PL237852B1 - Szczep Enterococcus faecalis do produkcji monoklonalnych preparatów fagowych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest szczep Enterococcus faecalis do otrzymywania monoklonalnych preparatów bakteriofagów litycznych o wysokim mianie, w tym w szczególności preparatów bakteriofagów do zastosowań terapeutycznych. Będący efektem wynalazku szczep gwarantuje produkcję bezpiecznych w stosowaniu monoklonalnych preparatów bakteriofagów terapeutycznych, nie zawierających zanieczyszczeń dodatkowymi, niepożądanymi bakteriofagami, które mogłyby stanowić źródło niekontrolowanego rozprzestrzeniania się genów wirulencji bakterii.

Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium są Gram-dodatnimi bakteriami kwasu mlekowego. Jako naturalny składnik mikroflory bytują na błonach śluzowych, głównie w układzie pokarmowym ludzi i zwierząt. W ostatnich latach pojawiło się jednak wiele patogennych szczepów tych bakterii. Co więcej stały się one jedną z głównych przyczyn zakażeń szpitalnych, w tym wielu zakażeń trudnych do zwalczania z wykorzystaniem antybiotyków (Arias i Murray, 2012). Trudności w zwalczaniu zakażeń E. faecalis i E. faecium wynikają z pozyskania przez szereg szczepów tych bakterii oporności na antybiotyki, w tym uznawaną za antybiotyk ostatniej szansy wankomycynę.

W tym kontekście szczególnie obiecująca okazuje się fagoterapia - leczenie zakażeń antybiotykoopornymi szczepami Enterococcus z wykorzystaniem bakteriofagów - wirusów infekujących wyłącznie bakterie i nieszkodliwych dla komórek organizmów eukariotycznych (Górski i in., 2009; Golka i in., 2014). Jej skuteczność w eradykacji patogennych szczepów Enterococcus wykazano nie tylko w modelach zwierzęcych, ale też u ludzi (Uchiyama i in., 2008; Letkiewicz i in., 2009).

Tylko tzw. bakteriofagi obligatoryjnie lityczne nadają się do zastosowań terapeutycznych (Gill i Hyman, 2010). Po infekcji bakterii mogą się one w niej namnażać wyłącznie drogą rozwoju litycznego, który prowadzi do lizy bakterii skorelowanej z jej śmiercią (Guttman i in., 2005). Wykluczone z zastosowań terapeutycznych bakteriofagi zwane łagodnymi po infekcji bakterii mogą rozwijać się drogą rozwoju litycznego lub pozostawać przez wiele generacji w formie utajonej, tzw. profaga, którym jest typowo DNA bakteriofaga wintegrowane do chromosomu bakteryjnego. W obronie przed utratą ich profagów z bakteryjnych chromosomów bakteriofagi łagodne nabyły w ewolucji szereg genów korzystnych dla środowiskowych adaptacji ich bakteryjnych gospodarzy. W przypadku bakteriofagów bakterii patogennych są to typowo geny związane z wirulencją bakterii, kodujące m.in. toksyny, adhezyny lub czynniki chroniące bakterie przed działaniem układu immunologicznego (Cheetham i in., 1995). W konsekwencji nabywanie nowych profagów jest jednym z głównych motorów ewolucji patogennych bakterii (Canchaya i in., 2003).

