PL238483B1 - Kompleks laktoferyny z jonami manganu, sposób jego otrzymywania, zastosowanie kompleksu oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca kompleks laktoferyny i jonów manganu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompleks laktoferyny z jonami manganu, sposób jego otrzymywania i zastosowanie, zwłaszcza do wytwarzania suplementu diety i/lub preparatu farmaceutycznego do profilaktyki dolegliwości związanych z mikroflorą układu pokarmowego, jak również sama kompozycja farmaceutyczna zawierająca kompleks laktoferyny i jonów manganu.

Rozwój medycyny w ostatnich kilkudziesięciu latach przyczynił się do znacznego polepszenia jakości opieki nad kobietą ciężarną oraz noworodkiem w okresie okołoporodowym. Postęp dotyczący przede wszystkim stanu higieny oraz powstania nowoczesnej neonatologii pozwala na utrzymanie przy życiu noworodków urodzonych przedwcześnie nawet o bardzo małej masie urodzeniowej (<1500 g, VLBW, ang. very low-birth weight).

W trakcie porodu siłami natury dziecko w sposób naturalny kolonizuje się mikroflorą bakteryjną (przede wszystkim szczepami z rodzajów Lactobacillus i Bifidobacterium) pochodzącą z dróg rodnych oraz przewodu pokarmowego zdrowej matki. Istnieją dowody na to, że flora nabyta w ten sposób stanowi jeden z pierwszych mechanizmów obronnych noworodka przed drobnoustrojami chorobotwórczymi panującymi w środowisku szpitalnym. W przypadku dzieci urodzonych przedwcześnie przebywających na oddziałach intensywnej opieki neonatologicznej sytuacja wygląda odmiennie. Po odsepar owaniu od matki karmione są mieszankami do żywienia jelitowego lub pozajelitowo oraz narażone są na ekspozycję i kolonizację szczepami o dużym potencjale wirulencji ze środowiska szpitalnego. Ponadto, noworodki o bardzo małej masie urodzeniowej nie są karmione mlekiem matki, które poza naturalną mikroflorą probiotyczną matki (bakterie z rodzaju Bifidobacterium i Lactobacillus) zawiera niezbędne składniki odżywcze, czynniki wzrostu, cytokiny, naturalne peptydy antybakteryjne, rozpuszczalne przeciwciała IgA. Nabyte na oddziale szpitalnym bakterie mogą w sposób niekontrolowany namnażać się w świetle jelita, prowadząc do jego dysbiozy. Nie w pełni wykształcone błony śluzowe jelita o niskiej motoryce oraz niewystarczająco skutecznie funkcjonujący układ immunologiczny ustępują wskutek działania toksyn i antygenów pochodzenia bakteryjnego. Dochodzi do przerwania ciągłości bariery jelitowej i translokacji bakterii ze światła jelita do naczyń krwionośnych i dalszego uogólnionego stanu zapalnego, co zostało opisane przez Sherman MP. New Concepts of Microbial Translocation in the Neonatal Intestine: Mechanisms and Prevention. Clinics in Perinatology. 2010; 37(3):565-79.

Zakażenia w okresie noworodkowym stanowią istotny problem w przebiegu opieki neonatologicznej co zostało opisane przez Lawn JE, Wilczynska-Ketende K, Cousens SN. Estimating the causes of 4 million neonatal deaths in the year 2000. Int J Epidemiol. 2006; 35(3):706-18.

W kontekście walki ze zjawiskami translokacji bakteryjnej i sepsy niezbędne wydaje się zwrócenie uwagi na żywienie noworodka. Szczególnie wyraźnie widać rolę naturalnie występujących białek mleka w porównaniu mikroflory jelitowej noworodków karmionych mlekiem matki i mieszankami mlekozastępczymi. Na szczególną uwagę wśród białek mleka zasługuje laktoferyna, która posiada status GRAS (ang. generally regarded as safe) i - ze względu na przypisywane jej liczne korzystne właściwości stanowi interesujący przedmiot badań licznych grup naukowych.

Laktoferyna (Lf) jest białkiem z rodziny transferyn występującym w płynach i wydzielinach śluzowych ssaków: w mleku, ślinie, łzach, nasieniu itd. Laktoferyna jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej około 80 kDa. Laktoferyna składa się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego posiadającego dwa homologiczne płaty: N oraz C (Fig. 1).

W publikacji Sanchez L, Calvo M, Brock JH. Biological role of lactoferrin. Archives of Disease in Childhood. 1992; 67(5):657-61 szeroko opisywane są właściwości antybakteryjne, przeciwgrzybicze i antywirusowe laktoferyny, które przyczyniły się do ogromnego wzrostu zainteresowania tym białkiem, jako składnikiem wykorzystywanym do produkcji zarówno suplementów diety, jak i wyrobów medycznych. Szczególne zastosowanie laktoferyna znalazła w profilaktyce zakażeń u wcześniaków, noworodków i starszych dzieci, jak podano w Huang J, Nandi S, Wu L, Yalda D, Bartley G, Rodriguez R, et al. Expression of natural antimicrobial human lysozyme in rice grains. Molecular Breeding. 2002; 10 (1-2):83-94. Doustna suplementacja różnymi formami laktoferyny ma duże znaczenie w łagodzeniu objawów klinicznych zjawiska translokacji bakterii ze światła jelita do krwioobiegu, wywołującego sepsę u noworodków o bardzo małej wadze urodzeniowej.

Dokument US 2011/0183008 ujawnia sposób leczenia osteoporozy obejmujący podanie laktoferyny zawierającej nie więcej niż dwa jony metalu na cząsteczkę laktoferyny. Stosowanymi jonami metalu są mangan, żelazo, miedź, chrom, kobalt, cynk lub magnez.

