PL235932B1 - Method for obtaining 25-hydroxylated vitamin D3 (calcifediol) - Google Patents

Method for obtaining 25-hydroxylated vitamin D3 (calcifediol) Download PDF

Info

Publication number
PL235932B1
PL235932B1 PL415451A PL41545115A PL235932B1 PL 235932 B1 PL235932 B1 PL 235932B1 PL 415451 A PL415451 A PL 415451A PL 41545115 A PL41545115 A PL 41545115A PL 235932 B1 PL235932 B1 PL 235932B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
reaction
cholecalciferol
concentration
hydroxylation
oxidant
Prior art date
Application number
PL415451A
Other languages
Polish (pl)
Other versions
PL415451A1 (en
Inventor
Agnieszka Rugor
Maciej Szaleniec
Jakub Staroń
Original Assignee
Inst Katalizy I Fizykochemii Powierzchni Im Jerzego Habera Polskiej Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Katalizy I Fizykochemii Powierzchni Im Jerzego Habera Polskiej Akademii Nauk filed Critical Inst Katalizy I Fizykochemii Powierzchni Im Jerzego Habera Polskiej Akademii Nauk
Priority to PL415451A priority Critical patent/PL235932B1/en
Publication of PL415451A1 publication Critical patent/PL415451A1/en
Publication of PL235932B1 publication Critical patent/PL235932B1/en

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób biokatalitycznego otrzymywania 25-hydroksylowanej witaminy D3 (kalcyfediolu) o wzorze II z witaminy D3 (cholekalcyferolu) o wzorze I.The present invention relates to a process for the biocatalytic preparation of 25-hydroxylated vitamin D3 (calcifediol) of formula II from vitamin D3 (cholecalciferol) of formula I.

W organizmie ludzkim 7-dehydrocholesterol pod wpływem promieniowania UV podlega przemianie do witaminy D3, a ta w wątrobie pod wpływem cytochromów P450 aktywacji przy C25 do kalcyfediolu. Kalcyfediol jest transportowany do nerek, gdzie podlega drugiemu etapowi aktywacji przy C1 do kalcytriolu.In the human body, 7-dehydrocholesterol under the influence of UV radiation is converted into vitamin D3, and this in the liver under the influence of cytochrome P450 activation at C25 to calcifediol. Calcifediol is transported to the kidneys where it undergoes a second step of activation at C1 to calcitriol.

Kalcyfediol jest niezbędnym składnikiem regulatorowym dla organizmu ludzkiego zapewniającym prawidłową gospodarkę wapniowo-fosforanową. Poza tym, jako że wykazuje wyższą aktywność niż macierzysta D3, stosowany jest jako terapeutyk w przypadku różnych schorzeń związanych z niedoborem witaminy D3 z demineralizacją kości, niewydolnością wątroby, jatrogennym zahamowaniem aktywności 25-hydroksylazy wątrobowej (tj. przy stosowaniu leków przeciwdrgawkowych), dezaktywacją genów kodujących 25-hydroksylazę wątrobową w wyniku mutacji, niewydolnością nerek związaną z podwyższonym poziomem parathormonu, nerczycą, u pacjentów po transplantacjach czy w przypadku hipogonadyzmu u mężczyzn.Calcifediol is an essential regulatory component for the human body ensuring proper calcium and phosphate metabolism. In addition, as it exhibits higher activity than the parent D3, it is used as a therapeutic for various conditions related to vitamin D3 deficiency with bone demineralization, liver failure, iatrogenic inhibition of hepatic 25-hydroxylase activity (i.e. when using anticonvulsants), gene inactivation coding hepatic 25-hydroxylase as a result of mutations, renal failure associated with elevated parathyroid hormone levels, nephrosis, in patients after transplantation or in the case of hypogonadism in men.

Kalcyfediol otrzymywany jest zarówno metodami chemicznymi (wieloetapowa synteza organiczna) jak i biotechnologicznymi (jednoetapowa synteza z zastosowaniem enzymu). Polską syntezę kalcyfediolu opracował w latach 80 Instytut Farmaceutyczny w Warszawie. Metodę opisano w czasopiśmie Przem. Chem., 2002, 81,300-310. Wykorzystuje ona zmodyfikowaną metodę Campbella, opisaną w czasopiśmie Steroids, 1969, 13 (5), 567-577, rozpoczynając syntezę od kwasu hiodezoksycholowego pozyskiwanego z odpadowej żółci wieprzowej. Ten wieloetapowy proces zmierza do odpowiedniej funkcjonalizacji bocznego łańcucha umożliwiającej, w końcowym etapie, syntezę ugrupowania hydroksy-dimetylowego oraz ugrupowania 5,7-dienowego. To z kolei pozwala na fotolityczny rozkład układu sterolowego i termoizomeryzację do kalcyfediolu.Calcifediol is obtained both by chemical methods (multi-stage organic synthesis) and biotechnological methods (single-stage synthesis with the use of an enzyme). The Polish synthesis of calcifediol was developed in the 1980s by the Pharmaceutical Institute in Warsaw. The method was described in the magazine Przem. Chem., 2002, 81, 300-310. It uses a modified Campbell method, described in the journal Steroids, 1969, 13 (5), 567-577, starting the synthesis with hiodesoxycholic acid obtained from waste pork bile. This multi-step process aims to properly functionalize the side chain allowing, in a final step, the synthesis of the hydroxy-dimethyl moiety and the 5,7-diene moiety. This in turn allows for photolytic degradation of the sterol system and thermoisomerization to calcifediol.

Inne metody chemicznej syntezy zostały opisane w czasopiśmie J. Org. Chem. 1986, 51, 4819-4828 oraz w czasopiśmie J. Org. Chem. 1995, 60, 6574-6581. Obie te metody wymagają zabezpieczenia grup hydroksylowych i wiążą się z wieloma etapami syntetycznymi.Other methods of chemical synthesis are described in the journal J. Org. Chem. 1986, 51, 4819-4828 and in the journal J. Org. Chem. 1995, 60, 6574-6581. Both of these methods require the protection of the hydroxyl groups and involve many synthetic steps.

Wieloetapowa totalna synteza chemiczna często wiąże się z niską wydajnością całkowitego procesu lub stosowaniem złożonych, kosztownych odczynników, jak i zużyciem dużych ilości rozpuszczalników organicznych, powodując tym samym spore obciążenie dla środowiska naturalnego. Dlatego dobrą alternatywą są regioselektywne enzymy jako biokatalizatory.The multi-step total chemical synthesis is often associated with low efficiency of the total process or the use of complex, expensive reagents, as well as the consumption of large amounts of organic solvents, thus placing a heavy burden on the environment. Therefore, regioselective enzymes as biocatalysts are a good alternative.

Z czasopisma Arch. Biochem. Biophys., 2012, 523 (1), 30-36 wiadomo, że zdecydowanie najwięcej doniesień dotyczących enzymatycznej 25-hydroksylacji steroli odnosi się do cytochromów rodziny P450. W organizmie ludzkim za aktywację witaminy D3 odpowiadają. CYP27A1, CYP3A4, CYP2R1, CYP2J2/3, CYP2D25 i CYP2C11, a w artykule „CYP2R1 is a major, but not exclusive, contributor to 25-hydroxyvitamin D production in vivo.”, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2013, 110 (39), 15650-15655 to CYP2R1 został wytypowany jako główny katalizator syntezy cholekalcyferolu przy C25 u człowieka.From the Arch. Biochem. Biophys., 2012, 523 (1), 30-36 it is known that by far the largest number of reports on the enzymatic 25-hydroxylation of sterols relates to the cytochrome P450 family. In the human body, they are responsible for the activation of vitamin D3. CYP27A1, CYP3A4, CYP2R1, CYP2J2 / 3, CYP2D25 and CYP2C11, and in the article "CYP2R1 is a major, but not exclusive, contributor to 25-hydroxyvitamin D production in vivo.", Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2013, 110 (39), 15650-15655, it is CYP2R1 that has been selected as the main catalyst for cholecalciferol synthesis at C25 in humans.

Do syntezy biotechnologicznej kalcytriolu często proponowane są biokatalizatory bakteryjne. W czasopiśmie Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 38 (2), 152-7 opisano transformacje witaminy D3 zarówno do kalcyfediolu jak i kalcytriolu stosując szczepy bakteryjne Amycolata sp. Autorzy przetestowali około 500 szczepów bakteryjnych oraz 450 grzybowych, spośród których tylko dla 12 szczepów (wszystkie z rodzaju Amycolata) określili zdolność do biotransformacji cholekalcyferolu do pożądanych produktów. Dla szczepu A. autotrophica FERM BP-1573 przeprowadzili biokonwersję odpowiednio do kalcyfediolu i kalcytriolu w skali 200 L z wydajnością procesu 8.3 mg/L i 0.17 mg/L. Dla tego samego szczepu potwierdzono także produkcję aktywowanej przy C25 i C1 witaminy D2 (ergocalciferol).Bacterial biocatalysts are often proposed for the biotechnological synthesis of calcitriol. In Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 38 (2), 152-7 describes the transformation of vitamin D3 into both calcifediol and calcitriol using bacterial strains of Amycolata sp. The authors tested about 500 bacterial and 450 fungal strains, of which only 12 strains (all of the Amycolata genus ) determined the ability to biotransform cholecalciferol to the desired products. For the A. autotrophica FERM BP-1573 strain, they bioconverted calcifediol and calcitriol, respectively, on a 200 L scale with a process yield of 8.3 mg / L and 0.17 mg / L. The production of vitamin D2 (ergocalciferol) activated at C25 and C1 was also confirmed for the same strain.

Regioselektywną hydroksylację witaminy D3 stwierdzono w artykule J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2014, 41, 265-273, w reakcji z enzymem określonym jako ACYP-sb3a, należącym do bakteryjnej rodziny CYP107. Enzym ten pochodzi z rzadkiego promieniowca Sebekia benihana.Regioselective hydroxylation of vitamin D3 was found in the article by J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2014, 41, 265-273, by reaction with an enzyme designated as ACYP-sb3a, belonging to the bacterial family of CYP107. This enzyme is derived from the rare actinomycetes Sebekia benihana.

Z kolei w czasopiśmie Chembiochem, 2013, 14 (17), 2284-2291 opisano reakcję syntezy kalcyfediolu katalizowaną przez zmutowaną hydroksylazę witaminy D3 z Pseudonocardia autotrophic.In turn, the journal Chembiochem, 2013, 14 (17), 2284-2291 describes the calcifediol synthesis reaction catalyzed by mutant vitamin D3 hydroxylase from Pseudonocardia autotrophic.

Zasadniczą wadą zastosowania wymienionych enzymów w systemie nadekspresji jako biokatalizatorów jest nierzadko niska regioselektywność reakcji, np. dla CYP27B1 (efekt potwierdzony w artykułach FEBS J., 2012, 279 (19), 3749-3761 i Mol. Cell. Endocrinol., 2014, 383(1-2), 181-192), a przede wszystkim konieczność stosowania kosztownych reutleniaczy: NAD(P)H, czy FAD.The main disadvantage of using the mentioned enzymes in the overexpression system as biocatalysts is often the low regioselectivity of the reaction, e.g. for CYP27B1 (the effect confirmed in the articles by FEBS J., 2012, 279 (19), 3749-3761 and Mol. Cell. Endocrinol., 2014, 383. (1-2), 181-192), and most of all the need to use expensive re-oxidants: NAD (P) H or FAD.