Profagi są też problemem w pozyskiwaniu bakteriofagów dla celów terapeutycznych. Te ostatnie typowo namnażają się wydajnie w bakteriach tego samego gatunku co zwalczane przez nie patogeny (Gill i Hyman, 2010; Balogh i in., 2010). Tymczasem profagi lub ich fragmenty są typowymi elementami genomów bakterii patogennych (Canchaya i in., 2003). W niektórych komórkach populacji zawierających aktywnego profaga może dojść do jego spontanicznego wycięcia i zapoczątkowania rozwoju litycznego. Opisano przypadki obecności w hodowlach bakterii licznych fagów łagodnych uwolnionych na skutek spontanicznej indukcji profagów (Wang i in., 2010). Fagi te po infekcji nowych gospodarzy mogą jako profagi integrować z ich chromosomami, stając się wektorami w rozsiewaniu genów wirulencji bakterii. Dlatego jedyną gwarancją pozyskania monoklonalnych preparatów fagów terapeutycznych, nie zawierających innych fagów poza użytymi do namnożenia, jest wykorzystywanie do ich produkcji szczepów bakterii pozbawionych profagów. Problem ten okazuje się być szczególnie istotny przy produkcji preparatów bakteriofagów terapeutycznych przeciwko E. faecalis i E. faecium. Wyniki badań ostatnich lat jednoznacznie wskazują na kluczowe znaczenie profagów w ewolucji szczepów tych bakterii szczególnie dobrze przystosowanych do rozprzestrzeniania się w warunkach szpitalnych (Giridhara Upadhyaya i in., 2009; Matos i in., 2013).

Celem wynalazku jest dostarczenie szczepów Enterococcus faecalis do produkcji preparatów bakteriofagów terapeutycznych o wysokim mianie, pozbawionych zanieczyszczeń fagami łagodnymi. Nieoczekiwanie tak określony cel został osiągnięty dzięki rozwiązaniu zaproponowanemu w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest szczep Enterococcus faecalis pozbawiony profagów i zdolny do produkcji monoklonalnych preparatów fagowych będący szczepem Enterococcus faecalis 1679wph zdeponowanym w PCM jako B/00074. Korzystnie, posiada on chromosom bakteryjny zawierający DNA o sekwencji Sekw. Nr 1.

PL 237 852 B1

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania preparatu bakteriofagowego, zwłaszcza terapeutycznego charakteryzujący się tym, że szczep bakteriofaga specyficznego wobec Enterococcus faecalis namnaża się w hodowli szczepu Enterococcus faecalis pozbawionego profagów według wynalazku i określonego powyżej, a następnie izoluje się namnożone fagi z uzyskanego lizatu, przy czym otrzymywane preparaty bakteriofagowe są pozbawione zanieczyszczeń fagami łagodnymi.

W poszukiwaniu szczepów Enterococcus faecalis pozbawionych aktywnych profagów, autorzy prezentowanego wynalazku przeszukali kolekcję szczepów do namnażania bakteriofagów terapeutycznych tej bakterii pod kątem wrażliwości na mitomycynę C - środek mogący indukować wycinanie profagów i związaną z ich rozwojem litycznym lizę bakterii. Poprzez analizę ustalonych dla celu wynalazku sekwencji genomowego DNA szczepów niewrażliwych na mitomycynę, wyodrębnili dwa szczepy nie posiadające w chromosomach rejonów odpowiadających aktywnym profagom. Nieoczekiwanie okazało się, że nie zawierające aktywnych profagów szczepy Enterococcus faecalis mogą zostać zaadaptowane do wydajnego namnażania bakteriofagów terapeutycznych przeciwko infekcjom spowodowanym przez szczepy Enterococcus.

Efektem wynalazku jest wyodrębnienie szczepu 1679wph E. faecalis o sekwencji genomowego DNA określonej jako SEQ ID NO.1, charakteryzującego się brakiem w genomach aktywnych profagów. Korzystnym efektem wynalazku jest możliwość efektywnego namnażania w komórkach szczepu 1679wph bakteriofagów Enterococcus, w tym w szczególności bakteriofagów zawartych w preparatach terapeutycznych.

Dodatkowym korzystnym efektem wynalazku jest możliwość namnażania bakteriofagów terapeutycznych przeciwko Enterococcus w komórkach szczepu 1679wph, w taki sposób by miana w/w fagów zawartych w lizatach wynosiły przynajmniej 10⁹pfu/ml.

Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku został on zilustrowany poniższymi przykładami, które przedstawiają sposób wyodrębnienia spośród różnych szczepów Enterococcus faecalis do namnażania fagów terapeutycznych szczepów pozbawionych aktywnych profagów, sposób wyk azania braku profagów w genomie szczepu E. faecalis 1679wph będącego przedmiotem prezentowanego wynalazku, oraz sposób wykazania, że otrzymany szczep nadaje się do wykorzystania jako szczep gospodarza do wydajnego namnażania bakteriofagów terapeutycznych. We wszystkich przykładach, o ile nie napisano inaczej, zastosowano standardowe metody mikrobiologii i biologii molekularnej opisane przez Miller (1972) oraz Sambrook i in. (1989).

P r z y k ł a d 1. Wstępna analiza sekwencji genomów wybranych szczepów Enterococcus faecalis pod kątem obecności sekwencji reprezentujących aktywne profagi.

Kilka szczepów Enterococcus faecalis do namnażania bakteriofagów terapeutycznych z kolekcji Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda przeczyszczono przez pojedyncze kolonie w celu otrzymania jednorodnych klonów, a następnie komórkami tych kolonii zaszczepiono świeżą pożywkę LB (2% trypton, Difco; 0,5% ekstrakt drożdżowy, Difco; 0,5% NaCI; pH 7,5). Komórki zawieszone w pożywce traktowano mitomycyną C i wysiewano różne rozcieńczenia tak traktowanych zawiesin na płytki z pożywką pełną. W przypadku czterech szczepów nie zaobserwowano różnicy w liczbie kolonii wyrosłych na płytkach po wysianiu komórek traktowanych mitomycyną C w porównaniu z komórkami kontrolnymi, co mogło wskazywać na brak aktywnych profagów w chromosomalnym DNA tych szczepów. Wyizolowane DNA tych szczepów wykorzystano do przygotowania bibliotek fragmentów, które następnie poddano sekwencjonowaniu, z wykorzystaniem sekwenatora genomowego Roche 454 Genome Sequencer GS FLX, zgodnie z metodologią opisaną poprzednio (Łobocka i in., 2012). Analiza wstępnie złożonych fragmentów sekwencji pod kątem identyfikacji rejonów DNA wykazujących cechy aktywnych profagów pozwoliła na wytypowanie dwóch szczepów, jako potencjalnie pozbawionych takich rejonów. W związku z tym przygotowano większe biblioteki fragmentów DNA tych szczepów i zsekwencjonowano je z wykorzystaniem sekwenatora MiSeq Small Genome Sequencer w technologii Illumina (Illumina).

Złożenie otrzymanych danych pozwoliło na otrzymanie prawie kompletnych draftów sekwencji genomowych zidentyfikowanych szczepów, oznaczonych na potrzeby obecnego wynalazku jako 1679wph (SEQ ID NO. 1) (2 853 265 par zasad) i 1854wph (SEQ ID NO.2) (2 858 082 par zasad). Niewielkie fragmenty o nieokreślonej kolejności reszt nukleotydowych w sekwencji draftów (jeden fragment o długości około 150 reszt w sekwencji szczepu 1679wph i 6 fragmentów o długościach około 2000, 25, 1700, 2240, 4800 i 960 reszt) były wielokrotnie za krótkie, by mogły odpowiadać sekwencjom wintegrowanych profagów. Natomiast wnikliwa analiza uzyskanych sekwencji genomowych obu szcze

PL 237 852 Β1 pów zarówno poprzez wyszukiwanie homologii z sekwencjami DNA w bazie danych GenBank, jak i poprzez wyszukiwanie homologii na poziomie białka po przetłumaczeniu otrzymanych sekwencji na sekwencje białkowe we wszystkich ramkach odczytu, potwierdziła wstępne wyniki wskazujące na brak w ich genomach fragmentów, które mogłyby reprezentować genomy aktywnych profagów. Ponadto obie sekwencje wykazywały 99% identyczności, co wskazywało na bliskie pokrewieństwo obu szczepów.

