PL237893B1

PL237893B1 - Nowe L-prolinowe sulfonamidowe pochodne zawierające układ pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny, sposób ich wytwarzania, ich zastosowania oraz kompozycja farmaceutyczna je zawierająca

Info

Publication number: PL237893B1
Application number: PL427991A
Authority: PL
Inventors: Mariusz Mojzych; Katarzyna Kotwica-Mojzych; Anna Bielawska; Krzysztof Bielawski; Dariusz PAWLAK; Dariusz Pawlak; Justyna Magdalena HERMANOWICZ; Justyna Magdalena Hermanowicz; Anna TANKIEWICZ-KWEDLO; Anna Tankiewicz-Kwedlo; Anna SZYMANOWSKA; Anna Szymanowska
Original assignee: Univ Medyczny W Bialymstoku; Univ Medyczny W Lublinie; Univ Przyrodniczo Humanistyczny W Siedlcach
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2021-06-14
Also published as: EP3886990B1; US20220017529A1; CA3121473C; CA3121473A1; WO2020111956A1; PL427991A1; EP3886990A1; EP3886990C0

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku są nowe pochodne sulfonamidowe 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny zawierające w grupie sulfonamidowej ester metylowy L-proliny lub 4-hydroksy-L-proliny. Związki te wykazują działanie przeciwnowotworowe, cytostatyczne, cytotoksyczne i antyproliferacyjne, w szczególności względem komórek nowotworowych, zwłaszcza komórek nowotworu przewodu pokarmowego, jak komórki raka żołądka i raka jelita grubego. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania takich nowych pochodnych sulfonamidowych 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny zawierających ester metylowy L-proliny lub 4-hydroksy-L-proliny. Przedmiotem niniejszego wynalazku są także zastosowania takich nowych pochodnych sulfonamidowych 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny zawierających ester metylowy L-proliny lub 4-hydroksy-L-proliny związane z ich aktywnością przeciwnowotworową, cytotoksyczną i/lub cytostatyczną, w szczególności względem komórek nowotworowych, zwłaszcza komórek raka żołądka i raka jelita grubego, a także kompozycja farmaceutyczna zawierająca takie pochodne sulfonamidowe 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny zawierające w grupie sulfonamidowej ester metylowy L-proliny lub 4-hydroksy-L-proliny.

Ze stanu techniki znana jest pochodna 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny, która wykazuje działanie przeciwnowotworowe, jak również znane są sposoby jej syntezy (Mojzych M, Chem. Soc. Pak., 2011,33, 123-128; Mojzych M, Rykowski A, Heterocycles, 2004, 63, 1829-1838).

Z patentu nr PL-198966 oraz z piśmiennictwa (Mojzych M, Rykowski A, Heterocycles, 2004, 63, 1829-1838) znana jest 5-fenylo-7-metylo-1/7-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyna oraz synteza 1 -fenylo-3-metylo-5-metylosulfonylo-1 /7-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazyny.

Celem niniejszego wynalazku było dostarczenie nowych związków nadających się do leczenia nowotworów, zwłaszcza nowotworów przewodu pokarmowego, w szczególności raka żołądka i/lub raka jelita grubego. Celem niniejszego wynalazku było również dostarczenie nowych związków o działaniu cytotoksycznym i cytostatycznym. Celem niniejszego wynalazku było także dostarczenie sposobu wytwarzania takich związków, kompozycji farmaceutycznych zawierających takie związki oraz zastosowań takich związków.

Cele te zrealizowano przy pomocy rozwiązań przedstawionych w załączonych zastrzeżeniach patentowych. Nieoczekiwanie stwierdzono bowiem, że cele te można zrealizować z zastosowaniem nowych pochodnych sulfonamidowych 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny zawierających ester metylowy L-proliny lub 4-hydroksy-L-proliny.

Przedmiotem wynalazku jest pochodna sulfonamidowa 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny o ogólnym wzorze 1:

(wzór 1) w którym R oznacza ester metylowy proliny lub ester metylowy 4-hydroksy-L-proliny.

Korzystnie związek według wynalazku stanowi pochodna sulfonamidowa 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny zawierająca w grupie sulfonamidowej ester metylowy L-proliny o wzorze 2:

PL 237 893 Β1

(wzór 2).

Korzystnie związek według wynalazku stanowi pochodna sulfonamidowa 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny zawierająca w grupie sulfonamidowej ester metylowy 4-hydroksy-Ł-proliny o wzorze 3:

(wzór 3).

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania sulfonamidowej pochodnej 5-fenylo7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]-triazyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza ester metylowy proliny lub ester metylowy 4-hydroksy-Ł-proliny, znamienny tym, że 1-(para-chlorosulfonylofenylo)-3-metylo-5-metylosulfonylo-1/7-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazynę poddaje się reakcji z chlorowodorkiem estru metylowego Ł-proliny albo 4-hydroksy-Ł-proliny w bezwodnym acetonitrylu w obecności węglanu sodu i otrzymuje się odpowiednią pochodną sulfonamidową z grupą metylosulfonową w pozycji 5 układu 1/7-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazyny, którą to pochodną następnie poddaje się reakcji z azydkiem sodu w bezwodnym etanolu.

Korzystnie otrzymaną tak pochodną sulfonamidową 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]-triazyny odpowiednio o wzorze 2 lub 3 oczyszcza się chromatograficznie, korzystniej z zastosowaniem chromatografii cieczowej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto pochodna jak określono powyżej do zastosowania jako lek.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto pochodna jak określono powyżej do zastosowania jako lek do leczenia nowotworu.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto pochodna jak określono powyżej do zastosowania jako lek do leczenia raka przewodu pokarmowego.

Korzystnie w zastosowaniach według wynalazku nowotwór przewodu pokarmowego stanowi rak żołądka.

Korzystnie w zastosowaniach według wynalazku nowotwór przewodu pokarmowego stanowi rak jelita grubego.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto pochodna jak określono powyżej do zastosowania jako środek cytostatyczny.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto pochodna jak określono powyżej do zastosowania jako środek cytotoksyczny.

PL 237 893 Β1

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że jako związek aktywny zawiera związek jak określono powyżej oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera jako składnik aktywny pochodną o ogólnym wzorze 1 według wynalazku, w którym R oznacza ester metylowy 4-hydroksy-Ł-proliny.

Pochodne sulfonamidowe 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny o ogólnym wzorze 1 będące przedmiotem niniejszego zgłoszenia patentowego pomimo obecności znanego szkieletu układu pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny mają w pełni odmienną strukturę od związków opisanych w piśmiennictwie i charakteryzują się obecnością grupy sulfonamidowej zawierającej ester metylowy Ł-proliny lub 4-hydroksy-Ł-proliny, co nadaje tym związkom charakterystyczne dla nich właściwości.