PL 235 932 B1PL 235 932 B1

Rozwiązanie dla drugiego problemu zaproponowano w czasopiśmie Biochem. Biophys. Res. Commun., 2011, 18, 405 (3), 393-8, gdzie jako katalizator zastosowano całe komórki rekombinowanej bakterii Rhodococcus erythropolis NI86/21, zawierającej obok hydroksylazy witaminy D3, system regeneracji NADH (ThcC, gen bank: U17130). Tak zrekombinowane komórki inkubowano w obecności 0.5 mM cholekalcyferolu w 50 mM buforze fosforanowym pH 7.4, 0.5% metylo-3-cyklodekstryny, 10% glicerolu, 1 mM tiaminy oraz 0.5 g/L nizyny. Uzyskano w ten sposób od 60 do 90% stopień konwersji w czterech kolejnych załadowaniach reaktora. W takim podejściu uzyskano maksymalnie 1.2 mg kalcyfediolu (stężenie ok. 0.4 mg/ml, jednak brak precyzyjnych danych w artykule na temat objętości próbki uniemożliwia ustalenie stężenia).The solution to the second problem is proposed in the journal Biochem. Biophys. Res. Commun., 2011, 18, 405 (3), 393-8, where whole cells of the recombinant Rhodococcus erythropolis NI86 / 21 bacterium containing besides vitamin D3 hydroxylase, the NADH regeneration system (ThcC, bank gene: U17130) were used as a catalyst. The thus recombinant cells were incubated in the presence of 0.5 mM cholecalciferol in 50 mM phosphate buffer pH 7.4, 0.5% methyl-3-cyclodextrin, 10% glycerol, 1 mM thiamine and 0.5 g / L nisin. In this way, the conversion rate from 60 to 90% was achieved in four successive reactor charges. This approach resulted in obtaining a maximum of 1.2 mg of calcifediol (concentration approx. 0.4 mg / ml, but the lack of precise data on the sample volume in the article makes it impossible to determine the concentration).

Innym przykładem jest zwiększenie efektywności pracy hydroksylazy witaminy D3 z Pseudonocardia autotrophica poprzez mutację punktową. Konstrukcję takiego katalizatora opisano w czasopiśmie ChemBioChem., 2013, 14 (17), 2284-2291. Stosując system reutlenienia NADH u R. erythropolis opisany powyżej, uzyskano w przeciągu 2 godzin ok. 0.57 g/L 25-OH-produktu.Another example is increasing the efficiency of vitamin D3 hydroxylase from Pseudonocardia autotrophica through a point mutation. The construction of such a catalyst is described in the journal ChemBioChem., 2013, 14 (17), 2284-2291. Using the NADH re-oxidation system in R. erythropolis described above, approximately 0.57 g / L of 25-OH-product was obtained within 2 hours.

Efektywny system produkcji kalcytriolu opracowano dla Pseudonocardia autotrophica ID9302 uzyskując 10.4 mg/L produktu w przeciągu 7 dniowej fermentacji w objętości 75 L. Szczegóły procesu opisano w czasopiśmie Biotechnol. Bioprocess Eng., 2006, 11,408-413.An efficient calcitriol production system was developed for Pseudonocardia autotrophica ID9302, yielding 10.4 mg / L of the product over a 7-day fermentation in a volume of 75 L. Details of the process are described in the journal Biotechnol. Bioprocess Eng., 2006, 11,408-413.

W czasopiśmie ChemCatChem., 2015, 7 (2), 283-290 opisano regioselektywną syntezę kalcyfediolu z zastosowaniem peroksydazy grzybiczej z Coprinopsis cinerea. Z uwagi na efektywny system nadekspresji oraz konieczność dostarczenia jedynie nadtlenku wodoru, katalizator niesie silny potencjał aplikacyjny. Autorzy informowali jednak jedynie o prowadzeniu reakcji przy niskim stężeniu substratu (0.05 mM).The journal ChemCatChem., 2015, 7 (2), 283-290 describes the regioselective synthesis of calcifediol using fungal peroxidase from Coprinopsis cinerea. Due to the effective overexpression system and the need to supply only hydrogen peroxide, the catalyst has a strong application potential. However, the authors only reported that the reaction was carried out at low substrate concentration (0.05 mM).

Wydajny system syntezy kalcyfediolu, do ok. 0.2 g/l produktu, opracowano dla rekombinowanej E. coli, co opisano w czasopiśmie Biosci. Biotechnol. Biochem., 2009, 73 (4), 805-810.An efficient system for the synthesis of calcifediol, up to approx. 0.2 g / l of the product, was developed for recombinant E. coli, as described in the Biosci journal. Biotechnol. Biochem. 2009, 73 (4), 805-810.

Inny przykład biokonwersji witaminy D3 do kalcyfediolu opisano w Biotechnol. Lett. 2015, 37, 1895-1904. Dzięki zastosowaniu komórek Pseudonocardia sp. KCTC 1029BP oraz optymalnych warunków konwersję przeprowadzono w skali 75 L i otrzymano 0.356 g/L kalcyfediolu z wydajnością 59.4%.Another example of the bioconversion of vitamin D3 to calcifediol is described in Biotechnol. Lett. 2015, 37, 1895-1904. Thanks to the use of Pseudonocardia sp. KCTC 1029BP cells and optimal conditions, the conversion was carried out on a 75 L scale and 0.356 g / L of calcifediol was obtained with an efficiency of 59.4%.

Ważnym elementem syntezy kalcyfediolu jest środowisko reakcji tj. opracowanie takiego składu, który pozwoli na wysoką rozpuszczalność słabo rozpuszczalnej witaminy D. Optymalna kompozycja mieszaniny opracowana dla syntezy kalcyfediolu z zastosowaniem komórek Pseudonocardia autotrophica ID9302 jako katalizatora oraz od 0.01 do 0.3% (w/v) substratu (witaminy D3) jest przedmiotem europejskiego patentu EP 2 377 942 B1. W skład opisanej wodnej mieszaniny reakcyjnej wchodzą: sole metali żelaza, manganu lub cynku w ilości od 0.01 do 0.3% (w/v); od 1 do 10% (w/v) co najmniej jednego z organicznych rozpuszczalników takich jak etanol, metanol, aceton, dimetylosulfotlenek; od 0.1 do 5% (w/v) cyklodekstryny; od 0.01 do 1% (w/v) buforu Tris (tris(hydroksymetylo)aminometan); od 0.01 do 1% (w/v) bursztynianu sodu; od 0.01 do 1% (w/v) chlorku sodu oraz od 0.001 do 0.5% chlorku magnezu.An important element in the synthesis of calcifediol is the reaction environment, i.e. the development of such a composition that will allow for high solubility of poorly soluble vitamin D. The optimal composition of the mixture developed for the synthesis of calcifediol using Pseudonocardia autotrophica ID9302 cells as a catalyst and from 0.01 to 0.3% (w / v) of the substrate (vitamin D3) is the subject of European patent EP 2 377 942 B1. The described aqueous reaction mixture includes: iron, manganese or zinc metal salts in the amount from 0.01 to 0.3% (w / v); from 1 to 10% (w / v) of at least one organic solvent such as ethanol, methanol, acetone, dimethyl sulfoxide; 0.1 to 5% (w / v) cyclodextrin; from 0.01 to 1% (w / v) Tris buffer (tris (hydroxymethyl) aminomethane); 0.01 to 1% (w / v) sodium succinate; from 0.01 to 1% (w / v) of sodium chloride and from 0.001 to 0.5% of magnesium chloride.

Bardzo podobny skład mieszaniny reakcyjnej, do produkcji lub wspomagania produkcji kalcytriolu lub kalcyfediolu, ujawniono w opisie zgłoszenia amerykańskiego: US 2012/0064584 A1.A very similar composition of the reaction mixture for producing or promoting the production of calcitriol or calcifediol is disclosed in US application: US 2012/0064584 A1.

W literaturze opisano szereg rozwiązań dotyczących biokatalitycznego utleniania pochodnych cholesterolu i witaminy D.The literature describes a number of solutions for the biocatalytic oxidation of cholesterol and vitamin D derivatives.

W artykule Biochem. Biophys. Res. Commun., 2013, 434 (2), 311-5 przedstawiono sposób syntezy 25-hydroksy-witaminy D2 stosując jako substrat ergosterol oraz naświetlanie UVB w obecności rekombinowanych komórek Saccharomyces cerevisiae z nadekspesją ludzkiego CYP2R1. Zrekombinowane komórki zawieszano w buforze z glukozą lub β-cyklodekstryną, a w wyniku naświetlania i reakcji enzymatycznej dla odpowiedniego prekursora witaminowego otrzymywano 25-hydroksy-witaminę D3 lub 25-hydroksy-witaminę D2.In the article Biochem. Biophys. Res. Commun., 2013, 434 (2), 311-5 shows a synthesis of 25-hydroxy-vitamin D2 using ergosterol as a substrate and UVB irradiation in the presence of recombinant Saccharomyces cerevisiae cells overexpressing human CYP2R1. The recombinant cells were suspended in glucose or β-cyclodextrin buffer, and the irradiation and enzymatic reaction for the appropriate vitamin precursor produced 25-hydroxy-vitamin D3 or 25-hydroxy-vitamin D2.

Brak regioselektywności enzymów wykazano w czasopiśmie Drug Metab. Dispos., 2013; 41 (5) 1112-24 dla mysiej i ludzkiej CYP2781. Aktywność enzymu CYP27B1 prowadzi do tworzenia pochodnych hydroksylowanych przy 17, 22, 23, 24, 26 atomie węgla, zaś największe powinowactwo do aktywności w kierunku 25-OH wykazuje względem 20-hydroksy-witaminy D3.The lack of regioselectivity of enzymes was demonstrated in the journal Drug Metab. Dispos., 2013; 41 (5) 1112-24 for mouse and human CYP2781. The activity of the enzyme CYP27B1 leads to the formation of hydroxylated derivatives at the carbon atom 17, 22, 23, 24, 26, and shows the greatest affinity for activity towards 25-OH towards 20-hydroxy-vitamin D3.

W czasopiśmie Mol. Cell. Endocrinol., 2014, 5, 383(1-2), 181-92 wykazano również aktywność CYP27B1 w kierunku tworzenia 1a-hydroksywitaminy D2.In the journal Mol. Cell. Endocrinol., 2014, 5, 383 (1-2), 181-92 also demonstrated the activity of CYP27B1 towards the formation of 1α-hydroxyvitamin D2.

W zgłoszeniu patentowym WO 2007/138894 opisano zastosowanie hydroksylazy witaminy D3 z Pseudonocardia autotrophica do produkcji 25-hydroksywitaminy D3 i 1,25-dihydroksy-witaminy D3. W wynalazku tym pomimo opracowania systemu nadekspresji synteza enzymatyczna zależna jest od kosztownego NADPH (fosforanu dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego).The patent application WO 2007/138894 describes the use of vitamin D3 hydroxylase from Pseudonocardia autotrophica for the production of 25-hydroxyvitamin D3 and 1,25-dihydroxy-vitamin D3. In this invention, despite the development of an overexpression system, the enzymatic synthesis depends on the expensive NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate).