Uzyskane szczepy Enterococcus faecalis pozbawione profagów oraz plazmidów zdeponowane zostały w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM), Wrocław, Polska, działającej zgodnie z traktatem budapesztańskim.

Oznaczenie szczepu Enterococcus faecalis	Polska Kolekcja Mikroorganizmów (PCM) Numer Dostępu Depozytu
1679wph	B/00074
1854wph	B/00075

Przykład 2. Zróżnicowanie szczepów 1679wph i 1854wph pod względem wrażliwości na fagi Enterococcus.

W celu sprawdzenia, czy mimo dużego podobieństwa na poziomie sekwencji DNA szczepy 1679wph i 1854wph różnią się pod względem wrażliwości na fagi, sprawdzono podatność tych szczepów na infekcję różnymi fagami zawartymi w trzynastu różnych preparatach fagów terapeutycznych przeciwko Enterococcus pochodzących z kolekcji Laboratorium Bakteriofagowego Instytutu Immunologii I Terapii Doświadczalnej PAN im. Ludwika Hirszfelda (Tabela 1). Do infekcji użyto lizaty o mianie 10⁸—10⁹, otrzymane w wyniku namnażania fagów w komórkach różnych szczepów Enterococcus wytypowanych poprzednio jako nadające się do wydajnego namnażania tych fagów i pochodzących z kolekcji Laboratorium Bakteriofagowego Instytutu Immunologii I Terapii Doświadczalnej PAN. Fagi namnażano przez dodanie do hodowli płynnej odpowiedniego szczepu Enterococcus faecalis w fazie wykładniczego wzrostu (o gęstości optycznej OD600 = ~0,35) w pożywce LB, zawiesiny fagów, tak by współczynnik infekcji (M.O.I.) wynosił 1. Dodatkowo do hodowli dodawano MgO4 i CaCb (do stężenia końcowego 10 mM). Całość pozostawiano na 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano w 37°C przez około 90 minut z wytrząsaniem. Jeżeli nie następowała liza, inkubację przedłużano przez noc. Lizat wirowano (20 min., 4°C, 9000 g), a uzyskany supernatant filtrowano przez filtry 0,22 PVDF (firmy MILLEX® GS). Badanie infekcyjności wykonywano metodą płytek dwuwarstwowych na podłożu LB, tak jak opisano poprzednio (Golec i in., 2011). Niespodziewanie okazało się, że komórki szczepu 1679wph infekowane są przez wszystkie badane fagi, a komórki szczepu 1854wph przez 12 z 13 badanych fagów. Ponadto, zaobserwowano niewielkie różnice w wydajności infekcji komórek szczepów 1679wph i 1854wph przez niektóre fagi, co świadczy o tym, że szczepy 1679wph i 1854wph mimo podobieństwa na poziomie sekwencji DNA genomowego różnią się wrażliwością na określone fagi.

Przykład 3. Weryfikacja przydatności szczepu 1679wph jako uniwersalnego gospodarza do wydajnego namnażania bakteriofagów Enterococcus faecalis.

W związku z infekcyjnością wielu różnych bakteriofagów Enterococcus dla komórek blisko spokrewnionych szczepów 1679wph i 1854wph sprawdzono, na przykładzie 1679wph, czy, po adaptacji bakteriofagów namnażanych poprzednio w komórkach innych szczepów Enterococcus, do namnażania w komórkach szczepu 1679wph, szczep 1679wph mógłby służyć jako gospodarz do wydajnego namnażania tych bakteriofagów. Pojedyncze łysinki utworzone na warstwie komórek szczepu 1679wph przez fagi wymienione w tabeli 1 izolowano i zawartymi w nich fagami infekowano komórki szczepu 1679wph. Następnie bakteriofagi pozyskane przez namnożenie w komórkach 1679wph używano ponownie do infekcji komórek 1679wph w celu ponownego namnożenia fagów, tak jak podano w przykładzie 1. Po zaobserwowaniu oznak lizy komórek hodowlę przerywano, a lizat oczyszczano z resztek komórek tak jak podano w przykładzie 1. Miano fagów zawartych w otrzymanych w ten sposób lizatach oznaczano na warstwie komórek szczepu 1679wph,zgodnie z opisem w przykładzie 1. Nieoczekiwanie okazało się, że miana wszystkich badanych bakteriofagów w lizatach uzyskanych z komórek szczepu 1679wph wynosiły przynajmniej 10⁹, co odpowiada standardom oczekiwanym dla preparatów fagów terapeutycznych (Merabishvili i in., 2009). Jest więc oczywiste, że szczep E. faecalis 1679wph, jak i blisko z nim spokrewniony szczep 1854wph są gospodarzami odpowiednimi do pozyskiwania preparatów bakteriofagów terapeutycznych o wysokim mianie cząstek fagowych.

