PL237004B1 - Hierarchicznie ustrukturyzowana warstwa makroporowatego poli(2,3’-bitiofenu) wdrukowana hormonem ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG), sposób jej otrzymywania i zastosowanie tej warstwy jako elementu rozpoznającego chemoczujnika do selektywnego oznaczania hCG - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest warstwa rozpoznająca białko, hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG), charakteryzująca się tym, że zawiera semi-kowalencyjnie wdrukowaną powierzchniowo makroporowatą warstwę poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu oraz wdrukowane luki molekularne umiejscowione na powierzchni makroporów tej warstwy. Ponadto zgłoszenie dotyczy też sposobu otrzymywania warstwy rozpoznającej białko, hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG), obejmującego następujące etapy: (i) osadzenie kryształu koloidalnego na powierzchni elektrody, (ii) aktywację powierzchni kryształu koloidalnego aldehydem glutarowym i unieruchomienie cząsteczek hCG na powierzchni kryształu koloidalnego, (iii) modyfikację cząsteczek hCG unieruchomionych na powierzchni kryształu koloidalnego za pomocą monomerów funkcyjnych (iv) osadzenie warstwy poli(2,3'-bitiofenu) wewnątrz wolnych przestrzeni kryształu koloidalnego, (v) usunięcie kryształu koloidalnego, i cząsteczek hCG. Przedmiotem zgłoszenia jest też zastosowanie ww. warstwy, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do wykrywania i oznaczania białek, hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest makroporowata warstwa, o strukturze odwróconego opalu, poli(2,3'-bitiofenu) semi-kowalencyjnie wdrukowana powierzchniowo cząsteczkami hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (ang. human chorionic gonadotropin, hCG), sposób jej otrzymywania i zastosowanie tej warstwy jako elementu rozpoznającego chemoczujnika do selektywnego oznaczania hCG.

Kontrola poziomu hormonów w płynach ustrojowych jest przydatnym narzędziem diagnostycznym w praktyce klinicznej. Oznaczenia takie pozwalają na odróżnienie jednego stanu metabolicznego od drugiego, a co za tym idzie diagnozowanie chorób i zaburzeń metabolicznych. W ostatnich latach zauważalny jest ciągły wzrost zainteresowania oznaczaniem hormonów, głownie ze względu na rosnącą zapadalność na takie choroby jak cukrzyca, nadczynność lub niedoczynność tarczycy oraz bezpłodność. Przykładowo w Polsce z powodu bezpłodności cierpi około 10-15% par w wieku reprodukcyjnym (G.H. Bręborowicz, Położnictwo i ginekologia (Vol. 1-2). Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2007). Oznaczanie hormonów płciowych we krwi jest utrudnione ze względu na krótki ich okres półtrwania w organizmie i dużą zmienność ich poziomu w ciągu doby (cykl biologiczny). Niektóre z nich (np. gonadoliberyna) są nawet wydzielane w powtarzających się, co 60-120 minut pulsach. Zmienność ta powoduje, że pojedyncze oznaczenie poziomu danego hormonu nie pozwala uzyskać pełnej informacji o funkcjonowaniu organizmu. Z tego powodu wykonanie profili dobowych stężeń hormonów ma znacznie wyższą wartość diagnostyczną. Dlatego też opracowanie skutecznych, tanich i łatwych w obsłudze testów do oznaczania hormonów pozwoliłoby znacznie podnieść trafność diagnozy i obniżyć jej koszty.

Istnieje kilka hormonów glikoproteinowych związanych z problem bezpłodności (G.H. Bręborowicz, Położnictwo i ginekologia (Vol. 1-2). Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2007). Jednym z nich jest hormon ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG). Najczęściej stosowane metody oznaczania hormonów glikoproteinowych wymagają zastosowania tandemowej spektrometrii mas (R. F. Loureiro, J. Chromatogr. A, 2006,1136,10-18; S. J. Soldin and O. P. Soldin, Clin Chem., 2009, 55, 1061-1066), testów immunologicznych (Y. Fuchiwaki and M. Yasuzawa, Sens. Actuator. A, 2011, 170, 100-105; Y. Fuchiwaki and M. Yasuzawa, Anal. Lett., 2012, 45, 262-271; S. A. Lim, et al., RSC Adv., 2014, 4, 58460-58466; S. Lofas, et al., Coll. Surf. Biointer., 1993, 1, 83-89; V. Borromeo, et al., Domestic Animal Endocrinol., 2014, 48, 145-157; G. Farace, et al., Bioelectrochemistry, 2002, 55, 1-3) lub chromatografii cieczowej sprzężonej z detekcją mas (LC-MS) (J. Grass, et al., Anal. Bioanal. Chem., 2011, 400, 2427-2438; G.A. Woldemariam and A.W. Butch, Clin Chem., 2014, 60, 1089-1097; Yao et al., J. Chromatogr. B, 2014, 962, 94-101). LC-MS przewyższa poprzednie metody pod względem dokładności uzyskanych wyników i możliwości automatyzacji oznaczeń. Jednakże, wysoka cena oraz konieczność zatrudnienia wykwalifikowanego personelu stanowią poważne wady tej metody, szczególnie w świetle rosnącego zapotrzebowania na proste i szybkie testy, które pacjenci mogliby wykonywać samodzielnie. W przypadku hCG dostępne są na rynku łatwe w obsłudze testy, tzw. testy ciążowe. Jednakże nie są one wolne od istotnych wad. W większości są to biosensory oparte na przeciwciałach. Dlatego też ich wytwarzanie jest skomplikowane i kosztowne, a ich trwałość jest ograniczona. Ponadto testy te są wyłącznie jakościowe, a nie ilościowe, czyli pozwalają jedynie stwierdzić obecność hormonu w próbce bez podania konkretnego stężenia.

Dlatego też wychodząc naprzeciw opisanym powyżej problemom, w ramach aktualnego wynalazku opracowane zostały wdrukowane molekularnie warstwy selektywnie wiążące hCG. Warstwy te zostały zastosowane w konstrukcji selektywnych chemoczujników do wykrywania i oznaczania hCG.

Polimery wdrukowane molekularnie (ang. Molecularly Imprinted Polymers, MIPs) (P. S. Sharma, et al., Trac-Trends in Analytical Chemistry, 2013, 51, 146-157) są doskonałym przykładem syntetycznych układów naśladujących rozpoznanie biologiczne. Te inteligentne materiały rozpoznają i selektywnie wiążą tylko wybrane cząsteczki. Jest to możliwe dzięki obecności wdrukowanych luk molekularnych obecnych w strukturze tego polimeru. Luki te pasują, co do wielkości, kształtu i szablonu oddziaływań, tylko do wybranych cząsteczek. Trwałość, łatwa synteza i możliwość prostego powiększania skali produkcji stanowią główne zalety tych materiałów nazywanych „plastikowymi przeciwciałami”.