PL 235 932 B1PL 235 932 B1

Bakteria Sterolibaterium denitrificans Chol-1S (DSM: 13999) została wyizolowana przez S. Tarlera i E. B. M. Dennera z kultury bakterii denitryfikujących stosowanych w oczyszczaniu ścieków sanitarnych. Sposób izolacji i hodowli oraz pełną charakterystykę bakterii Sterolibaterium denitrificans Chol-1S przedstawili oni w Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53, 1085-1091.The bacterium Sterolibaterium denitrificans Chol-1S (DSM: 13999) was isolated by S. Tarler and E. B. M. Denner from the culture of denitrifying bacteria used in sanitary sewage treatment. The method of isolation and cultivation as well as the full characterization of the Sterolibaterium denitrificans Chol-1S bacteria were presented in Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53, 1085-1091.

Z czasopisma J. Biol. Chem., 2007, 282, 13240-13249 znany jest sposób pozyskiwania z bakterii Sterolibaterium denitrificans Chol-1S ekstraktu komórkowego zawierającego enzym dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH), a z czasopisma J. Biol. Chem., 2012, 287, 36905-36916 znany jest sposób izolacji tego enzymu w warunkach beztlenowych.From the J. Biol journal. Chem., 2007, 282, 13240-13249, a method of obtaining from bacteria Sterolibaterium denitrificans Chol-1S a cell extract containing the enzyme C25 steroid dehydrogenase (S25DH) is known, and from the journal J. Biol. Chem., 2012, 287, 36905-36916, a method of isolating this enzyme under anaerobic conditions is known.

Z kolei w J. Biol. Chem., 2007, 282, 13240-13249 wykazano regioselektywność tego enzymu, a w artykule „Molybdoenzyme that catalyzes the anaerobic hydroxylation of a tertiary carbon atom in the side chain of cholesterol’opublikowanym w J. Biol. Chem., 2012, 287, 36905-36916 ujawniono spektrum substratowe złożone z czterech substratów: cholest-4-en-3-onu, cholest-4,6-dien-3-o 5-cholestan-33-ol-7-onu i cholest-5-en-3-olu (cholesterolu), dla których zidentyfikowano na podstawie analiz MS produkty reakcji hydroksylacji przy atomie węgla C25. Ponadto określono skład mieszaniny reakcyjnej, który opiera się na stosowaniu w celu solubilizacji powyższych substratów 2-hydroksypropyl-β-cyklodekstryny w stężeniu do 20-28% (w/v) w obecności 1% 1,4-dioxanu i 100 mM buforu fosforanowego o pH 7.5.In turn, in J. Biol. Chem., 2007, 282, 13240-13249, the regioselectivity of this enzyme has been demonstrated, and in the article "Molybdoenzyme that catalyzes the anaerobic hydroxylation of a tertiary carbon atom in the side chain of cholesterol" published in J. Biol. Chem., 2012, 287, 36905-36916 discloses a substrate spectrum composed of four substrates: cholest-4-en-3-one, cholest-4,6-dien-3-o 5-cholestan-33-ol-7-one and cholest-5-en-3-ol (cholesterol), for which the C25 hydroxylation reaction products were identified by MS analyzes. In addition, the composition of the reaction mixture was determined, which is based on the use of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin in a concentration of up to 20-28% (w / v) in the presence of 1% 1,4-dioxane and 100 mM phosphate buffer with pH 7.5.

W polskim zgłoszeniu patentowym P.411750 „Sposób otrzymywania 25-hydroksylowanych pochodnych sterolowych, w tym 25-hydroksy-7-dehydrocholesterolu” opisano inny skład mieszaniny reakcyjnej S25DH, w którym dodatek 1% 1,4-dioxanu zastąpiono 2-metoksyetanolem w ilości 1-10% (v/v) lub glikolem propylowym w ilości 1-10% (v/v) przy jednoczesnym zmniejszeniu zawartości 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny do stężenia 4-20% (w/v), najlepiej 8% (w/v). Przedstawione w opisie zgłoszenia P.411750 zmiany zapewniały możliwość redukcji ilości kosztownej 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny. Taką mieszaninę reakcyjną zastosowano w reakcjach hydroksylacji cholesterolu, 7-dehydrocholesterolu, cholest-4-en-3-onu, cholest-1,4-dien-3-onu oraz choelst-4,6-dien-3-onu. W zgłoszeniu tym wykazano również możliwość zastosowania enzymu w postaci immobilizowanej oraz opisano układ reakcyjny z elektrochemicznym odtwarzaniem akceptora elektronowego.In the Polish patent application P.411750 "The method of obtaining 25-hydroxylated sterol derivatives, including 25-hydroxy-7-dehydrocholesterol", a different composition of the S25DH reaction mixture is described, in which the addition of 1% 1,4-dioxane was replaced with 2-methoxyethanol in the amount of 1 -10% (v / v) or propyl glycol in the amount of 1-10% (v / v) while reducing the content of 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin to a concentration of 4-20% (w / v), preferably 8% (in / v). The changes presented in the description of application P.411750 made it possible to reduce the amount of expensive 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin. This reaction mixture was used in the hydroxylation reactions of cholesterol, 7-dehydrocholesterol, cholest-4-en-3-one, cholest-1,4-dien-3-one and choelst-4,6-dien-3-one. This application also showed the possibility of using the enzyme in an immobilized form and describes a reaction system with electrochemical reconstruction of an electron acceptor.

Celem wynalazku jest dostarczenie biokatalitycznego sposobu otrzymywania kalcyfediolu o wzorze II z cholekalcyferolu o wzorze I z wysoką wydajnością.The object of the invention is to provide a biocatalytic process for the preparation of calcifediol of formula II from cholecalciferol of formula I in high yield.

Stwierdzono nieoczekiwanie, że preparat enzymatyczny o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH), pochodzącej z bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, jest w stanie w obecności substancji będącej dla niego reutleniaczem (akceptorem elektronowym) prowadzić bardzo efektywną regioselektywną hydroksylację cholekalcyferolu o wzorze I do kalcyfediolu o wzorze II, przy stężeniu substratu do 2,8 mM, przez okres do 7 dni, w wodno-organicznym beztlenowym lub odtlenionym obojętnym gazem środowisku reakcji, buforowanym do pH 6-8, zawierającym czynnik solubilizujący.It was unexpectedly found that the enzyme preparation with the activity of steroid C25 dehydrogenase (S25DH), derived from the bacterium Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, is able to carry out a very effective regioselective hydroxylation of cholecalciferol of formula I to calcifediol in the presence of a substance that is a re-oxidant (electron acceptor) of formula II, at a substrate concentration of up to 2.8 mM, for up to 7 days, in a hydro-organic anaerobic or deoxygenated inert gas reaction medium, buffered to pH 6-8, containing a solubilizing agent.

Zgodnie z wynalazkiem sposób biokatalitycznego otrzymywania kalcyfediolu o wzorze II, polegający na regioselektywnej hydroksylacji, charakteryzuje się tym, że prowadzi się regioselektywną hydroksylację cholekalcyferolu o wzorze I, preparatem enzymatycznym o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) pochodzącej z bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, przy czym proces regioselektywnej hydroksylacji substratu o wzorze I prowadzi się w środowisku wodno-organicznym, beztlenowym lub odtlenionym obojętnym gazem, w obecności reutleniacza, którym jest heksacyjanożelazian (III) potasu Ks[Fe(CN)6], w temperaturze 15-45°C, w mieszaninie reakcyjnej, która zawieraAccording to the invention, the regioselective hydroxylation method for the biocatalytic preparation of calcifediol of formula II is characterized in that the regioselective hydroxylation of cholecalciferol of formula I is carried out by an enzyme preparation having the activity of steroid C25 dehydrogenase (S25DH) derived from the bacteria Sterolibacterium-1Sificans, Cholificium-1Sificans. the process of regioselective hydroxylation of the substrate of formula I is carried out in an aqueous-organic, anaerobic or deoxygenated inert gas in the presence of a re-oxidant, which is potassium hexacyanoferrate (III) Ks [Fe (CN) 6], at a temperature of 15-45 ° C, in the reaction mixture that contains

- bufor zapewniający pH w zakresie 6-8, wybrany spośród ortofosforanu potasu lub ortofosforanu sodu lub mieszaniny buforu tris(hydroksymetylo)aminometanowego i ortofosfora nowego (Tris/PO4),- a buffer providing a pH in the range of 6-8, selected from potassium orthophosphate or sodium orthophosphate or a mixture of tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer and orthophosphate (Tris / PO4),

- wodny roztwór o stężeniu 4-20% (w/v) solubilizatora, którym jest 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryna,- an aqueous solution with a concentration of 4-20% (w / v) of the solubilizer, which is 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin,

- oraz rozpuszczalnik organiczny 2-metoksyetanol w ilości 1-10% (v/v), utrzymując biokatalityczną aktywność preparatu enzymatycznego o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) przez okres do 7 dni, który to proces regioselektywnej hydroksylacji cholekalcyferolu ma następujący przebieg: do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze beztlenowej wprowadza wprowadza się bufor, solubilizator rozpuszczony w wodzie, reutleniacz i cholekalcyferol rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym, po czym inicjuje się reakcję dodając preparat enzymatyczny o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) i monitoruje się przebieg reakcji, a po jej zakończeniu wydziela się uzyskany produkt w znany sposób.- and the organic solvent 2-methoxyethanol in an amount of 1-10% (v / v), maintaining the biocatalytic activity of the enzyme preparation with the activity of C25 steroid dehydrogenase (S25DH) for up to 7 days, which process of regioselective hydroxylation of cholecalciferol is as follows: to the reactor in an anaerobic atmosphere, a buffer, a solubilizer dissolved in water, a re-oxidant and cholecalciferol dissolved in an organic solvent are introduced, and the reaction is initiated by adding an enzyme preparation with the activity of C25 steroid dehydrogenase (S25DH) and the course of the reaction is monitored, and then the reaction is released. the product obtained in a known manner.

PL 235 932 Β1PL 235 932 Β1

Dehydrogenaza C25 steroidowa (heterotrimer αβγ), jest enzymem molibdenowym katalizującym natywnie (tzn. w bakterii Sterolibacterium denitrificans w czasie mineralizacji cholesterolu) reakcję hydroksylacji cholest-4-en-3-onu i cholest-1,4-dienu-3-onu do 25-hydroksy-cholest-4-en-3-onu i 25-hydroksy-cholest-1,4-dienu-3-onu.C25 steroid dehydrogenase (αβγ heterotrimer) is a molybdenum enzyme that natively catalyses (i.e. in Sterolibacterium denitrificans during cholesterol mineralization) the reaction of hydroxylation of cholest-4-en-3-one and cholest-1,4-diene-3-one to 25 -hydroxy-cholest-4-en-3-one and 25-hydroxy-cholest-1,4-diene-3-one.

W kontekście niniejszego wynalazku „dehydrogenaza C25 steroidowa” lub „preparat enzymatyczny o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej” katalizuje reakcję hydroksylacji witaminy Da do 25-hydroksylowanego produktu, co pokazano na schemacie poniżej. Enzym, celem regeneracji, wymaga obecności reutleniacza; dla S25DH jestto heksacyjanożelazian (III) potasu (Ka[Fe(CN)6]) lubtetrafluoroboran ferrocenu (III) [Fe(cp)2]BF4, które w reakcji ulegają redukcji odpowiednio do heksacyjanożelazianu (II) potasu (K4[Fe(CN)e]) lub ferrocenu (II) ([Fe(cp)2]); S25DHOX i S25DHred oznaczają formę enzymu odpowiednio utlenioną i zredukowaną.In the context of the present invention, a "C25 steroid dehydrogenase" or "C25 steroid dehydrogenase enzyme preparation" catalyzes the vitamin Da hydroxylation reaction to the 25-hydroxylated product as shown in the diagram below. The enzyme requires a re-oxidant to regenerate; for S25DH it is potassium hexacyanoferrate (III) (Ka [Fe (CN) 6]) or ferrocene (III) tetrafluoroborate [Fe (cp) 2] BF4, which in the reaction are reduced to potassium hexacyanoferrate (II) (K4 [Fe (CN) ) e]) or ferrocene (II) ([Fe (cp) 2]); S25DH OX and S25DH red denote the oxidized and reduced form of the enzyme, respectively.

