przez 30 min), • mleko poddane metodzie pasteryzacji przy zastosowaniu wysokich ciśnień w warunkach ciśnienia 450 MPa, przez okres 15 minut (zob. też opis w przykładzie 1), • mleko poddane metodzie pasteryzacji przy zastosowaniu wysokich ciśnień w warunkach ciśnienia 450 MPa, przez okres 15 minut (zob. też opis w Przykładzie 1) a następnie liofilizacji (opis w Przykładzie 1)

Po przeprowadzeniu powyższych procesów, wszystkie próbki oraz mleko surowe odwirowano 4400 rpm przez 15 minut w 4°C (Centrifuge 5702R, Eppendorf), do dalszych analiz rozdzielono supernatanty na porcje do probówek typu Eppendorf i zamrożono w temperaturze -21 °C.

Do oceny zawartości składników bioaktywnych wykorzystano metodę ELISA. Stężenie leptyny, adiponektyny, czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) i insuliny analizowano przy zastosowaniu komercyjnych zestawów ELISA, tj. Humań Leptin; Humań HMWAdiponectin/Acrp30 (R&D Systems, Inc); Humań HGF (R&D Systems, Inc); Insulin ELISA (DRG Instruments GmbH, Germany). Aktywność Lipazy badano testem kolorymetrycznym lipase assay kit ( MAK046 Sigma-Aldrich).

Wyniki

Mleko utrwalane metodą wysokich ciśnień w wariancie ciśnienia o wartości 450 MPa przez 15 minut, a następnie poddane procesowi liofilizacji zachowuje wyższe stężenie składników bioaktywnych

PL 238 537 B1 niż mleko pasteryzowane metodą holder, odpowiednio HGF 79,2% w mleku ciśnieniowanym i odpowiednio 72% w mleku po liofilizacji vs 3,2% w mleku po pasteryzacji holder; insulina 109 % w mleku po ciśnieniowaniu i odpowiednio 93% w mleku po liofilizacji vs 90% po pasteryzacji holder, leptyna 101,4% w mleku ciśnieniowanym, 116% w mleku poddanym liofilizacji vs 34,2% po pasteryzacji holder. Dla adiponektyny zaobserwowano znaczny spadek zawartości hormonu po ciśnieniowaniu 14,8% w stosunku do 76% po pasteryzacji holder, który nie uległ zmianie po liofilizacji 14,2% w stosunku do mleka surowego. Wyniki przedstawiono na FIG. 1 (A-D).

Stwierdzono, że mleko utrwalane przy zastosowaniu metody wysokich ciśnień w wariancie o wartości ciśnienia 450 MPa przez 15 minut, zachowuje niemalże niezmienioną aktywność enzymatyczną lipazy na poziomie 78% aktywności w mleku ciśnieniowanym, odpowiednio 75% w mleku ciśnieniowanym i poddanym liofilizacji w porównaniu z 3,8% w mleku po pasteryzacji holder. Wyniki przedstawiono na FIG. 2.

B) Mleko traktowane ciśnieniem w kilku wariantach jedno i dwuimpulsowych. Oznaczanie aktywności biologicznej.

Próbki mleka kobiecego od 80 dawczyń z Regionalnego Banku Mleka Kobiecego w Warszawie (~50 ml) przechowywano w temperaturze 4°C. Dla uzyskania minimalnej objętości 125 ml do badania, próbki od 2-4 dawczyń łączono w pule. Każdą pulę dzielono na porcje i poddawano ciśnieniowaniu jak opisano w Przykładzie 1, w 4 wariantach wymienionych poniżej. Temperatura wyjściowa wynosiła 19-21°C. Czas generowania ciśnienia wynosił 15-25 sekund, czas dekompresji 1-4 s. Badano następujące warianty:

(1) 600 MPa, 10 minut;

(2) 200 MPa, 10 min; przerwa 10 minut; 400 MPa, 10 minut;

(3) 100 MPa, 10 min; przerwa 10 minut; 600 MPa, 10 minut;

(4) 200 MPa, 10 min; przerwa 10 minut; 600 MPa, 10 minut.

Jako kontrolę, porcje mleka poddawano pasteryzacji metodą Holdera w urządzeniu Sterifeed S90 ECO Pasteurise (Medicare Colgate Ltd.), w 62,5°C przez 30 min.