PL 238 483 B1

Dokument WO 2011/50395 ujawnia preparat zawierający laktoferynę oraz mieszankę odżywczą, stosowany jako suplement diety przez osobników będących w ciąży lub spodziewających się ciąży lub będących po porodzie. Stosowana laktoferyna jest nasycona jednym lub większą ilością jonów: żelaza (III), cynku, miedzi lub manganu.

Dokument EP2653040 ujawnia kompozycję odżywczą dla osobnika z alergią lub nietolerancją białek mleka, zwłaszcza wcześniaków lub niemowląt do osłabienia działania drobnoustrojów chorobotwórczych. Kompozycja oparta jest na mleku osła, surowym lub liofilizowanym z dodatkiem mieszanki lipidów. Kompozycja zawiera laktoferynę oraz mangan.

Dokument WO 2011/50393 ujawnia sposób zapobiegania lub leczenia kolki u noworodków, obejmujący podawanie dziecku mleka matki zawierającego wyizolowaną laktoferynę lub podawanie dziecku kombinacji mleka matki i formulacji zawierającej laktoferynę. Stosowana laktoferyna jest nasycona jednym lub większą ilością jonów: żelaza (III), cynku, miedzi lub manganu.

Dotychczasowe doniesienia na temat modyfikacji laktoferyny za pomocą jonów manganu wskazują na to, że białko to jest w stanie związać jony manganu po uprzednim usunięciu jonów żelaza z miejsca wiążącego jak opisano np. w publikacji Marchetti M, Superti F, Ammendolia MG, Rossi P, Valenti P, Seganti L. Inhibition of poliovirus type 1 infection by iron-, manganese and zinc saturated lactoferrin. Medical Microbiology and Immunology. 1999; 187(4):199-204 czy Ainscough EW, Brodie AM, Plowman JE. The chromium, manganese, cobalt, and copper complexes of human lactoferrin. Inorganica Chimica Acta. 1979; 37(C):282.

Celem wynalazku będącego przedmiotem opisu jest dostarczenie kompleksu laktoferyny rozwiązującego nowy problem techniczny, to jest zapewniającego zarówno stymulację wzrostu probiotyków, jednocześnie zapewniając zdolność do wiązania żelaza, które jest niezbędne do wzrostu bakterii patogennych. Kompleks laktoferyny i jonów manganu zwłaszcza manganu na trzecim stopniu utlenienia nie wykazuje negatywnego wpływu na komórki ludzkie, posiada zaś pozytywny wpływ na wzrost szczepów probiotycznych. Stymulacja wzrostu bakterii probiotycznych może pośrednio przyczynić się do ograniczenia wzrostu mikroorganizmów patogennych, zahamowania translokacji tych szczepów do krwi.

Wynalazek realizuje powyższy cel poprzez zapewnienie kompleksu laktoferyny wysyconego jonami manganu (LfMn), niezawierającego jonów żelaza oraz zapewnienie sposobu do otrzymywania takich kompleksów. Właściwości kompleksu mogą być wykorzystane do suplementacji celem zmniejszenia ryzyka wystąpienia sepsy u noworodków. Wynalazek może mieć zastosowanie jako prebiotyk, wchodząc w skład preparatów symbiotycznych. Taki preparat może znaleźć zastosowanie jako preparat wspomagający/łagodzący przebieg przewlekłych chorób zapalnych jelit. Wynalazek mógłby także posłużyć jako suplement diety zalecany w prewencji i/lub terapii infekcji (bakteryjnych, wirusowych). Dotychczas polecane w infekcjach górnych dróg oddechowych są preparaty laktoferyny o nieznanym stopniu wysycenia jonami żelaza.

Zaletą kompleksów laktoferyny według wynalazku jest obecność wyłącznie lub prawie wyłącznie manganu w kompleksie, co stanowi o wartości kompleksu w suplementacji manganem. Mangan jest istotnym mikroelementem m.in. jest kofaktorem wielu enzymów w tym dysmutazy ponadtlenkowej chroniącej przed stresem oksydacyjnym. Klinicznymi symptomami niedoboru manganu jest zahamowanie syntezy mukopolisacharydów (m.in. kwas hialuronowy) i lipopolisacharydów, upośledzenie rozwoju szkieletu i ataksja. Niebezpieczny jest również jego nadmiar, który powoduje stan wyczerpania katecholaminy w centralnym układzie nerwowym; bezsenność; ból głowy; niepokój; gwałtowne ruchy rąk; utrata koordynacji przypominająca chorobę Parkinsona. Suplementacja manganem jest wyjątkowo zalecana w przypadku wcześniaków i wtedy mangan jest podawany pozajelitowo co może powodować powikłania związane z dysfunkcją mózgu i wątroby jak opisano w Rao R, Georgieff M. Nutrition of the Preterm Infant: Scientific Basis and Practical Guidelines. 0000:277-310 i Santos D, Batoreu C, Mateus L, Marreilha dos Santos AP, Aschner M. Manganese in human parenteral nutrition: Considerations for toxicity and bio monitoring. NeuroToxicology. 2014; 43:36-45. Mleko matki natomiast dostarcza 3 mcg w trakcie wczesnego niemowlęctwa z czego jedynie 8% zostaje zaabsorbowane przez dziecko, niem niej jednak pomimo nadmiaru manganu w mleku matki metal ten nie powoduje niebezpiecznych efektów. Zatem naturalna forma występowania pozwala na pobranie jedynie niezbędnej ilości jonów manganu. Pozostała część przechodząc przez układ trawienny noworodka może zostać wykorzystana przez bakterie probiotyczne i wspomagać tym samym tworzenie prawidłowej flory bakteryjnej. Mangan w postaci schelatowanej przez laktoferynę może być podawany w postaci wchłanianej w jelicie, gdzie następuje absorpcja manganu w organizmie. Zaletą takiego podawania jest stopniowe uwalnianie manganu w związku z dużą stabilnością manganowej formy laktoferyny w zasadowym pH, które panuje w jelicie.