Schemat reakcji hydroksylacji cholekalcyferolu I do kalcyfediolu II.Scheme of the hydroxylation reaction of cholecalciferol I to calcifediol II.

W kontekście niniejszego wynalazku „dehydrogenaza C25 steroidowa” lub „preparat enzymatyczny o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej” to enzym, mieszanina izoenzymów lub preparat enzymatyczny, którego katalitycznie aktywna część określona jest sekwencjami aminokwasowymi o kodach identyfikacyjnych zdeponowanych w Genbanku: dla podjednostki β AFF61326.1, podjednostka γ AFF61327.1, warianty podjednostki a: AFF61329.1 lub AFF61325.1, AFF61328.1, AFF61330.1, IAFF61337.1.In the context of the present invention, a "steroid C25 dehydrogenase" or "steroidal C25 dehydrogenase enzyme preparation" is an enzyme, isoenzyme mixture or enzyme preparation, the catalytically active portion of which is defined by the amino acid sequences with the identification codes deposited with Genbank: for the β subunit AFF61326.1, γ subunit AFF61327.1, variants a subunit: AFF61329.1 or AFF61325.1, AFF61328.1, AFF61330.1, IAFF61337.1.

W kontekście niniejszego wynalazku przez „preparat enzymatyczny” należy rozumieć enzym nieoczyszczony, zawierający, prócz S25DH lub izoenzymów S25DH, inne białka w tym enzymy, które z uwagi na specyfikę substratu i mieszaniny reakcyjnej nie wykazują aktywności i nie modyfikują substratu inaczej jak hydroksylacja przy C25.In the context of the present invention, the term "enzyme preparation" is understood to mean a crude enzyme containing, apart from S25DH or S25DH isoenzymes, other proteins, including enzymes which, due to the nature of the substrate and the reaction mixture, do not exhibit activity and do not modify the substrate other than hydroxylation at C25.

Termin „proces biokatalityczny” dotyczy w kontekście tego wynalazku każdego procesu prowadzonego w obecności aktywności enzymatycznej S25DH, czy to w postaci oczyszczonej, nieoczyszczonej, ekstraktu komórkowego, czy komórek bakteryjnych pod warunkiem, że wykazują one wobec substratów jedynie aktywność dehydrogenazy C25 steroidowej.The term "biocatalytic process" in the context of this invention refers to any process carried out in the presence of the enzymatic activity of S25DH, whether in a purified, crude, cell extract or bacterial cell form, provided that they exhibit only steroid C25 dehydrogenase activity on the substrates.

W kontekście tego wynalazku termin „regioselektywny” jest rozumiany jako proces przebiegający wyłącznie przy 25 atomie węgla cholekalcyferolu.In the context of this invention, the term "regioselective" is understood to mean a process that takes place exclusively at the carbon atom of the cholecalciferol.

Korzystnie obecny w preparacie enzymatycznym katalizujący enzym S25DH charakteryzuje się budową heterotrimeryczną αβγ, której sekwencję aminokwasów zdeponowano w GENBANKu pod następującymi numerami referencyjnymi: dla podjednostki β AFF61326.1, podjednostki γ AFF61327.1, warianty podjednostki a: AFF61329.1 lub AFF61325.1, AFF61328.1, AFF61330.1, AFF61337.1.Preferably, the enzyme catalyzing the enzyme S25DH present in the enzyme preparation is characterized by an αβγ heterotrimeric structure, the amino acid sequence of which has been deposited in GENBANK under the following reference numbers: for the β subunit AFF61326.1, the γ subunit AFF61327.1, variants of the α subunit: AFF61329.1 or AFF61329.1, AFF61328.1, AFF61330.1, AFF61337.1.

Korzystnie obecny w preparacie enzymatycznym katalizujący enzym charakteryzuje się sekwencją aminokwasową o identyczności na poziomie przynajmniej 70% w odniesieniu do sekwencji aminokwasów zdeponowanych w GENBANKu pod następującymi numerami referencyjnymi: dla podjednostki β AFF61326.1, podjednostki γ AFF61327.1, warianty podjednostki a AFF61329.1 lub AFF61325.1, AFF61328.1, AFF61330.1, AFF61337.1 i funkcjonalnie katalizuje tę samą reakcję hydroksylacji.Preferably, the catalyzing enzyme present in the enzyme preparation has an amino acid sequence of at least 70% identity with the amino acid sequences deposited with GENBANK under the following reference numbers: for the β subunit AFF61326.1, the γ subunit AFF61327.1, the α subunit variants of AFF61329.1 or AFF61325.1, AFF61328.1, AFF61330.1, AFF61337.1 and functionally catalyzes the same hydroxylation reaction.

Korzystnie regioselektywną hydroksylację cholekalcyferolu prowadzi się w temperaturze do 30°C.Preferably, the regioselective hydroxylation of colecalciferol is carried out at a temperature of up to 30 ° C.

PL 235 932 B1PL 235 932 B1

W sposobie według wynalazku stosuje się korzystnie mieszaninę reakcyjną, która zawiera bufor fosforanowy, zapewniający pH wynoszące 7,5, wodny roztwór 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny o stężeniu 4-15% (w/v), a najlepiej 4-8% (w/v), oraz 2-metoksyetanol w ilości 1.25% (v/v).Preferably, a reaction mixture is used in the process of the invention which comprises a phosphate buffer providing a pH of 7.5, an aqueous solution of 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin at a concentration of 4-15% (w / v), preferably 4-8% ( w / v), and 2-methoxyethanol in the amount of 1.25% (v / v).

Taka kompozycja solubilizuje (rozpuszcza) używany substrat w stężeniu do 1.13 g/L to jest do 2.8 mM.This composition solubilizes (dissolves) the substrate used up to a concentration of 1.13 g / L, i.e. up to 2.8 mM.

W sposobie według wynalazku, jako reutleniacz stosuje się heksacyjanożelazian (III) potasu K3[Fe(CN)6]. Korzystnie jest stosować K3[Fe(CN)6], gdyż jest tani i dobrze rozpuszczalny w wodzie. Jednakże w przypadku szczególnych zastosowań, gdzie obecność śladowych ilości cyjanków jest niewskazana, korzystne jest zastąpienie K3[Fe(CN)6] przez tetrafluoroboran ferrocenu (III) [Fe(cp)2]BF4.In the process according to the invention, potassium hexacyanoferrate (III) K3 [Fe (CN) 6] is used as the re-oxidant. It is preferable to use K3 [Fe (CN) 6] as it is cheap and highly soluble in water. However, for specific applications where the presence of traces of cyanide is inadvisable, it is preferable to replace K3 [Fe (CN) 6] with ferrocene (III) [Fe (cp) 2] BF4 tetrafluoroborate.

Ponieważ podczas procesu hydroksylacji substratu następuje redukcja reutleniacza, a szybkość procesu biokatalitycznego zależy od stężenia utlenionej formy reutleniacza, korzystne jest zapewnienie jego wysokiego stężenia w całym okresie reakcji. Osiąga się to poprzez prowadzenie procesu przy wysokim początkowym stężeniu łatwo rozpuszczalnego w wodzie K3[Fe(CN)6] wynoszącym od 1-100 mM, szczególnie 10-20 mM, a najlepiej 12-15 mM. W przypadku stosowania reutleniacza w postaci [Fe(cp)2]BF4 proces prowadzi się przy jego stężeniu początkowym przynajmniej 0.1 mM, a zwłaszcza 0.2-2 mM.Since the re-oxidant is reduced during the substrate hydroxylation process, and the rate of the biocatalytic process depends on the concentration of the oxidized form of the re-oxidant, it is preferable to ensure its high concentration throughout the reaction period. This is achieved by operating the process at a high initial concentration of easily water-soluble K3 [Fe (CN) 6] ranging from 1-100 mM, especially 10-20 mM, and preferably 12-15 mM. When a re-oxidant in the form of [Fe (cp) 2] BF4 is used, the process is carried out at an initial concentration of at least 0.1 mM, in particular 0.2-2 mM.

Ponadto, korzystnie jest gdy w procesie hydroksylacji substratu stosuje się reutleniacz w takiej ilości by stosunek jego stężenia molowego do stężenia molowego substratu wynosił przynajmniej 2:1, przy czym górną granicą stężenia reutleniacza jest jego rozpuszczalność w medium reakcyjnym.Moreover, it is preferred that the re-oxidant is used in the hydroxylation of the substrate in an amount such that the ratio of its molar concentration to the molar concentration of the substrate is at least 2: 1, with the re-oxidant concentration being the upper limit of its solubility in the reaction medium.

Korzystnie przebieg reakcji monitoruje się wykorzystując wysokosprawną chromatografię cieczową.Preferably the course of the reaction is monitored using high performance liquid chromatography.

Sposobem według wynalazku można uzyskiwać kalcyfediol będący cennym produktem dla przemysłu farmaceutycznego i kosmetycznego.By the method according to the invention, calcifediol can be obtained, which is a valuable product for the pharmaceutical and cosmetic industries.

Wynalazek w przykładach realizacji objaśniono szczegółowo poniżej.The invention is explained in detail in the following examples of embodiment.

Przykładowe przygotowanie preparatu enzymatycznegoExemplary preparation of an enzyme preparation

Przykładowa procedura przygotowania preparatu enzymatycznego poprzedzona jest dwoma etapami prowadzącymi do pozyskania natywnego preparatu enzymatycznego z aktywnością S25DH: hodowla bakteryjna oraz izolacja z masy bakteryjnej preparatu enzymatycznego o aktywności S25DH.An exemplary procedure for the preparation of an enzyme preparation is preceded by two steps leading to the acquisition of a native enzyme preparation with S25DH activity: bacterial culture and isolation of the enzyme preparation with S25DH activity from the bacterial mass.

Hodowlę bakterii Sterolibaterium denitrificans Chol-1S prowadzi się w środowisku beztlenowym przykładowo według procedury opisanej w artykule Journal of Biological Chemistry; 2007, 282,The cultivation of the bacteria Sterolibaterium denitrificans Chol-1S is carried out in an anaerobic environment, for example according to the procedure described in the Journal of Biological Chemistry; 2007, 282,

13240-13249. Zakończenie hodowli następuje w końcowym etapie logarytmicznej fazy wzrostu bakterii i odbywa się poprzez zwirowanie masy bakteryjnej i zamrożenie w celu długotrwałego przechowywania.13240-13249. Completion of cultivation occurs at the final stage of the logarithmic growth phase of bacteria and is accomplished by centrifuging the bacterial mass and freezing for long-term storage.

