PL237365B1

PL237365B1 - Microfluidal device for growing cell culture in a gradient of bioactive substance

Info

Publication number: PL237365B1
Application number: PL419754A
Authority: PL
Inventors: Roman SZAFRAN; Kazimierz GĄSIOROWSKI; Katarzyna GĘBCZAK; Benita WIATRAK
Original assignee: Politechnika Wroclawska; Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2021-04-06
Also published as: PL419754A1; WO2018106132A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest urządzenie mikrofluidalne (bioczip) do prowadzenia hodowli komórkowych w układzie stacjonarnym, w ciągłym gradiencie substancji aktywnej oraz prowadzenia badań procesów biologicznych przebiegających w jej gradiencie. Mikrourządzenie znajduje zastosowanie w biologii, medycynie, farmacji, biotechnologii i inżynierii biomedycznej. Konstrukcja bioczipu umożliwia jednoczesne prowadzenie hodowli kontrolnej (tzw. ślepa próba) oraz hodowli właściwej w stabilnym gradiencie substancji aktywnej o ultraniskim stężeniu oraz ciągłą, pośrednią detekcję tego stężenia dzięki wykorzystaniu komory wskaźnikowej. W szczególności, urządzenie umożliwia wytworzenie mikrośrodowiska właściwego do prowadzenia badań podstawowych: proliferacji, wzrostu i różnicowania komórek, odpowiedzi immunologicznej, leczenia uszkodzeń, embriogenezy oraz metastazy nowotworowej - zjawisk zależnych od gradientów molekularnych, koniecznych do odwzorowania i regulacji szlaków sygnalizacji komórkowej, charakterystycznych dla tych procesów. Gradienty te w urządzeniu tworzone są w prosty, szybki i powtarzalny sposób dzięki wykorzystaniu zjawiska adwekcyjnego transportu masy, a hodowle i badania prowadzone są w warunkach stacjonarnych (nieprzepływowych), przez co naturalna sekrecja czynników biochemicznych przez komórki jest niezaburzona.The subject of the invention is a microfluidic device (biochip) for carrying out cell cultures in a stationary system in a continuous gradient of the active substance and for conducting research on biological processes running along its gradient. The microdevice is used in biology, medicine, pharmacy, biotechnology and biomedical engineering. The construction of the biochip allows for the simultaneous conduct of a control culture (the so-called blank test) and proper culture in a stable gradient of active substance with an ultra-low concentration, and continuous, indirect detection of this concentration thanks to the use of an indicator chamber. In particular, the device enables the creation of a microenvironment appropriate for basic research: cell proliferation, growth and differentiation, immune response, treatment of damage, embryogenesis and neoplastic metastasis - phenomena dependent on molecular gradients, necessary for the mapping and regulation of cell signaling pathways, characteristic of these processes . These gradients in the device are created in a simple, fast and repeatable way thanks to the phenomenon of advective mass transport, and the cultures and research are carried out in stationary (non-flow) conditions, thanks to which the natural secretion of biochemical factors by cells is not disturbed.

W ludzkim ciele gradienty stężeń biomolekuł są regulowane i pełnią zadania kontrolne wielu podstawowych funkcji komórki. Do biocząsteczek należą między innymi: lipidy, glikolipidy, sterole, witaminy, hormony, neurotransmitery i metabolity. W celu zrozumienia wpływu bodźców chemicznych na komórkowych szlakach sygnałowych na biologię komórki, poszukuje się metod odwzorowania mikrośrodowiska panującego w organizmach żywych w warunkach sztucznych. Klasycznie w tym celu wykorzystuje się tzw. komory Boydena, Dunn'a lub Zigmond'a, a ostatnio hodowle prowadzi się również na podłożach z agarozy na szlakach Petriego, gdzie gradienty stężenia wytwarzane są za pomocą mikroaspiratorów. Klasyczne rozwiązania do hodowli komórkowych w gradiencie stężenia ze względu na rozmiary, nie pozwalają na badanie zjawisk zachodzących na poziomie komórkowym i w ich bezpośrednim otoczeniu. Przykładowo, średnice większości komórek zawierają się w przedziale 1-100 mikrometrów, a wydzielane przez nie chemiczne sygnały międzykomórkowe (np. cytokiny i chemokiny) obejmują swym zasięgiem odległości rzędu 250 mikrometrów. W porównaniu z rozmiarami klasycznych komór hodowlanych, których wymiary charakterystyczne wynoszą od kilku milimetrów do kilku centymetrów, układy mikrofluidalne oferują wyższą dokładność oraz lepszą kontrolę generowanego gradientu dzięki wymiarom charakterystycznym dopasowanym do skali komórkowej (np. wysokość/szerokość kanału), mieszczącym się w przedziale od kilku do kilkuset mikrometrów. To z kolei pozwala na prowadzenie badań zjawisk zachodzących na poziomie komórkowym. Dodatkowo, układy mikrofluidalne operują na niewielkich objętościach płynu, rzędu mikrolitrów, co znacząco obniża koszty badań. (Alicia G. G. Toh, Z.Nam-Trung Nguyen, P. Wang Chun Yang; Engineering microfluidic concentration gradient generators for biological applications, Microfluid Nanofluid, 2014, 16:1-18). Mikrofluidalne generatory gradientów zostały już z powodzeniem wykorzystane do prowadzenia badań nad opracowaniem nowych leków, chemotaksji, wpływu czynników biochemicznych na przeżywalność komórek oraz różnicowanie komórek macierzystych.In the human body, biomolecule concentration gradients are regulated and perform the control tasks of many basic cell functions. The biomolecules include, among others: lipids, glycolipids, sterols, vitamins, hormones, neurotransmitters and metabolites. In order to understand the influence of chemical stimuli on cell signaling pathways on cell biology, methods of mapping the microenvironment of living organisms in artificial conditions are being searched for. Classically, for this purpose, the so-called Boyden, Dunn or Zigmond chambers, and more recently, cultures are also carried out on agarose media in Petri lanes, where concentration gradients are generated by microaspirators. Classic solutions for cell culture in a concentration gradient due to their size do not allow for the study of phenomena occurring at the cellular level and in their immediate surroundings. For example, most cells have diameters in the range of 1-100 micrometers and their secretion of intercellular chemical signals (e.g. cytokines and chemokines) are in the range of 250 micrometers. Compared to the sizes of classic breeding chambers, whose characteristic dimensions range from a few millimeters to several centimeters, microfluidic systems offer higher accuracy and better control of the generated gradient thanks to the characteristic dimensions adjusted to the cell scale (e.g. height / width of the channel), ranging from a few to several hundred micrometers. This, in turn, allows research on phenomena taking place at the cellular level. In addition, microfluidic systems operate on small volumes of fluid, on the order of microliters, which significantly reduces research costs. (Alicia G. G. Toh, Z.Nam-Trung Nguyen, P. Wang Chun Yang; Engineering microfluidic concentration gradient generators for biological applications, Microfluid Nanofluid, 2014, 16: 1-18). Microfluidic gradient generators have already been used successfully to conduct drug development research, chemotaxis, the influence of biochemical factors on cell survival and stem cell differentiation.