W ostatnich latach daje się zauważyć znaczny wzrost zainteresowania syntezą MIP-ów wdrukowanych za pomocą szablonów wielkocząsteczkowych (Mw >1500 Da) (N. M. Bergmann and N. A. Peppas, Prog. Polym. Sci., 2008, 33, 271-288; A. Bossi, Biosens. Bioelectron., 2007, 22, 1131-1137; Z. Iskierko, et al., Biotechnol. Adv., 2016, 34, 30-46; D. R. Kryscio and N. A. Peppas, Acta Biomater., 2012, 8, 461-473; E. Verheyen, et al., Biomaterials, 2011, 32, 3008-3020; K. G. Yang, et al., Anal.

PL 237 004 B1

Bioanal. Chem., 2012, 403, 2173-2183; J.-F. Yao, et al., J. Chromatogr. B, 2014, 962, 94-101). Duży rozmiar i niska stabilność konformacyjna sprawiają, że wdrukowywanie takich szablonów jak białka stanowi poważne wyzwanie. Duży rozmiar makromolekuł takich jak białka znacznie utrudnia ich dyfuzję do luk molekularnych obecnych wewnątrz warstwy MIP-u. Powoduje do znaczne obniżenie czułości chemoczujników oraz wydłużenie czasu ich odpowiedzi. Dlatego też zaproponowano podejście zwane wdrukowaniem powierzchniowym. Polega ona na osadzeniu warstw MIP o grubości zbliżonej do średnicy cząsteczek docelowego białka (~5-10 nm) (Y. Kamon, et al., Polym. Chem., 2014, 5, 4764-4771; f. T. C. Moreira, et al., Sens. Actuators, B, 2013, 182, 733-740; F. T. C. Moreira, et al., Electrochim. Acta, 2013, 107, 481-487; F. T. C. Moreira, et al., Biosens. Bioelectron., 2013, 45, 237-244; F. T. C. Moreira, et al., Sens. Actuators, B, 2014, 196, 123-132). W ten sposób wszystkie luki molekularne w MIP-ie znajdują się na powierzchni jego warstwy i są otwarte. Ponadto, znajdują się one blisko powierzchni przetwornika sygnału. Wadą tego podejścia jest konieczność uzyskania bardzo precyzyjnej kontroli nad grubością osadzanej warstwy. Innym stosowanym podejściem jest pokrycie cząsteczek białka osadzonych na stałym nośniku „grubą warstwą polimeru, a następnie na przeniesieniu tej warstwy ze stałego nośnika na powierzchnię przetwornika sygnału wraz z odwróceniem tej warstwy. W taki sposób luki molekularne, które były początkowo ukryte głęboko pod warstwą polimeru znajdują się na powierzchni warstwy i są łatwo dostępne dla wydajnego wiązania cząsteczek analitu (G. Cabra1-Miranda, et al., J. Mater. Chem. B, 2014, 2, 3087-3095; G. Erturk, et al., Anal. Chim. Acta, 2015, 891, 120-129; G. Erturk, et al., Sens. Actuator., B, 2016, 224, 823-832). Niestety takie procedury są bardzo skomplikowane. Ponadto ilość luk molekularnych w tak wytworzonym polimerze jest niewielka przez to czułość wykonanych w ten sposób chemoczujników jest niewystarczająca.

Podjęto już próby połączenia strategii wdrukowania powierzchniowego z technikami rozwijania powierzchni. Na przykład, przeprowadzono wdrukowanie białek unieruchomionych na powierzchni nano- lub mikrocząstek (X. W. Kan, et al., Sens. Actuators, B, 2012, 168, 395-401; S. Liu, et al., Biosens. Bioelectron., 2013, 42, 80-86; D. Z. Zhou, et al., Sens. Actuators, B, 2011, 153, 96-102). Cząstki te były osadzane w postaci warstw na powierzchni stałych substratów, a następnie puste przestrzenie pomiędzy nimi były wypełniane polimerem. Po usunięciu tych nano-/mikrocząstek i wymyciu szablonu uzyskano makroporowate polimery z lukami molekularnymi położonymi wyłącznie na powierzchni porów. Dolne granice wykrywalności (LOD) chemoczujników były doskonałe, tzn. 10 μg/mL dla piezomikrograwimetrycznych i 100 fg/mL dla elektrochemicznych (DPV) oznaczeń wybranych białek.

Inną trudnością związaną z wdrukowywaniem białek jest to iż w przypadku, stosowanej najczęściej strategii wdrukowania niekowalencyjnego (Sellergren, Lepisto, & Mosbach, 1988), bardzo trudno jest oszacować jak wiele miejsc wiążących jest dostępnych na powierzchni szablonu. Jednym ze sposobów uniknięcia tego problemu jest zastosowanie tzw. wdrukowania semi-kowalencyjnego (M. Cieplak et al., Biosens. Bioelectron., 2015, 74, 960-966). Wdrukowywanie to jest trudne, ale prowadzi do wytworzenia jednorodnych luk molekularnych o dobrze zdefiniowanej strukturze. Ponadto, połączenie ww. metodologii z wdrukowaniem powierzchniowym i technikami rozwijania powierzchni dały znakomite rezultaty (M. Dabrowski et al., Biosens. Bioelectron., 2017, 94, 155-161, zgłoszenie patentowe P.418388). Zastosowanie semi-kowalencyjnie, powierzchniowo wdrukowanego, przy pomocy cząsteczek ludzkiej albuminy osocza krwi (ang. Human Serum Albumin, HSA), poli(2,3'-bitiofenu) w postaci makroporowatej warstwy o strukturze odwróconego opalu do konstrukcji chemoczujnika opartego na tranzystorze polowym z rozszerzoną bramką (ang. extended-gate field effect transistor, EG-FET) pozwoliło na opracowanie chemoczujnika pozwalającego na selektywne oznaczanie HSA w femtomolowym zakresie stężeń.

Dlatego też celem wynalazku jest uzyskanie semi-kowalencyjnie wdrukowanego powierzchniowo poli(2,3'-bitiofenu) w postaci makroporowatej warstwy o strukturze odwróconego opalu, którą można zastosować jako warstwę rozpoznającą chemoczujnika do selektywnego oznaczania hCG.

