PL238196B1 - Sposób usuwania tlenu z pożywek fermentacyjnych sterylizowanych metodą ozonowania - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób usuwania tlenu z pożywek fermentacyjnych sterylizowanych metodą ozonowania, wykorzystywanych do beztlenowych procesów biotechnologicznych.

Ozonowanie stanowi skuteczną metodę sterylizacji pożywek fermentacyjnych na zimno, bez stosowania wysokich temperatur [Dziugan i wsp., Ozonation as an effective way to stabilize new kinds of fermentation media used in biotechnological production of liquid fuel additives, 2016]. Zastosowanie ozonu w przetwarzaniu żywności zostało zatwierdzone przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków, jako środka przeciwdrobnoustrojowego do obróbki, przechowywania i przetwarzania żywności. Stwierdzono, że ozonowanie jest także bezpieczną metodą usuwania związków toksycznych ze środowisk naturalnych, np. bisfenolu A (substancji zaburzającej gospodarkę hormonalną człowieka i zwierząt) [Kusvuran i Yildirim, Degradation of bisphenol A by ozonation and determination of degradation intermediates by gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-mass spectrometry, 2013].

Sterylizacja pożywek fermentacyjnych poprzez ich ozonowanie zapewnia nie tylko zabicie mikroorganizmów zanieczyszczających brzeczki fermentacyjne, ale także powoduje odbarwienie brzeczek, utlenienie inhibitorów procesów fermentacyjnych: SO2 i NO2 oraz związków powierzchniowo-czynnych.

Konwencjonalne beztlenowe procesy biotechnologiczne powinny jednakże odbywać się w ściśle beztlenowym środowisku lub z niewielkim dostępem wolnego tlenu. W związku z tym, zastosowanie ozonu, jako czynnika wyjaławiającego, stanowi problem ze względu na znaczną pozostałość tlenu w pożywce po sterylizacji, co hamuje procesy biotechnologiczne prowadzone w warunkach beztlenowych. Wysokie stężenia tlenu powodują zahamowanie procesów biotechnologicznych prowadzonych z udziałem drobnoustrojów beztlenowych [Botheju i wsp., Oxygen effects in anaerobic digestion, 2009].

Znane są metody chemiczne usuwania tlenu ze środowiska fermentacyjnego za pomocą redukujących związków chemicznych. W patencie US 5178796 opisano sposób usuwania rozpuszczonego tlenu z roztworów wodnych za pomocą soli kwasu ketoglukonowego. Z kolei w amerykańskim opisie patentowym US 4524015 opisano absorbcję tlenu za pomocą kwasu askorbinowego. Natomiast w patencie europejskim EP0598384 przedstawiona została metoda usuwania tlenu poprzez zastosowanie gazowego N2.

Często do usuwania tlenu stosowane są także reduktory nieorganiczne w postaci siarczków [Luther i wsp., Thermodynamics and kinetics of sulfide oxidation by oxygen: A look at inorganically controlled reactions and biologically mediated processes in the environment, 2011 ]. Wyniki badań wskazują jednak, że niektóre reduktory, zwłaszcza te oparte na siarczkach, mogą zaburzać wzrost drobnoustrojów [Fukushima i wsp., Use of photocatalytic reduction to hasten prep aration of culture media for saccharolytic Clostridium species, 2003]. Niektóre badania sugerują także użycie chlorowodorku cysteiny jako czynnika redukującego [Mould i wsp., A review and simplification of the in vitro incubation medium, 2005].

Celem wynalazku jest opracowanie skutecznego sposobu usuwania tlenu z pożywek fermentacyjnych po procesie ozonowania, bez konieczności stosowania związków chemicznych mogących zaburzać procesy biotechnologiczne.

Nieoczekiwanie okazało się, że cel wynalazku został osiągnięty poprzez wykorzystanie drożdży Metschnikowia spp.

Sposób usuwania tlenu z pożywek fermentacyjnych sterylizowanych metodą ozonowania wykorzystywanych do beztlenowych procesów biotechnologicznych według wynalazku polega na tym, że do pożywki po sterylizacji dodaje się biomasę drożdży z rodzaju Metschnikowia w ilości od 1% do 10% objętościowych (v/v) w przypadku zawiesiny lub od 1% do 10% wagowych w przypadku pasty, po czym prowadzi się ich inkubację w czasie od 2 do 24 godzin w temperaturze od 15 do 30°C.