Po przeprowadzeniu powyższych procesów, wszystkie próbki oraz mleko surowe odwirowano 4400 rpm przez 15 minut w 4°C (Centrifuge 5702R, Eppendorf), do dalszych analiz rozdzielono supernatanty na porcje do probówek typu Eppendorf i zamrożono w temperaturze -21 °C.

Do oceny zawartości składników bioaktywnych wykorzystano metodę ELISA. Stężenie leptyny, adiponektyny, czynnika wzrostu hepatocytów (HGF) i insuliny analizowano przy zastosowaniu komercyjnych zestawów ELISA, tj. Human Leptin; Human HMW Adiponectin/Acrp30 (R&D Systems, Inc); Human HGF (R&D Systems, Inc); Insulin ELISA (DRG Instruments GmbH, Germany).

Do oznaczenia laktoferyny stosowano przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej laktoferynie (ABCAM, Cambridge, UK) jako czynnik do opłaszczenia dołków płytki miktotitracyjnej (Nalge Nunc International, Naperville, II, USA) w celu związania laktoferyny z próbki. Do testów wykorzystywano po 100 pl mleka rozcieńczonego 5000-, 10 000-, 25 000- i 50 000-krotnie oraz preparat wzorcowy laktoferyny od 0,8 do 25 ng/100 pl (Sigma, St. Louis, MO, USA). Ilość związanej laktoferyny kwantyfikowano z pomocą znakowanych fosfatazą przeciwciał króliczych przeciwko ludzkiej laktoferynie (Jackson ImmunoResearch, USA). Stężenie IgG określano według następującej procedury: stosowano fragment F(ab’)2 koziego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG (Jackson ImmunoResearch, USA) do opłaszczenia dołków płytki miktotitracyjnej (Nalge Nunc International, Naperville, II, USA) w celu związania IgG z próbki. Do testów wykorzystywano po 100 pl mleka rozcieńczonego 100-, 25-, 500- i 1000-krotnie oraz preparat wzorcowy IgG od 0,2 do 12,5 ng/100 pl (Jackson ImmunoResearch, USA). Ilość związanego IgG kwantyfikowano z pomocą znakowanych fosfatazą przeciwciał królicznych specyficznych dla fragmentu Fcy ludzkiego IgG (Jackson ImmunoResearch, USA).

Wynik dla testów dla laktoferyny i IgG odczytywano z pomocą fosforanu 4-nitrofenylu (SERVA, Heidelberg, Niemcy) jako substratu, a absorbancję mierzono w czytniku Stat Fax 2100 Microplate Reader (Awareness Technology Inc., Palm City, FL, USA) przy 405 nm (referencyjna: 630 nm). Wszystkie etapy wiązania i płukania w testach ELISA wykonywano w soli fizjologicznej buforowanej TRIS (TBS, pH 7,5) zawierającej 0,2% Tween 20. Wszystkie próbki analizowano w czterech różnych rozcieńczeniach, każde w dwóch powtórzeniach.

Wyniki

Wyniki przedstawiono na FIG. 3 (adiponektyna (A), leptyna (B), insulina (C), laktoferyna (E) i IgG (F)).

Dla HGF uzyskano poziom 11,28 % (metoda holder), 36,15% (600 MPa), 38,81% (100 MPa + 600 MPa), 97,15% (200 MPa + 400 MPa) i 43,02% (200 MPa + 600 MPa) (FIG. 3 (D)).

PL 238 537 B1

PODSUMOWANIE

Powyższe wyniki wykazują, że traktowanie mleka kobiecego sposobem według wynalazku, a więc traktowanie ciśnieniem w zakresie 400-550 MPa w pojedynczym cyklu przy zastosowaniu szybkiej dekompresji, nieoczekiwanie jest wystarczające do eliminacji mikroorganizmów (daje nawet lepsze wyniki w teście obciążeniowym niż zastosowanie dwóch cykli w tym zakresie ciśnień), a równocześnie zapewnia zachowanie aktywności biologicznej komponentów mleka. Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili nieoczekiwanie, że zastosowanie jedynie pojedynczego cyklu traktowania ciśnieniem, w zakresie 400-550 MPa przy zastosowaniu czasu dekompresji w zakresie od 80 ms do 1 s pozwala na uzyskanie optymalnego efektu, zarówno pod kątem bezpieczeństwa mikrobiologicznego jak i zachowania aktywności biologicznej mleka kobiecego. Jest więc możliwe utrwalanie mleka kobiecego w procesie znacznie prostszym i krótszym niż znane w stanie techniki.