PL 238 483 B1

Podawanie go w formie chroniącej przed nagłym miejscowym wzrostem stężenia jonów manganu może znacznie zwiększyć bezpieczeństwo i korzyści prozdrowotne terapii wykorzystującej manganową formę laktoferyny.

Innym celem wynalazku jest zapewnienie sposobu otrzymywania kompleksów według wynalazku. Sposób otrzymywania kompleksów LfMn według wynalazku odbywa się poprzez dializę.

Zaletą opracowanej metody jest możliwość regulacji wysycenia manganem za pomocą pH reakcji. Dodatkowo uzyskanie materiału trwałego w wodzie umożliwia łatwe przeprowadzenie do formy zliofilizowanej bez zanieczyszczania preparatu solami. Zastosowanie dializy pozwala na przeprowadzenie ciągłego procesu uzyskiwania formy manganowej, który pozwala na minimalizację kontaminacji żelazem, którego obecność mniejsza wydajność wysycenia jonami manganu.

Zaletą sposobu według wynalazku jest otrzymanie kompleksu laktoferyny z manganem na trzecim stopniu utlenienia. Dotychczasowy stan techniki mówi o tworzeniu formy laktoferyny z manganem na drugim stopniu utlenienia w warunkach pH~9, jednak brak jest wyników potwierdzających ten fakt. Nasze badania udowodniły, że w pH wyższym ~8.5 mangan wiąże się dodatkowo (poza manganem Mn³⁺) niespecyficznie z manganem na drugim stopniu utlenienia.

Wynalazek ujawniony w tym dokumencie jest odpowiedzią na zapotrzebowanie na preparaty chroniące przed zakażeniami bakteryjnymi i pozytywnie wpływającymi na naturalną mikroflorę organizmu. W dobie wzrastającej lekooporności wielu patogennych szczepów bakteryjnych konieczne jest wprowadzenie skutecznej ochrony polegającej na wzmocnieniu naturalnej linii obrony organizm u poprzez zwiększenie udziału bakterii probiotycznych z rodzaju Lactobacillus. Preparaty takie mogą znaleźć szczególne zastosowanie w przypadku ochrony zdrowia noworodków z małą masą urodzeniową, zwłaszcza przedwcześnie urodzonych, które są szczególnie narażone na zakażenia. Nie bez znaczenia jest także działanie takich preparatów dla pacjentów po antybiotykoterapii, pacjentów onkologicznych i chorych cierpiących na przewlekłe stany zapalne jelit.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia strukturę bydlęcej laktoferyny związanej z dwoma jonami żelaza (PDB: 1BLF); Fig. 2 przedstawia wykres stabilności wiązania manganu przez MnLf rozpuszczoną w wodzie, buforowanym fosforanami roztworze soli fizjologicznej (PBS, ang. phosphate buffered saline) oraz buforach: HEPES (pH 7), octanowym (pH 4) i fosforanowym (pH 6, 6.5, 7, 7.5, 8); Fig. 3 przedstawia elektroforegramy uzyskane podczas rozdziału mieszaniny poreakcyjnej - reakcja w pH 7.5 ( - ) oraz następującym przedializowaniu mieszaniny reakcyjnej do wody MilliQ przez 24 h ( - ); Fig. 4 przedstawia diagram uzyskany na podstawie rozdziałów elektroforetycznych apolaktoferyny po reakcji z manganem w pH 7.5 przed i po dializie do 0.1 M NaHCO3 oraz do wody w przypadku warunków normalnych; Fig. 5 przedstawia fotografię żelu SDSPAGE uzyskanego dla próbek manganowej formy laktoferyny, wyjściowej laktoferyny (DMV), holo oraz apolaktoferyny; Fig. 6 przedstawia widma EPR manganowej formy laktoferyny uzyskanej w pH 8.5 ( - ), MnLf uzyskanej w pH 7.5 ( - ); apoLf z jonami Mn²⁺ w ilości pozwalającej na 50% wysycenie białka, zmieszane tuż przed pomiarem ( - ); oraz apoLf z jonami Mn²⁺ w ilości pozwalającej na 5% wysycenie białka ( - ), wszystkie próbki przygotowano w wodzie MilliQ; Fig. 7 przedstawia uwalnianie manganu przez MnLf oraz żelaza przez holo-Lf w środowisku symulującym układ pokarmowy. (100% odpowiada wyjściowemu wysyceniu Lf jonami manganu); Fig. 8 przedstawia uwalnianie manganu w środowisku symulującym układ pokarmowy - analiza zdolności laktoferyny do wiązania żelaza po uwolnieniu manganu - strzałką oznaczono moment, w którym dodano do układu żelazo; Fig. 9 przedstawia krzywe wzrostu szczepu wzorcowego (panel lewy) oraz szczepu pochodzącego z preparatu probiotycznego bakterii Lactobacillus plantarum inkubowanych z apolaktoferyną (A), natywną laktoferyną (N), hololaktoferyną (H) oraz laktoferyną wysyconą jonami manganu (Mn) w stężeniach 0.6, 5 i 40 mg/ml. Wykresy przedstawiają średnią z pomiaru gęstości optycznej hodowli (długość fali 620 nm) w czasie dla tryplikatu, Fig. 10 przedstawia krzywe wzrostu szczepu wzorcowego (panel lewy) oraz szczepu pochodzącego z preparatu probiotycznego bakterii Lactobacillus rhamnosus inkubowanych z apolaktoferyną (A), natywną laktoferyną (N), hololaktoferyną (H) oraz laktoferyną wysyconą jonami manganu (Mn) w stężeniach 0.6, 5 i 40 mg/ml. Wykresy przedstawiają średnią z pomiaru gęstości optycznej hodowli (długość fali 620 nm) w czasie dla tryplikatu; Fig. 11 przedstawia reprezentatywne mikrofotografie z barwienia immunofluorescencyjnego białek połączeń ścisłych w komórkach linii Caco-2, kontrola - a, apolaktoferyną - b, natywna laktoferyna - c, hololaktoferyną - d, laktoferyna wysyconą jonami manganu - e; Fig. 12 przedstawia komórki linii J774.A1 w medium bezsurowiczym poddawano działaniu LPS (100 ng/ml) i/lub różnych form laktoferyny (5 mg/ml, A - apolaktoferyną, N - natywna laktoferyna, H

PL 238 483 B1 hololaktoferyną, Mn - laktoferyna wysyconą jonami manganu). Po 23 godzinach hodowli zbierano nadsącze znad komórek i oznaczano w nich poziom cytokin IL-6 (górny panel) oraz TNF-α (dolny panel).