Pochodna sulfonamidowa 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny według wynalazku, w której R w ogólnym wzorze 1 oznacza ester metylowy Ł-proliny, ma następujący wzór strukturalny:

h₃C wzór 2.

Pochodna sulfonamidowa 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny będąca przedmiotem niniejszego zgłoszenia patentowego, w której R w ogólnym wzorze 1 oznacza ester metylowy 4-hydroksy Ł-proliny, ma następujący wzór strukturalny:

wzór 3.

W wyniku przeprowadzonych prób i badań, zarówno w układzie in vitro jak i in vivo, okazało się, że związki według wynalazku wykazują działanie przeciwnowotworowe, cytostatyczne, cytotoksyczne, antyapoptotyczne i antyproliferacyjne, dzięki czemu mogą być one stosowane jako leki, w szczególności leki do leczenia nowotworów, zwłaszcza do leczenia nowotworów układu pokarmowego, w szczególności raka żołądka i/lub raka jelita grubego. Dzięki swoim właściwościom związki według wynalazku mogą być także stosowane jako środki antyapoptotyczne, antyproliferacyjne, cytostatyczne i/lub cytotoksyczne.

Oznaczanie aktywności przeciwnowotworowej nowych pochodnych sulfonamidowych 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]-triazyny zawierających ester metylowy Ł-proliny lub 4-hydroksy-Ł-proliny według wynalazku w warunkach in vitro przeprowadzono wykorzystując komórki raka żołądka (linia komórkowa AGS) i komórki raka jelita grubego (linia komórkowa DLD-1 i linia komórkowa

PL 237 893 B1

HT-29). Na hodowlach takich komórek nowotworowych przeprowadzono pomiar cytotoksyczności związków według wynalazku oraz dokonano oceny ich wpływu na biosyntezę DNA badanych komórek nowotworowych. Dodatkowo na liniach komórkowych raka jelita grubego (linia komórkowa DLD-1 i linia komórkowa HT-29) dokonano oceny wpływu tych związków na wybrane znaczniki biochemiczne apoptozy, takie jak: utrata asymetrii rozmieszczenia fosfolipidów błony komórkowej oraz zmiana potencjału mitochondrialnego. Pomiar cytotoksyczności związków według wynalazku wykonano metodą Carmichael'a, określając żywotność komórek przy użyciu soli tetrazolowej (MTT) w badaniu MTT. Wpływ związków na proces biosyntezy DNA w badanych komórkach raka żołądka i jelita grubego oceniono poprzez pomiar wbudowywania [³H]-tymidyny do DNA badanych komórek. Indukcję apoptozy badano wykorzystując metodę z użyciem aneksyny V znakowanej izotiocyjanianem fluoresceiny (Annexin V-FITC), tworzącej w obecności jonów wapnia kompleksy z fosfatydyloseryną. Do oceny zmian potencjału mitochondrialnego wykorzystano zestaw JC-1 MitoScreen kit (BD Biosciences, USA).

Związki według wynalazku wykazują silną aktywność przeciwnowotworową względem badanych linii komórek nowotworowych. Dokładny opis oznaczenia aktywności przeciwnowotworowej związków według wynalazku w warunkach in vitro przedstawiono w przykładzie 2. Ponadto w Tabeli 1 zestawiono wyniki aktywności cytotoksycznej i cytostatycznej związków według wynalazku po 24 godzinach inkubacji. W Tabelach 2 i 3 oraz na Figurach 1 i 2 przedstawiono wpływ związków według wynalazku na indukcję procesów apoptozy w komórkach nowotworowych: DLD-1 i HT-29. Figury 3 i 4 przedstawiają wpływ związków według wynalazku na mitochondrialny potencjał błonowy w komórkach raka jelita grubego (linia komórkowa DLD-1 i linia komórkowa HT-29). Aktywność przeciwnowotworową przykładowego związku według wynalazku (o wzorze 3) w warunkach in vivo przedstawiono w przykładzie 3.

Pochodne sulfonamidowe 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny zawierające w grupie sulfonamidowej ester metylowy L -proliny lub 4-hydroksy- L -proliny według wynalazku otrzymywane są innym sposobem wytwarzania niż sposoby znane w stanie techniki.

Sposób wytwarzania pochodnych sulfonamidowych 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny zawierających w grupie sulfonamidowej ester metylowy L -proliny lub 4-hydroksy-L-proliny według wynalazku charakteryzuje się tym, że 1-(para-chlorosulfonylofenylo)-3-metylo5-metylosulfonylo-1 H-pirazolo[4,3-e ][1,2,4]triazynę poddaje się reakcji z chlorowodorkiem estru metylowego L -proliny albo 4-hydroksy- L -proliny, w zależności od żądanego produktu końcowego, w bezwodnym acetonitrylu w obecności węglanu sodu i otrzymuje się odpowiednią nową pochodną sulfonamidową z grupą metylosulfonową w pozycji 5 układu 1H-pirazolo[4,3-e ][1,2,4]triazyny, którą to pochodną następnie poddaje się reakcji z azydkiem sodu w bezwodnym etanolu i w rezultacie się otrzymuje odpowiednią finalną pochodną sulfonamidową zawierającą odpowiednio w grupie sulfonamidowej ester metylowy L -proliny (związek o wzorze 2) lub 4-hydroksy- L -proliny (związek o wzorze 3), którą to pochodną korzystnie następnie oczyszcza się chromatograficznie, korzystnie z zastosowaniem chromatografii cieczowej.

Przykładowy sposób wytwarzania nowych pochodnych sulfonamidowych 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]-triazyny zawierających w grupie sulfonamidowej ester metylowy L -proliny lub 4-hydroksy- L -proliny według wynalazku przedstawiono w przykładzie 1, w którym podano dane spektroskopowe i temperatury topnienia otrzymanych związków według wynalazku.

Związki według wynalazku można stosować jako takie w zastosowaniach według wynalazku lub w postaci kompozycji farmaceutycznych. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera, oprócz związku według wynalazku jako składnika aktywnego, farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę. Farmaceutycznie akceptowalne nośniki, rozcieńczalniki i zaróbki są znane specjalistom w dziedzinie niniejszego wynalazku i obejmują ciekłą lub nieciekłą bazę kompozycji. Określenie „akceptowalny” oznacza tu, że składniki stosowanej tu kompozycji farmaceutycznej mogą być zmieszane z farmaceutycznie aktywnym składnikiem jak tu zdefiniowano, czyli jednym i/lub więcej niż jednym związkiem według wynalazku, i innym składnikiem w taki sposób, że nie wystąpi żadna interakcja, która mogłaby, w zwykłych warunkach stosowania, istotnie zmniejszyć farmaceutyczną skuteczność kompozycji. Stosowane farmaceutycznie akceptowalne nośniki, rozcieńczalniki i zaróbki muszą posiadać wystarczająco wysoką czystość i wystarczająco niską toksyczność, żeby czynić je odpowiednimi do podawania osobnikowi, który ma być leczony, jak wiadomo w dziedzinie niniejszego wynalazku. Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku można wytwarzać w standardowy sposób. Sposoby wytwarzania kompozycji farmaceutycznych zawierających co najmniej jeden składnik aktywny i farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę są znane w dziedzinie niniejszego wynalazku. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierające jako składnik aktywny co najmniej

PL 237 893 B1 jeden związek według wynalazku można stosować do leczenia nowotworów, zwłaszcza nowotworów przewodu pokarmowego, w szczególności raka żołądka i/lub raka jelita grubego.