Zgodnie z wynalazkiem, warstwa rozpoznająca białko, hormon ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG), charakteryzuje się tym, że zawiera powierzchniowo semi-kowalencyjnie wdrukowaną białkiem hCG makroporowatą warstwę poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu oraz wdrukowane luki molekularne umiejscowione na powierzchni makroporów tej warstwy, przy czym warstwa ta zawiera 2,3'-bitiofen i monomery funkcyjne, przy czym monomery funkcyjne są wybrane z grupy zawierającej: monomer kwasu karboksylowego, który stanowi kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy, i monomer aminy I-rzędowej, który stanowi bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloanilina zawiera 2,3'-bitiofen i monomery funkcyjne zawierające grupy karboksylowe i aminowe.

PL 237 004 B1

Korzystnie, warstwa poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu stanowi polimer zawierający monomer 2,3'-bitiofenu.

Ponadto wynalazek obejmuje sposób otrzymywania warstwy rozpoznającej hormon ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG), charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:

(i) osadzenie kryształu koloidalnego z nanokulek krzemionkowych na powierzchni elektrody w postaci monowarstwy z warstw Langmuira, (ii) aktywację powierzchni kryształu koloidalnego dialdehydem alkilowym, który stanowi aldehyd glutarowy, a następnie unieruchomienie cząsteczek hCG na powierzchni kryształu koloidalnego, (iii) modyfikację monomerami funkcyjnymi, zawierającymi grupy karboksylowe i aminowe, powierzchni cząsteczek hCG unieruchomionych na powierzchni kryształu koloidalnego, przy czym monomery funkcyjne są wybrane z grupy obejmującej: monomoner kwasu karboksylowego, który stanowi kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy, i monomer aminy I-rzędowej, który stanowi bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloanilina;

(iv) osadzenie warstwy poli(2,3'-bitiofenu) poprzez elektropolimeryzację wewnątrz wolnych przestrzeni kryształu koloidalnego, z wytworzeniem makroporowatego poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu, (v) usunięcie kryształu koloidalnego, (vi) usunięcie cząsteczek hCG, przy czym modyfikację powierzchni unieruchomionych na powierzchni kryształu koloidalnego cząsteczek hCG monomerami funkcyjnymi, jak w etapie (iii), wykonuje się po unieruchomieniu cząsteczek hCG na powierzchni kryształu koloidalnego w etapie (ii).

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (i) osadza się kryształ koloidalny na powierzchni elektrody z nanokulek krzemionkowych (SiO2) w postaci co najmniej jednej monowarstwy o strukturze heksagonalnej o maksymalnym upakowaniu.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (i) osadzenie kryształu koloidalnego z nanokulek w postaci monowarstwy o strukturze heksagonalnej, prowadzi się poprzez przeniesienie z subfazy wodnej warstwy Langmuira nanokulek na powierzchnię stałej elektrody za pomocą techniki Langmuira-Blodgett.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (i) jako powierzchnię stałej elektrody stosuje się elektrody z metalu szlachetnego, korzystnie złota, najkorzystniej złoconych płytek szklanych.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (i) stosuje się kryształ koloidalny nanokulek o strukturze heksagonalnej w postaci od jednej do dziesięciu monowarstw, korzystnie czterech monowarstw.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (ii) aktywację prowadzi się w roztworze dialdehydu o stężeniu od 0,5% do 50%, korzystnie 2,5%, w buforze o pH od 1 do 12, korzystnie w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (buforze PBS) o pH = 7,4, przez okres od 5 minut do 24 godzin, korzystnie 1 godz., w temperaturze od 0°C do 60°C, korzystnie w temperaturze pokojowej.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (ii) na powierzchni nośnika unieruchamia się cząsteczki hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG).

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (ii) osadzanie cząsteczek hCG na powierzchni pokrytej kryształem koloidalnym aktywowanym prowadzi się poprzez jej zanurzenie na okres od 5 minut do 48 godzin, korzystnie 18 godzin, w temperaturze od 0°C do 45°C, korzystnie 4°C, w roztworze hCG, korzystnie o stężeniu od 0,1 ąg/mL do 10 mg/mL, korzystnie 3 mg/mL (hCG), w buforze o pH od 1 do 12, korzystnie w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (buforze PBS) o pH = 7,4.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (iii) osadzane cząsteczki hCG, następnie modyfikuje się monomerami funkcyjnymi kwasem 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowym i p-bis(2,2'-bitieny-5-ylo)metyloalaniną.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (iii) modyfikację cząsteczek hCG kwasem 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowym prowadzi się w taki sposób iż, powierzchnię z osadzonym kryształem koloidalnym o powierzchni modyfikowanej hCG zanurza się na okres od 5 minut do 24 godzin, korzystnie 1 godz., do roztworu kwasu 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowego, N- (3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodiimidu (EDC), 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HOAt) i trietyloaminy

PL 237 004 B1 w mieszaninie bezwodnego toluenu i bezwodnego chlorku metylenu, w stężeniach zakresie od 0,1 μΜ do 1 M dla każdego składnika.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (iii) modyfikację cząsteczek hCG p-bis(2,2'-bitieny-5-ylo)metyloalaniną prowadzi się w taki sposób iż, powierzchnię z osadzonym kryształem koloidalnym o powierzchni modyfikowanej hCG i kwasem 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowym zanurza się przez okres od 5 minut do 24 godzin, korzystnie 1 godz., do roztworu p-bis(2,2'-bitieny-5-ylo)metyloaniliny, N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodiimidu (EDC), trietyloaminy i 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HOAt) w mieszaninie bezwodnego toluenu i bezwodnego chlorku metylenu).

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (iv) prowadzi się elektropolimeryzację w warunkach potencjostatycznych przy potencjale wybranym z zakresu od 0,30 do 2,30 V względem elektrody pseudo-odniesienia Ag|AgCI, korzystnie 1,25 V, z zastosowaniem monomeru sieciującego, korzystnie 2,3'-bitiofenu, która prowadzi do pokrycia hCG warstwą politiofenu z wytworzeniem makroporowatego poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (iv) elektropolimeryzację prowadzi się w roztworze zawierającym 2,3'-bitiofen jako monomer sieciujący o stężeniu od 0,1 mM do 10 M, korzystnie 0,5 M, i elektrolit podstawowy LiCIO4 o stężeniu od 0,1 mM do 10 M, korzystnie 3,0 M, w węglanie propylenu.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (v) usuwa się nanokulki kryształu koloidalnego, przez ich rozpuszczenie w kwasie mineralnym, korzystnie w kwasie fluorowodorowym, o stężeniu w zakresie od 1 do 10%, korzystnie 5%, z uzyskaniem pustych makroporów w warstwie makroporowatego polimeru wdrukowanego molekularnie o strukturze odwróconego opalu.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, w Etapie (v) usuwa się cząsteczki hCG jako szablonu, poprzez wywołanie ich hydrolizy w warunkach zasadowych, korzystnie za pomocą roztworu NaOH, o stężeniu w zakresie od 1 do 10 M, korzystnie 7,5 M, z uzyskaniem wolnych wdrukowanych luk molekularnych umiejscowionych wyłącznie na powierzchni porów makroporowatego polimeru wdrukowanego molekularnie o strukturze odwróconego opalu.