Przedmiotem wynalazku jest kompleks laktoferyny z jonami manganu, charakteryzujący się tym, że jony manganu (III) stanowią 96-98% mol. względem ilości moli wszystkich jonów metali w kompleksie.

Korzystnie, gdy jony manganu (III) stanowią 98% mol. względem ilości moli wszystkich jonów metali w kompleksie.

Korzystnie, gdy procentowe wysycenie laktoferyny jonami Mn³⁺ wynosi co najwyżej 50%.

Innym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania kompleksu laktoferyny z jonami manganu opisanego powyżej obejmujący prowadzenie reakcji laktoferyny z solą manganu i oczyszczanie kompleksu laktoferyny z manganem, charakteryzujący się tym, że reakcję prowadzi się poprzez dializę.

Korzystnie gdy reakcję laktoferyny z solą manganu prowadzi się poprzez dializę w pH w zakresie 7,0-7,5, w buforze wybranym z grupy: 20-100 mM HEPES, 100 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, temperaturze w zakresie 30-40°C, a sól manganu stanowi cytrynian manganu (II), w nadmiarze molowym jonów manganu 5-20 w stosunku do laktoferyny, w czasie 12-48 h, oczyszczanie kompleksu prowadzi się zaś poprzez dializę do wody ultraczystej przez 10-24 h w temperaturze pokojowej z 3-krotną zmianą wody.

Korzystnie, gdy stosunek molowy jonów Mn²⁺ i kwasu cytrynowego w buforze o pH 7,4 jest 3:2.

Korzystnie, gdy reakcję laktoferyny z solą manganu prowadzi się w warunkach tlenowych.

Korzystnie gdy buforem jest HEPES o stężeniu 50 mM.

Korzystnie gdy reakcję laktoferyny z solą manganu prowadzi się w temperaturze 37°C.

Korzystnie gdy reakcję laktoferyny z solą manganu prowadzi się w co najmniej 5-krotnym molowym nadmiarze jonów Mn²⁺ względem laktoferyny.

Korzystnie, gdy reakcję laktoferyny z solą manganu prowadzi do uzyskania kompleksu białka związanego wyłącznie z jonami Mn³⁺.

Jeszcze innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompleksu laktoferyny z jonami manganu opisanego powyżej do wytwarzania suplementu diety do profilaktyki zaburzeń mikroflory układu pokarmowego.

Korzystnie zaburzeniami mikroflory układu bakteryjnego są dysbakterioza związana z antybiotykoterapią, onkoterapią, wcześniactwem, stanami zapalnymi jelit.

Korzystnie, gdy suplement diety podawany jest celem regulacji mikroflory układu pokarmowego na korzyść bakterii probiotycznych.

Korzystnie dolegliwości są wywołane przez bakterie, grzyby i/lub wirusy.

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca kompleks laktoferyny i jonów manganu opisany powyżej.

Przykłady realizacji wynalazku

Sposoby otrzymywania kompleksu laktoferyny z manganem:

P r z y k ł a d 1

Kompleks laktoferyny z manganem otrzymano w następujący sposób:

- przygotowano apolaktoferynę o poziomie wysycenia żelazem na poziomie 1-2%, bez zawartości jonów manganu, zgodnie z procedurą opisaną przez Majka G., Śpiewak K., Kurpiewska K., Heczko P., Stochel G., Strus M., Brindell M., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405, 15; 5191-5200

- apolaktoferynę rozpuszczono w 20 ml wody o jakości MilliQ w stężeniu 50 mg/ml i umieszczono w membranie dializacyjnej o wartości odcięcia 10 kDa

- przygotowano bufor 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, pH ~7,4

- w 2 litrach przygotowanego buforu rozpuszczono cytrynian manganu w stężeniu 0,43 mM, co odpowiada stosunkowi molowemu Lf:Mn²⁺ na poziomie 1:20

- dializę apolaktoferyny do buforu z cytrynianem manganu prowadzono przez 24 h w temperaturze 37°C

- w celu usunięcia niespecyficznie związanych jonów manganu prowadzono dializę do wody o jakości MilliQ przez kolejne 24 h w temperaturze pokojowej z 3-krotną zmianą wody

- preparat poddawano liofilizacji i przechowywano w 4°C

Wynik: wysycenie manganem na poziomie 50%, obecny wyłącznie Mn³⁺, kompleks stabilny w pH fizjologicznym.