Korzystnie stosuje się biomasę drożdży w postaci zawiesiny o koncentracji komórek 105-10⁸ jtk/ml lub pasty o koncentracji komórek 10⁹-10¹⁰ jtk/gram.

Korzystnie stosuje się pożywki składające się z brzeczek fermentacyjnych o stężeniu od 2°P do 20°P.

Korzystnie stosuje się pożywkę słodową lub melasową.

Sposób według wynalazku pozwala na usunięcie tlenu z pożywki bez konieczności stosowania związków chemicznych mogących zaburzać procesy biotechnologiczne.

Metschnikowia spp. to drożdże niekonwencjonalne, różniące się od konwencjonalnych drożdży Saccharomyces cerevisiae słabą zdolnością fermentacyjną. Drożdże z rodzaju Metschnikowia rozmnażają się wegetatywnie przez pączkowanie, tworząc słabo rozbudowaną pseudogrzybnię. W starszych

PL 238 196 B1 hodowlach tworzą chlamydospory zawierające tłuszcz. Ponadto znane są ich bardzo dobre zdolności adaptacyjne do zmiennych warunków środowiska oraz oporność na stres środowiskowy.

Istotną cechą jest również ich wysoka aktywność antydrobnoustrojowa, zwłaszcza przeciwgrzybowa, w stosunku do patogenów roślin i mikroflory zanieczyszczającej środowiska fermentacyjne [Pawlikowska i Kręgiel, Niekonwencjonalne drożdże Metschnikowia pulcherrima i ich zastosowanie w biotechnologii, 2017]. Aktywność ta jest jednak ograniczona i nie wpływa na wzrost mikroorganizmów beztlenowych. W warunkach beztlenowych drożdże te nie namnażają się i są obojętne dla przemysłowych szczepów mikroorganizmów beztlenowych. Zahamowanie wzrostu drożdży Metschnikowia spp. po usunięciu tlenu z pożywki sprawia, że ich biomasa może stanowić dodatkowe źródło pierwiastków biogennych: C, N, S, P dla szczepów przemysłowych prowadzących procesy beztlenowe.

Przedmiot wynalazku ilustrują poniższe przykłady oraz rysunek, na którym:

Fig. 1. przedstawia wykres dynamiki usuwania tlenu z brzeczki słodowej 12°P przy użyciu drożdży Metschnikowia sp. w dawce 1% v/v oraz 10% v/v.

Fig. 2. przedstawia wykres dynamiki usuwania tlenu z brzeczki melasowej 2°P przy użyciu drożdży Metschnikowia sp. w dawce 1% v/v oraz 10% v/v.

Fig. 3. przedstawia wykres dynamiki usuwania tlenu z brzeczki melasowej 2°P przy użyciu drożdży Metschnikowia spp. w dawce 10% w/v.

Przykład 1

Do reaktora o pojemności 1 l wprowadzono 500 ml pożywki słodowej o zawartości ekstraktu 12°P i poddano ją procesowi ozonowania w czasie 20 min, przy przepływie 0,4 ml na minutę przy stężeniu ozonu 100 g O3 na m³.

Następnie do ozonowanej pożywki o zawartości tlenu ponad 16 mg O2/l wprowadzono 50 ml (10% v/v) zawiesiny drożdży Metschnikowia spp. o koncentracji komórek 0,5 χ 10⁷ jtk/ml i zawiesinę pozostawiono w temp. 25°C na czas 24 godzin, mierząc w sposób ciągły zawartość tlenu w pożywce za pomocą czujnika amperometrycznego InPro 6000.

Osobną próbę przeprowadzono w tych samych warunkach z zastosowaniem mniejszej dawki drożdży wynoszącej 5 ml (1% v/v).

Wyniki przedstawiono na Fig. 1.