Wyróżniamy dwa podstawowe typy mikrofluidalnych generatorów gradientu - statyczne i dynamiczne. Układy dynamiczne charakteryzują się ciągłym przepływem płynu w obrębie komory hodowlanej, a gradient stężenia wytwarzany jest dzięki adwekcyjnemu mieszaniu płynów o różnych stężeniach. Urządzenia tego typu znajdują zastosowanie do badań zjawisk w obecności naprężeń ścinających i mają zastosowanie do komórek, które natywnie narażone są na takie naprężenia oraz wymagają zastosowania komórek z linii adherentnych. Dodatkowo wymagają urządzeń wymuszających ciągły i stabilny przepływ płynu w urządzeniu, który to przepływ zaburza profile stężeń substancji uwalnianych przez komórki. W amerykańskim wniosku patentowym US 20020113095 A1 opisano mikrourządzenie złożone z systemu kanałów do generowania rozcieńczeń o żądanym stężeniu i gradientów stężenia. Przepływowe urządzenie składało się z szeregu połączonych kanałów i mieszalników, dzięki którym możliwe było uzyskanie szeregu strumieni o zadanym stężeniu. Ich równoległy przepływ przez kanał wylotowy generował nieciągły, poprzeczny gradient stężenia w komorze hodowlanej. Z kolei, w innym amerykańskim patencie US 8216526 (B2) opisano urządzenie mikrofluidalne zaopatrzone w centralnie rozmieszczoną okrągłą komorę hodowlaną, styczną na krawędziach z systemem przepływowych kanałów. Substancja aktywna przepływając w obrębie komory, na jej krótkim odcinku, wytwarzała w jej wnętrzu gradient stężenia, przy czym był on efektem dyfuzyjno-adwekcyjnego ruchu masy. Dyfuzyjno-adThere are two basic types of microfluidic gradient generators - static and dynamic. Dynamic systems are characterized by a continuous flow of fluid within the culture chamber, and the concentration gradient is produced by advective mixing of fluids of different concentrations. Devices of this type are used to study phenomena in the presence of shear stresses and are applicable to cells that are natively exposed to such stresses and require the use of cells from adherent lines. Additionally, they require devices forcing a continuous and stable fluid flow in the device, which disrupts the concentration profiles of substances released by the cells. The US patent application US 20020113095 A1 describes a microdevice consisting of a channel system for generating dilutions of a desired concentration and concentration gradients. The flow device consisted of a series of connected channels and mixers, thanks to which it was possible to obtain a number of streams with a given concentration. Their parallel flow through the outlet channel generated a discontinuous, transverse concentration gradient in the culture chamber. In turn, another US patent US 8216526 (B2) describes a microfluidic device provided with a centrally located circular growth chamber tangential at its edges with a system of flow channels. The active substance, flowing within the chamber, along its short section, generated a concentration gradient inside the chamber, which was the result of the diffusion-advective movement of the mass. Diffusion-ad

PL 237 365 B1 wekcyjny mechanizm transportu masy umożliwił szybkie formowanie i kontrolowanie ciągłych gradientów stężeń, jednak konstrukcja urządzenia wymuszała bardzo precyzyjną kontrolę ciśnień na wlotach i wylotach z kanałów przepływowych.The selective mass transport mechanism allowed for the rapid formation and control of continuous concentration gradients, but the design of the device required very precise control of pressures at the inlets and outlets from the flow channels.