Wynalazek również obejmuje zastosowanie powierzchniowo, semi-kowalencyjnie wdrukowanej makroporowatej warstwy poli(2,3'-bitiofenu), o strukturze odwróconego opalu, określonej powyżej, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do wykrywania i oznaczania białek, korzystnie hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG).

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnym przykładzie wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków, których opisy są przedstawione poniżej.

Fig. 1. Kolejne etapy procedury wytwarzania warstwy poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu wdrukowanego hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG).

Fig. 2. Zarejestrowany za pomocą mikroskopii SEM widok (1, 3, i 5) z boku i (2, 4, i 6) z góry osadzonych na powierzchni elektrody, którą stanowiła złocona płytka szklana, (1 i 2) czterech warstw nanokulek SiO2 o średnicy 500-nm tworzących kryształ koloidalny, (3 i 4) warstwy makroporowatego MIP-u po usunięciu nanokulek i ekstrakcji hCG, oraz (5 i 6) warstwy makroporowatego NIP-u po usunięciu nanokulek. (7) Zmiany natężenia prądu zarejestrowanego podczas osadzania w warunkach potencjostatycznych warstwy makroporowatego polimeru wdrukowanego molekularnie za pomocą hCG (MIP-u).

Fig. 3. Krzywe kalibracyjne chemoczujników (1, 2) (EG-FET)Z(MIP-hCG) i (3) (EG-FET)ZNIP, zarejestrowane w dla roztworów hCG w (1, 3) 10 mM buforze węglanowym o pH = 10, oraz (2) w sztucznym serum NORTROL tysiąckrotnie rozcieńczonym 10 mM buforem węglanowym o pH = 10.

Fig. 4. Krzywe kalibracyjne chemoczujników (EG-FET)Z(MIP-hCG) zarejestrowane w dla roztworów (1) hCG oraz białek przeszkadzających, tj. (2) mioglobiny, (3) cytochromu c i (4) albuminy ludzkiej osocza krwi (HSA) w 10 mM buforze węglanowym o pH = 10.

Fig. 5. Zamiany natężenia prądu źródło-dren zarejestrowane dla hCG i rożnych substancji przeszkadzających w 10 mM buforze węglanowym o pH = 10.

Fig. 6. Schemat układu pomiarowego z zastosowaniem EG-FET-u. Skróty WE, RE oraz G, D i S oznaczają, odpowiednio, elektrodę pracującą (złoconą płytkę szklaną pokrytą warstwą MIP-u lub NIP-u), elektrodę odniesienia (płytkę platynową) oraz bramkę, dren i źródło (elementy FET-u). Elektroda pracująca (WE) była spolaryzowana do napięcia, Vr = 2,0 V.

PL 237 004 B1

Fig. 7. Krzywe kalibracyjne chemoczujników (1-5) (EG-FET)Z(MIP-hCG) i (6) (EG-FET)ZNIP zarejestrowane w dla roztworów (1,2) hCG oraz białek przeszkadzających, tj., (3) cytochromu c, (4) albuminy ludzkiej osocza krwi (HSA) oraz (5) mioglobiny w 10 mM buforze węglanowym o pH = 10 i w sztucznym serum NORTROL 1000 razy rozcieńczonym 10 mM buforze węglanowym o pH = 10.

Korzystne przykłady wykonania wynalazku

W trzech opisanych poniżej przykładach przedstawiona jest procedura przygotowania warstwy materiału rozpoznającego hCG, o strukturze odwróconego opalu, i zastosowanie tej warstwy w konstrukcji dwóch chemoczujników do selektywnego oznaczania hCG.

Materiał rozpoznający hormon hCG, w postaci warstwy MIP-u o strukturze odwróconego opalu, został wykonany w sposób analogiczny do naszego poprzedniego wynalazku (M. Dabrowski et al., Biosens. Bioelectron., 2017, 94, 155-161, zgłoszenie patentowe P.418388). Jednakże procedura wytwarzania tej warstwy rozpoznającej została zmodyfikowana. Po pierwsze, jako molekularny szablon w aktualnym wynalazku zastosowany został hormon hCG, a nie ludzka albumina osocza krwi (HSA). Po drugie, w przeciwieństwie do poprzedniego wynalazku, w tym przypadku niezmodyfikowany szablon białkowy został najpierw unieruchomiony na powierzchni kryształu koloidalnego SiO2, a dopiero potem unieruchomione wcześniej cząsteczki hCG zostały zmodyfikowane monomerami funkcyjnymi. Rozwiązanie to pozwoliło na znaczne uproszczenie procedury znakowania białkowego szablonu cząsteczkami monomerów funkcyjnych i pozwoliło wyeliminować żmudny i czasochłonny proces chromatograficznego oczyszczania znakowanego białka (Przykład 1).

W końcu złoconą płytkę szklaną, pokrytą tak przygotowaną warstwą makroporowatą MIP, zastosowano jako element rozpoznający dwóch selektywnych chemoczujników, tzn. EG-FET (Przykład 2) oraz czujnika elektrochemicznego (Przykład 3), do oznaczania hCG.