Preparat enzymatyczny o aktywności S25DH oczyszcza się (izoluje) z bakterii wzrastających na pożywce z azotanem jako akceptorem elektronów oraz cholesterolem jako donorem elektronów według procedury opisanej w Journal of Biological Chemistry, 2012, 287, 36905-36916.The enzyme preparation with S25DH activity is purified (isolated) from bacteria grown on media with nitrate as electron acceptor and cholesterol as electron donor according to the procedure described in Journal of Biological Chemistry, 2012, 287, 36905-36916.

W szczególności, aby uzyskać katalizator nieoczyszczony zawiesinę komórek bakteryjnych w 20 mM buforze Tris/PO4 o pH 7.0 (stosunek wagowy mokrej masy do buforu 1:2) poddaje się homogenizacji a następnie wirowaniu (4°C, przyspieszenie 15 000 g, 30 min) w celu usunięcia niezdezintegrowanych komórek i pozostałego cholesterolu. Po odrzuceniu osadu pozostałość materiału poddaje się solubilizacji w obecności 0.057 g/ml 70% Tweenu 20 i 10% gliceryny (w/v) przez 6-18 h, w szczególności przez 12 h, po czym następuje ultrawirowanie celem usunięcia frakcji membranowej (4°C, 150 000 g, 1.5 h). Uzyskany nadsącz był stosowany jako preparat nieoczyszczony o aktywności S25DH (przykład 2 i 3). Materiał ten może podlegać dalszemu oczyszczaniu na kolumnie DEAE-Sepharose zgodnie z procedurą opisaną w Journal of Biological Chemistry, 2012, 287, 36905-36916. Uzyskany preparat enzymatyczny został zastosowany do reakcji w przykładzie 4. Natomiast katalizator oczyszczony na dwóch dalszych kolumnach (Q-sepharose i Reactive Red) został użyty w przykładzie 1. Ze względów ekonomicznych korzystne jest jednak stosować katalizator nieoczyszczony.In particular, to obtain the catalyst, the crude suspension of the bacterial cells in 20 mM Tris / PO4 buffer at pH 7.0 (wet weight to buffer weight ratio 1: 2) is homogenized and then centrifuged (4 ° C, acceleration 15,000 g, 30 min) to remove non-disintegrated cells and residual cholesterol. After removing the precipitate, the material residue is solubilized in the presence of 0.057 g / ml 70% Tween 20 and 10% glycerin (w / v) for 6-18 h, in particular for 12 h, followed by ultracentrifugation to remove the membrane fraction (4 ° C, 150,000 g, 1.5 h). The obtained supernatant was used as a crude preparation with the activity of S25DH (Examples 2 and 3). This material can be further purified on a DEAE-Sepharose column according to the procedure described in Journal of Biological Chemistry, 2012, 287, 36905-36916. The resulting enzyme preparation was used for the reaction in Example 4. Whereas a catalyst purified on two further columns (Q-sepharose and Reactive Red) was used in Example 1. However, it is preferable to use a crude catalyst for economic reasons.

Przykładowy układ reakcyjnyAn exemplary reaction system

Proces biokatalityczny według wynalazku może być realizowany w znanym reaktorze okresowym z zasilaniem. Proces przykładowo realizuje się w opisanych poniżej warunkach.The biocatalytic process according to the invention can be carried out in a known fed batch reactor. The process is carried out, for example, under the conditions described below.

W przykładowym układzie reakcyjnym zawierającym reaktor okresowy, realizację procesu według wynalazku, tj. hydroksylację cholecalciferolu, prowadzi się w mieszaninie reakcyjnej, która zawiera bufor zapewniający pH w zakresie 6-8, wodny roztwór 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny o stężeniu najlepiej 4-8% (w/v), oraz 2-metoksyetanol w korzystnej ilości od 1.25%-5% (v/v).In an exemplary reaction system containing a batch reactor, the implementation of the process of the invention, i.e. hydroxylation of cholecalciferol, is carried out in a reaction mixture that contains a buffer that provides a pH in the range of 6-8, an aqueous solution of 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin with a concentration preferably of 4-8 % (w / v), and 2-methoxyethanol in a preferred amount from 1.25% -5% (v / v).

W układzie reakcyjnym jako reutleniacz stosuje się heksacyjanożelazian (III) potasu K3[Fe(CN)6] lub tetrafluoroboran ferrocenu (III) [Fe(cp)2]BF4.In the reaction system, potassium hexacyanoferrate (III) K3 [Fe (CN) 6] or ferrocene tetrafluoroborate (III) [Fe (cp) 2] BF4 is used as the re-oxidant.

PL 235 932 B1PL 235 932 B1

Korzystnie jest stosować Ks[Fe(CN)6], gdyż jest tani i lepiej rozpuszczalny a jego stężenie łatwo jest uzupełnić przez dodanie utlenionej soli Ks[Fe(CN)6] do reaktora.It is preferable to use Ks [Fe (CN) 6] as it is cheap and more soluble and its concentration is easily made up by adding the oxidized salt of Ks [Fe (CN) 6] to the reactor.

Jednak w przypadku szczególnych zastosowań, gdzie obecność śladowych ilości cyjanków jest niewskazana, korzystne jest zastąpienie KsFe(CN)6] przez [Fe(cp)2]BF4.However, for specific applications where the presence of trace amounts of cyanide is inadvisable, it is preferable to replace KsFe (CN) 6] with [Fe (cp) 2] BF4.

Ponieważ podczas procesu hydroksylacji substratu następuje redukcja reutleniacza, a szybkość procesu zależy od stężenia formy utlenionej, korzystnie jest zapewnienie jego wysokiego stężenia w całym okresie reakcji. Osiąga się to poprzez wysokie początkowe stężenie szczególnie łatwo rozpuszczalnego w wodzie Ks[Fe(CN)6] od 1-100 mM, przykładowo ustalając je na poziomie 12-15 mM. Natomiast dla reutleniacza w postaci [Fe(cp)2]BF4 stosuje się stężenie przynajmniej 0.1 mM, a korzystnie 2 mM.Since the re-oxidant is reduced during the substrate hydroxylation process and the rate of the process depends on the concentration of the oxidized species, it is preferable to ensure a high concentration throughout the reaction period. This is achieved by a high initial concentration of especially water-soluble Ks [Fe (CN) 6] from 1-100 mM, for example setting it to 12-15 mM. For the re-oxidant in the form of [Fe (cp) 2] BF4, a concentration of at least 0.1 mM and preferably 2 mM is used.

Drugim sposobem zapewnienia wysokiego stężenia reutleniacza jest stopniowe dodawanie sypkiego reutleniacza w przypadku gdy jego stężenie w reaktorze spadnie co można łatwo sprawdzić poprzez analizę kolorymetryczną (zanik koloru żółtego) lub spektrofotometryczną (zmniejszenie absorbancji przy λ =420 nm, Δε = 1040 M-1 cm-1).The second way to ensure a high concentration of re-oxidant is to gradually add loose re-oxidant when its concentration in the reactor decreases, which can be easily checked by colorimetric analysis (disappearance of yellow color) or spectrophotometric analysis (reduction of absorbance at λ = 420 nm, Δε = 1040 M -1 cm - 1 ).

Przykładowa izolacja reagentów z mieszaniny reakcyjnejAn example of isolation of reagents from the reaction mixture

Po zakończeniu przykładowej reakcji produkt hydroksylacji znajduje się w wodno-organicznej mieszaninie reakcyjnej zawierającej następujące zanieczyszczenia:Upon completion of the exemplary reaction, the hydroxylation product is contained in an aqueous-organic reaction mixture containing the following impurities:

- enzym,- enzyme,

- nieprzereagowany substrat,- unreacted substrate,

- utleniony i zredukowany akceptor elektronowy (reutleniacz),- oxidized and reduced electron acceptor (re-oxidant),

- 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstrynę (solubilizator),- 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin (solubilizer),

- organiczny rozpuszczalnik (2-metoksyetanol),- organic solvent (2-methoxyethanol),

- bufor (np. fosforanowy lub mieszanina buforu tris(hydroksymetylo)aminometanowego i ortofosforanowego (Tris/PO4)).- buffer (e.g. phosphate or a mixture of tris (hydroxymethyl) aminomethane and orthophosphate (Tris / PO4) buffer).

Produkt wydziela się w znany sposób, zgodnie z regułami sztuki chemicznej. Następnie oddziela się akceptor elektronowy (reutleniacz). W przypadku zastosowania Ks[Fe(CN)6], niezależnie od stopnia utlenienia, heksacyjanożelaziany (II) i (III) tworzą z jonami Fe2+ nierozpuszczalne w wodzie osady (tzw. błękit Turnbulla i błękit Pruski). Reakcję tą wykorzystuje się do usunięcia formy utlenionej akceptora. Dodanie nadmiaru jonów Fe2+ (np. w formie nasyconego roztworu FeSO4) i usunięcie osadu poprzez szybkie odwirowanie daje transparenty roztwór. Wydzielenie reagentów organicznych z roztworu wodnego najkorzystniej przeprowadza się stosując ekstrakcję. Ekstrakcję przeprowadza się do fazy stałej (SPE, solid phase extraction) lub metodą ciecz-ciecz (przykładowo z octanem etylu, dichlorometanem, chloroformem, eterem dietylowym, eterem tertbutylometylowym lub innym; kilkukrotna (jedno- do trójkrotna) ekstrakcja w stosunku 1:1 faza wodna, faza organiczna).The product is isolated in a known manner, in accordance with the rules of the chemical art. The electron acceptor (re-oxidant) is then separated. When using Ks [Fe (CN) 6], irrespective of the oxidation state, hexacyanoferrates (II) and (III) together with Fe 2+ ions form water-insoluble sediments (the so-called Turnbull blue and Prussian blue). This reaction is used to remove the oxidized form of the acceptor. Addition of excess Fe 2+ ions (e.g. in the form of a saturated FeSO4 solution) and removal of the precipitate by rapid centrifugation produces a banner solution. The isolation of the organic reagents from the aqueous solution is most preferably accomplished using extraction. Extraction is performed in solid phase extraction (SPE) or by liquid-liquid method (for example with ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, tert-butyl methyl ether or other); multiple (one to three times) extraction in the ratio 1: 1 phase water, organic phase).

Przeprowadzone eksperymenty wskazują, że stosowana w reakcji 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryna nie utrudnia przeniesienia produktu/substratu do fazy organicznej, ale częściowo także rozpuszcza się w fazie organicznej, co stanowi zanieczyszczenie produktu po odparowaniu rozpuszczalnika stosowanego w ekstrakcji.The conducted experiments show that the 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin used in the reaction does not hinder the transfer of the product / substrate to the organic phase, but also partially dissolves in the organic phase, which is a product contamination after evaporation of the solvent used in the extraction.

Metoda ekstrakcji SPE ma tą przewagę nad ekstrakcją ciecz-ciecz, że pozwala oddzielić od reagentów organicznych 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstrynę. Pozostałe składniki mieszaniny reakcyjnej: jonowy akceptor elektronowy, enzym, jony fosforanowe, potasowe lub Tris, rozpuszczalnik organiczny oraz woda również zostają odizolowane, nie ulegając rozpuszczeniu w fazie hydrofobowej złoża SPE. Ze złoża odzyskuje się zatem czysty substrat/produkt.The SPE extraction method has the advantage over liquid-liquid extraction as it allows the separation of 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin from organic reagents. The remaining components of the reaction mixture: ion electron acceptor, enzyme, phosphate, potassium or Tris ions, organic solvent and water are also isolated without being dissolved in the hydrophobic phase of the SPE bed. Thus, a pure substrate / product is recovered from the bed.