PL 238 483 B1

P r z y k ł a d 2

Kompleks laktoferyny z manganem otrzymano w następujący sposób:

- przygotowano apolaktoferynę o poziomie wysycenia żelazem na poziomie 1-2%, bez zawartości jonów manganu, zgodnie z procedurą opisaną przez Majka G., Śpiewak K., Kurpiewska K., Heczko P., Stochel G., Strus M., Brindell M., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405, 15; 5191-5200

- apolaktoferynę rozpuszczono w 20 ml wody o jakości MilliQ w stężeniu 50 mg/ml i umieszczono w membranie dializacyjnej o wartości odcięcia 10 kDa

- przygotowano bufor 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 25 mM NaHCOs, pH 8,5

- w 2 litrach przygotowanego buforu rozpuszczono cytrynian manganu w stężeniu 0,43 mM, co odpowiada stosunkowi molowemu Lf:Mn²⁺ na poziomie 1:20

- dializę apolaktoferyny do buforu z cytrynianem manganu prowadzono przez 24 h w temperaturze 37°C

- w celu usunięcia niespecyficznie związanych jonów manganu prowadzono dializę do wody o jakości MilliQ przez kolejne 24 h w temperaturze pokojowej z 3-krotną zmianą wody

- preparat poddawano liofilizacji i przechowywano w 4°C

Wynik: wysycenie manganem na poziomie ok. 100%, obecny Mn²⁺ i Mn³⁺, kompleks stabilny w pH fizjologicznym.

P r z y k ł a d 3

Kompleks laktoferyny z manganem otrzymano w następujący sposób:

- przygotowano apolaktoferynę o poziomie wysycenia żelazem na poziomie 1-2%, bez zawartości jonów manganu, zgodnie z procedurą opisaną przez Majka G., Śpiewak K., Kurpiewska K., Heczko P., Stochel G., Strus M., Brindell M., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405, 15; 5191-5200

- apolaktoferynę rozpuszczono w 20 ml wody o jakości MilliQ w stężeniu 50 mg/ml i umieszczono w membranie dializacyjnej o wartości odcięcia 10 kDa

- przygotowano bufor 50 mM octan sodu, 100 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, pH 4,0

- w 2 litrach przygotowanego buforu rozpuszczono cytrynian manganu w stężeniu 0,43 mM, co odpowiada stosunkowi molowemu Lf:Mn²⁺ na poziomie 1:20

- dializę apolaktoferyny do buforu z cytrynianem manganu prowadzono przez 24 h w temperaturze 37°C

- w celu usunięcia niespecyficznie związanych jonów manganu prowadzono dializę do wody o jakości MilliQ przez kolejne 24 h w temperaturze pokojowej z 3-krotną zmianą wody

- preparat poddawano liofilizacji i przechowywano w 4°C

Wynik: wysycenie manganem: 0%.

P r z y k ł a d 4

Kompleks laktoferyny z manganem otrzymano w następujący sposób:

- przygotowano apolaktoferynę o poziomie wysycenia żelazem na poziomie 1-2%, bez zawartości jonów manganu, zgodnie z procedurą opisaną przez Majka G., Śpiewak K., Kurpiewska K., Heczko P., Stochel G., Strus M., Brindell M., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405, 15; 5191-5200

- apolaktoferynę rozpuszczono w 20 ml wody o jakości MilliQ w stężeniu 50 mg/ml i umieszczono w membranie dializacyjnej o wartości odcięcia 10 kDa

- przygotowano bufor 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, pH ~7,4

- w 2 litrach przygotowanego buforu rozpuszczono cytrynian manganu w stężeniu 0,43 mM, co odpowiada stosunkowi molowemu Lf:Mn²⁺ na poziomie 1:20

- dializę apolaktoferyny do buforu z cytrynianem manganu prowadzono przez 4 h w temperaturze 37°C

- w celu usunięcia niespecyficznie związanych jonów manganu prowadzono dializę do wody o jakości MilliQ przez kolejne 24 h w temperaturze pokojowej z 3-krotną zmianą wody

- preparat poddawano liofilizacji i przechowywano w 4°C

Wynik: wysycenie manganem na poziomie 30%, obecny wyłącznie Mn³⁺, kompleks stabilny w pH fizjologicznym.

PL 238 483 Β1

Stabilność kompleksów według wynalazku

W celu oceny stabilności wiązania pomiędzy laktoferyną a jonami manganu, przygotowaną w poprzednich doświadczeniach MnLf zawieszano w wodzie MilliQ (ultraczystej) oraz buforach o różnym składzie i wartościach pH, po czym przez 16 godzin monitorowano absorbancję przy 426 nm. Stabilność wiązania manganu przez MnLf rozpuszczoną w wodzie, buforowanym fosforanami roztworze soli fizjologicznej (PBS, ang. phosphate buffered salinę) oraz buforach: HEPES (pH 7), octanowym (pH 4) i fosforanowym (pH 6, 6.5, 7, 7.5, 8) ilustruje fig. 2.

Zaobserwowano wyraźną zależność stopnia uwalniania manganu przez laktoferynę od składu rozpuszczalnika. MnLf jest stabilna w rozpuszczalnikach o pH obojętnym lub zasadowym, które nie zawierają jonów mogących tworzyć słabo rozpuszczalne sole z jonami manganu. Po 16 godzinach nie obserwuje się uwalniania manganu w przypadku rozpuszczenia MnLf w wodzie MilliQ, buforze HEPES (pH 7), roztworze PBS oraz buforze fosforanowym o pH 8.0. Obniżanie pH w przypadku buforu fosforanowego prawdopodobnie wpływa na konformację białka - protonacja niektórych reszt aminokwasowych osłabia siłę wiązania jonów manganu. Rosnące stężenie jonów H⁺ koreluje z poziomem uwolnionego z MnLf manganu - proces ten najwydajniej zaszedł w buforze octanowym o pH 4.

Ocena stopnia wysycenia kompleksu manganem

Ilościowe określenie zawartości manganu oraz żelaza w manganowej laktoferynie zostało przeprowadzone za pomocą techniki IPC-OES (lnductively coupled plasma optical emission spectroscopy) w wcześniej zmineralizowanych za pomocą 65% ultraczystego kwasu azotowego próbkach. Stężenie laktoferyny w uzyskanym preparacie oznaczono za pomocą testu ELISA. W Tabeli 1 zestawiono wyniki oznaczeń dla trzech niezależnych powtórzeń uzyskiwania manganowej formy laktoferyny. Wyniki przedstawione w Tabeli 1 wskazują, że stosunek manganu do laktoferyny w badanych próbkach wynosi około 1, odpowiada on 50% wysyceniu laktoferyny jonami manganu. Uzyskany wynik jest zgodny z rezultatami uzyskanymi podczas rozdziałów za pomocą elektroforezy kapilarnej i przedstawiony został na fig. 3 i fig. 4.