P r z y k ł a d 1

A. Osadzanie warstwy kryształu koloidalnego nanokulek krzemionki (SiO2)

Kryształ koloidalny SiO2 został przygotowany w sposób analogiczny do rozwiązania opisanego w: M. Dabrowski et al., Biosens. Bioelectron., 2017, 94, 155-161 albo zgłoszeniu patentowym

P.418388. W celu przygotowania warstwy Langmuira nanokulek krzemionkowych, najpierw te nanokulki zostały oczyszczone według znanej i opisanej w literaturze procedury (S. Reculusa and S. Ravaine, Appl. Surf. Sci., 2005, 246, 409-414; S. Reculusa and S. Ravaine, Chem. Mater., 2003, 15, 598-605; S. Reculusa et al., J. Colloid Interface Sci., 2004, 279, 471-478). Następnie zawiesinę nanokulek odwirowano i po zdekantowaniu supernatantu, nanokulki zawieszono w roztworze zmieszanych rozpuszczalników, bezwodnego etanolu i chloroformu (1:4, v:v). Stężenie nanokulek w tym roztworze wynosiło ~10 mg/mL. Tak przygotowaną zawiesinę naniesiono na subfazę wodną znajdującą się w wannie Langmuira. Po odparowaniu rozpuszczalników organicznych, monowarstwę nanokulek znajdującą się na powierzchni tej subfazy sprężono, z prędkością 10 cm²/min, do docelowego ciśnienia powierzchniowego 6,0 mN/m, przy którym przeprowadzono za pomocą techniki LB transfer warstwy Langmuira nanokulek na złocone płytki szklane (B. v. Duffel et al., J. Mater. Chem., 2001, 3333-3336).

Przed przeprowadzeniem transferu LB powierzchnia złoconych płytek szklanych została odpowiednio przygotowana (tj. oczyszczona i zhydrofilizowana). W tym celu płytki szklane przemyto wodą destylowaną, po czym metanolem a następnie acetonem. Następnie tak oczyszczoną powierzchnię złota poddano działaniu plazmy tlenowej (50 W, ciśnienie tlenu 0.25 kPa) przez 10 min i niezwłocznie zastosowano jako przewodzące podłoże do osadzania warstw kryształów koloidalnych nanokulek SiO2. Aby osadzić te warstwy, płytki zanurzano pionowo w subfazie z maksymalną szybkością jaką umożliwiało urządzenie do zanurzania (38 mm/min), a następnie wynurzano je z subfazy z minimalną dostępną szybkością (1 mm/min). Procedurę zanurzania i wynurzania powtórzono cztery razy, aby przenieść cztery warstwy nanokulek. Po pierwszym wynurzeniu próbkę wysuszono i podgrzano strumieniem gorącego powietrza, aby zwiększyć adhezję pierwszej monowarstwy nanokulek do powierzchni złota. Technika LB umożliwiła przeniesienie czterech monowarstw tych nanokulek tworząc na złoconej płytce szklanej strukturę o najgęstszym upakowaniu, tj. o strukturze heksagonalnej (Fig. 1 I).

B. Modyfikowanie powierzchni warstwy kryształu koloidalnego nanokulek krzemionki (SO)

Powierzchnia kryształu koloidalnego SiO2 została zmodyfikowana w sposób analogiczny do poprzedniego wynalazku (M. Dabrowski et al., Biosens. Bioelectron., 2017, 94, 155-161, zgłoszenie patentowe P.418388), lecz zastosowana procedura została znacznie zmodyfikowana.

W celu unieruchomienia hCG na powierzchni kryształu koloidalnego, płytki z osadzonym kryształem zanurzono w 2,5% roztworze aldehydu glutarowego w buforze PBS o pH = 7,4 przez

PL 237 004 B1 godz. w temperaturze pokojowej. Następnie, po trzykrotnym przemyciu wodą destylowaną, płytki zanurzono na noc w temperaturze 4°C w roztworze hCG (3 mg/mL) w buforze PBS o pH = 7,4 (Fig. 1 II). W końcu płytki przemyto buforem PBS (pH = 7,4), a następnie trzykrotnie wodą Milli-Q. Etap ten zapewnił ścisłą kontrolę nad rozmieszczeniem luk molekularnych w osadzonym w następnych etapach MIP-ie.

Następnie unieruchomione na powierzchni kryształu koloidalnego cząsteczki hCG zostały zmodyfikowane monomerami funkcyjnymi, mianowicie kwasem 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowym i p-bis(2,2'-bitieny-5-ylo)metyloaniliną (Fig. 1 III). W tym celu, płytki z osadzonym kryształem koloidalnym SiO2 o powierzchni modyfikowanej hCG zanurzono na 1 godz. do roztworu kwasu 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowego (11 mg, 52 gM), N-(3-dimetyloaminopropylo)-N’-etylokarbodiimidu (EDC, 15 gL, 13,23 mg, 85 gM), 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HOAt, 11 mg, 80 pM) i trietyloaminy (25 pL) w mieszaninie bezwodnego toluenu i bezwodnego chlorku metylenu (1 mL, 7:3 obj.:obj.). Następnie płytki przemyto trzykrotnie bezwodnym toluenem. Następnie zanurzono te płytki przez okres 1 godz. do roztworu p-bis(2,2'-bitieny-5-ylo)metyloaniliny (20 mg, 46 pM), N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'etylokarbodiimidu (EDC, 15 pL, 13,23 mg, 85 pM), trietyloaminy (25 pL) i 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HOAt, 11 mg, 80 gM) w mieszaninie bezwodnego toluenu i bezwodnego chlorku metylenu (1 mL, 7:3 obj.:obj.). Na koniec przemyto te płytki najpierw trzykrotnie toluenem, następnie trzykrotnie wodą Mili-Q., po czym buforem fosforanowym o pH = 7.

Etap ten pozwolił na precyzyjną kontrolę nad rozmieszczeniem miejsc rozpoznających na powierzchni wdrukowanych luk molekularnych. Co więcej, opisana procedura jest znacznie prostsza niż ta opisana w stanie techniki (M. Dabrowski et al., Biosens. Bioelectron., 2017, 94, 155-161, zgłoszenie patentowe P.418388).

C. Osadzanie makroporowatego poli(2,3'-bitiofenu) wdrukowanego za pomocą hCG (MIP- hCG)

Dzięki uprzedniemu unieruchomieniu hCG na powierzchni kryształu koloidalnego można było przeprowadzić elektropolimeryzację z zastosowaniem węglanu propylenu, tj. rozpuszczalnika który nie miesza się z wodą i dlatego nie usuwa on wody strukturalnej z wnętrza cząsteczek białka. Dzięki temu trójwymiarowa struktura białka nie została zniszczona, co prowadziło do utworzenia niezdeformowanych luk molekularnych wewnątrz polimeru, które są zdolne do selektywnego i wydajnego wiązania cząsteczek hCG w MIP-ie. Poza tym wysoki współczynnik lepkości dynamicznej węglanu propylenu (η » 2,5 mPa^s) powoduje, iż współczynniki dyfuzji substancji w nim rozpuszczonych są niskie. Pozwoliło to lepiej kontrolować elektropolimeryzację. Podczas elektropolimeryzacji w warunkach potencjostatycznych poli(2,3'-bitiofen) osadzał się powoli od powierzchni elektrody złotej do zewnętrznej powierzchni kryształu koloidalnego. Obserwacja okresowych fluktuacji natężenia prądu podczas osadzania poli(2,3'-bitiofenu) wewnątrz kryształu koloidalnego (Fig. 2A) pozwoliły na precyzyjną kontrolę nad grubością osadzanej warstwy. W ten sposób puste przestrzenie wewnątrz tego kryształu koloidalnego zostały całkowicie wypełnione poli(2,3'-bitiofenem) (Fig. 1 IV).