Niniejszy wynalazek zostanie poniżej zilustrowany za pomocą przykładów wykonania i figur, które nie mają jednak w jakikolwiek sposób ograniczać zakresu ochrony wynalazku jak zdefiniowano w zastrzeżeniach patentowych. O ile nie wskazano inaczej, stosowano znane i/lub komercyjnie dostępne urządzenia, metody, warunki reakcji, odczynniki i zestawy, takie jakie powszechnie stosuje się w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek i jakie są zalecane przez wytwórców odpowiednich odczynników i zestawów.

Krótki opis figur

Fig. 1 przedstawia wyniki badania indukcji apoptozy w komórkach raka jelita grubego DLD-1 inkubowanych przez 24 godziny z pochodnymi sulfonamidowymi 5-fenylo-7-metylo-pirazolo [4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]-triazyny według wynalazku w stężeniu 1,5 gM i 3,0 gM. Badanie przeprowadzono przy użyciu aneksyny V i jodku propidyny (PI).

Fig. 2 przedstawia wyniki badania apoptozy w komórkach raka jelita grubego HT-29 inkubowanych przez 24 godziny z pochodnymi sulfonamidowymi 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5- b ][1,2,4]triazyny według wynalazku w stężeniu 1,5 gM i 3,0 gM. Badanie przeprowadzono przy użyciu aneksyny V i jodku propidyny (PI).

Fig. 3 przedstawia wyniki oceny spadku mitochondrialnego potencjału błonowego w komórkach raka jelita grubego DLD-1 inkubowanych przez 24 godziny z pochodnymi sulfonamidowymi 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny według wynalazku w stężeniu 1,5 gM i 3,0 gM. Badanie przeprowadzono przy użyciu barwnika JC-1.

Fig. 4 przedstawia wyniki oceny spadku mitochondrialnego potencjału błonowego w komórkach raka jelita grubego HT-29 inkubowanych przez 24 godziny z pochodnymi sulfonamidowymi 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny według wynalazku w stężeniu 1,5 gM i 3,0 gM. Badanie przeprowadzono przy użyciu barwnika JC-1.

Fig. 5 przedstawia wyniki oceny spadku mitochondrialnego potencjału błonowego w komórkach raka jelita grubego HT-29 inkubowanych przez 24 godziny z pochodnymi sulfonamidowymi 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny według wynalazku w stężeniu 1,5 gM i 3,0 gM. Badanie przeprowadzono przy użyciu barwnika JC-1.

Fig. 6 przedstawia wyniki badania wpływu pochodnej sulfonamidowej 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny zawierającej ester metylowy 4-hydroksy- L -proliny według wynalazku (związek o wzorze 3) na objętość guza u myszy z ksenoprzeszczepem DLD-1 i HT-29.

Fig. 7 przedstawia wielkość guza u myszy z ksenoprzeszczepem DLD-1 w grupie kontrolnej (lewa strona) i w grupie otrzymującej pochodną sulfonamidową 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5- b ][1,2,4]triazyny zawierającą ester metylowy 4-hydroksy- L -proliny według wynalazku (związek o wzorze 3) (prawa strona) po dwóch tygodniach doświadczenia.

Fig. 8 przedstawia średnie masy guza u myszy z ksenoprzeszczepem DLD-1 i HT-29 w grupie kontrolnej i w grupie otrzymującej pochodną sulfonamidową 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny zawierającą ester metylowy 4-hydroksy- L -proliny według wynalazku (związek o wzorze 3) po dwóch tygodniach doświadczenia (* względem kontroli).

Fig. 9 przedstawia wyniki badania wpływu pochodnej sulfonamidowej 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny zawierającej ester metylowy 4-hydroksy- L -proliny według wynalazku (związek o wzorze 3) na masę ciała myszy z ksenoprzeszczepem DLD-1 i HT-29 po dwóch tygodniach doświadczenia.

Fig. 10 przedstawia wyniki badania wpływu pochodnej sulfonamidowej 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny zawierającej ester metylowy 4-hydroksy- L -proliny według wynalazku (związek o wzorze 3) na parametry hematologiczne u myszy z ksenoprzeszczepem DLD-1 i HT-29 po dwóch tygodniach doświadczenia.

Fig. 11 przedstawia wyniki badania wpływu pochodnej sulfonamidowej 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny zawierającej ester metylowy 4-hydroksy- L -proliny według wynalazku (związek o wzorze 3) na parametry hematologiczne u myszy z ksenoprzeszczepem DLD-1 i HT-29 po dwóch tygodniach doświadczenia.

PL 237 893 Β1

Przykład 1

Sposób wytwarzania 1 -[4-(chlorosulfonylo)fenylo]-3-metylo-5-metylosulfonylo-1 H-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazyny

Do kolby zawierającej 2 ml kwasu chlorosulfonowego ochłodzonego w mieszaninie wody z lodem do temperatury 0-5°C dodano 1-fenylo-3-metylo-5-metylosulfonylo-1/7-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazynę (1156 mg, 4 mmole). Początkowo przez pół godziny reakcję prowadzono w temperaturze 0-5°C, a następnie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny kontrolując przebieg reakcji na płytkach TLC. Po zakończeniu reakcji, mieszaninę reakcyjną wylano na wodę z lodem i ekstrahowano chlorkiem metylenu (4x50 ml). Połączone ekstrakty wysuszono nad bezwodnym MgSO4. Po odparowaniu chlorku metylenu na wyparce surowy produkt oczyszczono na kolumnie chromatograficznej stosując mieszaninę chlorek metylenu : metanol (50:1) jako eluent. Produkt otrzymano w postaci żółtego osadu.