PL 237 852 Β1

Tabela 1. Infekcyjność* bakteriofagów Enterococcus namnażanych w komórkach różnych szczepów Enterococcus, dla szczepów E. faecalis 1679wph i 1854wph.

Preparat fagowy	Szczep Enterococcus użyty do namnażania	Liczba łysinek (podana jako pfu/ml) na warstwie komórek szczepu Enterococcus faecalis:
		1679wph	1854wph
EF1	KRZ	8x 106	6x 106
EF3	KRZ	2x 107	1 x 107
EF12	KRZ	6x10®	8x10®
EF13	ADA	2x 106	4x 107
EF15	PIE	2x 105	2 x 107
EF49	1679	1 x 108	2 χ 108
EF56	1854	6x10®	5x10®
EF4	RYB	1 x 109	1 x 10®
EF7	PIE	2x 107	2 x 107
EF37	1515	3x 109	3 x 109
EF39	27677	2x 109	2 x 109
EF57	1854	3x 109	6x 10®
EF62	2451	8x 104	Brak łysinek

* Liczbę łysinek określoną na podstawie ich zliczeń na szalkach z warstwą komórek danego szczepu podano w przeliczeniu na ml lizatu użytego do infekcji (pfu/ml).

Tabela 2. Miana bakteriofagów Enterococcus w lizatach otrzymanych po adaptacji i namnożeniu w komórkach szczepu E. faecalis 1679wph.

Lizaty	Szczep Enterococcus poprzedniego gospodarza do namnażania	Miano fagów w lizatach namnożonych w komórkach szczepu E. faecalis 1679wph, po adaptacji (pfu/ml)
EF1	KRZ	6x 109
EF3	KRZ	1 x 109
EF12	KRZ	1 x 109
EF13	ADA	7x 109
EF15	PIE	1 x 109
EF49	1679	5 x 10 10
EF56	1854	1 x 10 10
EF4	RYB	9x 109
EF7	PIE	7x 109
EF37	1515	1 x 10 10
EF39	27677	9x 109
EF57	1854	4 x 10 10
EF62	2451	4x 108
EF24	661	1 x 109

PL 237 852 B1

Literatura

Arias CA, Murray BE. 2012. The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance. Nat Rev Microbiol. 10: 266-278.

Balogh, B.; Jones, J. B.; Iriarte, F. B.; Momol, M. T. Phage therapy for plant disease control. Curr. Pharm. Biotechnol., 2010, 11: 48-57.

Canchaya C, Proux C, Fournous G, Bruttin A, Brussow H. 2003. Prophage genomics. Micr obiol. Mol. Biol. Rev. 67: 238-276,

Cheetham BF, Katz ME. 1995. A role for bacteriophages in the evolution and transfer of bacterial virulence determinants. Mol Microbiol. 18: 201-208.

Gill, J.J., and Flyman, P. 2010. Phage choice, isolation, and preparation for phage therapy. Curr Pharm Biotechnol. 11: 2-14.

Golec, P., Dąbrowski, K., Hejnowicz, M.S., Gozdek, A., Loś, J.M., Węgrzyn, G., Lobocka, M.B., and Loś, M. (2011). A reliable method for storage of tailed phages. J Microbiol Methods. 84, 486-9.