Tabela 1. Zawartość manganu i żelaza w trzech niezależnych próbkach oczyszczonej manganowej laktoferyny przypadających na mol białka.

Próbka	pH	Mn/Lf [M/M]	Średnie wysycenie [M/M]
1	7.5	0,99	47±2
2	0,92
3	0,91
1	8.5	2,55	127±1
2	2,56
3	2.53

Analiza czystości kompleksu według wynalazku

Zawartość laktoferyny w preparacie oceniono na podstawie rozdziału z wykorzystaniem techniki SDS-PAGE. Fotografię żelu SDS-PAGE uzyskanego dla próbek manganowej formy laktoferyny, wyjściowej laktoferyny (DMV), holo oraz a po laktoferyny przedstawia fig. 5. Zestawienie rozdziałów dla powyższych form pozwala na porównanie czystości preparatów. Na podstawie uzyskanego żelu SDSPAGE (przedstawionego na fig. 5), czystość uzyskanego preparatu manganowej formy laktoferyny oszacowano na 90%. Sposób uzyskiwania formy manganowej nie powoduje degradacji białka i zapewnia mu pożądaną aktywność biologiczną.

PL 238 483 B1

Ocena stopnia utlenienia manganu w uzyskanym preparacie MnLf

Pomiary widm EPR pozwoliły na ocenę stopnia utlenienia manganu w przygotowanych próbkach MnLf. Przeprowadzone przez nas pomiary udowodniły, że w przypadku MnLf uzyskanej w pH 7.5 mangan występuje wyłącznie jako jon Mn³⁺ ze względu na brak sygnału od Mn²⁺ na widmie przedstawionym na fig. 6. Niewielki pik obserwowany dla MnLf uzyskanej w pH 7.5 pochodzi od śladowych ilości Fe³⁺. W białku uzyskanym w pH 8.5 widoczne są znaczne ilości Mn²⁺. Analiza intensywności sygnału wskazuje na to, że około 20% manganu występuje na drugim stopniu utlenienia. Pozostała część manganu na trzecim stopniu utlenienia nie jest widoczna na widmie, ale możemy zakładać jej obecność ze względu na niską intensywność sygnału dla Mn²⁺ w stosunku do wyników uzyskanych za pomocą ICPOES oraz ELIS Y (Tabela 1). Uzyskane wyniki potwierdzają, iż w pH 8.5 i wyższym następuje niespecyficzne wiązanie manganu, co potwierdza również wyższe niż 100% wysycenie preparatu manganowej laktoferyny uzyskanej w takich warunkach (Tabela 1). Stosowane dotychczas metody wykorzystywały syntezę w 0.1 M buforze węglanowym, którego pH wynosi około 9 w temperaturze pokojowej. W takich warunkach możemy spodziewać jeszcze większego stopnia niespecyficznego wiązania Mn²⁺. Dodatkowo zastosowanie wodorowęglanu nie jest korzystne w przypadku wysycania laktoferyny manganem, ze względu na tworzenie nierozpuszczalnych węglanów manganu.

Uwalnianie manganu przez laktoferynę w warunkach modelowych układu pokarmowego

Określenie stopnia uwalniania jonów manganu w warunkach symulujących środowisko układu pokarmowego wcześniaka zostało przeprowadzone poprzez zastosowanie dializy 10 ml manganowej formy laktoferyny o stężeniu 50 mg/ml do 200 ml buforu o pH 4. Następnie po 2 h inkubacji pH w tym buforze zostało zwiększone poprzez dodatek NaOH. Po osiągnięciu pH 6 lakforerynę inkubowano godzinę, a pH ponownie podniesiono do wartości 7.5 i inkubowano kolejną godzinę. Na każdym etapie pobierano z worka dializacyjnego 100 μl próbki białka. Pobraną laktoferynę zmineralizowano za pomocą 65% kwasu azotowego. Zawartość Mn i Fe w próbce oznaczono metodą ICP-OES. Eksperyment dla MnLf prowadzono równolegle z holoLf w identycznych warunkach. Przedstawione doświadczenie w uproszczony sposób odwzorowuje warunki panujące w układzie pokarmowym wcześniaka. Ze względu na nie w pełni rozwinięty układ pokarmowy, pH żołądka u wcześniaków i dzieci z niską masą urodzeniową jest wyższe niż u dzieci urodzonych w terminie, tuż po porodzie pH jest ono zasadowe (w przedziale 7-8), jednak po czasie zaczyna spadać do poziomu 2-3 w ciągu kilku godzin (31). W przeprowadzonym eksperymencie założono, że MnLf może być podawana do godziny po porodzie, kiedy pH częściowo uległo obniżeniu, dlatego pH utrzymywano na poziomie 4. Czas przebywania w żołądku wcześniaka ustalono 2 h, na postawie danych literaturowych (32, 33) (około 60 minut półtrwania w żołądku w przypadku preparatów sztucznych). W jelicie cienkim czas pasażu jelitowego został ustalony na 2 godziny (33). Pierwsza godzina odpowiada warunkom panującym w jelicie cienkim, w drugiej godzinie pH podwyższono do 7.5 odpowiadającego środowisku jelita grubego (patrz fig. 7). Uzyskane wyniki wskazują, że w ciągu 2 godzin w kwaśnym pH żołądka około 50% manganu zostaje uwolnione ze struktury laktoferyny. Pozostała część manganowej formy laktoferyny i treść żołądkowa z uwolnionym manganem może być przetransportowana do jelita cienkiego, gdzie mangan ulega wchłanianiu. Kolejny eksperyment (przedstawiony na fig. 8) miał na celu udowodnienie, że l aktoferyna po uwolnieniu manganu wykazuje swoją aktywność - zdolność do wiązania jonów żelaza. Analogicznie do poprzedniego eksperymentu przeprowadzono inkubację MnLf przez 2 h w pH 4, po tym czasie pH podniesiono do 6 za pomocą NaOH i do buforu dializacyjnego dodano żelazo w ilości moli pozwalających na wysycenie białka w 50% (niedomiar).