Ci \ SOj	Wydajność 65%;
δ	Ή NMR (CDCh) δ: 2,91 (s, 3H), 3,63 (s, 3H), 8,29 (d,
HjC	2H, J = 9,2 Hz), 8,81 (d, 2H, J = 9,2 Hz)

Sposób wytwarzania 1 -(4-(3-metylo-5-metylosulfonylo-1 H-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazyn-1 -ylo)fenylosulfonylo)pirolidyno-2-karboksylanu metylu oraz 4-hydroksy-1-(4-(3-metylo-5-metylosulfonylo-1 H-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazyn-1 -ylo)fenylosulfonylo)pirolidyno-2-karboksylanu metylu

Otrzymaną w powyższy sposób 1-(para-chlorosulfonylofenylo)-3-metylo-5-metylosulfonylo-1/7-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazynę (0,5 mmol) rozpuszczono w bezwodnym acetonitrylu (5 ml) i dodano 1,75 mmola odpowiedniego chlorowodorku estru metylowego Ł-proliny lub 4-hydroksy-Ł-proliny oraz 1,75 mmola węglanu sodu. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej do całkowitego zaniku substratu (kontrola TLC). Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik odparowano na wyparce, a surowy produkt oczyszczono na kolumnie chromatograficznej stosując jako eluent mieszaninę CH2CI2: MeOH (25:1).

Ϊ^Η’ O ϋ Λ*⁰0 o’^s, Λ SOjCH,

Wydajność 96%. Temperatura topnienia: 79-83°C; Ή NMR (CDCI3) δ: 1,81-1,90 (m, 1H), 1,96-2,07 (m, 2H), 2,09-2,17 (m, 1H), 2,88 (s, 3H), 3,39-3,45 (m, 1H), 3,48-3,53 (m, 1H), 3,60 (s, 3H),3,73 (s, 3H), 4,40 (dd, 1H, Ji = 8,7 Hz, J2 = 3,3 Hz), 8,09 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 8,63 (d, 2H,J=8,7 Hz); ^I3C NMR (CDCI3) δ: 11,44, 24,68, 30,93,40,76, 48,35, 52,46,60,43, 119,96, 129,17, 137,12, 140,92, 146,50,148,03, 161,93, 172,36.

PL 237 893 Β1

OH	Wydajność 96%. Temperatura topnienia: 112 114 °C;
I o->°	Ή NMR (aceton) δ: 2,07-2,13 (m, 1H), 2,15-2,21 (m, 1H), 2,85 (s, 3H), 3,45 (dt, 1H,7/ =11,2 Hz, h = 1,7
A / N SO_;CHj H,C	Hz), 3,59 (s, 3H), 3,65 (dd, 1H, Ji = 10,8 Hz, h = 4,2 Hz), 3,73 (s, 3H), 4,36 (t, lH,7-7,9 Hz), 4,42 (bs, 1H), 8,16 (d, 2H.78,7 Hz), 8,67 (d, 2H, 7 = 9,1 Hz); ^I3C NMR (aceton) 6; 11,26, 23,33, 40,21, 41,15, 57,60,60,83,70,11,120,80, 130,32, 137,24, 142,19, 147,31, 149,60, 162,92, 173,10.

Sposób wytwarzania pochodnych sulfonamidowych o wzorze 2 i 3

Otrzymane w powyższy sposób pochodne sulfonamidowe z grupą metylosulfonową (0,33 mmol) rozpuszczono w bezwodnym etanolu (5 ml) i dodano azydek sodu (21 mg, 0,33 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika do zaniku substratu (kontrola TLC), a następnie po odparowaniu rozpuszczalnika surowy produkt reakcji oczyszczono na kolumnie chromatograficznej stosując jako eluent układ CH2CI2 : MeOH (50:1).

1-[4-(7-metylo-5H-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyn-5-ylo)fenylo-sulfonylo]pirolidyno-2-karboksylan metylu

(związek o wzorze 2)

Wydajność 93%, Temperatura topnienia: 125-127°C; Ή NMR (CDCb) δ: 1,82-188 (m, 1H), 1,95-2,05 (m, 2H), 2,10-2,15 (m, 1H), 2,88 (s, 3H), 3,38-3,45 (m, 1H), 3,48-3,54 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 4,39-4,42 (dd, 1H, Ji = 8,8 Hz, J2 = 4,0 Hz), 8,09 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 8,63 (d, 2H, 7= 8,8 Hz);

¹³C NMR (CDCb) δ: 11,43, 24,68, 30,92,40,76, 48,34, 52,46, 119,95, 129,17, 137,11, 140,92, 146,50, 148,02, 161,92, 172,35.

PL 237 893 Β1

4-hydroksy-1 -[4-(7-metylo-5H-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-£>][1,2,4]triazyn-5-ylo)fenylosulfonylo]pirolidyno-2-karboksylan metylu

OH H c if · ₀’ 0 o-^s. .-ΛΑ N 1 T N H,C (związek 0 wzorze 3)

Wydajność 83%. T emperatura topnienia: 122-128°C; ^XH NMR (aceton) δ: 2,04-2,18 (m, 2H), 3,39 (d, 1H, J = 11,2 Hz), 2,85 (s, 3H), 3,62 (d, 1H, J = 12 Hz), 3,77 (s, 3H), 4,33 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 4,57 (bs, 1H, OH), 8,08 (d, 2H, J = 9,2 Hz), 8,48 (d, 2H, J = 9,2 Hz); ^,3C NMR (aceton) δ: 11,26, 41,14, 52,53,57,59, 60,82, 70,22, 120,79, 130,32, 137,23, 142,19, 147,30, 149,60, 162,92, 173,09.

Przykład 2

Aktywność przeciwnowotworową, cytostatyczną, cytotoksyczną, antyapoptotyczną i antyproliferacyjną pochodnych sulfonamidowych 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny według wynalazku badano w warunkach in vitro oraz in vivo w następujący sposób.

Komórki AGS ludzkiego raka żołądka (ATCC CRL-1739, Manassas, VA, USA) hodowano w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle’s Medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM glutaminy, 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2. Następnie komórki liczono w hemocytometrze i przenoszono w ilości 1 x10⁶komórek na „oczko” w 1 ml pożywki hodowlanej z butelek „Costar” (Sigma, USA) do 6-oczkowych płytek „Nunc” (Wiesbaden, Niemcy). Do przenoszenia komórek wykorzystano bezwapniowy bufor fosforanowy z dodatkiem 0,05% trypsyny i 0,02% EDTA. Po 48 godzinach pożywkę hodowlaną wymieniono na pożywkę DMEM, która nie zawierała czerwieni fenolowej i płodowej surowicy bydlęcej (FBS). W ciągu kolejnych 24 godzin komórki pokrywały co najmniej 80% powierzchni każdego „oczka” płytki. W ten sposób przygotowane komórki inkubowano przez 24 godziny z badanymi związkami i używano do dalszych doświadczeń.