Wykazano, że zastosowanie dawki 10% v/v drożdży powoduje usunięcie tlenu z brzeczki słodowej do poziomu 0,05 mg O2/l w czasie 2 godzin, natomiast w dawce 1% v/v odpowiednio w czasie 15,5 godziny. Zawartość biomasy drożdży w brzeczce słodowej po czasie usunięcia tlenu z pożywki, wyniosła odpowiednio 6 χ 106 jtk/ml oraz 2 χ 106 jtk/ml, co w efekcie, oprócz usunięcia tlenu, dało wzbogacenie brzeczki w białko na poziomie 0,1:0,2 mg/ml.

Przykład 2

Do reaktora o pojemności 1 l wprowadzono 500 ml pożywki melasowej o zawartości ekstraktu 2°P i poddano ją procesowi ozonowania w czasie 20 min, przy przepływie 0,4 ml na minutę przy stężeniu ozonu 100 g O3 na m³.

Następnie do ozonowanej pożywki o zawartości tlenu ponad 16 mg O2/l wprowadzono 50 ml (10% v/v) zawiesiny drożdży Metschnikowia spp. o koncentracji komórek 1,5 χ 108 jtk/ml i zawiesinę pozostawiono w temp. 20°C na okres 24 godzin, mierząc w sposób ciągły zawartość tlenu w pożywce za pomocą czujnika amperometrycznego InPro 6000.

Osobną próbę przeprowadzono w tych samych warunkach z zastosowaniem mniejszej dawki drożdży wynoszącej 5 ml (1% v/v).

Wyniki przedstawiono na Fig. 2.

Wykazano, że zastosowanie dawki 10% v/v drożdży powoduje usunięcie tlenu z brzeczki melasowej do poziomu 0,05 mg O2/l w czasie 4,5 godziny, natomiast w dawce 1% v/v odpowiednio w czasie 18 godzin. Zawartość biomasy drożdży w brzeczce melasowej po czasie usunięcia tlenu z pożywki, wyniosła odpowiednio 1 χ 10⁷ jtk/ml oraz 3 χ 106 jtk/ml, co w efekcie, oprócz usunięcia tlenu, dało wzbogacenie brzeczki w białko na poziomie 0,1:0,8 mg/ml.

Przykład 3

Do reaktora o pojemności 1 l wprowadzono 500 ml pożywki melasowej o zawartości ekstraktu 2°P i poddano ją procesowi ozonowania w czasie 20 min, przy przepływie 0,4 ml na minutę przy stężeniu ozonu 100 g O3 na m³.

Następnie do ozonowanej pożywki o zawartości tlenu ponad 16 mg O2/l wprowadzono 50 g (10% w/v) biomasę drożdży Metschnikowia spp. w postaci pasty o koncentracji komórek około

PL 238 196 B1

1,2 χ 10¹⁰ jtk/g, zawiesinę wymieszano i pozostawiono w temp. 20°C na okres 24 godzin, mierząc w sposób ciągły zawartość tlenu w pożywce za pomocą czujnika amperometrycznego InPro 6000.

Wyniki przedstawiono na Fig. 3.

Wykazano, że zastosowanie dawki 10% w/v drożdży powoduje usunięcie tlenu z brzeczki melasowej do poziomu 0,05 mg O2/l w czasie 2,5 godzin. Zawartość biomasy drożdży w brzeczce melasowej po czasie usunięcia tlenu z pożywki, wyniosła 1 χ 109 jtk/ml, oprócz usunięcia tlenu, dało wzbogacenie brzeczki w białko na poziomie 2,5 mg/ml.

Claims (4)

1. Sposób usuwania tlenu z pożywek sterylizowanych metodą ozonowania wykorzystywanych do beztlenowych procesów biotechnologicznych, znamienny tym, że do pożywki po sterylizacji metodą ozonowania dodaje się biomasę drożdży z rodzaju Metschnikowia, w ilości od 1 % do 10% objętościowych (v/v) w przypadku zawiesiny lub od 1 % do 10% wagowych w przypadku pasty, po czym prowadzi się ich inkubację w czasie od 2 godzin do 24 godzin w temperaturze od 15 do 30°C.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się biomasę drożdży w postaci zawiesiny o koncentracji komórek 105-108 jtk/ml, lub pasty o koncentracji komórek 109-10¹⁰ jtk/gram.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się pożywki składające się z brzeczek fermentacyjnych o stężeniu od 2°P do 20°P.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że stosuje się pożywkę słodową lub melasową.