Działanie różnych form laktoferyny na wzrost szczepów probiotycznych z rodzaju Lactobacillus

Przeprowadzono testy wpływu różnych form laktoferyny (apoLf, nLf, holoLf, MnLf) na cztery szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus. Wykorzystano dwa szczepy wzorcowe Lactobacillus plantarum (ATCC 14431) i Lactobacillus rhamnsosus GG (ATCC 53103) oraz szczepy L. plantarum i L. rhamnsosus pochodzące z komercyjnie dostępnego preparatu probiotycznego Lactoral firmy Biomed.

W celu określenia wpływu różnych form laktoferyny na wzrost bakterii z rodzaju Lactobacillus stosowano następującą procedurę: całonocną hodowlę bakterii w 10 ml bulionu MRS wirowano (10 minut, 10 000 x g), a pelet bakterii zawieszano w 10 ml buforowanego fosforanami roztworu soli fizjologicznej (PBS). Płukanie wykonywano dwukrotnie, po czym zawiesinę rozcieńczano do uzyskania wyjściowego stężenia bakterii ok. 10⁴ cfu/ml w następujących podłożach hodowlanych:

- bulionie MRS - pozytywna kontrola wzrostu.

PL 238 483 B1

- bulionie MRS-/- - bulion MRS nie zawierający soli manganu ani jonów żelaza. Celem pozbycia się jonów żelaza, podłoże inkubowano przez 6 godzin z jonowymieniaczem Chelex-100, którego następnie pozbywano się przez filtrację. Podłoże to stanowiło negatywną kontrolę wzrostu.

- bulionie MRS-/- z dodatkiem różnych form laktoferyny (apolaktoferyna - A, natywna laktoferyna - N, hololaktoferyna - H, Mn - laktoferyna wysyconą jonami manganu) w stężeniach 0.6, 5 i 40 mg/ml.

Z tak przygotowanych zawiesin bakterii przenoszono 300 μl na 96-dołkowe testowe płytki hodowlane. Korzystając z czytnika mikropłytek Tecan M200 PRO, monitorowano gęstość hodowli przez 24 h w temperaturze 37°C.

Uzyskane wyniki (patrz fig. 9 i 10) jednoznacznie wskazują, że jedynie laktoferyna wysyconą jonami manganu zdolna jest do stymulacji wzrostu wszystkich badanych szczepów bakterii z rodzaju Lactobacillus. Obserwuje się kinetykę wzrostu podobną do tej, jaką bakterie te osiągają w pełnym bulionie MRS zawierającym w swoim składzie także jony manganu. Jest to zgodne z opisywanym w literaturze uzależnieniem tych bakterii od jonów manganu - w centrach aktywnych syntetyzowanych przez nie białek znajduje się mangan, a nie żelazo. W odróżnieniu od MnLf zastosowanie pozostałych form laktoferyny (apoLf, nLf, holoLf) nie powoduje przyspieszenia wzrostu bakterii probiotycznych. Stanowi to istotną przesłankę do uznania laktoferyny wysyconej manganem za jedyną formę tego białka o pozytywnym działaniu bakterie z rodzaju Lactobacillus. Wniosek ten stanowi o przewadze wynalazku nad obecnymi na rynku oraz opisanymi w literaturze naukowej preparatami laktoferyny.

Wpływ kompleksu LfMn na komórki ludzkie epitelium jelitowego

Wykorzystano komórki linii ludzkiego nabłonka jelitowego (Caco-2), by określić wpływ laktoferyny wysyconej jonami manganu na żywotność i funkcjonowanie epitelium. Przeprowadzono test z aneksyną V-FITC i jodkiem propidyny (Annexin-V-FLUOS Staining Kit, Roche), by określić poziom komórek apoptotycznych i nekrotycznych. Nie zaobserwowano istotnych statystycznie różnic w poziomie apoptozy i nekrozy komórek pod wpływem testowanych form laktoferyny w stężeniu 5 mg/ml (nekroza na poziomie 12%, apoptoza na poziomie 0,5%). Laktoferyna wysyconą jonami manganu nie wykazuje odmiennych właściwości w tym względzie w stosunku do komercyjnie dostępnego preparatu. Wykonano także barwienie immunofluorescencyjne na obecność białek połączeń ścisłych (przeciwciała anty-okludyna sprzężone z FITC), by sprawdzić, czy laktoferyna wysyconą jonami manganu nie wpływa integralność bariery tworzonej przez komórki epitelialne. Uzyskane wyniki (patrz fig. 11) wskazują, że żadna z form laktoferyny nie wpływa istotnie na tworzenie połączeń ścisłych między komórkami epitelium. W tym względzie przedmiot wynalazku także nie różni się od dostępnej na rynku formy laktoferyny. Uzyskane rezultaty sugerują, że laktoferyna wysyconej jonami manganu nie wykazuje efektów cytotoksycznych ani nie narusza integralności epitelium jelitowego. W przeprowadzonych testach ta forma laktoferyny nie różni się w sposób istotny od mającej status GRAS komercyjnie dostępnej natywnej laktoferyny.