W tym celu na złoże SPE (przykładowo złoże polimerowe) (po etapie kondycjonowania przeprowadzonego zgodnie z regułami sztuki) nanosi się mieszaninę reakcyjną, a następnie przepłukuje ją 40% (w/v) wodnym roztworem izopropanolu w ilości co najmniej 1 objętości mieszaniny reakcyjnej, a korzystnie 5 objętościami nałożonej mieszaniny reakcyjnej. Aby dokonać ekstrakcji związków sterolowych z fazy stałej, po wysuszeniu złoża powietrzem przeprowadza się elucję rozpuszczalnikiem organicznym (chloroformem) w ilości 1-4 objętości stosowanego złoża. Ślady wody z eluatu osusza się bezwodnym MgSO4. Końcowym etapem jest odparowanie rozpuszczalnika organicznego od hydroksylowanego produktu.To this end, the reaction mixture is applied to the SPE bed (e.g. polymer bed) (after the conditioning step according to the rules of the art) and then rinsed with 40% (w / v) aqueous isopropanol in an amount of at least 1 volume of the reaction mixture, and preferably 5 volumes of the applied reaction mixture. To extract sterol compounds from the solid phase, after air drying the bed, elution is performed with an organic solvent (chloroform) in an amount of 1-4 bed volumes used. Traces of water in the eluate are dried with anhydrous MgSO4. The final step is to evaporate the organic solvent from the hydroxylated product.

W przypadku niekompletnej konwersji substratu, po odparowaniu rozpuszczalnika od substratu/produktu przeprowadza się preparatywną chromatografię kolumnową na adsorbencie krzemionkowym, aktywnym tlenku glinu lub krzemionce modyfikowanej C18, używając, w przypadku tlenku glinu i krzemionki, mieszaniny rozpuszczalników o stałej dielektrycznej równej od 2.72 do 5.20, natomiast w przypadku wykorzystania krzemionki modyfikowanej C18 stosuje się mieszaninę rozpuszczalnikówIn the case of incomplete conversion of the substrate, after evaporation of the solvent from the substrate / product, preparative column chromatography is carried out on a silica adsorbent, active alumina or C18 modified silica, using, in the case of alumina and silica, a solvent mixture with a dielectric constant of 2.72 to 5.20, while in the case of using C18 modified silica, a mixture of solvents is used

PL 235 932 Β1 o stałej dielektrycznej równej od 38.00 do 46.00. W trakcie elucji kolejne frakcje kontroluje się TLC (cienkowarstwową chromatografią cieczową), używając tego samego solwentu do rozwinięcia płytek i stosując jako sposób detekcji np. naniesienia pary jodu lub ogrzewanie płytki (120°C) spryskanej roztworem 50% (v/v) H2SO4 w metanolu lub oświetlanie pod lampą UV. Odparowanie rozpuszczalnika organicznego z odpowiednich frakcji wycieku z kolumny pozwala na uzyskanie czystych składników mieszaniny.PL 235 932 Β1 with a dielectric constant of 38.00 to 46.00. During elution, successive fractions are monitored by TLC (thin layer liquid chromatography), using the same solvent to unfold the plates and using as a detection method, e.g. application of iodine vapor or heating the plate (120 ° C) sprayed with 50% (v / v) H2SO4 solution in methanol or lighting under a UV lamp. By evaporating the organic solvent from the appropriate fractions of the column effluent, pure components of the mixture are obtained.

Przykłady otrzymywania sposobem według wynalazku 25-hydroksylowanej witaminy D3 (kalcyfediolu).Examples of the preparation of 25-hydroxylated vitamin D3 (calcifediol) by the method of the invention.

Przykład 1Example 1

Synteza kalcyfediolu na drodze biokatalitycznego utleniania cholekalcyferolu z zastosowaniem homogenicznego oczyszczonego białka S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w warunkach anaerobowych w układzie woda/2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na str. 7.Calcifediol synthesis by biocatalytic oxidation of cholecalciferol with the use of homogeneous purified S25DH protein from Sterolibacterium denitrificans bacteria under anaerobic conditions in the water / 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin / 2-methoxyethanol system, the scheme of which is shown on page 7.

Reakcja prowadzona była w warunkach anaerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym z zasilaniem (zamykanej probówce) o objętości 1.5 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)e] jako akceptora elektronowego (reutleniacza).The reaction was carried out under anaerobic conditions in a 1.5 ml stirred tank batch reactor (sealed tube) using K3 [Fe (CN) e] as an electron acceptor (re-oxidant).

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze beztlenowej wprowadzono 0.04 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7.5, 0.08 ml 40% 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak aby uzyskać końcowe stężenie 8%, 0.005 ml 1 M K3[Fe(CN)e], 0.255 ml wody oraz 0.005 ml roztworu substratu (20 g/L w 2-metoksyetanolu) tak aby początkowe stężenie substratu wynosiło 0.25 g/L. Reakcję zainicjowano dodając 0.04 ml wysoko oczyszczonego preparatu enzymatycznego o aktywności S25DH. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 0.4 ml. Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C na wytrząsaniu 800 rpm. Monitorowanie przebiegu reakcji realizowane było przez 7 dni na podstawie analizy HPLC produktu w pobieranych próbkach. Po 24 h reakcji zaobserwowano 87% konwersję substratu i dodano kolejną porcję substratu 0.002 ml substratu (o stężeniu 20 g/L w 2-metoksyetanolu). Po 4 dniach reakcji zaobserwowano 96% konwersję i ponownie dodano 0.002 ml substratu. Po 162 h reakcji uzyskano 99.58% konwersję substratu i stężenie produktu 0.39 g/L, co pozwoliło uzyskać 0.11 mg produktu. Stężeniowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie pokazano na wykresie 1.0.04 ml of 1 M phosphate buffer at pH 7.5, 0.08 ml of 40% 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin dissolved in water in order to obtain a final concentration of 8%, 0.005 ml of 1 M K3 [Fe (CN) were introduced into the mixer reactor placed in an anaerobic atmosphere e], 0.255 ml of water and 0.005 ml of substrate solution (20 g / L in 2-methoxyethanol) so that the initial substrate concentration is 0.25 g / L. The reaction was initiated by adding 0.04 ml of a highly purified enzyme preparation with activity S25DH. The total volume of the reaction mixture was 0.4 ml. The reaction was carried out at 30 ° C with shaking of 800 rpm. The reaction progress was monitored for 7 days on the basis of HPLC analysis of the product in the collected samples. After 24 h of reaction, 87% conversion of substrate was observed and another portion of substrate, 0.002 ml of substrate (at a concentration of 20 g / L in 2-methoxyethanol) was added. 96% conversion was observed after 4 days of reaction and 0.002 ml of starting material was added again. After 162 h of reaction, 99.58% conversion of substrate was achieved and a product concentration of 0.39 g / L was obtained, which allowed for 0.11 mg of product. The concentration profile of the course of the reaction described in the example is shown in Figure 1.

—I----------1-----------1----------1-----------,------T---1-----------1----------1-----------1----------1-----------1----------1----------- I (Μ- *....... -♦><>—I ---------- 1 ----------- 1 ---------- 1 -----------, - ---- T --- 1 ----------- 1 ---------- 1 ----------- 1 ------ ---- 1 ----------- 1 ---------- 1 ----------- I (Μ- * ...... . - ♦> <>

T' C-.-0.8T 'C -.- 0.8

03- .·~ i --0.6 π03-. · ~ And --0.6 π

0,2- ii0.2- ii

1/-0.4 C·1 ii - u - stężenie produktu y -·-całkowita konwersja r1 / -0.4 C · 1 ii - u - product concentration y - · -total conversion r

0- J-0.00- J-0.0

24 48 72 96 120 144163 czas [h]24 48 72 96 120 144163 time [h]

Wykres 1 Stężeniowy profil przebiegu reakcji opisanej w przykładzie 1.Diagram 1 Concentration profile of the reaction described in example 1.

P rzykład 2Example 2

Synteza kalcyfediolu na drodze biokatalitycznego utleniania cholekalcyferolu z zastosowaniem homogenicznego nieoczyszczonego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w warunkach anaerobowych w układzie woda/cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na str. 5.Calcifediol synthesis by biocatalytic oxidation of cholecalciferol using a homogeneous crude enzyme preparation S25DH from Sterolibacterium denitrificans bacteria under anaerobic conditions in the water / cyclodextrin / 2-methoxyethanol system, the scheme of which is shown on page 5.

Reakcja prowadzona była w warunkach anaerobowych w mieszalnikowym reaktorze okresowym (zamykanej probówce) o objętości 1,5 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)e] jako akceptora elektronowego (reutleniacza).The reaction was carried out under anaerobic conditions in a 1.5 ml mixed batch reactor (sealed tube) using K3 [Fe (CN) e] as an electron acceptor (re-oxidant).

PL 235 932 Β1PL 235 932 Β1

Do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze beztlenowej wprowadzono 0.04 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7.5, od 0.01-0.08 ml 40% 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak aby uzyskać końcowe stężenie 1,2,4 lub 8%, 0.005 ml 1 M K3[Fe(CN)e], 0.005 ml roztworu substratu (20 g/L w 2-metoksyetanolu) tak aby początkowe stężenie substratu wynosiło około 0.25 g/L i uzupełniono wodą do objętości 0.32 ml. Reakcję zainicjowano dodając 0.08 ml nieoczyszczonego preparatu enzymatycznego o aktywności S25DH. Zastosowany katalizator otrzymany został na drodze homogenizacji komórek bakteryjnych i solubilizacji frakcji błonowej a następnie oddzieleniu frakcji nierozpuszczalnej. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 0.4 ml. Po 5 dniach reakcji uzyskano 64% konwersję dla układu zawierającego 1% 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny, 90% dla 2% 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny, 97% dla 4% 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny i 99% dla 8% 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny. Stężeniowe profile przebiegu reakcji opisanych w przykładzie pokazano na wykresie 2.0.04 ml of 1 M phosphate buffer at pH 7.5, 0.01-0.08 ml of 40% 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin dissolved in water, was introduced into the stirred-tank reactor in an anaerobic atmosphere to obtain a final concentration of 1,2,4 or 8%, 0.005 ml of 1 M K3 [Fe (CN) e], 0.005 ml of substrate solution (20 g / L in 2-methoxyethanol) so that the initial substrate concentration is about 0.25 g / L, and made up to 0.32 ml with water. The reaction was initiated by adding 0.08 ml of a crude enzyme preparation of activity S25DH. The catalyst used was obtained by homogenizing bacterial cells and solubilizing the membrane fraction and then separating the insoluble fraction. The total volume of the reaction mixture was 0.4 ml. After 5 days of reaction, 64% conversion was achieved for the system containing 1% 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin, 90% for 2% 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin, 97% for 4% 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin and 99% for 8% 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin. The concentration profiles of the reactions described in the example are shown in Figure 2.

Wykres 2. Stężeniowe profile przebiegu reakcji opisanych w przykładzie 2.Diagram 2. Concentration profiles of the course of reactions described in example 2.

P rzykład 3Example 3

Synteza kalcyfediolu na drodze biokatalitycznego utleniania cholekalcyferolu z zastosowaniem homogenicznego nieoczyszczonego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w warunkach anaerobowych w układzie woda/cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na str. 5.Calcifediol synthesis by biocatalytic oxidation of cholecalciferol using a homogeneous crude enzyme preparation S25DH from Sterolibacterium denitrificans bacteria under anaerobic conditions in the water / cyclodextrin / 2-methoxyethanol system, the scheme of which is shown on page 5.