Komórki DLD-1 ludzkiego raka jelita grubego (ATCC CCL-221, Manassas, VA, USA) hodowano w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle’s Medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM glutaminy, 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2. Następnie komórki liczono w hemocytometrze i przenoszono w ilości 1 x10⁶komórek na „oczko” w 1 ml pożywki hodowlanej z butelek „Costar” (Sigma, USA) do 6-oczkowych płytek „Nunc” (Wiesbaden, Niemcy). Do przenoszenia komórek wykorzystano bezwapniowy bufor fosforanowy z dodatkiem 0,05% trypsyny i 0,02% EDTA. Po 48 godzinach pożywkę hodowlaną wymieniono na pożywkę DMEM, która nie zawierała czerwieni fenolowej i płodowej surowicy bydlęcej (FBS). W ciągu kolejnych 24 godzin komórki pokrywały co najmniej 80% powierzchni każdego „oczka” płytki. W ten sposób przygotowane komórki inkubowano przez 24 godziny z badanymi związkami i używano do dalszych doświadczeń.

Komórki HT-29 ludzkiego raka jelita grubego (ATCC HTB-38, Manassas, VA, USA) hodowano w pożywce McCoy’s 5A z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM glutaminy, 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2. Następnie komórki liczono w hemocytometrze i przenoszono w ilości 1 χ 10⁶ komórek na „oczko” w 1 ml pożywki hodowlanej z butelek „Costar” (Sigma, USA) do 6-oczkowych płytek „Nunc” (Wiesbaden, Niemcy). Do przenoszenia komórek wykorzystano bezwapniowy bufor fosforanowy z dodatkiem 0,05% trypsyny i 0,02% EDTA. Po 48 godzinach pożywkę hodowlaną wymieniono na pożywkę McCoy’s 5A, która nie zawierała czerwieni fenolowej i płodowej surowicy bydlęcej (FBS). W ciągu kolejnych 24 godzin komórki pokrywały co najmniej 80% powierzchni każdego „oczka” płytki. W ten sposób przygotowane komórki inkubowano przez 24 godziny z badanymi związkami według wynalazku i używano do dalszych doświadczeń.

Pomiar cytotoksyczności badanych związków według wynalazku wykonano metodą Carmichael’a (Carmichael J et al, Cancer Res., 1987, 47: 943-946), określając żywotność komórek przy użyciu soli

PL 237 893 B1 tetrazolowej (MTT) w badaniu MTT. W żywych komórkach, pod wpływem mitochondrialnych dehydrogenaz, zastosowany barwnik ulega przemianie do purpurowego formazanu. Przemiana ta nie zachodzi w martwych komórkach. Komórki inkubowano 24 godziny w inkubatorze zapewniającym odpowiednie warunki, tj. w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2 wraz z pożywką zawierającą różne stężenia badanych związków według wynalazku. Po 24-godzinnej inkubacji komórki płukano trzy razy (3x1 ml) PBS. Następnie dodano 1 ml PBS oraz 50 μl MTT o stężeniu 5 mg/cm³ PBS i kontynuowano inkubację przez 4 godziny. Po upływie wymaganego czasu podłoże usunięto, a do komórek dodano 1 ml 0,1M kwasu solnego w absolutnym izopropanolu i komórki odstawiono na 10 minut. W tak przygotowanym lizacie komórek mierzono absorbancję przy długości fali 630 nm. Wynik absorbancji uzyskany w hodowlach komórek kontrolnych przyjęto za 100%. Natomiast żywotność komórek inkubowanych w obecności badanych związków przedstawiono jako procent wartości kontrolnych. Poziom istotności p wyznaczono nieparametrycznym testem U Manna-Whitney’a za pomocą programu SigmaStat. Wyniki przy poziomie istotności p<0,05 uznano za istotne statystycznie. Wartości IC50 (ang. inhibitory concentration 50 - stężenie powodujące 50-procentową redukcję przeżywalności komórek) dla linii komórkowych AGS, DLD-1, HT-29 wyznaczono na podstawie analizy zależności zastosowanych stężeń badanych związków według wynalazku i stopnia przeżywalności komórek za pomocą programu Statistica 10 PL.

Wpływ badanych związków według wynalazku na proces biosyntezy DNA oceniono poprzez pomiar wbudowywania [³H]-tymidyny do DNA badanych komórek. Komórki inkubowano 24 godziny w inkubatorze zapewniającym odpowiednie warunki, tj. w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2 wraz z pożywką zawierającą różne stężenia badanych związków według wynalazku. Badane związki dodano do pożywki hodowlanej i inkubowano przez 24 godziny. Po tym czasie pożywkę wymieniano na świeże i do każdego oczka dodano 0,5 μCi [³H]-tymidyny (aktywność właściwa 6,7 Ci/mmol) i komórki dalej inkubowano przez 4 godziny w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO2, w temperaturze 37°C. Po tym czasie pożywkę usunięto, a powierzchnię komórek przemyto trzy razy (3x1 ml) 0,05 molowym Tris-HCl o pH 7,4, zawierającym 0,11 molowy NaCl. Następnie komórki przemyto dwa razy (2x1 ml) 5% roztworem kwasu trichlorooctowego (TCA) i rozpuszczono w 1 ml 0,1 molowego NaOH zawierającym 1% SDS. Po 5 minutach uzyskany lizat komórkowy przenoszono do fiolek scyntylac yjnych zawierających 2 ml płynu scyntylacyjnego i mierzono radioaktywność. Intensywność biosyntezy DNA w komórkach kontrolnych, wyrażona w dpm radioaktywnej tymidyny wbudowanej do DNA badanych komórek, w przeliczeniu na 1 x 106 komórek przyjęto za 100%. Wartości z prób badanych wyrażono jako procent wartości kontrolnej. Poziom istotności p wyznaczono nieparametrycznym testem U MannaWhitney’a za pomocą programu SigmaStat. Wyniki przy poziomie istotności p<0,05 uznano za istotne statystycznie. Na podstawie otrzymanych wyników wyznaczono wartości IC50 (ang. inhibitory concentration 50 - stężenie hamujące o 50% wbudowywanie [³H]-tymidyny).

W poniższej Tabeli 1 podano wyniki badania działania przeciwnowotworowego, cytostatycznego, cytotoksycznego i antyproliferacyjnego związków według wynalazku wobec komórek nowotworowych.

PL 237 893 Β1

tymidyna ICso (μΜ)		HT-29	3,62 ± 0,02	2,30 ± 0,02
	DLD-1		0,56 ± 0,01			1,55 ±0,02

		AGS i	0,55 ± 0,01	1,05 ±0,01
ICso (μΜ)		HT-29	1,73 ±0,03	3,13 ±0,02
s 'U MW O a		DLD-1	1,10 ±0,01	3,10 + 0,02
a £ & 8 u		AGS	0,92 ± 0,01	0,80 ±0,01

	Związek	o f \ / o ^=o o X	,z z z I	(związek o wzorze 2)	o J __/ O r° o 2	z z	o N O N S O * N ee*

PL 237 893 B1

Indukcję apoptozy badano wykorzystując metodę z użyciem aneksyny V znakowanej izotiocyjanianem fluoresceiny (Annexin V-FITC), tworzącej kompleksy z fosfatydyloseryną w obecności jonów wapnia. Kompleksy te oznaczano używając zestawu do badania apoptozy FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit II (BD Biosciences, USA) oraz cytometru przepływowego BD FACSCanto II (BD Biosciences Systems, San Jose, CA, USA). Analizy wyników dokonano za pomocą programu FACSDiva (BD Biosciences Systems, San Jose, CA, USA).