Golkar Z, Bagasra O, Pace DG. 2014. Bacteriophage therapy: a potential solution for the antibiotic resistance crisis. J Infect Dev Ctries. 8:129-136.

Górski A, Miedzybrodzki R, Borysowski J, Weber-Dabrowska B, Lobocka M, Fortuna W, Letkiewicz S, Zimecki M, Filby G. 2009. Bacteriophage therapy for the treatment of infections. Curr Opin Investig Drugs. 10: 766-774.

Giridhara Upadhyaya PM, Ravikumar KL, Umapathy BL. 2009. Review of virulence factors of enterococcus: an emerging nosocomial pathogen. Indian J Med Microbiol. 27: 301-305.

Guttman, B., Raya, P., and Kutter, E. 2005. Basic phage biology. In Bacteriophages: biology and application, E.B., Kutter, and A., Sulakvelidze, eds. (Boca Raton (FL): CRC Press), pp. 29-66.

Letkiewicz S, Miedzybrodzki R, Fortuna W, Weber-Dabrowska B, Górski A. 2009. Eradication of Enterococcus faecalis by phage therapy in chronic bacterial prostatitis-case report. Folia Microbiol (Praha). 54: 457-461.

Łobocka M., Hejnowicz M. S., Gągała U., Weber-Dąbrowska B., Węgrzyn G., Dadlez M. 2014. The first step to bacteriophage therapy - how to choose the correct phage. In.: Phage Therapy. Current Research and Applications. Borysowski J., Międzybrodzki R., Górski, A. (ed.). Caister Academic Press, pp. 23-69.

Matos RC, Lapaque N, Rigottier-Gois L, Debarbieux L, Meylheuc T, Gonzalez-Zorn B, Repoila F, Lopes Mde F, Serror P. 2013. Enterococcus faecalis prophage dynamics and contributions to pathogenic traits. PLoS Genet. 9(6):e1003539.

Merabishvili, M., Pirnay, J.P., Verbeken, G., Chanishvili, N., Tediashvili, M., Lashkhi, N., Glonti, T., Krylov, V., Mast, J., Van Parys, L., Lavigne, R., Volckaert, G., Mattheus, W., Verween, G., De Corte, P., Rose, T., Jennes, S., Zizi, M., De Vos, D., and Vaneechoutte, M. 2009. Quality-controlled small-scale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. PLoS One. 4, e4944.

Miller J.H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour. New York.

Uchiyama J, Rashel M, Takemura I, Wakiguchi H, Matsuzaki S. In silico and in vivo evaluation of bacteriophage phiEF24C, a candidate for treatment of Enterococcus faecalis infections. 2008. Appl Environ Microbiol. 74: 4149-4163.

Wang, X., Kim, Y., Ma, Q., Hong, S.H., Pokusaeva, K., Sturino, J.M., and Wood, T.K. 2010. Cryptic prophages help bacteria cope with adverse environments. Nature Communications 1, 147.

Claims (3)

1. Szczep Enterococcus faecalis pozbawiony profagów i zdolny do produkcji monoklonalnych preparatów fagowych będący szczepem Enterococcus faecalis 1679wph zdeponowanym w PCM jako B/00074.

2. Szczep Enterococcus faecalis, znamienny tym, że posiada chromosom bakteryjny zawierający DNA o sekwencji Sekw. Nr 1.

3. Sposób otrzymywania preparatu bakteriofagowego, zwłaszcza terapeutycznego, znamienny tym, że szczep bakteriofaga specyficznego wobec Enterococcus faecalis namnaża się w hodowli szczepu Enterococcus faecalis pozbawionego profagów określonego w zastrz. 1 lub 2, a następnie izoluje się namnożone fagi z uzyskanego lizatu, przy czym otrzymywane preparaty bakteriofagowe są pozbawione zanieczyszczeń fagami łagodnymi.