Reakcja prowadzona była w warunkach anaerobowych w szklanym mieszalnikowym reaktorze okresowym 45 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)e] jako akceptora elektronowego (reutleniacza).The reaction was carried out under anaerobic conditions in a 45 ml glass stirred batch reactor using K3 [Fe (CN) e] as an electron acceptor (re-oxidant).

Przeprowadzono dwie reakcje w reaktorach okresowych o całkowitej objętości 30 ml stosując proporcje reagentów opisanych w przykładzie 2, dla dwóch stężeń 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny: 4 i 8% oraz stężenia początkowego substratu 0.18 g/L. Po 72 h procesu uzyskano 65% stopień konwersji dla reaktora o 8% 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny i 81% stopień konwersji dla reaktora zawierającego 4% 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny. Z mieszanin reakcyjnych udało się wyizolować czysty produkt z wydajnością 60%. Czystość produktu potwierdzono metodą ESI-MS oraz H-NMRTwo reactions were performed in 30 ml total volume batch reactors using the proportions of the reagents described in Example 2, for the two concentrations of 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin: 4 and 8%, and the initial substrate concentration of 0.18 g / L. After 72 h of the process, a 65% degree of conversion was achieved for the reactor with 8% 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin and 81% degree of conversion for the reactor containing 4% 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin. It was possible to isolate pure product from the reaction mixtures with a yield of 60%. The purity of the product was confirmed by ESI-MS and H-NMR

Przykład 4Example 4

Synteza kalcyfediolu na drodze biokatalitycznego utleniania cholekalcyferolu z zastosowaniem homogenicznego preparatu enzymatycznego S25DH z bakterii Sterolibacterium denitrificans w warunkach anaerobowych w układzie woda/2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryna/2-metoksyetanol, której schemat pokazano na str. 5.Calcifediol synthesis by biocatalytic oxidation of cholecalciferol using a homogeneous enzyme preparation S25DH from Sterolibacterium denitrificans bacteria under anaerobic conditions in the water / 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin / 2-methoxyethanol system, the scheme of which is shown on page 5.

Reakcje prowadzone były w warunkach anaerobowych w reaktorach okresowych z zasilaniem o objętości 25 ml z zastosowaniem K3[Fe(CN)e] jako akceptora elektronowego (reutleniacza).Reactions were conducted under anaerobic conditions in 25 mL fed batch reactors using K3 [Fe (CN) e] as an electron acceptor (re-oxidant).

Do 10 reaktorów mieszalnikowych umieszczonych w atmosferze beztlenowej wprowadzono X ml 40% 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny rozpuszczonej w wodzie tak aby uzyskać końcowe stężenie 1,2, 4 lub 8%, 0.25 ml 1 M K3[Fe(CN)e], Y ml roztworu substratu (20 g/L w 2-metoksyetanolu) tak aby początkowe stężenie 2-metoksyetanolu wyniosło 1.25%, 2.5% lub 5%, i uzupełniono wodą do objętości 4.5 ml (Tabela 1). Reakcję zainicjowano dodając 15.5 ml preparatu enzymatycznego o aktywnościX ml of 40% 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin dissolved in water were introduced into 10 mixing reactors placed in an anaerobic atmosphere to obtain a final concentration of 1,2, 4 or 8%, 0.25 ml of 1 M K3 [Fe (CN) e], Y ml of substrate solution (20 g / L in 2-methoxyethanol) so that the initial concentration of 2-methoxyethanol is 1.25%, 2.5% or 5%, and made up to 4.5 ml with water (Table 1). The reaction was initiated by adding 15.5 ml of activity enzyme preparation

PL 235 932 Β1PL 235 932 Β1

S25DH w 20 mM buforze Tris/PCM o pH 7.0. Zastosowany katalizator stanowił częściowo oczyszczoną frakcję po kolumnie DEAE-Sepharose zawierającą aktywność S25DH. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 20 ml.S25DH in 20 mM Tris / PCM buffer, pH 7.0. The catalyst used was a partially purified fraction after a DEAE-Sepharose column containing S25DH activity. The total volume of the reaction mixture was 20 ml.

Tabela 1. Kompozycja 10 reaktorów mieszalnikowych w przykładzie 4Table 1. Composition of the 10 stirred tank reactors in example 4

C 2metoksyetanolu [% v/v) C 2 -methoxyethanol [% v / v) C cykiodekstryny: C cyicodextrin: 8% 8% i ΐ - -fi: - . and ΐ - -fi: -. V (mlj V (mlj L>r\ pi ....... . η.ίΒΙΐμ,Η..,,. . f L > r \ pi ........ η.ίΒΙΐμ, Η .. ,,. . f Nr reaktora Reactor No. 1 1 x T. * ł -, I r x T. * ł -, I r 1,25% 1.25% cyklodekstryna [X] cyclodextrin [X] 4 4 K5[Fe(CN)6]K 5 [Fe (CN) 6 ] 0,25 0.25 cholekalcyferol w 2metoksyetanolu [V] cholecalciferol in 2-methoxyethanol [V] 0,25 0.25 r — i J 5 ę·'·- * -r - i J 5 ę · '· - * - Woda Water 0 0 j*,» Λ» i< j *, »Λ» and < Katalizator Catalyst 15,5 15.5 - ę- J- ’ - ę- J- ’ Ccyklodekstryny: C-cyclodextrins: 4% 4% 2% 2% 1% 1% Nr reaktora Reactor No. 2 2 3 3 4 4 V [ml] V [ml] V[ml] V [ml] V [ml] V [ml] V cykiodekstryny [X) V cykiodextrins [X) 2 2 1 1 0,5 0.5 V Kj[Fe(CN)6]V Kj [Fe (CN) 6 ] 0,25 0.25 0,25 0.25 0,25 0.25 V chołecalcyferol w 2metoksyetanolu [Y] V cholecalciferol in 2-methoxyethanol [Y] 0,25 0.25 0,25 0.25 0,25 0.25 V wody V of water 2 2 3 3 3,5 3.5 V katalizatora V catalyst 15,5 15.5 15,5 15.5 15,5 15.5 2,50% 2.50% C cykiodekstryny: C cyicodextrin: 4% 4% 2% 2% 1% 1% Nr reaktora Reactor No. 5 5 6 6 7 7 V [ml] V [ml] V [ml] V [ml] V [ml] V [ml] cyklodekstryna [X| cyclodextrin [X | 2 2 1 1 1 1 K3[Fe(CN)6]K 3 [Fe (CN) 6 ] 0,25 0.25 0,25 0.25 0,25 0.25 cholekalcyferol w 2metoksyetanolu [Y] cholecalciferol in 2-methoxyethanol [Y] 0,5 0.5 0,5 0.5 0,5 0.5 Woda Water 2 2 2,75 2.75 3,25 3.25 Katalizator Catalyst 15,5 15.5 15,5 15.5 15,5 15.5 Lfł Lfł C cykiodekstryny C cyicodextrin 4% 4% 2% 2% 1% 1% Nr reaktora Reactor No. 8 8 9 9 10 10 V [ml] V [ml] V [ml] V [ml] V [ml] V [ml] cyklodekstryna (X] cyclodextrin (X] 2 2 1 1 1 1 K3[Fe(CN)6]K 3 [Fe (CN) 6 ] 0,25 0.25 0,25 0.25 0,25 0.25 cholekalcyferol w 2metoksyetanolu [Y] cholecalciferol in 2-methoxyethanol [Y] 1 1 1 1 1 1 Woda Water 1 1 2,25 2.25 2,75 2.75 Katalizator Catalyst 15,5 15.5 15,5 15.5 15,5 15.5

Reakcję prowadzono przez 7 dni uzupełniając substrat o kolejne, takie same porcje po 24, 48 i 66 h w reaktorach, w których wykazano wysoką konwersję (tj. >90%) Zmiany stężenia w czasie i końcowe stopnie konwersji przedstawiono w Tabeli 2.The reaction was carried out for 7 days supplementing the substrate with the same aliquots after 24, 48 and 66 h in the reactors which showed high conversion (i.e.> 90%). The concentration changes over time and the final conversion rates are shown in Table 2.

PL 235 932 Β1PL 235 932 Β1

Tabela 2 Zmiany stężenia 25-OH D3 w reaktorach zawierających różne stężenie 2-metoksyetanolu i 2-hydroksypropyl-p-cyklodekstrynaTable 2 Changes in 25-OH D3 concentration in reactors containing different concentrations of 2-methoxyethanol and 2-hydroxypropyl-p-cyclodextrin

Nr reaktora Reactor No. 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 C 2-metoksyetanol C 2-methoxyethanol 1,25% 1.25% 1,25% 1.25% 1,25% 1.25% 1,25% 1.25% 2,5% 2.5% 2,5% 2.5% 2,5% 2.5% 5% 5% 5% 5% 5% 5% C cyklodekstryny C cyclodextrin 8% 8% 4% 4% 2% 2% 1% 1% 4% 4% 2% 2% 1% 1% 4% 4% 2% 2% 1% 1% Czas [h] Time [h] C 25-OH-Dj [g/Lj C 25-OH-Dj [g / Lj 0 0 0 0 O ABOUT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 15 0,25 0.25 0,25 0.25 0,25 0.25 0,21 0.21 0,39 0.39 0,37 0.37 0,27 0.27 0,51 0.51 0,36 0.36 0,26 0.26 39 39 0,62 0.62 0,52 0.52 0,59 0.59 0,34 0.34 0,48 0.48 0,47 0.47 0,39 0.39 0,86 0.86 0,56 0.56 0,42 0.42 63 63 0,75 0.75 0,67 0.67 0,55 0.55 0,47 0.47 0,80 0.80 0,76 0.76 0,41 0.41 0,98 0.98 0,69 0.69 0,55 0.55 135 135 0,61 0.61 0,56 0.56 0,53 0.53 0,36 0.36 0,64 0.64 0,64 0.64 0,33 0.33 1,04 1.04 0,70 0.70 0,62 0.62 159 159 0,63 0.63 0,63 0.63 0,58 0.58 0,43 0.43 0,66 0.66 0,65 0.65 0,44 0.44 1,13 1.13 0,77 0.77 0,83 0.83 konwersja conversion 99,0% 99.0% 93,9% 93.9% 87,8% 87.8% 91,5% 91.5% 100,0% 100.0% 96,0% 96.0% 76,7% 76.7% 95,5% 95.5% 97,1% 97.1% 76,8% 76.8%

Średnia konwersja z 10 reaktorów wyniosła 92% co pozwoliło uzyskać 126 mg produktu ze 192 ml mieszaniny reakcyjnej. Izolacja przeprowadzona zgodnie z opisem przykładowym (ekstrakcja ciecz-ciecz) pozwolą wydzielić blisko 100 mg czystego związku o czystości potwierdzonej metodą ESI-MS i H-NMR.Average conversion from 10 reactors was 92% which allowed to obtain 126 mg of product from 192 ml of reaction mixture. Isolation carried out in accordance with the exemplary description (liquid-liquid extraction) will allow the isolation of nearly 100 mg of pure compound with the purity confirmed by ESI-MS and H-NMR.