Komórki DLD-1 i HT-29 inkubowano przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 wraz z pożywką zawierającą badane związki według wynalazku o określonych stężeniach. Oba badane związki zostały zastosowane w stężeniu 1,5 μM i 3,0 μM. Po zakończonej inkubacji usunięto pożywkę, dodano dołączony w zestawie bufor wiążący i zawieszono w nim komórki. W celu kalibracji aparatu wykonano dwie próby kontrolne, tj. pozytywną i negatywną. Kontrola pozytywna stanowiła wzorzec komórek kontrolnych, u których wywołano apoptozę poprzez dodanie 3% formaldehydu. Wykonano trzy próby kontrolne. Pierwsza zawierała komórki kontrolne oraz jodek propidyny, druga - komórki kontrolne i aneksynę V-FITC, a trzecia - komórki kontrolne oraz jodek propidyny i aneksynę V-FITC. Po dodaniu 2 μl 3% formaldehydu komórki wstawiono na 10 minut do lodówki. Kontrolę negatywną stanowiły komórki kontrolne, które nie zostały poddane działaniu żadnego czynnika. Komórki z prób kontrolnych oraz komórki poddane działaniu badanych związków według wynalazku (1 x 106 komórek/ml), zawieszone w dołączonym do zestawu buforze, poddano dalszym badaniom. Pobrano po 200 μl zawiesiny z każdej badanej próbki i przenoszono ją do probówek. Do każdej próbki w temperaturze pokojowej dodawano po 3 μl aneksyny V-FITC oraz 5 μl jodku propidyny (PI) i umieszczono je na 15 minut w ciemnym miejscu. Tak przygotowaną zawiesinę komórek analizowano w ciągu jednej godziny w cytometrze przepływowym BD FACSCanto II za pomocą programu BD FacsDiva. Wyniki opisywanego doświadczenia można określić w następujący sposób: komórki żywe (próba podwójnie negatywna - brak reakcji z aneksyną V i PI), wczesna apoptoza (próba dodatnia z aneksyną V i ujemna z PI), późna apoptoza (próba dodatnia z aneksyną V i dodatnia z PI) oraz nekroza (próba ujemna z aneksyną V i dodatnia z PI).

Po dwudziestoczterogodzinnej inkubacji komórek raka jelita grubego DLD-1 ze związkami według wynalazku oceniono wpływ tych związków na indukcję apoptozy. Związki według wynalazku badano w stężeniu 1,5 μΜ i w stężeniu 3,0 μΜ. Wykazano, że oba badane związki według wynalazku w wyniku swojego działania prowadzą do programowanej śmierci komórki (apoptozy). W populacji komórek kontrolnych wykazano: 6,1% komórek apoptotycznych i 1,9% komórek nekrotycznych. W populacji komórek inkubowanych ze związkiem o wzorze 2 według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ uzyskano 22,7% komórek wczesno- i późnoapoptotycznych oraz 2,5% komórek nekrotycznych, a w stężeniu 3,0 μM odnotowano 46,4% komórek wczesno- i późnoapoptotycznych oraz 6,6% komórek nekrotycznych. W populacji komórek inkubowanych ze związkiem o wzorze 3 według wynalazku w stężeniu 1,5 μM wykazano: 49,1% komórek apoptotycznych i 7,0% komórek nekrotycznych. Odsetek komórek wczesno- i późnoapoptotycznych przy stężeniu 3,0 μΜ dla związku o wzorze 3 według wynalazku wynosił odpowiednio 1,7% i 80,8%, natomiast komórek nekrotycznych 6,5%.

Wyniki badania indukcji apoptozy w komórkach raka jelita grubego DLD-1 inkubowanych przez 24 godziny ze związkami według wynalazku w stężeniu 1,5 μM i 3,0 μM przedstawiono na Figurze 1 wraz z reprezentatywnymi cytogramami z analizy komórek DLD-1 i wynikami w postaci wartości średnich, które przedstawiono zarówno na Figurze 1 jak i w Tabeli 2 poniżej.

PL 237 893 Β1

Tabela 2. Indukcja apoptozy w komórkach raka jelita grubego DLD-1 inkubowanych przez 24 godziny ze związkami według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ i 3,0 μΜ. Badanie przeprowadzono przy użyciu aneksyny V i jodku propidyny.

	kontrola	Związek o wzorze 2 (13 μΜ)	Związek o wzorze 2 (3,0 μΜ)	Związek o wzorze 3 (13 μΜ)	Związek o wzorze 3 (3,0 μΜ)
żywe	92,0%	74,8%	47,1%	43,9%	11,0%
apoptoza wczesna	1,8%	13,1%	16,4%	17,0%	1,7%
apoptoza późna	4,3%	9,6%	30,0%	32,1%	80,8%
nekroza	1,9%	2,5%	6,6%	7,0%	6,5%

Po 24-godzinnej inkubacji komórek raka jelita grubego HT-29 ze związkami według wynalazku zbadano wpływ tych związków na indukcję apoptozy. Zaobserwowano, że oba badane związki według wynalazku w obu zastosowanych stężeniach wykazują właściwości proapoptotyczne w linii komórkowej HT-29. W populacji komórek kontrolnych wykazano: 7,7% komórek apoptotycznych i 2,3% komórek nekrotycznych. W populacji komórek inkubowanych ze związkiem o wzorze 2 według wynalazku odsetek komórek wczesno- i późnoapoptotycznych w stężeniu 1,5 μΜ wynosił odpowiednio 9,0% i 4,7%, a komórek nekrotycznych 1,0%. W populacji komórek inkubowanych ze związkiem o wzorze 2 według wynalazku w stężeniu 3,0 μΜ uzyskano 19,0% komórek apoptotycznych i 2,7% komórek nekrotycznych. W populacji komórek inkubowanych ze związkiem o wzorze 3 według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ odsetek komórek wczesno- i późnoapoptotycznych wynosił 30,5%, zaś odsetek komórek nekrotycznych - 4,5%. W populacji komórek inkubowanych ze związkiem o wzorze 3 według wynalazku w stężeniu uzyskano 25,2% komórek wczesnoapoptotycznych, 13,7% komórek późnoapoptotycznych i 2,6% komórek nekrotycznych.