Statyczne mikrofluidalne generatory gradientów wykorzystują dyfuzyjny mechanizm transportu masy, który jest o kilka rzędów wolniejszym mechanizmem transportu niż mechanizm adwekcyjny. Stąd też czas ustalania gradientu jest długi i często wymusza wprowadzanie komórek dopiero po jego ustaleniu, co jest trudne technicznie do realizacji. Generatory statyczne umożliwiają prowadzenie badań z udziałem komórek nieadherentnych oraz przy braku naprężeń ścinających oddziałujących na ciało komórki, jak również umożliwiają zachowanie profili stężeń substancji naturalnie uwalnianych z ich wnętrza. Rozwiązania te często jednak wymagają wykorzystania membran i hydrożeli do stabilizacji profilu stężenia oraz z racji długich czasów ustalania profilu stężenia, komory hodowlane są krótkie, przez co generują proporcjonalnie duże gradienty stężenia, co skutkuje niską rozdzielczością wyników badań. W opisie patentowym nr US8377685 (B2), opisano urządzenie mikrofluidalne do badań procesu chemotaksji w stabilnym gradiencie czynnika aktywnego. Urządzenie składało się z dwóch zbiorników połączonych kanałem, w którym odbywała się migracja komórek w kierunku czynnika aktywującego chemotaksję. Gradient czynnika aktywnego w kanale łączącym zbiorniki uzyskiwano dzięki procesowi dyfuzji substancji aktywnej w kierunku zasobnika komórek. Z kolei z amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr US20110003372 (A1) znane jest urządzenie mikrofluidalne do badań procesów chemicznych i biologicznych w gradiencie stężenia substancji aktywnej, które składa się z zasobników połączonych równolegle przebiegającymi w części roboczej kanałami poprzecznie połączonych łącznikami. Gradienty stężenia generowane są w krótkich poprzecznych łącznikach dzięki procesowi dyfuzji substancji aktywnej pomiędzy równoległymi kanałami. Podobnie, w amerykańskim zgłoszeniu patentowym US20070253868 (A1) ujawniono urządzenie mikrofluidalne do generowania gradientu stężenia cząstek, które zbudowane jest z pojedynczego kanału, posiadającego wlot i wylot oraz porowate membrany na obu końcach kanału, przepuszczalne dla cząstek, które zapewniały stabilizację gradientu stężenia. Z europejskiego zgłoszenia patentowego EP1741487 (A1) znane jest urządzenie mikrofluidalne zaopatrzone w pole obserwacji leżące pomiędzy co najmniej dwiema komorami, a w obrębie pola obserwacji wytwarzany jest dyfuzyjny gradient stężenia substancji aktywnej. Z kolei w amerykańskim opisie patentowym US8449837 (B2) ujawniono złożone technicznie urządzenie mikrofluidalne do badań zjawisk w układach biologicznych w gradiencie stężenia substancji aktywnej. Urządzenie wyposażone jest w szereg kanałów i zbiorników zasilających oraz dwa równoległe przepływowe kanały zasilające połączone poprzecznymi kanałami łącznikowymi, a w obrębie kanałów łącznikowych wytwarzane są dyfuzyjne gradienty stężenia substancji aktywnej w różnych zakresach rozcieńczeń. Z niemieckiego opisu patentowego DE102014109468 (B3) znane jest wielowarstwowe urządzenie mikrofluidalne do prowadzenia hodowli komórkowych w gradiencie stężenia substancji aktywnej, które składa się z trzech kanałów rozmieszczonych jeden nad drugim, oddzielonych porowatą membraną, przez którą dyfunduje aktywny składnik mieszaniny. W kanale środkowym, będącym komorą hodowlaną wytwarzany jest poprzeczny dyfuzyjny gradient stężenia substancji aktywnej. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO2015032900 (A1) opisano urządzenie mikrofluidalne wyposażone w pojedynczą komorę hodowlaną w kształcie wieloboku. Wewnątrz komory hodowlanej wytwarzany był gradient stężenia substancji aktywnych poprzez doprowadzenie równoległych do boków wielokąta kanałów, przez które przepływała substancja aktywna, i które to kanały kontaktowały się z komorą jedynie poprzez półprzepuszczalną membranę, w ten sposób, że wewnątrz komory wytwarzany był dyfuzyjny gradient stężenia substancji aktywnej. Z kolei amerykańskie zgłoszenie patentowe US20130171682 (A1) dotyczy wielodołkowego urządzenia mikrofluidalnego umożliwiającego prowadzenie równoległych hodowli, analizę i obserwację procesu wzrostu i migracji komórek. W polskich zgłoszeniach patentowych P415008 (A1) i P415010 (A1) opisano przepływowe urządzenia do prowadzenia hodowli komórek nerwowych umożliwiające generowanie uszkodzeń sieci neuronów. Urządzenia te nie umożliwiają jednak prowadzenia badań w gradiencie stężenia substancji aktywnych.Static microfluidic gradient generators use the diffusion mass transport mechanism, which is several orders of magnitude slower than the advection mechanism. Hence, the time to establish the gradient is long and often forces the introduction of cells only after it has been established, which is technically difficult to implement. Static generators enable research with the participation of non-adherent cells and in the absence of shear stresses affecting the cell body, as well as maintain the concentration profiles of substances naturally released from their interior. However, these solutions often require the use of membranes and hydrogels to stabilize the concentration profile and, due to the long time of setting the concentration profile, the culture chambers are short, and therefore generate proportionally large concentration gradients, which results in a low resolution of the test results. In the patent specification No. US8377685 (B2), a microfluidic device for studying the chemotaxis process in a stable gradient of the active agent is described. The device consisted of two tanks connected by a channel in which the migration of cells towards the chemotaxis activating factor took place. The gradient of the active agent in the channel connecting the reservoirs was obtained thanks to the diffusion of the active substance towards the reservoir of cells. In turn, from the US patent application No. US20110003372 (A1), a microfluidic device is known for the study of chemical and biological processes in the concentration gradient of the active substance, which consists of reservoirs connected in parallel in the working part by channels connected transversely with connectors. Concentration gradients are generated in short transverse connectors due to the diffusion of the active substance between parallel channels. Similarly, US patent application US20070253868 (A1) discloses a microfluidic device for generating a particle concentration gradient which is composed of a single channel having an inlet and an outlet and porous membranes at both ends of the channel permeable to the particles which ensure stabilization of the concentration gradient. From the European patent application EP1741487 (A1) a microfluidic device is known which has an observation field lying between at least two chambers, and a diffusive concentration gradient of the active substance is generated within the observation field. In turn, the American patent US8449837 (B2) discloses a technically complex microfluidic device for studying phenomena in biological systems in the concentration gradient of the active substance. The device is equipped with a series of feed channels and tanks and two parallel flow feed channels connected by transverse connecting channels, and within the connecting channels, diffuse concentration gradients of the active substance in various dilution ranges are generated. DE102014109468 (B3) discloses a multilayer microfluidic device for conducting cell cultures in a concentration gradient of an active substance, which consists of three channels arranged one above the other, separated by a porous membrane through which the active component of the mixture diffuses. A transverse diffusion gradient of active substance concentration is generated in the middle channel, which is the culture chamber. The international patent application WO2015032900 (A1) describes a microfluidic device equipped with a single polygon-shaped rearing chamber. Inside the culture chamber, a concentration gradient of active substances was created by introducing channels parallel to the sides of the polygon through which the active substance was flowing, and which channels contacted the chamber only through a semi-permeable membrane, so that a diffusive concentration gradient of the active substance was produced inside the chamber. . On the other hand, the US patent application US20130171682 (A1) relates to a multi-well microfluidic device enabling parallel culture, analysis and observation of the cell growth and migration process. Polish patent applications P415008 (A1) and P415010 (A1) describe flow devices for conducting the cultivation of nerve cells that enable the generation of damage to the neuron network. However, these devices do not allow for research in the concentration gradient of active substances.