Claims (9)

Zastrzeżenia patentowePatent claims 1. Sposób biokatalitycznego otrzymywania kalcyfediolu o wzorze II, polegający na regioselektywnej hydroksylacji, znamienny tym, że prowadzi się regioselektywną hydroksylację cholekalcyferolu o wzorze I, preparatem enzymatycznym o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) pochodzącej z bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S, przy czym proces regioselektywnej hydroksylacji cholekalcyferolu o wzorze I prowadzi się w środowisku wodno-organicznym, beztlenowym lub odtlenionym obojętnym gazem, w obecności reutleniacza, którym jest heksacyjanożelazian (III) potasu K3[Fe(CN)e], w temperaturze 15-45°C, w mieszanie reakcyjnej, która zawiera1. The method of biocatalytic preparation of calcifediol of formula II, which is based on regioselective hydroxylation, characterized in that the regioselective hydroxylation of cholecalciferol of formula I is carried out with an enzyme preparation with the activity of steroid C25 dehydrogenase (S25DH) derived from the bacteria Sterolibacterium-denitrificans, with Chol regioselective hydroxylation of cholecalciferol of formula I is carried out in an aqueous-organic, anaerobic or deoxygenated inert gas in the presence of a re-oxidant, which is potassium hexacyanoferrate (III) K3 [Fe (CN) e], at a temperature of 15-45 ° C, under stirring reaction which includes - bufor zapewniający pH w zakresie 6-8, wybrany spośród ortofosforanu potasu lub ortofosforanu sodu lub mieszaniny buforu tris(hydroksymetylo)aminometanowego i ortofosforanowego,- a buffer providing a pH in the range of 6-8, selected from potassium orthophosphate or sodium orthophosphate or a mixture of tris (hydroxymethyl) aminomethane and orthophosphate buffer, - wodny roztwór o stężeniu 4-20% (w/v) solubilizatora, którym jest 2-hydroksypropyl-p-cyklodekstryna,- an aqueous solution with a concentration of 4-20% (w / v) of the solubilizer, which is 2-hydroxypropyl-p-cyclodextrin, - oraz rozpuszczalnik organiczny 2-metoksyetanol w ilości 1-10% (v/v), utrzymując biokatalityczną aktywność preparatu enzymatycznego o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) przez okres do 7 dni, który to proces regioselektywnej hydroksylacji cholekalcyferolu ma następujący przebieg: do reaktora mieszalnikowego umieszczonego w atmosferze beztlenowej wprowadza się bufor, solubilizator rozpuszczony w wodzie, reutleniacz i cholekalcyferol rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym, po czym inicjuje się reakcję dodając preparat enzymatyczny o aktywności dehydrogenazy C25 steroidowej (S25DH) i monitoruje się przebieg reakcji, a po jej zakończeniu wydziela się uzyskany produkt w znany sposób.- and the organic solvent 2-methoxyethanol in an amount of 1-10% (v / v), maintaining the biocatalytic activity of the enzyme preparation with the activity of C25 steroid dehydrogenase (S25DH) for up to 7 days, which process of regioselective hydroxylation of cholecalciferol is as follows: to the reactor in an anaerobic atmosphere, a buffer, a solubilizer dissolved in water, a re-oxidant and cholecalciferol dissolved in an organic solvent are introduced, and the reaction is initiated by adding an enzyme preparation with the activity of C25 steroid dehydrogenase (S25DH) and the course of the reaction is monitored, and after its completion, the the product obtained in a known manner. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecny w preparacie enzymatycznym katalizujący enzym S25DH charakteryzuje się budową heterotrimeryczną αβγ, której sekwencję aminokwasów zdeponowano w GENBANKu pod następującymi numerami referencyjnymi: dla podjednostki β AFF61326.1, podjednostki γ AFF61327.1, warianty podjednostki a: AFF61329.1 lub AFF61325.1, AFF61328.1, AFF61330.1, AFF61337.1.2. The method according to p. The method of claim 1, characterized in that the enzyme catalyzing the S25DH enzyme preparation is characterized by a heterotrimeric structure of αβγ, the amino acid sequence of which has been deposited in GENBANK under the following reference numbers: for the β subunit AFF61326.1, the γ subunit AFF61327.1, variants of the a subunit: AFF61329.1 or AFF61325.1, AFF61328.1, AFF61330.1, AFF61337.1. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecny w preparacie enzymatycznym katalizujący enzym charakteryzuje się sekwencją aminokwasową o identyczności sekwencji aminokwasowej na poziomie przynajmniej 70% w odniesieniu do sekwencji aminokwasów zdeponowanych w GENBANKu pod następującymi numerami referencyjnymi dla podjednostki γ AFF61326.1, podjednostki yAFF61327.1 warianty podjednostki a: AFF61329.1 lub AFF61325.1, AFF61328.1, AFF61330.1 AFF6133.1 i funkcjonalnie katalizuje tę samą reakcję hydroksylacji.3. The method according to p. The method of claim 1, wherein the catalyzing enzyme present in the enzyme preparation has an amino acid sequence with an amino acid sequence identity of at least 70% with respect to the amino acid sequences deposited with GENBANK under the following reference numbers for the γ AFF61326.1 subunit, yAFF61327.1 subunit variants a: AFF61329.1 or AFF61325.1, AFF61328.1, AFF61330.1 AFF6133.1 and functionally catalyzes the same hydroxylation reaction. PL 235 932 Β1PL 235 932 Β1 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że regioselektywną hydroksylację cholekalcyferolu prowadzi się w temperaturze do 30°C.4. The method according to p. The method of claim 1, wherein the regioselective hydroxylation of cholecalciferol is carried out at a temperature of up to 30 ° C. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się w nim mieszaninę reakcyjną, która zawiera bufor fosforanowy, zapewniający pH wynoszące 7.5, wodny roztwór 2-hydroksypropyl-3-cyklodekstryny o stężeniu 4-15% (w/v), a najlepiej 4-8% (w/v), oraz 2-metoksyetanol w ilości 1.25% (v/v).5. The method according to p. The process of claim 1, wherein the reaction mixture comprises a phosphate buffer providing a pH of 7.5, an aqueous solution of 2-hydroxypropyl-3-cyclodextrin at a concentration of 4-15% (w / v), preferably 4-8% (w / v), and 2-methoxyethanol in the amount of 1.25% (v / v). 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się przy stężeniu cholekalcyferolu w środowisku reakcji wynoszącym do 2.8 mM.6. The method according to p. The process of claim 1, wherein the process is carried out at a concentration of cholecalciferol in the reaction medium of up to 2.8 mM. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że początkowe stężenie reutleniacza w postaci K3[Fe(CN)e] w mieszaninie reakcyjnej ustala się w zakresie od 1-100 mM, szczególnie 10-20 mM, a najlepiej 12-15 mM.7. The method according to p. The process of claim 1, wherein the initial concentration of the K3 re-oxidant [Fe (CN) e] in the reaction mixture is set in the range of 1-100 mM, especially 10-20 mM, preferably 12-15 mM. 8. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że w procesie hydroksylacji cholekalcyferolu stosuje się reutleniacz korzystnie w takiej ilości, by stosunek jego stężenia molowego do stężenia molowego cholekalcyferolu wynosił przynajmniej 2:1, przy czym górną granicą stężenia reutleniacza jest jego rozpuszczalność w medium reakcyjnym.8. The method according to p. The process of claim 1, wherein the re-oxidant is preferably used in the hydroxylation of cholecalciferol in an amount such that the ratio of its molar concentration to the molar concentration of cholecalciferol is at least 2: 1, the re-oxidant concentration being an upper limit of its solubility in the reaction medium. 9. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że przebieg reakcji monitoruje się wykorzystując wysokosprawną chromatografię cieczową.9. The method according to p. The process of claim 1, wherein the course of the reaction is monitored using high performance liquid chromatography.
PL415451A 2015-12-22 2015-12-22 Method for obtaining 25-hydroxylated vitamin D3 (calcifediol) PL235932B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL415451A PL235932B1 (en) 2015-12-22 2015-12-22 Method for obtaining 25-hydroxylated vitamin D3 (calcifediol)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL415451A PL235932B1 (en) 2015-12-22 2015-12-22 Method for obtaining 25-hydroxylated vitamin D3 (calcifediol)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL415451A1 PL415451A1 (en) 2017-07-03
PL235932B1 true PL235932B1 (en) 2020-11-16

Family

ID=59201239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL415451A PL235932B1 (en) 2015-12-22 2015-12-22 Method for obtaining 25-hydroxylated vitamin D3 (calcifediol)

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL235932B1 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
PL415451A1 (en) 2017-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2389383T3 (en) Procedure for the preparation of steroid derivatives by reducing ox oxidizing compounds or by oxidizing hydroxysteroid compounds using a hydroxysteroid dehydrogenase
Zhao et al. Mycolicibacterium cell factory for the production of steroid-based drug intermediates
CN102272304B (en) Sterol side chain-cleaving enzyme protein and use thereof
JP2006340718A (en) Method for selective oxidation of cholic acid
Rugor et al. Regioselective hydroxylation of cholecalciferol, cholesterol and other sterol derivatives by steroid C25 dehydrogenase
Ehrhardt et al. Expression of human CYP27A1 in B. megaterium for the efficient hydroxylation of cholesterol, vitamin D3 and 7-dehydrocholesterol
CN104350157B (en) Process for the selective reduction of bile acids, salts or derivatives thereof, in biphasic system
JP2021533823A (en) Genetically modified bacteria and their uses
Tieu et al. Metabolism of 20-hydroxyvitamin D3 and 20, 23-dihydroxyvitamin D3 by rat and human CYP24A1
EP2130907B1 (en) Transformed strain derived from strain deficient in multidrug efflux protein, and bioconversion method using the same
Mao et al. Enhancing the sustainability of KsdD as a biocatalyst for steroid transformation by immobilization on epoxy support
PL235932B1 (en) Method for obtaining 25-hydroxylated vitamin D3 (calcifediol)
GB2131811A (en) Microbial 1,2-dehydrogenation of steroids
Kučka et al. Corticosterone metabolism in chicken tissues: evidence for tissue-specific distribution of steroid dehydrogenases
Bovara et al. A new enzymatic route to the synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid
Cruz et al. Study of key operational parameters for the side-chain cleavage of sitosterol by free mycobacterial cells in bis-(2-ethylhexyl) phthalate
PL226816B1 (en) Method for obtaining obtaining 25-hydroxylated sterol derivatives, including 25-hydroxy-7-dehydrocholesterol
Tibbetts et al. Yeast mitochondrial oxodicarboxylate transporters are important for growth on oleic acid
KR101131071B1 (en) Buffer composition for promoting production of Calcitriol or Calcifediol and method for production of Calcitriol or Calcifediol using the same
Yamaga et al. Characterization of the microsomal steroid-8-ene isomerase of cholesterol biosynthesis.
EP4001424A1 (en) Synthesis of 25-hydroxy-vitamin d3, 25-hydroxy-7-dehydrocholesterol and analogous alcohols using the beta-proteobacterium thauera aromatica
Yao et al. Arsinothricin Biosynthesis Involving a Noncanonical Radical SAM Enzyme for C-As Bond Formation
El Refai et al. Enhancement of-sitosterol bioconversion by Fusarium solani using aqueous-organic solvent system
Tan et al. Biological conversion of 17α-hydroperoxyprogesterone to 11α, 17α-dihydroxyprogesterone
JP3178134B2 (en) Method for producing vitamin D3 derivative