Wyniki badania indukcji apoptozy w komórkach raka jelita grubego HT-29 inkubowanych przez 24 godziny ze związkami według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ i 3,0 μΜ przedstawiono na Figurze 2 wraz z reprezentatywnymi cytogramami z analizy komórek HT-29 i wynikami w postaci wartości średnich, które przedstawiono zarówno na Figurze 2, jak i w Tabeli 3 poniżej.

PL 237 893 Β1

Tabela 3. Indukcja apoptozy w komórkach raka jelita grubego HT-29 inkubowanych przez 24 godziny ze związkami według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ i 3,0 μΜ. Badanie przeprowadzono przy użyciu aneksyny V i jodku propidyny.

	kontrola	Związek 0 wzorze 2 (1,5 μΜ)	Związek 0 wzorze 2 (3,0 μΜ)	Związek 0 wzorze 3 (1,5 μΜ)	Związek 0 wzorze 3 (3,0 μΜ)
żywe	90,0%	85,3%	78,3%	65,0%	58,4%
apoptoza wczesna	3,5%	9,0%	9,6%	14,5%	25,2%
apoptoza późna	4,2%	4,7%	9,4%	16,0%	13,7%
nekroza	2,3%	1,0%	2,7%	4,5%	2,6%

Do oceny zmian potencjału mitochondrialnego wykorzystano zestaw: JC-1 MitoScreen kit (BD Biosciences, USA). Komórki nowotworowe DLD-1 i HT-29 pokrywające około 80% powierzchni płytki inkubowano z badanymi związkami według wynalazku w określonych stężeniach przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2. Oba badane związki według wynalazku zostały zastosowane w stężeniu 1,5 μΜ i 3,0 μΜ. Po zakończonej inkubacji usunięto pożywkę, dodano dołączony w zestawie bufor i po dwukrotnym przemyciu, komórki zawieszono w mieszaninie barwnika JC-1 (jodek 5,5’,6,6’-tetrachloro-1 ,T,3,3’-tetraetylobenzimidazolokarbocyjanianu) z buforem o stężeniu 10 μg/ml. Następnie próby inkubowano w ciemności przez 15 minut, przepłukano roztworem PBS i poddano natychmiast analizie przy użyciu cytometru przepływowego BD FacsCanto II oceniając wyniki z zastosowaniem programu BD FacsDiva. W żywych, nienaruszonych komórkach barwnik JC-1 ulega akumulacji w mitochondriach, tworząc agregaty fluoryzujące na pomarańczowo. Spadek potencjału mitochondrialnego ΔψΓη charakteryzuje się rozpadem tych agregatów i zieloną fluorescencją.

Po 24 godzinach inkubacji komórek raka jelita grubego DLD-1 ze związkami według wynalazku oceniono wpływ tych związków na mitochondrialny potencjał błonowy Δψπ. Uzyskane wyniki analizy cytometrycznej komórek DLD-1, poddanych działaniu nowych pochodnych, wyraźnie świadczą o depolaryzacji mitochondriów. W przypadku komórek kontrolnych obniżenie Δψητ zaobserwowano w 0,2% populacji komórek.

Oba związki w zastosowanych stężeniach obniżały mitochondrialny potencjał błonowy w komórkach raka jelita grubego DLD-1. Zastosowanie związku o wzorze 2 według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ prowadziło do obniżenia Δψητ w 48,9% populacji komórek, a w stężeniu 3,0 μΜ w 63,8% populacji komórek, natomiast zastosowanie związku o wzorze 3 według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ prowadziło do obniżenia Δψητ w 49,5% populacji komórek, a w stężeniu 3,0 μΜ w 71,3% populacji komórek.

Wyniki oceny spadku mitochondrialnego potencjału błonowego w komórkach raka jelita grubego DLD-1 inkubowanych przez 24 godziny ze związkami według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ i 3,0 μΜ przedstawiono na Figurze 3 wraz z reprezentatywnymi cytogramami z analizy badanych komórek DLD-1 i wynikami w postaci wartości średnich.

Po 24 godzinach inkubacji komórek raka jelita grubego HT-29 ze związkami według wynalazku zbadano wpływ tych związków na mitochondrialny potencjał błonowy. Badane związki zastosowano w stężeniu 1,5 μΜ i 3,0 μΜ. Zaobserwowano, że oba badane związki według wynalazku obniżają mitochondrialny potencjał błonowy w komórkach HT-29. W populacji komórek kontrolnych 4,8% populacji posiadało obniżony Δψπ. Zastosowanie związku o wzorze 2 według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ prowadziło do obniżenia Δψητ w 25,7% populacji komórek, a w stężeniu 3,0 μΜ w 79,7% populacji komórek, natomiast zastosowanie związku o wzorze 3 według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ prowadziło do obniżenia ΔψΓη w 26,9% populacji komórek, a w stężeniu 3,0 μΜ w 81,0% populacji komórek.

PL 237 893 B1

Wyniki oceny spadku mitochondrialnego potencjału błonowego w komórkach raka jelita grubego HT-29 inkubowanych przez 24 godziny ze związkami według wynalazku w stężeniu 1,5 μΜ i 3,0 μΜ przedstawiono na Figurze 4 wraz z reprezentatywnymi cytogramami z analizy badanych komórek HT-29 oraz wyniki w postaci wartości średnich.

P r z y k ł a d 3

Drugi etap badań przeprowadzono z wykorzystaniem zwierząt (samice myszy Cby.CgFoxn1 nu/J) (Jackson Laboratory, USA). Szczep ten wykazuje defekt nabłonka grasicy (bezgrasiczność) oraz cebulek włosowych (homozygotyczne samice) i jest powszechnie stosowany do badań nad substancjami modulującymi rozrost nowotworu. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi doświadczeń na zwierzętach oraz protokołem zatwierdzonym przez Lokalną Komisję Etyczną (uchwała NR 8/2018). Badania przeprowadzone w warunkach in vivo zostały wykonane w Centrum Medycyny Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Jest to nowoczesna jednostka, która zapewnia wysoki standard hodowli w statusie SPF za barierą hodowlaną. Zwierzęta przebywają w pomieszczeniu z nadciśnieniem, optymalnej temperaturze 22°C, wilgotności powietrza 55%, z piętnastoma wymianami powietrza na godzinę (prędkość nie przekracza 0.3 m/s) i cyklem dnia świetlnego 12/12. Zwierzęta całodobowo monitorowano, a okresowej kontroli podlegały zarówno zwierzęta (zgodnie z zaleceniami FELASA), jak i pomieszczenia, w których się one znajdowały. Centrum Medycyny Doświadczalnej posiada Certyfikat Zgodności z Zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLP).

W badaniach wstępnych myszy zostały podzielone na dwie grupy. Zwierzętom z pierwszej grupy na stronie grzbietowej podskórnie wstrzyknięto 50 μl zawiesiny zawierającej sto milionów komórek DLD1 w PBS, natomiast myszom z grupy drugiej 50 μl zawiesiny zawierającej sto milionów komórek HT-29 w PBS zgodnie z metodyką opisaną przez Shinohara i wsp. (Shinohara N, Tsuduki T, Ito J et al, Biochim Biophys Acta, 2012, 1821,980-988).