Immunostymulacyjne właściwości MnLf

Przeprowadzono szereg doświadczeń, by sprawdzić immunostymulacyjne własności laktoferyny wysyconej jonami manganu. W tym celu posłużono się testem immunoenzymatycznym na fazie stałej (ELISA), by oznaczyć poziom cytokin pro- (TNF-α, IL-6, IL-8) i antyzapalnych (IL-10) w nadsączach znad hodowli komórek poddanych działaniu różnych form laktoferyny. W przypadku komórek linii Caco-2 nie zaobserwowano stymulacji komórek do sekrecji badanych cytokin pod wpływem żadnej z badanych form (stężenie cytokin poniżej progów detekcji testu). W doświadczeniach na komórkach układu odp ornościowego (wykorzystano mysią linię makrofagową J774.A1) także nie zaobserwowano wzrostu sekrecji cytokin po inkubacji komórek z badanymi formami laktoferyny (patrz fig. 12).

W części doświadczeń na makrofagach J774.A1 sprawdzano także wpływ laktoferyny na indukowaną przez obecność lipopolisacharydu lub zabitych komórek bakteryjnych sekrecję cytokin prozapalnych przez makrofagi. W tych eksperymentach makrofagom zadawano następujące czynniki:

• LPS wyizolowany z bakterii Escherichia coli (Sigma-Aldrich), 100 ng/ml • zawiesina zabitych przez autoklawowanie (temperatura 121°C, ciśnienie 1,02 bar, czas 15 minut) bakterii Escherichia coli szczepu 3A/1 - zachowano stosunek liczby makrofagów do liczby komórek bakteryjnych na poziomie 1:20 • różne formy laktoferyny (apoLf, nLf, holoLf, MnLf) w stężeniu 5 mg/ml.

Dla części próbek sekwencyjnie zadawano czynnik bakteryjny (LPS lub zabite bakterie E. coli) i badaną formę Lf. W przypadku tych próbek pierwszy czynnik podawano na 30 minut, po czym do

PL 238 483 B1 próbki dodawano drugi badany czynnik (LPS/E. coli dla próbek z laktoferyną, a laktoferynę dla próbek z LPS/E. coli). Po kolejnych 23 godzinach zbierano nadsącze i oznaczano poziomy cytokin (patrz fig. 12).

Przeprowadzone doświadczenia potwierdziły także zdolność laktoferyny do hamowania immunostymulacyjnego wpływu LPS (patrz fig. 12). Dodanie laktoferyny zarówno przed jak i po inkubacji komórek z lipopolisacharydem powoduje spadek stężenia cytokin prozapalnych do poziomu 15-20% w porównaniu do komórek stymulowanych LPS. W tym względzie syntetyzowana przez nas MnLf nie różni się od komercyjnie dostępnych i opisanych w literaturze form laktoferyny.

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompleks laktoferyny z jonami manganu, znamienny tym, że jony manganu (III) stanowią 96-98% mol. względem ilości moli wszystkich jonów metali w kompleksie.
2. 2. Kompleks według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że jony manganu (III) stanowią 98% mol. względem ilości moli wszystkich jonów metali w kompleksie.
3. 3. Kompleks według zastrzeżenia 1 albo 2, znamienny tym, że poziom wysycenia laktoferyny jonami Mn³⁺ wynosi co najwyżej 50%.
4. 4. Sposób otrzymywania kompleksu laktoferyny z jonami manganu, jak określono w zastrzeżeniach od 1 do 3 obejmujący prowadzenie reakcji laktoferyny z solą manganu i oczyszczanie kompleksu laktoferyny z manganem, znamienny tym, że reakcję prowadzi się poprzez dializę w pH w zakresie 7,0-7,5, w buforze wybranym z grupy: 20-100 mM HEPES, 100 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, temperaturze w zakresie 30-40°C, a sól manganu stanowi cytrynian manganu (II), w nadmiarze molowym jonów manganu 5-20 w stosunku do laktoferyny, w czasie 12-48 h a oczyszczanie kompleksu prowadzi się poprzez dializę do wody ultraczystej przez 10-24 h w temperaturze pokojowej z 3-krotną zmianą wody.
5. 5. Sposób według zastrzeżenia 4, znamienny tym, że stosunek molowy jonów Mn²⁺ i kwasu cytrynowego w buforze o pH 7,4 jest 3:2.
6. 6. Sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że reakcję laktoferyny z solą manganu prowadzi się w warunkach tlenowych.
7. 7. Sposób według zastrzeżenia 4, znamienny tym, że buforem jest HEPES o stężeniu 50 mM.
8. 8. Sposób według zastrzeżenia 4, znamienny tym, że reakcję laktoferyny z solą manganu pro- wadzi się w temperaturze 37°C.
9. 9. Sposób według zastrzeżenia 4, znamienny tym, że reakcję laktoferyny z solą manganu prowadzi się w co najmniej 5-krotnym molowym nadmiarze jonów Mn²⁺ względem laktoferyny.
10. 10. Sposób według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że reakcję laktoferyny z solą manganu prowadzi do uzyskania kompleksu białka związanego wyłącznie z jonami Mn³⁺.
11. 11. Kompleks laktoferyny z jonami manganu określony zastrzeżeniami od 1 do 3 do zastosowania do wytwarzania suplementu diety do profilaktyki zaburzeń mikroflory układu pokarmowego.
12. 12. Kompleks laktoferyny do zastosowania według zastrzeżenia 11, znamienny tym, że zaburzeniami mikroflory układu bakteryjnego są dysbakterioza związana z antybiotykoterapią, onkoterapią, wcześniactwem, stanami zapalnymi jelit.
13. 13. Kompleks laktoferyny do zastosowania według zastrzeżenia 11, znamienny tym, że suplement diety podawany jest celem regulacji mikroflory układu pokarmowego na korzyść bakterii probiotycznych.
14. 14. Kompleks laktoferyny do zastosowania według któregokolwiek zastrzeżenia od 11 do 13, znamienny tym, że dolegliwości są wywołane przez bakterie, grzyby i/lub wirusy.
15. 15. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca kompleks laktoferyny i jonów manganu jak opisano w zastrzeżeniach od 1 do 3.