Dzięki wysokiej odporności chemicznej bitiofenu możliwe było następnie zastosowanie kwasu fluorowodorowego do rozpuszczenia nanokulek SiO2, po czym silnie zasadowe środowisko do zhydrolizowania i ekstrakcji szablonu hCG. W ten sposób wytworzono warstwę semi-kowalencyjnie wdrukowanego powierzchniowo poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu.

Syntezę i osadzanie warstwy MIP-u na powierzchni złoconych płytek szklanych przeprowadzono w układzie trójelektrodowym z zastosowaniem mininaczynka szklanego (Fig. 5) w warunkach potencjostatycznych przy potencjale wynoszącym E =1,25 V względem elektrody pseudo-odniesienia Ag|AgCI. Roztwór węglanu propylenu do polimeryzacji zawierał monomer sieciujący, tj. 2,3'-bitiofen, (0,5 M) i elektrolit podstawowy LiCIO4 (3,0 M). Po zakończeniu elektropolimeryzacji warstwy MIP-u przemyto metanolem, aby usunąć nadmiar substratów i elektrolitu podstawowego. Następnie wysuszono je na powietrzu. Nanokulki SiO2 kryształu koloidalnego usunięto z osadzonej warstwy przez zanurzenie pokrytych warstwą MIP-u płytek do 5% HF przez okres 5 min. Następnie z warstwy MIP-u usunięto hCG wymuszając jej hydrolizę w warunkach silnie zasadowych (~7,5 M NaOH, 40°C, 45 min).

P r z y k ł a d 2

Oznaczanie hCG z zastosowaniem chemoczujnika EG-FET/(MIP-hCG)

Parametry analityczne chemoczujnika nie zależą wyłącznie od właściwości warstwy rozpoznającej, ale również od zastosowanego sposobu przetwarzania sygnału rozpoznawania chemicznego na użyteczny sygnał analityczny. Tranzystor polowy z rozszerzoną bramką (ang. extended-gate fieldeffect transistor, EG-FET) pokrytą rozpoznającą warstwą MIP-u jest znakomitym narzędziem selek

PL 237 004 B1 tywnego oznaczania białek (Z. Iskierko et al., Biosens. Bioelectron., 2015, 74, 526-533; M. Dąbrowski et al., Biosens. Bioelectron., 2016, 79, 627-635, M. Dąbrowski et al., Biosens. Bioelectron., 2017, 94, 155-161). Chemoczujnik ten odpowiada przede wszystkim na naładowane cząsteczki, które absorbują się na powierzchni elektrody pracującej. Dlatego też EG-FET-y w tych warunkach tj. w roztworach o pH znacząco odbiegającym od pl (punktu izoelektrycznego) danego białka są bardzo czułe na jego obecność .

Wytworzony w ramach niniejszego wynalazku chemoczujnik (EG-FET)/(MIP-hCG) wykazuje wysoką czułość względem hCG (krzywa 1 na Fig. 3). Zakres liniowej odpowiedzi zawiera się pomiędzy 10^-15 a 10^-13 M. Równanie regresji liniowej przyjęło następującą postać Δ/μA = -2,6 x 10^-5 (±0,2 x 10^-5) - 17,7 x 10^-6 (±0,12 x 10^-6) x log( c _hCG, M). Dla stężeń przekraczających 10^-13 M czułość chemoczujnika spadała prawdopodobnie ze względu na to, że wszystkie wdrukowane luki molekularne były zajęte przez cząsteczki hCG. Chemoczujnik wykazywał wysoką selektywność zarówno względem innych białek (Fig. 4) jak i substancji przeszkadzających o znacznie mniejszych masach molowych (Fig. 5). Umożliwiło to oznaczanie hCG w próbkach sztucznego serum NORTROL (Thermo-Fisher) (krzywa 2 na Fig. 3). Co więcej, elektroda pokryta kontrolną warstwą makroporowatego NIP-u wykazywała niższe zmiany sygnału analitycznego w badanym zakresie stężeń hCG (krzywa 3 na Fig. 3).

Oznaczenia prowadzono w warunkach stacjonarnych, z zastosowaniem układu analitycznego, którego schemat przedstawionego na Figurze 6. Układ składał się z dwóch elementów, tj., z części wykrywającej i przetwarzającej (elektronicznej). Pomiary prowadzone były w układzie dwuelektrodowym gdzie elektrodę procującą stanowiła złocona płytka szklana pokryta warstewką makroporowatego MIP-u, a elektrodę odniesienia płytka platynowa. Odległość pomiędzy tymi równolegle zamontowanymi elektrodami była stała i wynosiła ~5 mm. Obydwie elektrody były zanurzone w roztworze badanym. Część elektroniczna układu składała się z handlowo dostępnego MOSFET-u. Elektrodę pracującą pokrytą warstwą MIP-u podłączono do obszaru bramkowego MOSFET-u, aby spełniała rolę rozszerzonej bramki klasycznego FET-u. Dzięki temu zmiany potencjału bramki powodowane wiązaniem się hCG na powierzchni elektrody pracującej zmieniały efektywny potencjał przyłożony do bramki, co prowadziło do jej otwarcia. Otwarcie bramki wpływało z kolei na natężenie prądu źródło-dren, który został tutaj użyty jako sygnał analityczny. Źródło i dren komercyjnego MOSFET-u podłączono do źródła wymuszająco-mierzącego, które umożliwiało wymuszanie zmian napięcia drenu (Vd) i pomiar natężenia prądu źródło-dren EG-FET-u (/D). Do tego źródła mierzącego podłączona była także elektroda odniesienia (płytka platynowa), dzięki czemu można było kontrolować napięcie bramki. W trakcie wiązania hCG przez warstwę MIP-u napięcie to było ustawiane przy stałej wartości równej 2,0 V.