Po pierwszym tygodniu, gdy guzy osiągnęły średnice ok. 5 mm, tj. według danych literaturowych wielkość odpowiednią do przeprowadzania dalszych etapów badań, rozpoczęto podskórne podawanie pochodnej sulfonamidowej 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny zawierającej w grupie sulfonamidowej ester metylowy 4-hydroksy- L-proliny według wynalazku (związek o wzorze 3) w dawce 50 μg/kg raz dziennie przez dwa tygodnie. Moment podawania związku oznaczono jako czas 0. Grupę kontrolną stanowiły zwierzęta otrzymujące podskórnie 50 μl 10% DMSO w PBS (rozpuszczalnik dla związku o wzorze 3). Przed podaniem pochodnej sulfonamidowej 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3- e ]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny zawierającej w grupie sulfonamidowej ester metylowy 4-hydroksy- L-proliny według wynalazku (czas 0), po pierwszym tygodniu (czas 1) oraz drugim tygodniu (czas 2) podawania tego związku oceniono wielkości guzów w dwóch wymiarach przy pomocy elektronicznej suwmiarki. Objętość guzów wyrażono w mm³ zgodnie z obliczeniami, które zostały opisane przez Feldman i wsp. (Feldman JP, Goldwasser R, Mark S, Schwartz J, Orion I, JAQM, 2009, 4, 455-462).

W grupie myszy z ksenoprzeszczepem DLD-1 i HT-29 zaobserwowano istotne statystycznie zahamowanie rozwoju guzów u zwierząt otrzymujących związek o wzorze 3 według wynalazku po drugim tygodniu trwania doświadczenia w porównaniu do grupy kontrolnej (p<0,001) (Fig. 5 i 6). Post mortem stwierdzono także istotną statystycznie redukcję masy guzów w grupach myszy z ksenoprzeszczepem DLD-1 i HT-29 otrzymujących związek o wzorze 3 w porównaniu do kontroli (p<0,05) (Fig. 7 i 8).

Dodatkowo oceniono wpływ związku o wzorze 3 na masę ciała zwierząt po dwutygodniowej terapii. Nie zaobserwowano istotnych zmian pomiędzy grupą otrzymującą związek o wzorze 3 według wynalazku, a kontrolą (Fig. 9), co potwierdza brak negatywnego wpływu badanego związku na d obrostan zwierząt.

Analiza hematologiczna po dwutygodniowej terapii nie wykazała istotnych statystycznie zmian w takich parametrach jak: krwinki białe (WBC), krwinki czerwone (RBC), płytki krwi (PLT), h ematokryt (HCT), hemoglobina (HGB), średnia objętość erytrocytów (MCV), średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej (MCH), średnie stężenie hemoglobiny w erytrocytach (MCHC) (Fig. 10, 11). Świadczy to o względnym bezpieczeństwie pochodnej sulfonamidowej 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b ][1,2,4]triazyny zawierającej w grupie sulfonamidowej ester metylowy 4-hydroksy-L-proliny według wynalazku (związek o wzorze 3).

Przeprowadzane badania wykazały, że związki według wynalazku wykazują silne działania przeciwnowotworowe, cytostatyczne, cytotoksyczne, antyapoptotyczne i antyproliferacyjne. Przeprowadzone badania wykazały także, że badane związki według wynalazku hamują biosyntezę DNA w komórkach nowotworowych, w szczególności raka żołądka i raka jelita grubego. Przeprowadzone badania wykazały ponadto, że związki według wynalazku wykazują wysoką aktywność przeciwnowotworową,

PL 237 893 Β1 cytostatyczną, cytotoksyczną, antyapoptotyczną i antyproliferacyjną w stosunku do komórek nowotworowych, w szczególności komórek raka żołądka i raka jelita grubego, a zatem mogą być stosowane w leczeniu nowotworów, zwłaszcza nowotworów przewodu pokarmowego, w szczególności raka żołądka i raka jelita grubego.

Claims

1. Pochodna sulfonamidowa 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny o ogólnym wzorze 1:

(wzór 1) w którym R oznacza ester metylowy proliny lub ester metylowy 4-hydroksy-Ł-proliny.

2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi go pochodna sulfonamidowa 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny, zawierająca w grupie sulfonamidowej ester metylowy Ł-proliny, o wzorze 2:

(wzór 2).

3. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi go pochodna sulfonamidowa 5-fenylo7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]triazyny, zawierająca w grupie sulfonamidowej ester metylowy 4-hydroksy-Ł-proliny, o wzorze 3:

PL 237 893 Β1

(wzór 3).

4. Sposób wytwarzania sulfonamidowej pochodnej 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]-triazyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza ester metylowy proliny lub ester metylowy 4-hydroksy-Ł-proliny, znamienny tym, że l-(para-chlorosulfonylofenylo)3-metylo-5-metylosulfonylo-1/7-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazynę poddaje się reakcji z chlorowodorkiem estru metylowego Ł-proliny albo 4-hydroksy-Ł-proliny w bezwodnym acetonitrylu w obecności węglanu sodu i otrzymuje się odpowiednią pochodną sulfonamidową z grupą metylosulfonową w pozycji 5 układu 1/7-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazyny, którą to pochodną następnie poddaje się reakcji z azydkiem sodu w bezwodnym etanolu.

5. Sposób wytwarzania według zastrz. 4, znamienny tym, że ponadto otrzymaną tak pochodną sulfonamidową 5-fenylo-7-metylo-pirazolo[4,3-e]tetrazolo[4,5-b][1,2,4]-triazyny odpowiednio o wzorze 2 lub 3 oczyszcza się chromatograficznie, korzystnie z zastosowaniem chromatografii cieczowej.

6. Pochodna jak określono w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3 do zastosowania jako lek.

7. Pochodna jak określono w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3 do zastosowania jako lek do leczenia nowotworu.

8. Pochodna jak określono w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3 do zastosowania jako lek do leczenia raka przewodu pokarmowego.

9. Pochodna według zastrz. 8, znamienna tym, że nowotwór przewodu pokarmowego stanowi rak żołądka.

10. Pochodna według zastrz. 8, znamienna tym, że nowotwór przewodu pokarmowego stanowi rak jelita grubego.

11. Pochodna jak określono w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3 do zastosowania jako środek cytostatyczny.

12. Pochodna jak określono w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3 do zastosowania jako środek cytotoksyczny.

13. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że jako związek aktywny zawiera związek jak określono w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3 oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.

14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 13, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera pochodną o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza ester metylowy 4-hydroksy-Ł-proliny.