Żadne ze znanych rozwiązań konstrukcyjnych mikroukładów do prowadzenia hodowli komórkowych w gradiencie stężenia substancji aktywnej nie umożliwia jednocześnie szybkiego wytwarzania gradientu stężenia substancji aktywnej w wyniku ruchów adwekcyjnych płynu w komorze hodowlanej oraz prowadzenia hodowli w warunkach stacjonarnych, bez udziału naprężeń ścinających oraz bez zaburzania profilu czynników biochemicznych podlegających naturalnej sekrecji z komórek. Znane z literatury naukowej rozwiązania nie umożliwiają prowadzenia wielu jednoczesnych hodowli komórek w gradiencie stężenia czynników oraz bez ich udziału (tzw. ślepa próba) w jednym urządzeniu, jak równieżNone of the known design solutions of microcircuits for conducting cell cultures in the concentration gradient of the active substance allows for the rapid production of the concentration gradient of the active substance as a result of advection movements of the fluid in the culture chamber and cultivation under stationary conditions, without the participation of shear stresses and without disturbing the profile of biochemical factors undergoing natural secretion from cells. The solutions known from the scientific literature do not allow for multiple simultaneous cultures of cells in the concentration gradient of factors and without their participation (the so-called blank test) in one device, as well as

PL 237 365 B1 ciągłej, pośredniej detekcji gradientu czynnika o ultraniskim stężeniu, którego bezpośredni pomiar nie jest możliwy, i bez bezpośredniego kontaktu substancji wskaźnikowej z hodowlą komórkową.Continuous, indirect gradient detection of an ultra-low concentration factor, which cannot be measured directly, and without direct contact of the indicator substance with the cell culture.

W rezultacie wynikła potrzeba opracowania nowego rozwiązania konstrukcyjnego rozwiązującego powyższe problemy.As a result, there was a need to develop a new design solution solving the above problems.

Urządzenie mikrofluidalne do hodowli komórek w gradiencie substancji bioaktywnej według wynalazku składa się z trzech warstw oraz dwóch osłon zbiorników zasilających, które wystają poza krawędź mikrourządzenia od 10 do 50% swojej długości, przy czym wierzchnią warstwę stanowi pokrywa, w której znajdują się zbiorniki płynów zasilających komory hodowlane, punkty orientacyjne oraz podziałka milimetrowa; w środkowej warstwie funkcjonalnej wykonanej z błony klejowej znajduje się zespół kanałów, które mają wydłużony kształt i przebiegają równolegle do dłuższych krawędzi urządzenia, a każdy z kanałów pełniących rolę komór hodowlanych i wskaźnikowych na swych końcach połąc zony jest ze zbiornikiem płynów, przy czym co najmniej jedna z komór przeznaczona jest do prowadzenia hodowli komórek w gradiencie stężenia substancji aktywnej hodowla właściwa, jedna do prowadzenia hodowli bez udziału czynnika aktywnego tzw. ślepa próba i jedna do rozwinięcia profilu stężenia substancji wskaźnikowej komora wskaźnikowa; a warstwę spodnią stanowi podstawa, przy czym klejowa warstwa funkcjonalna (7) łączy pokrywę (6) z podstawą (9) w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.The microfluidic device for cell cultivation in the gradient of bioactive substance according to the invention consists of three layers and two feed reservoir covers that extend beyond the edge of the microdevice from 10 to 50% of its length, the top layer being a cover in which there are reservoirs of fluids feeding the chambers breeding, landmarks and millimeter marks; in the central functional layer made of adhesive film there is a set of channels that have an elongated shape and run parallel to the longer edges of the device, and each of the channels serving as breeding and indicator chambers at its ends is connected to a fluid reservoir, with at least one from the chambers is intended for the cultivation of cells in the concentration gradient of the active substance proper culture, one for culturing without the active agent, the so-called blank and one to develop the indicator substance concentration profile indicator chamber; and the backsheet is the base, the adhesive functional layer (7) connecting the cover (6) to the base (9) in a non-separable, durable and hydraulically tight manner.

Korzystnie pokrywa wykonana jest z poli(metakrylanu) metylu PMMA.Preferably, the cover is made of PMMA poly (methyl methacrylate).

Korzystnie warstwa funkcjonalna wykonana jest z akrylowej błony klejowej.Preferably, the functional layer is made of an acrylic adhesive film.

Korzystnie wysokość warstwy funkcjonalnej jest nie mniejsza niż średnica komórek planowanych do hodowli i badań.Preferably, the height of the functional layer is not less than the diameter of the cells planned for cultivation and research.

Korzystnie komory mikrourządzenia posiadają półkoliste zakończenia dopasowane rozmiarem do średnicy zbiorników.Preferably, the microdevice chambers have semicircular ends that are sized to the diameter of the tanks.

Korzystnie wszystkie komory są dokładnie tego samego kształtu i rozmiarów.Preferably all chambers are of exactly the same shape and size.

Korzystnie wszystkie zbiorniki zasilające mają cylindryczny kształt o średnicy dopasowanej do średnicy końcówki strzykawki jednorazowej.Preferably, all of the supply tanks are cylindrical in shape with a diameter matching the diameter of the tip of the disposable syringe.

Korzystnie wszystkie zbiorniki zasilające są dokładnie tego samego kształtu i o tej samej objętości.Preferably, all the feed tanks are of exactly the same shape and volume.

Korzystnie objętość każdego ze zbiorników jest co najmniej równa objętości komory.Preferably, the volume of each reservoir is at least equal to the volume of the chamber.

Korzystnie zbiorniki od góry zabezpieczone są za pomocą osłon.Preferably, the tanks are secured from above with covers.

Korzystnie osłony zbiorników połączone są z pokrywą w sposób rozłączny i hydraulicznie szczelny.Preferably, the covers of the tanks are connected to the cover in a releasable and hydraulically tight manner.

Korzystnie podziałka milimetrowa przebiega wzdłuż każdej z komór na całej długości ich przestrzeni roboczej, poza obrębem komór.Preferably, a millimeter scale extends along each of the chambers over the entire length of their working space, outside the chambers.

Korzystnie punkty orientacyjne mają formę równo oddalonych okręgów o średnicy nie większej niż 0,1 mm ustawionych w jednym lub kilku rzędach symetrycznie wzdłuż osi każdej z komór.Preferably, the landmarks are in the form of equally spaced circles not greater than 0.1 mm in diameter arranged in one or more rows symmetrically along the axis of each of the chambers.

Korzystnie podstawa wykonana jest ze szkła sodowego, borokrzemowego lub poli(metakrylanu) metylu PMMA.Preferably, the base is made of sodium, borosilicate or PMMA poly (methyl methacrylate) glass.

Korzystnie właściwości powierzchniowe komór hodowlanych zostały zmodyfikowane w celu zapewnienia lepszej adhezji komórek do ich powierzchni i ograniczenia adsorpcji substancji aktywnych na ich wewnętrznej powierzchni.Preferably, the surface properties of the culture chambers have been modified in order to ensure better adhesion of the cells to their surface and to limit the adsorption of active substances on their inner surface.

Korzystnie wszystkie warstwy wykonane są z materiałów o niskiej autoluminescencji.Preferably, all layers are made of low autoluminescent materials.

Korzystnie wszystkie warstwy wykonane są z materiałów transparentnych dla promieniowania świetlnego w zakresie widzialnym oraz ultrafiolecie.Preferably, all layers are made of materials transparent to light radiation in the visible and ultraviolet range.

Korzystnie warstwy wykonane są z materiałów biokompatybilnych.Preferably, the layers are made of biocompatible materials.

Urządzenie mikrofluidalne do hodowli komórek w gradiencie substancji bioaktywnej według wynalazku umożliwia prowadzenie hodowli komórkowych w układzie stacjonarnym (nie przepływowym) bez narażania komórek na stres związany z występowaniem naprężeń ścinających indukowanych przez przepływające płyny oraz przy zachowaniu niezaburzonych profili stężenia, podlegających naturalnej sekrecji, czynników biochemicznych z komórek; umożliwia prowadzenie hodowli w ciągłym gradiencie substancji aktywnej oraz prowadzenie badań procesów biologicznych przebiegających w jej gradiencie, przy czym konstrukcja bioczipu umożliwia jednoczesne prowadzenie hodowli kontrolnej (tzw. ślepa próba) oraz co najmniej jednej hodowli właściwej w stabilnym gradiencie substancji aktywnej o ultraniskim stężeniu, której bezpośrednia detekcja nie jest możliwa, oraz ciągłą, pośrednią detekcję stężenia wskaźnika metodą spektrofotometryczną, bez narażania komórek na kontakt z substancją wskaźnikową.The microfluidic device for cell culture in a gradient of bioactive substance according to the invention enables cell cultures to be carried out in a stationary (non-flow) system without exposing the cells to stress related to the occurrence of shear stresses induced by flowing fluids and maintaining undisturbed concentration profiles of naturally secreted biochemical factors from cells; enables the cultivation of the active substance in a continuous gradient and the research of biological processes running along its gradient, while the construction of the biochip enables the simultaneous conduct of a control culture (the so-called blank test) and at least one specific culture in a stable gradient of active substance with an ultra-low concentration, the direct detection is not possible, and continuous, indirect detection of the indicator concentration by spectrophotometric method, without exposing the cells to contact with the indicator substance.

PL 237 365 B1PL 237 365 B1

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania oraz na rysunku na którym:The subject of the invention is presented in more detail in the exemplary embodiments and in the drawing where:

fig. 1 przedstawia trójkomorowe urządzenie mikrofluidalne, fig. 2 przedstawia układ warstw w trójkomorowym urządzeniu mikrofluidalnym, fig. 3 przedstawia czterokomorowe urządzenie mikrofluidalne, fig. 4 przedstawia układ warstw w czterokomorowym urządzeniu mikrofluidalnym.Figure 1 shows a three-chamber microfluidic device, Figure 2 shows a layering in a three-chamber microfluidic device, Figure 3 shows a four-chamber microfluidic device, Figure 4 shows a layering in a four-chamber microfluidic device.

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

Trójkomorowe, otwarte urządzenie mikrofluidalne o wymiarach 25/75/5,13 mm (szerokość/długość/wysokość) do prowadzenia pojedynczej hodowli komórek w gradiencie substancji bioaktywnej zostało przedstawione na fig. 1 oraz fig. 2. Na fig. 1 zostało uwidocznione urządzenie w widoku ogólnym wraz ze zbiornikami płynów 1 zasilających układ trzech równolegle przebiegających komór 2, dwóch osłon 3 zbiorników, punktami orientacyjnymi 4 oraz podziałką milimetrową 5. Urządzenie mikrofluidalne składa się z trzech warstw oraz dwóch osłon zbiorników, których układ został przedstawiony na fig. 2.A three-chamber, open microfluidic device with dimensions 25/75 / 5.13 mm (width / length / height) for growing a single cell culture in a gradient of bioactive substance is shown in Fig. 1 and Fig. 2. Fig. 1 shows the device in a general view with the fluid reservoirs 1 supplying the arrangement of three parallel chambers 2, two reservoir covers 3, landmarks 4 and a millimeter scale 5. The microfluidic device consists of three layers and two reservoir covers, the arrangement of which is shown in Fig. 2.

Wierzchnia warstwa stanowiąca pokrywę 6 mikrourządzenia wykonana została z PMMA o grubości 3 mm. W warstwie tej na wysokości wlotów i wylotów z komór mikrourządzenia wyk onanych zostało sześć cylindrycznych zbiorników 1, o średnicy 4,3 mm dopasowanej do średnicy komór mikrourządzenia i rozmieszczonych na obu końcach każdej komory. W osi każdej z komór w równych odległościach wynoszących 1 mm, na spodniej stronie pokrywy um ieszczono punkty orientacyjne 4 w postaci kropek o średnicy 0,05 mm ustawione w jednym rzędzie. Wzdłuż każdej z komór na długości ich obszaru roboczego, poza przestrzenią roboczą komór umieszczono podziałkę milimetrową 5. Warstwa funkcjonalna 7 wykonana została z komercyjnie dostępnej błony klejowej przygotowanej na bazie kleju akrylowego o grubości 0,13 mm. W warstwie tej wykonano trzy podłużne, symetrycznie rozłożone na powierzchni warstwy, wzajemnie równoległe komory 2, każda o szerokości 4,3 mm i długości 68,6 mm, przy czym obszar roboczy każdej z komór był długości 50mm. Każda z komór posiadała półkoliste zakończenia 8 o średnicy 4,3 mm, rozmieszczone tak, by pokrywały się one z krawędziami otworów zbiorników umieszczonymi współosiowo ze środkami półkolistych zakończeń. Podstawa 9 wykonana została z podstawowego szkiełka mikroskopowego o grubości 2mm. Warstwa klejowa łączy pokrywę z podstawą w sposób nierozłączny i hydraulicznie szczelny. Wewnętrzna powierzchnia każdej z komór posiada zmodyfikowane właściwości powierzchniowe ograniczające adsorpcję substancji aktywnych na ich wewnętrznych powierzchniach oraz ułatwiające immobilizacje komórek w komorach mikrourządzenia. Górne powierzchnie zbiorników zasilających posiadają zabezpieczenia w postaci prostokątnych odcinków folii polipropylenowej samoprzylepnej o grubości 1 mm i wymiarach 25/20 (szerokość/długość) na każdym końcu urządzenia, tworzące osłony 3 zbiorników zasilających. Krawędź osłony zbiornika jest odsunięta od krawędzi mikrourządzenia o 10 mm i wystaje poza jej obręb. Osłony zbiorników połączone są z pokrywą w sposób rozłączny i hydraulicznie szczelny.The top layer 6 of the microdevice is made of 3 mm thick PMMA. In this layer, at the height of the inlets and outlets from the microdevice chambers, six cylindrical tanks 1 were made, 4.3 mm in diameter, matched to the diameter of the microdevice chambers and distributed at both ends of each chamber. Along the axis of each of the chambers at equal distances of 1 mm, on the underside of the cover there are landmarks 4 in the form of dots with a diameter of 0.05 mm arranged in one row. Along each of the chambers, along the length of their working area, outside the working space of the chambers, a millimeter scale 5 was placed. The functional layer 7 was made of a commercially available adhesive film prepared on the basis of acrylic adhesive, 0.13 mm thick. In this layer, there were made three oblong, symmetrically distributed on the surface of the layer, mutually parallel chambers 2, each 4.3 mm wide and 68.6 mm long, with the working area of each chamber being 50 mm long. Each of the chambers had semicircular ends 8 with a diameter of 4.3 mm, arranged to coincide with the edges of the openings of the tanks placed coaxially with the centers of the semicircular ends. The base 9 was made of a basic microscope slide with a thickness of 2 mm. The adhesive layer connects the cover to the base in a non-separable and hydraulically tight manner. The inner surface of each of the chambers has modified surface properties limiting the adsorption of active substances on their internal surfaces and facilitating the immobilization of cells in the chambers of the microdevice. The upper surfaces of the supply tanks are protected by rectangular sections of 1 mm thick self-adhesive polypropylene film 25/20 (width / length) at each end of the device, forming the covers of the 3 supply tanks. The edge of the tank cover is 10 mm away from the edge of the microdevice and extends beyond its boundary. The covers of the tanks are connected to the cover in a separable and hydraulically tight manner.

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

Czterokomorowe, otwarte urządzenie mikrofluidalne o wymiarach 45/100/10,06 mm (szerokość/długość/wysokość) do prowadzenia dwóch równoległych hodowli komórek w gradiencie substancji bioaktywnej zostało przedstawione na fig. 3 oraz fig. 4. Na fig. 3 zostało uwidocznione urządzenie w widoku ogólnym wraz ze zbiornikami płynów 1 zasilających układ czterech równolegle przebiegających komór 2, dwóch osłon 3 zbiorników, punktami orientacyjnymi 4 oraz podziałką milimetrową 5. Urządzenie mikrofluidalne składa się z trzech warstw oraz dwóch osłon zbiorników, których układ został przedstawiony na fig. 2.A four-chamber, open microfluidic device with dimensions of 45/100 / 10.06 mm (width / length / height) for cultivating two parallel cultures of cells in a gradient of bioactive substance is shown in Fig. 3 and Fig. 4. Fig. 3 shows the device in general view, together with the fluid reservoirs 1 supplying the system of four parallel chambers 2, two reservoir covers 3, landmarks 4 and a millimeter scale 5. The microfluidic device consists of three layers and two reservoir covers, the arrangement of which is shown in Fig. 2.

Mikrourządzenie zostało zrealizowane podobnie jak przedstawiono to w przykładzie realizacji 1, z tą różnicą że: wierzchnia warstwa stanowiąca pokrywę 6 wykonana została z PMMA o grubości 5 mm. W warstwie tej wykonanych zostało osiem cylindrycznych zbiorników zasilających o średnicy 4,3 mm. Symetrycznie do osi każdej z komór w równych odległościach wynoszących 1 mm, na spodniej stronie pokrywy umieszczono punkty orientacyjne 4 w postaci kropek o średnicy 0,05 mm ustawione w dwóch równoległych oddalonych od siebie o 2 mm rzędach. Warstwa funkcjonalna 7 wykonana została z komercyjnie dostępnej błony klejowej o grubości 0,06 mm. W warstwie tej wykonano cztery komory, każda o szerokości 4,3 mm i długości 80 mm, przy czym obszar roboczy każdej z komór był długości 60mm. Podstawa 9 wykonana została z PMMA o grubości 5 mm. Górne powierzchnie zbiorników zasilających posiadają zabezpieczenia w postaci prostokątnych odcinków folii polipropylenowej samoprzylepnejThe microdevice was made similar to that shown in embodiment 1, with the difference that: the top layer 6 was made of 5 mm thick PMMA. Eight cylindrical supply tanks with a diameter of 4.3 mm were made in this layer. Symmetrically to the axis of each of the chambers at equal distances of 1 mm, on the underside of the cover there are landmarks 4 in the form of dots with a diameter of 0.05 mm arranged in two parallel rows spaced 2 mm apart. The functional layer 7 was made of a commercially available adhesive film 0.06 mm thick. Four chambers were made in this layer, each 4.3 mm wide and 80 mm long, with the working area of each chamber being 60 mm long. The base 9 is made of 5 mm thick PMMA. The upper surfaces of the supply tanks are protected in the form of rectangular sections of self-adhesive polypropylene foil

PL 237 365 B1 o grubości 0.5 mm i wymiarach 45/25 (szerokość/długość). Krawędź osłony zbiornika jest odsunięta od krawędzi mikrourządzenia o 5 mm i wystaje poza jej obręb.PL 237 365 B1 with a thickness of 0.5 mm and dimensions 45/25 (width / length). The edge of the tank cover is 5 mm away from the edge of the microdevice and extends beyond its boundary.

Claims

1. A multilayer microfluidic device for cell culture in a gradient of a bioactive substance, characterized by the fact that it consists of three layers and two tank covers (3) that extend beyond the edge of the microdevice from 10 to 50% of its length, with the top layer being the cover ( 6), in which there are reservoirs of fluids (1) feeding the breeding chambers, landmarks (4) and a millimeter scale (5); in the central functional layer (7) made of adhesive film there is a set of channels (2) that have an elongated shape and run parallel to the longer edges of the device, and each of the channels (2) serving as breeding and indicator chambers is connected at its ends with a fluid reservoir (1), at least one of the channels (2) is designed to cultivate cells in a concentration gradient of the active substance, the so-called breeding chamber, one for breeding without active agent, the so-called a blank sample and one to develop the concentration profile of the indicator substance, the so-called indicator chamber; and the backsheet constitutes the base (9), the adhesive functional layer (7) connecting the cover (6) to the base (9) in a non-detachable, durable and hydraulically sealed manner.

2. The device according to claim 2. The method of claim 1, wherein the cover (6) is made of PMMA poly (methyl methacrylate).

3. The device according to claim 2. The method of claim 1, wherein the functional layer (7) is made of an acrylic adhesive film.

4. The device according to claim 1 3. The method of claim 1, characterized in that the height of the functional layer (7) is not less than the diameter of the cells planned for cultivation and research.

5. The device according to claim 1 2. The method of claim 1, characterized in that the channels (2) have semicircular ends (8) sized to the diameter of the fluid reservoirs (1).

6. The device according to claim 1 3. characterized in that all the channels (2) are of exactly the same shape and size.

7. The device according to claim 1 3. The fluid reservoirs of claim 1, wherein all the fluid reservoirs (1) are cylindrical in shape and have a diameter matching the diameter of the tip of the disposable syringe.

8. The device according to claim 1 3. The fluid reservoir according to claim 1, characterized in that all the fluid reservoirs (1) are of exactly the same shape and of the same volume.

9. The device according to claim 1 2. The method of claim 1, characterized in that the volume of each of the fluid reservoirs (1) is at least equal to the volume of the channel (2).

10. The device according to claim 1 2. The method of claim 1, characterized in that the fluid reservoirs (1) are secured from above by covers (3).

11. The device according to claim 1 The method of claim 1, characterized in that the covers (3) of the supply tanks are connected to the cover (6) in a releasable and hydraulically tight manner.

12. The device according to claim 1, 3. The method of claim 1, characterized in that a millimeter scale (5) runs along each of the chambers along the entire length of their working spaces, outside the channels (2).

13. The device according to claim 1, 2. The landmarks of claim 1, characterized in that the landmarks (4) are in the form of equally spaced circles not greater than 0.1 mm in diameter arranged in at least one row symmetrically along the axis of each of the chambers.

14. The device according to claim 1, 2. The method of claim 1, wherein the base (9) is made of sodium, borosilicate, poly (methacrylate) or methyl PMMA glass.

15. The device according to claim 1, 2. The method of claim 1, characterized in that the surface properties of the channels (2) have been modified to ensure better adhesion of the cells to their surface and to limit the adsorption of active substances on their inner surface.

16. The device according to claim 1, 3. The apparatus of claim 1, wherein all layers of the device are made of low autoluminescent materials.

17. The device according to claim 1 1. characterized in that all layers are made of transparent materials for light radiation in the visible and ultraviolet range.

18. The device according to claim 1, 2. The method of claim 1, wherein the layers are made of biocompatible materials