P r z y k ł a d 3

Oznaczanie hCG z zastosowaniem elektrochemicznego czujnika MIP-hCG

Wytworzone według opisanej w Przykładzie 1 procedury złocone płytki szklane pokryte makroporowatą warstwą MIP-hCG zostały zastosowane jako elektrody pracujące w czujniku elektrochemicznym do selektywnego oznaczania hCG. Czujnik ten odpowiadał na zmiany pojemności elektrochemicznej warstwy podwójnej powodowane osadzaniem się cząsteczek hCG na powierzchni elektrody. Pomiary były prowadzone w układzie trójelektrodowym, gdzie elektrodę odniesienia stanowił podwójny (połączony równolegle) drucik srebrny pokryty warstwą chlorku srebra, przeciwelektrodę płytka platynowa, a elektrodę pracującą złocona płytka szklana pokryta warstwą MIP-hCG. Odległość pomiędzy tymi równolegle zamontowanymi płytkami była stała i wynosiła ~5 mm. Pomiary prowadzono przy potencjale E = 0,2 V vs. Ag/AgCI, na który nałożone były sinusoidalne zmiany o amplitudzie 10 mV i częstotliwości 20 Hz. Pomiary były prowadzone w rozcieńczonym (10 mM) buforze węglanowym. Dzięki temu grubość elektrochemicznej warstwy podwójnej była wystarczająco duża. Co więcej, w wymienionych powyżej warunkach, na powierzchni elektrody pracującej, nie zachodził żaden proces redoks.

Wytworzony w ramach niniejszego wynalazku chemoczujnik MIP-hCG wykazuje wysoką czułość względem hCG (krzywa 1 na Fig. 7). Zakres jego liniowości zawiera się pomiędzy 0,17 a 2 fM hCG. Równanie regresji liniowej przyjęło następującą postać ΔC μF = 7,88 x 10-³ (±3,23 x 10^-3) + + 6,33 x 10^-3 (±3,1 x 10^-3) x chCG, fM, ze współczynnikiem korelacji, R² = 0.975. Chemoczujnik wykazywał wysoką selektywność zarówno względem innych białek (krzywe 3-5, Fig. 7).

Umożliwiło to oznaczanie hCG w próbkach sztucznego serum NORTROL (Thermo-Fisher) (Krzywa 2, Fig 7). Co więcej, elektroda pokryta kontrolną warstwą makroporowatego MIP-u nie wykazywała żadnej zmiany sygnału analitycznego w badanym zakresie stężeń hCG (krzywa 6, Fig. 7).

PL 237 004 B1

Wnioski

Zastosowanie kryształu koloidalnego SiO2 z unieruchomionymi cząsteczkami hCG, które zostały następnie zmodyfikowane kwasem 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowym i p-bis(2,2'-bitieny-5-ylo)metyloaniliną, jako szablonu zaowocowało wytworzeniem warstwy semi-kowalencyjnie wdrukowanego powierzchniowo makroporowatego MIP-u o strukturze odwróconego opalu. Znaczne rozwinięcie powierzchni tej warstwy MIP-u, ułatwiona dyfuzja hCG do wdrukowanych luk molekularnych oraz zastosowanie EG-FET-u lub impedymetrycznych pomiarów pojemnościowych, jako metod przetwarzania sygnału pozwoliły na oznaczanie hCG w femtomolowym zakresie stężeń. Jest to zakres znacznie niższy od zakresu stężeń hCG spotykanego w próbkach moczu lub surowicy krwi pacjentów. Czułość opracowanego i wykonanego chemoczujnika w ramach ww. wynalazku jest jedną z najwyższych czułości w ogóle opisanych w literaturze na temat wdrukowania molekularnego (L. Li et al., Analyst, 2013, 138, 6962-6968; L. Li et al., Microchim. Acta, 2015, 182, 2477-2483; D. Cai et al., Nat. Nanotechnol., 2010, 5, 597-601; X. D. Wang et al., Analyst, 2013, 138, 1219-1225; B. V. M. Silva et al, Biosens. Bioelectron., 2016, 77, 978-985; A. Tiwari et al., Biosens. Bioelectron., 2012, 35, 224-229, (M. Dabrowski et al., Biosens. Bioelectron., 2017, 94, 155-161, zgłoszenie patentowe P.418388). Ponadto precyzyjna kontrola nad strukturą wdrukowanych luk molekularnych pozwoliła uzyskać bardzo wysoką selektywność oznaczeń hCG. Dużą zaletą opracowanej w niniejszym wynalazku procedury wytwarzania chemoczujników MIP jest jej uniwersalność. Jak pokazują uzyskan e wyniki z niniejszego, jak i z poprzedniego zgłoszenia patentowego (M. Dabrowski et al., Biosens. Bioelectron., 2017, 94, 155-161, zgłoszenie patentowe P.418388), procedurę tę stosunkowo łatwo będzie można rozszerzyć na wytwarzanie chemoczujników selektywnych względem innych białek a także innych związków wielkocząsteczkowych.

Claims (18)

1. Warstwa rozpoznająca hormon ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG), znamienna tym, że zawiera powierzchniowo semi-kowalencyjnie wdrukowaną białkiem hCG makroporowatą warstwę poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu oraz wdrukowane luki molekularne umiejscowione na powierzchni makroporów tej warstwy, przy czym warstwa ta zawiera 2,3'-bitiofen i monomery funkcyjne, przy czym monomery funkcyjne są wybrane z grupy zawierającej: monomer kwasu karboksylowego, który stanowi kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy, i monomer aminy I-rzędowej, który stanowi bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloanilina.

2. Warstwa według zastrz. 1, znamienna tym, że warstwa poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu stanowi polimer zawierający monomer 2,3'-bitiofenu.

3. Sposób otrzymywania warstwy rozpoznającej hormon ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG), znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

(i) osadzenie kryształu koloidalnego z nanokulek krzemionkowych na powierzchni elektrody w postaci monowarstwy z warstw Langmuira, (ii) aktywację powierzchni kryształu koloidalnego dialdehydem alkilowym, który stanowi aldehyd glutarowy, a następnie unieruchomienie cząsteczek hCG na powierzchni kryształu koloidalnego, (iii) modyfikację monomerami funkcyjnymi, zawierającymi grupy karboksylowe i aminowe, powierzchni cząsteczek hCG unieruchomionych na powierzchni kryształu koloidalnego, przy czym monomery funkcyjne są wybrane z grupy obejmującej: monomoner kwasu karboksylowego, który stanowi kwas 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowy i monomer aminy I-rzędowej, który stanowi bis(2,2'-bitien-5-ylo)metyloanilina;

(iv) osadzenie warstwy poli(2,3'-bitiofenu) poprzez elektropolimeryzację wewnątrz wolnych przestrzeni kryształu koloidalnego, z wytworzeniem makroporowatego poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu, (v) usunięcie kryształu koloidalnego, (vi) usunięcie cząsteczek hCG, przy czym modyfikację powierzchni unieruchomionych na powierzchni kryształu koloidalnego cząsteczek hCG monomerami funkcyjnymi, jak w etapie (iii), wykonuje się po unieruchomieniu cząsteczek hCG na powierzchni kryształu koloidalnego w etapie (ii).

PL 237 004 B1

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w Etapie (i) osadza się kryształ koloidalny na powierzchni elektrody z nanokulek krzemionkowych (SiO2) w postaci co najmniej jednej monowarstwy o strukturze heksagonalnej o maksymalnym upakowaniu.

5. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że w Etapie (i) osadzenie kryształu koloidalnego z nanokulek w postaci monowarstwy o strukturze heksagonalnej, prowadzi się poprzez przeniesienie z subfazy wodnej warstwy Langmuira nanokulek na powierzchnię stałej elektrody za pomocą techniki Langmuira-Blodgett.

6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-5, znamienny tym, że w Etapie (i) jako powierzchnię stałej elektrody stosuje się elektrody z metalu szlachetnego, korzystnie złota, najkorzystniej złoconych płytek szklanych.

7. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-6, znamienny tym, że w Etapie (i) stosuje się kryształ koloidalny nanokulek o strukturze heksagonalnej w postaci od jednej do dziesięciu monowarstw, korzystnie czterech monowarstw.

8. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-7, znamienny tym, że w Etapie (ii) aktywację prowadzi się w roztworze dialdehydu o stężeniu od 0,5% do 50%, korzystnie 2,5%, w buforze o pH od 1 do 12, korzystnie w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (buforze PBS) o pH = 7,4, przez okres od 5 minut do 24 godzin, korzystnie 1 godz., w temperaturze od 0°C do 60°C, korzystnie w temperaturze pokojowej.

9. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-8, znamienny tym, że w Etapie (ii) na powierzchni nośnika unieruchamia się cząsteczki hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG).

10. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-9, znamienny tym, że w Etapie (ii) osadzanie cząsteczek hCG na powierzchni pokrytej kryształem koloidalnym aktywowanym prowadzi się poprzez jej zanurzenie na okres od 5 minut do 48 godzin, korzystnie 18 godzin, w temperaturze od 0°C do 45°C, korzystnie 4°C, w roztworze hCG, korzystnie o stężeniu od 0,1 μg/mL do 10 mg/mL, korzystnie 3 mg/mL (hCG), w buforze o pH od 1 do 12, korzystnie w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (buforze PBS) o pH = 7,4.

11. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-10, znamienny tym, że w Etapie (iii) osadzane cząsteczki hCG, następnie modyfikuje się monomerami funkcyjnymi kwasem 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowym i p-bis(2,2'-bitieny-5-ylo)metyloalaniną.

12. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-11, znamienny tym, że w Etapie (iii) modyfikację cząsteczek hCG kwasem 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowym prowadzi się w taki sposób iż, powierzchnię z osadzonym kryształem koloidal nym o powierzchni modyfikowanej hCG zanurza się na okres od 5 minut do 24 godzin, korzystnie 1 godz., do roztworu kwasu 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowego, N- (3-dimetyloaminopropylo)-N’- etylokarbodiimidu (EDC), 1-hydroksy-7-aza-benzotriazolu (HOAt) i trietyloaminy w mieszaninie bezwodnego toluenu i bezwodnego chlorku metylenu, w stężeniach zakresie od 0,1 pM do 1 M dla każdego składnika.

13. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-12, znamienny tym, że w Etapie (iii) modyfikację cząsteczek hCG p-bis(2,2'-bitieny-5-ylo)metyloalaniną prowadzi się w taki sposób iż, powierzchnię z osadzonym kryształem koloidalnym o powierzchni modyfikowanej hCG i kwasem 2,2'-bitiofeno-5-karboksylowym zanurza się przez okres od 5 minut do 24 godzin, korzystnie 1 godz., do roztworu p-bis(2,2'-bitieny-5-ylo)metyloaniliny, N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'- etylokarbodiimidu (EDC), trietyloaminy i 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HOAt) w mieszaninie bezwodnego toluenu i bezwodnego chlorku metylenu.

14. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-13, znamienny tym, że w Etapie (iv) prowadzi się elektropolimeryzację w warunkach potencjostatycznych przy potencjale wybranym z zakresu od 0,30 do 2,30 V względem elektrody pseudo-odniesienia Ag|AgCI, korzystnie 1,25 V, z zastosowaniem monomeru sieciującego, korzystnie 2,3'-bitiofenu, która prowadzi do pokrycia hCG warstwą politiofenu z wytworzeniem makroporowatego poli(2,3'-bitiofenu) o strukturze odwróconego opalu.

15. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-14, znamienny tym, że w Etapie (iv) elektropolimeryzację prowadzi się w roztworze zawierającym 2,3'-bitiofen jako monomer sieciujący o stężeniu od 0,1 mM do 10 M, korzystnie 0,5 M, i elektrolit podstawowy LiCIO4 o stężeniu od 0,1 mM do 10 M, korzystnie 3,0 M, w węglanie propylenu.

PL 237 004 B1

16. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-15, znamienny tym, że w Etapie (v) usuwa się nanokulki kryształu koloidalnego, przez ich rozpuszczenie w kwasie mineralnym, korzystnie w kwasie fluorowodorowym, o stężeniu w zakresie od 1 do 10%, korzystnie 5%, z uzyskaniem pustych makroporów w warstwie makroporowatego polimeru wdrukowanego molekularnie o strukturze odwróconego opalu.

17. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 3-16, znamienny tym, że w Etapie (v) usuwa się cząsteczki hCG jako szablonu, poprzez wywołanie ich hydrolizy w warunkach zasadowych, korzystnie za pomocą roztworu NaOH, o stężeniu w zakresie od 1 do 10 M, korzystnie 7,5 M, z uzyskaniem wolnych wdrukowanych luk molekularnych umiejscowionych wyłącznie na powierzchni porów makroporowatego polimeru wdrukowanego molekularnie o strukturze odwróconego opalu.

18. Zastosowanie powierzchniowo, semi-kowalencyjnie wdrukowanej makroporowatej warstwy poli(2,3'-bitiofenu), o strukturze odwróconego opalu, określonej w zastrz. 1-2, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do wykrywania i oznaczania białka hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG).