PL235682B1 - Sposób wykrywania i diagnozowania przebiegu cukrzycy - Google Patents

Sposób wykrywania i diagnozowania przebiegu cukrzycy Download PDF

Info

Publication number
PL235682B1
PL235682B1 PL423634A PL42363417A PL235682B1 PL 235682 B1 PL235682 B1 PL 235682B1 PL 423634 A PL423634 A PL 423634A PL 42363417 A PL42363417 A PL 42363417A PL 235682 B1 PL235682 B1 PL 235682B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
diabetes
patients
raman
urine
group
Prior art date
Application number
PL423634A
Other languages
English (en)
Other versions
PL423634A1 (pl
Inventor
Ewa Łucja Stępień
Agnieszka Kamińska
Maciej ROMAN
Maciej Roman
Czesława PALUSZKIEWICZ
Czesława Paluszkiewicz
Original Assignee
Inst Fizyki Jadrowej Im Henryka Niewodniczanskiego Polskiej Akademii Nauk
Univ Jagiellonski
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Fizyki Jadrowej Im Henryka Niewodniczanskiego Polskiej Akademii Nauk, Univ Jagiellonski filed Critical Inst Fizyki Jadrowej Im Henryka Niewodniczanskiego Polskiej Akademii Nauk
Priority to PL423634A priority Critical patent/PL235682B1/pl
Priority to EP18884407.0A priority patent/EP3717902B1/en
Priority to PCT/PL2018/050059 priority patent/WO2019108076A1/en
Priority to US16/767,208 priority patent/US11506609B2/en
Publication of PL423634A1 publication Critical patent/PL423634A1/pl
Publication of PL235682B1 publication Critical patent/PL235682B1/pl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4005—Concentrating samples by transferring a selected component through a membrane
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4005—Concentrating samples by transferring a selected component through a membrane
    • G01N2001/4016—Concentrating samples by transferring a selected component through a membrane being a selective membrane, e.g. dialysis or osmosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/061—Sources
    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób spektroskopowego wykrywania i diagnozowania przebiegu cukrzycy, na podstawie detekcji zmian składu mikropęcherzyków pochodzących z moczu (UEV). Wynalazek powinien znaleźć zastosowanie w praktyce klinicznej, zwłaszcza we wczesnej diagnostyce klinicznej cukrzycy.
Ze względu na znaczący wzrost zachorowań w latach 1980-2014, z 108 mln do 422 mln, cukrzyca stanowi jedno z najpoważniejszych zagrożeń zdrowia człowieka [1]. W 2011 roku cukrzyca została uznana przez Organizację Narodów Zjednoczonych (UN; ang. United Nations) za epidemię o charakterze globalnym. Cukrzyca jest zaliczana do tzw. chorób cywilizacyjnych, czyli chorób szerzących się globalnie i powszechnie występujących, spowodowanych rozwojem cywilizacji. Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), ocenia się, że liczba chorych na cukrzycę (chorobowość) w ciągu ostatnich 30 lat się podwoiła, z 4,7% w roku 1980 na 8,5% w roku 2014, co sprawia, że w Europejskim Regionie WHO, 64 mln ludzi żyje z cukrzycą. Co roku ok. 5% zgonów spowodowanych jest podwyższonym poziomem glukozy, co daje w skali globalnej ok. 3,7 mln zgonów z powodu cukrzycy oraz powikłań z nią związanych [1], Stąd istotną potrzebą jest szybkie wykrywanie cukrzycy u potencjalnych pacjentów, a następnie diagnostyka jej powikłań i postępów. W związku z tym, tworzy się i rozwija liczne techniki diagnostyczne pozwalające na wykrywanie choroby (cukrzycy) i monitorowanie jej przebiegu.
Spektroskopia ramanowska znalazła szerokie zastosowanie w badaniach biologicznych, głównie w badaniach struktury kwasów nukleinowych DNA, RNA, kompleksów białek z kwasami nukleinowymi (rybonukleoproteiny) [2], lipidów i karotenoidów [3,4] i innych związków chemicznych (metabolitów) [5]. W medycynie laboratoryjnej, spektroskopia ramanowska ma coraz więcej zastosowań głównie w monitorowaniu poziomu leków i identyfikacji patogenów [6], jednak coraz częściej jest wykorzystywana do diagnostyki nowotworów, w tym nowotworów jamy ustnej [5], piersi [7,8], żołądka [9], skóry [10], diagnostyki osteoporozy [11], cukrzycy [12,13], miażdżycy [4,14], także do diagnostyki funkcji nerek [15,16]. Innym zastosowaniem spektroskopii ramanowskiej są badania w medycynie sądowej do identyfikowania śladów krwi i innych śladów biologicznych [17,18,19]. Nowym i unikalnym zastosowaniem spektroskopii ramanowskiej może być analiza sygnatur molekularnych mikropęcherzyków zewnątrzkomórkowych, co zostało wykonane na próbkach z hodowli nowotworowych linii komórkowych i próbkach osocza od pacjentów [20].
Mikropęcherzyki lub inaczej pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (ang. extracellular vesicles - EVs) to drobne, kuliste struktury błonowe o średnicy 20-1000 nm, uwalniane do przestrzeni międzykomórkowej [21],Termin odnosi się zarówno do mikropęcherzyków pączkujących bezpośrednio z błony komórkowej w trakcie cyklu życiowego komórki - ektosomy (ang. microvesicles) lub podczas programowanej śmierci komórki - pęcherzyki apoptotyczne (ang. apoptotic blebs), jak również do pęcherzyków pochodzenia wewnątrzkomórkowego - egzosomów (ang. exosomes) uwalnianych z ciałek wielopęcherzykowych (ang. multivesicular bodies) [22], Pomimo odmiennej charakterystyki pod względem rozmiarów (egzosomy: 30-100 nm, ektosomy: 100-1000 nm, pęcherzyki apoptotyczne: 500-1000 nm), mikropęcherzyki wykazują wiele cech wspólnych, jak: dwuwarstwowa błona lipidowa oraz białka i kwasy nukleinowe znajdujące się wewnątrz tych struktur [21,23,24], Zawartość (ang. cargo) transportowana przez mikropęcherzyki, która odzwierciedla status komórki wydzielającej, jest przekazywana do komórki docelowej - bierze czynny udział w sygnalizacji międzykomórkowej [25]. EVs mogą być pozyskiwane ze wszystkich płynów ustrojowych (np. krew, mocz, ślina, płyn mózgowo rdzeniowy) i ich analiza może zastąpić w przyszłości inwazyjną i kosztowną biopsję tradycyjną. W przypadku chorób układu moczowo-płciowego diagnostyka może być przeprowadzona również na podstawie analizy materiału z mikropęcherzyków pochodzących z moczu - UEVs (ang. urine extracellular microvesicles) [26,27,28].
W publikacji naukowej Krafffa (2016) [20] zastosowano pęcherzyki zewnątrzkomórkowe jako biomarkery diagnostyczne do rozróżniania pacjentów z nowotworem. Do analizy porównawczej EV od pacjentów z nowotworem z EV od pacjentów zdrowych zastosowano między innymi spektroskopię ramanowską. Do tego celu wyizolowano poprzez wirowanie różnicowe z surowicy i osocza krwi dwie różne frakcje EV wzbogacone egzosomami oraz ektosomami. Zaobserwowaną zmianę profilu odzwierciedlającego strukturę białek (alpha-helix-rich, beta-sheet-rich) zastosowano do detekcji raka prostaty.
PL 235 682 Β1
Z kolei w publikacji naukowej Brindha (2017) [5] ujawniono zastosowanie spektroskopii ramanowskiej (dla wysokich liczb falowych, HWVN) do charakteryzacji próbek moczu pacjentów zdrowych, przed nowotworowych oraz nowotworowych. Zauważono, że zawarte w moczu flawoproteiny, metabolity, tryptofan orazfenyloalanina związane są z obserwowanymi różnicami widm Ramana pomiędzy grupami zdrowymi i nowotworowymi. Należy zauważyć, że w przedstawionym rozwiązaniu analizie poddawano widma w zakresie wysokich liczb falowych (2600-3500 cm-1).
Z publikacji naukowej Saatkamp (2016) [16] znane jest zastosowanie spektroskopii Ramana do szacowania stężenia mocznika i kreatyniny w moczu, które można dalej wykorzystać do diagnozowania choroby nerek.
W publikacji naukowej Kamińska 2016 [28] przedstawiono badania wskazujące zależność pomiędzy gęstością EV, ich rozkładem wielkości oraz przebiegiem wczesnego uszkodzenia nerek u pacjentów z cukrzycą typu 2. W badaniu uwzględniono pacjentów z cukrzycą kontrolowaną oraz niekontrolowaną (dodatkowo z niewydolnością nerek oraz bez niewydolności nerek). Średnicę i liczbę EV oceniono metodą Tunable Resistive Pulse Sensing. Gęstość EV oceniono transmisyjnym mikroskopem elektronowym. Wykazano, że mocz jest bogaty w EV. Ponadto EV wykorzystano do rozróżnienia pacjentów z cukrzycą kontrolowaną oraz niekontrolowaną, przy czym rozróżnienie oparto o liczbę i rozkład wielkości EV, co pozwoliło również na odzwierciedlenie pogorszenia czynności nerek, sugerując, że EV można zastosować jako biomarkery uszkodzenia nerek.
Wobec opisanego powyżej stanu techniki nadal istnieje zapotrzebowanie na dostarczenie sposobu pozwalającego na wczesne bezinwazyjne diagnozowanie występowania cukrzycy oraz kontrolę jej przebiegu.
Nieoczekiwanie sposób taki został uzyskany w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania i diagnozowania przebiegu cukrzycy charakteryzujący się tym, że bada się zmianę składu w mikropęcherzykach obecnych w moczu (UEV) pobranym od pacjenta, a zmiana ta świadczy o obecności cukrzycy i jej przebiegu, przy czym:
a) z próbki moczu izoluje się mikropęcherzyki UEV,
b) rejestruje się widma Ramana i dokonuje analizy rozkładu intensywności pasm charakterystycznych, przy czym pasma charakterystyczne w widmie Ramana są położone w zakresach od 980 cm-1 do 1020 cm-1, od 1110 cm-1 do 1140 cm-1, od 1420 do 1470 cm-1, od 1565 cm-1 do 1710 cm-1,
c) w przypadku stwierdzenia spadku wartości współczynnika Rl dla intensywności widma Ramana w porównaniu z Rl dla widma Ramana uzyskanego w analogiczny sposób dla próbki pobranej od osoby zdrowej uznaje się, że pacjent cierpi na cukrzycę, gdzie wartość współczynnika Rl oblicza się na podstawie wzoru:
n, lAmidl „ _ , I Lipidy ki — —-------------- X U. -f- —-------------' Fenyloalanina 1 Fenyloalanina przy czym uznaje się, iż wartość współczynnika Rl:
- dla grupy pacjentów zdrowych wynosi powyżej 1000, korzystnie od 1144 do 1164,
- dla grupy pacjentów chorych wynosi poniżej 600,
- dla grupy pacjentów z cukrzycą kontrolowaną wynosi od 550 do 600, natomiast
- dla grupy pacjentów z cukrzycą niekontrolowaną wynosi od 390 do 410.
Korzystnie, w etapie a) próbkę moczu poddaje się wirowaniu, korzystnie przy 2000 x g przez około 30 minut.
Korzystnie, w etapie a) próbkę moczu poddaje się zagęszczaniu przy użyciu membrany dializacyjnej o dużej średnicy porów, korzystnie przepuszczalnej dla cząsteczek o średniej masie cząsteczkowej nie większej niż 1000 kDa (MWCO), a następnie przemywaniu.
Korzystnie, do przepłukiwania stosuje się roztwór zawierający chlorek srebra i dichloroizocyjanuran sodu, korzystnie w ilości 1 mg chlorku srebra i 4,5 mg dichloroizocyjanuranu sodu na litr próbki moczu.
Nieoczekiwanie, w pracach które doprowadziły do niniejszego wynalazku ustalono, że zmiana intensywności pasm w widmie Ramana, będąca efektem różnic w składzie molekularnym UEV, w stosunku do UEV od osób zdrowych, potwierdza obecność choroby oraz pozwala rozróżnić schorzenia na cukrzycę kontrolowaną i cukrzycę niekontrolowaną.
PL 235 682 B1
Sposób według wynalazku pozwala na uzyskanie rozróżnienia pacjentów z cukrzycą od grupy kontrolnej, ale również różnicowania chorych z cukrzycą kontrolowaną od chorych z cukrzycą niekontrolowaną, poprzez analizę spektroskopią ramanowską mikropęcherzyków zawartych w moczu (UEV).
Rysunek Fig. 1 przedstawia mikrofotografię mikropęcherzyków z osadu moczu (UEV) pozyskanych metodą wirowania od osoby zdrowej (C) i osoby z nieuregulowana cukrzycą typu 2 (UD), Fig. 2. widma Ramana spulowanych próbek pochodzących od pacjentów z kontrolowaną cukrzycą typu 2 (CD), pacjentów z niekontrolowaną cukrzycą (UD), i dwóch próbek od zdrowej kontroli (C), Fig. 3. analizę składowych głównych (PCA) widm Ramana uzyskanych od chorych z CD (), UD (a) i od kontroli C(·) - wykresy w jednostkach niemianowanych i przedstawiają udział komponenty, w tym przypadku zmiennej (intensywność pasma [j.a.]) w modelu macierzy kowariancji.
P r z y k ł a d 1 Diagnozowanie obecności cukrzycy oraz cukrzycy kontrolowanej i cukrzycy niekontrolowanej.
Opis grupy badanej.
Grupę badaną stanowili chorzy z cukrzycą typu 2 (n=45). Chorych podzielono na 2 grupy ze względu na stopień uregulowania cukrzycy na podstawie poziomu hemoglobiny glikowanej (HbA1C) zgodnie z wytycznymi Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego z 2016 r [29]: z uregulowaną cukrzycą (CD) (n=19), dla HbA1C > 7% jako chorzy z nieuregulowaną cukrzycą (UD) (n=26). Grupę chorych porównano z grupą kontrolną (n=6). Tabela 1 pokazuje charakterystykę badanej grupy.
Ponadto sporządzono wywiad lekarski, który obejmował informacje dotyczące danych demograficznych, ciśnienia tętniczego krwi, wielkości BMI (body mass index), zwyczajów żywieniowych oraz nałogów (palenia tytoniu, spożywania alkoholu), a także rodzaju stosowanego leczenia przeciwcukrzycowego oraz leków (diuretyki: oszczędzające potas, pętlowe, tiazydowe i tiazydopodobne, β-blokery, ACEI, antagoniści Ca, inhibitory Na/K ATP-azy, rozszerzające naczynia, klopidogrel, kwas acetylosalicylowy, statyny), informacji na temat przebytych operacji i zabiegów m.in. pomostowanie aortalno - wieńcowe (CABG; ang. coronary artery bypass graft) oraz przezskórna interwencja wieńcowa (PCI; ang. percutaneous coronary intervention), obecności schorzeń towarzyszących i nowotworów. Z badania wyłączeni zostali pacjenci, u których w trakcie badania lub wywiadu stwierdzono:
- obecność lub podejrzenie świeżej infekcji bakteryjnej lub wirusowej,
- choroby nowotworowe,
- przebyte incydenty sercowo-naczyniowe lub operacja kardiochirurgiczna w okresie 6 miesięcy poprzedzających wywiad,
- cechy uszkodzenia wątroby,
- sterydowa i niesterydowa terapia przeciwzapalna,
- chirurgiczne leczenie otyłości,
- stosowanie hormonalnej terapii zastępczej w przypadku kobiet,
- choroby autoimmunologiczne (tj. przewlekłe zapalenie stawów, zespół antyfosfolipidowy).
Zagęszczanie i izolacja mikropęcherzyków UEVs z próbek moczu.
Poranny mocz w ilości ok. 250 ml pobrano od pacjentów i zdrowych ochotników. Wstępnie mocz poddano wirowaniu przy wartości 2000 g przez około 30 min, aby usunąć komórki nabłonka, bakterie i osad. Następnie mocz zagęszczono metodą filtracji hydrostatycznej/dializy - HFD (ang. hydrostatic filtration dialysis), która opiera się o filtrację moczu przy użyciu membrany dializacyjnej o dużej średnicy porów przepuszczanej dla cząsteczek o średniej masie cząsteczkowej nie większej niż 1000 kDa (MWCO). Po zredukowaniu objętości próbkę przemywa się wodą dejonizowaną i próbka ponownie redukowana jest do objętości kilku mililitrów. W innym wariancie można zastosować roztwór zawierający chlorek srebra i dichloroizocyjanuran sodu w ilości odpowiednio 1 mg i 4,5 mg, na każdy litr próbki moczu, w celu chemicznej inaktywacji pozostałych bakterii.
Ocena obecności UEVs w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM).
Próbki osadu wirowano w probówce typu Eppendorf i utrwalano w 2,5% aldehydzie glutarowym (nr kat. G5882, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) w 0,1 M buforze kakodylowym (nr kat. C4945, Aldrich, St. Louis, USA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie w 1% roztworze czterotlenku osmu (OsO4) przez 1 godzinę. Próbki były odwadniane w etanolu i zatapiane w PolyBed 812 w 68°C. Skrawki do analizy umieszczono na siatce (300 mesh grids). Następnie skrawki zostały skontrastowane octanem uranylu i cytrynianu ołowiu. Do obserwacji wykorzystano mikroskop elektronowy JEOL JEM 2100HT (JEOL Ltd., Tokio, Japonia) z napięciem przyspieszającym 80 kV. Etap ten obrazuje Fig. 1.
PL 235 682 Β1
Rejestracja widm Ramana i analiza pasm charakterystycznych.
Widma Ramana rejestrowano za pomocą spektrometru ramanowskiego lnVia Raman wyposażonego w optyczny mikroskop konfokalny z obiektywem suchym Leica N PLAN EPI (100x, NA 0.85). Laser emitujący światło o długości fali 532 nm był chłodzony powietrzem, moc lasera w pozycji próbki wynosiła ok. 15 mW. Detektor CCD był ochłodzony termoelektrycznie do -70°C. Kropla zawiesiny UEV była nanoszona na okienko CaF2 i pozostawiana do odparowania wody. Każdą wysuszoną próbkę mierzono w co najmniej 15 losowo wybranych miejscach. Ostatecznie 100 skanów z czasem naświetlania 20 s i rozdzielczością ok. 1,5 cm-1 było zbieranych z każdego miejsca. Spektrometr był kalibrowany na podstawie położenia pasma Ramana płytki krzemu znajdującej się wewnątrz urządzenia. Analizę składowych głównych (PCA) przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Unscrambler X 10.3 (Oprogramowanie CAM O AS, Norwegia). Przed analizą PCA, widma Ramana były korygowane poprzez odjęcie linii bazowej (baseline), wygładzone i znormalizowane. Zarejestrowane widma Ramana zostały przedstawione na Fig. 2. W tabeli 2 zostały przedstawione intensywności pasm charakterystycznych, które mają istotny wkład w różnicowanie poszczególnych grup próbek, co wywnioskowano na podstawie przeprowadzonej analizy PCA. Fig. 3. przedstawia analizę składowych głównych widm Ramana zarejestrowanych na próbkach uzyskanych od pacjentów. Jest na niej wyraźnie widoczne gromadzenie się poszczególnych punktów w klastry obejmujące poszczególne grupy badanych.
Tabela 1
Charakterystyka badanych grup pod względem parametrów biochemicznych i epidemiologicznych.
Parametr Kontrola (C) n=6 Kontrolowana cukrzyca (CD) n=19 Niekontrolowana cukrzyca (UD) n=26 p-value
płeć (M/K) 6 13/6 18/8 -
Wiek [lata] 51 (7) 62 (16) 61 (13) 0,099
HbA1C [%] — 44 (42 - 48) 68 (62 - 73) <0,0001
Glukoza w surowicy (mmol/L) 5 (5-6) 7 (6-8) 9 (7-11) <0.0001
Albumina w moczu [mg/L] 6 (4-13) 6 (1-10) 30 (12-244) 0,0002
Kreatynina w moczu [mM] 12 (9-16) 5 (4-10) cn I σ> co 0,008
Kreatynina w surowicy [μΜ] 69 (60 - 85) 73 (62 - 87) 77 (61 -104) 0,546
GFR [mL/min/1.73m2] 84 (76-100) 89 (68-103) 86 (64-100) 0,921
PL 235 682 Β1
Tabela 2
Wykaz charakterystycznych pasm, dla których zaobserwowano istotne statystycznie różnice w widmach Ramana.
Pozycja pasma Średnia intensywność pasma [j.a]# P
C CD UD
1565 - 1710 cm'1 Amid I 0,303 (0,016) 0,223 (0,055)* 0,247 (0,024)* 4.38E-7
1420-1470 cm'1 Lipidy 0,115(0,006) 0,111 (0,007) 0,138 (0,019)* 3,82E-5
1110-1140 cnT1 Białka 0,014 (0,001) 0,015 (0,003) 0,017(0,003)* 0,024
980- 1020 cm'1 Fenyloalanina 0,023 (0,005) 0,034 (0,006)* 0,053 (0,007)* 2.97E-9
#Wartości średnie intensywność pasma zostały znormalizowane i są wyrażone w jednostkach arbitralnych [j.a.] ‘Wartości intensywności różniące się istotnie statystycznie w porównaniu do kontroli, dla poziomu istotności a=0.05; grupy porównano między sobą testem nieparametrycznym Kruskala-Wallisa, dodatkowo dla porównania dwóch grup zastosowano test U MannaWhitney’a,
Wyznaczenie współczynnika Rl - Ratio Intensity, różnicującego grupy chorych z kontrolowaną cukrzycą (CD) i niekontrolowaną cukrzycą (UD) od kontroli (C).
Dla wyznaczenia wartości współczynnika Rl, który w sposób arbitralny różnicuje grupy CD, UD od grupy kontrolnej C, posłużono się równaniem:
Rl lĄmid 1
F enyloalanina
I Lipidy
I Feny la alanina (1) gdzie:
lAmidi - oznacza wartość intensywności pasma dla Amidu I (1565-1710 cm1)
Ipenyioaianina - oznacza wartość intensywności pasma dla fenyloalaniny (980-1020 cm-1)
Iupidy - oznacza wartość intensywności pasma dla lipidów (1420-1470 cm-1) a- współczynnik wagi, wyznaczony jako iloraz istotności statystycznej (p) dla różnicy między intensywnościami pasm Iatmi i lupidy pomiędzy grupami chorych i zdrowych; w tym przypadku a = 87,2 _ pAmid I
P Lipidy a= 87,2
Wartość prawdopodobieństwa (p) została obliczona w programie OriginPro 2017 (zgodnie z algorytmem dla testu Kruskala-Wallisa).
Statystyka testowa Kruskala-Wallisa w programie OriginPro 2017 jest obliczana zgodnie z równaniem:
Λ R]
H - test statystyczny Kruskala-Wallisa
N - liczba wszystkich obserwacji
K - liczba porównywanych grup
PL 235 682 B1 nj - liczba obserwacji w danej grupie
Rj - suma rang w danej grupie
Na podstawie wzoru wyznaczono IR dla grup C, CD i UD:
RIc =1154 ±10,5 RIcd = 575 ± 24,7 RIud = 409 ± 9,9
Wartości podano w wyznaczonym doświadczalnie błędem względnym.
Na tej podstawie wyznaczono wartość progową dla cukrzycy:
Rl < 600
Literatura
World Health Organization. Global report on diabetes. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data, Geneva 2016. ISBN 978 92 4 156525 7.
Thomas GJ, Agard DA. Quantitative analysis of nucleic acids, proteins, and viruses by Raman band deconvolution. Biophys J. 1984; 46:763-768.
Bonetti A, Bonifacio A, Della Mora A, Livi U, Marchini M, Ortolani F. Carotenoids co-localize with hydroxyapatite, cholesterol, and other lipids in calcified stenotic aortic valves. Ex vivo Raman maps compared to histological patterns. Eur J Histochem. 2015;59(2):2505.
Kochan K, Marzec KM, Chruszcz-Lipska K, Jasztal A, Maślak E, Musiolik H, Chłopicki S, Barańska M. Pathological changes in the biochemical profile of the liver in atherosclerosis and diabetes assessed by Raman spectroscopy. Analyst. 2013 ;138(14):3885-90
Brindha E, Rajasekaran R, Aruna P, Koteeswaran D, Ganesan S. High wavenumber Raman spectroscopy in the characterization of urinary metabolites of normal subjects, oral premalignant and malignant patients. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 2017;171:52-59.
Neugebauer U, Rosch P, Popp J. Raman spectroscopy towards clinical application: drug monitoring and pathogen identification. Int J Antimicrob Agents. 2015;46 Suppl 1:S35-9
Haka AS, Shafer-Peltier KE, Fitzmaurice M, Crowe J, Dasari RR, Feld MS. Diagnosis breast cancer by using Raman Spectroscopy. Adv Drug Deliv Rev. 2015; 89: 121-134.
Abramczyk H, Brozek-Pluska B. New look inside human breast ducts with Raman imaging. Raman candidates as diagnostic markers for breast cancer prognosis: Mammaglobin, palmitic acid and sphingomyelin. Anal Chim Acta. 2016;909:91-100.
Yao H, Tao Z, Ai M, et al. Raman spectroscopic analysis of apoptosis of single human gastric cancer cells. Vibrat Spec. 2009; 50: 193-197
Zeng H, Lui H, McLean Dl. Skin cancer detection using in vivo Raman spectroscopy, SPIE Newsroom. 2011; DOI: 10.1117/2.1201104.003705
Lloyd WR, Agarwal S, Nigwekar SU, Esmonde-White K, Loder S, Fagan S, Goverman J, Olsen BR, Jumlongras D, Morris MD, Levi B. Raman spectroscopy for label-free identification of calciphylaxis. J Biomed Opt. 2015;20(8):80501.
Dingari NC, Horowitz GL, Kang JW, Dasari RR, Barman I. Raman spectroscopy provides a powerful diagnostic tool for accurate determination of albumin glycation. PLoS One. 2012;7(2):e32406.
Barman I, Dingari NC, Kang JW, Horowitz GL, Dasari RR, Feld MS. Raman spectroscopy-based sensitive and specific detection of glycated hemoglobin. Anal Chem. 2012;84(5):2474-82.
Alderico R, Sokki S. Raman spectroscopy for diagnosis of atherosclerosis: a rapid analysis using neural networks. Med Eng Phys. 2005; 27: 237-244.
Hong TD, Phat D, Plaza P, Daudon M, Dao NQ. Identification of urinary calculi by Raman laser fiber optics spectroscopy. Clin Chem. 1992 Feb;38(2):292-8.
Saatkamp CJ, de Almeida ML, Bispo JA, Pinheiro AL, Fernandes AB, Silveira L Jr. Quantifying creatinine and urea in human urine through Raman spectroscopy aiming at diagnosis of kidney disease. J Biomed Opt. 2016 Mar;21 (3):37001.
Muro CK, Lednev IK. Identification of individual red blood cells by Raman microspectroscopy for forensic purposes: in search of a limit of detection. Anal Bioanal Chem. 2017;409(1):287-293.
Sikirzhytskaya A, Sikirzhytski V, Lednev IK. Raman spectroscopic signature of vaginal fluid and its potential application in forensic body fluid identification. Forensic Sci Int. 2012;216(1- 3):44-8.
PL 235 682 Β1
Virkler K, Lednev IK. Raman spectroscopic signature of semen and its potential application to forensic body fluid Identification. Forensic Sci Int. 2009; 193(1-3):56-62.
Krafft C, Wilhelm K, Eremin A, Nestel S, von Bubnoff N, Schultze-Seemann W, Popp J, Nazarenko I. A specific spectral signature of serum and plasma-derived extracellular vesicles for cancer screening. Nanomedicine. 2017;13(3): 835-841doi: 10.1016/j.nano.2016.11.016.
Thery C, Ostrowski M i Segura E. Membranę vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 2009;9:581-93.
Colombo M, Raposo G i Thery C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles., Annu Rev Celi Dev Biol; 2014; 30:255-89.
van der Pol E.Boing AN, Harrison P, Sturk A, Nieuwland R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacol Rev. 2012; 64(3); 676-705.
van der Pol E, Boing AN, Gool EL, Nieuwland R. Recent developments in the nomenclature, presence, isolation, detection and clinical impact of extracellular vesicles, i inni. 1,2016, J Thromb Haemost. 2016; 14(1): strony 48-56.
Lee J-K, Jang J-Y, Jeon Y-K, Kin C-W. Extracellular Vesicles as an Emerging Paradigm of Cell-to-Cell Communication in Stern Celi Biology. Journal of Stern Celi Research & Therapy. 2014;4:206. doi: 10.4172/2157-7633.1000206
Koppers-Lalic D, Hackenberg M, de Menezes R,et al. 26 Non-invasive prostatę cancer detection by measuring miRNA variants (isomiRs) in urine extracellular vesicles. Oncotarget. 2016;7(16):22566-78.
Delić D Eisele C, Schmid R, Baum P et al. Urinary Exosomal miRNA Signature in Type II Diabetic Nephropathy Patients. 3,2016, PLoS One. 2016;11(3):e0150154.
Kamińska A, Platt M, Kuśnierz-Cabala B et al. Urinary Extracellular Vesicles: Potential Biomarkers of Renal Function in Diabetic Patients. J Diabet Res. 2016; 5741518, 12 pp, doi.org/10.1155/2016/5741518
Polskie Towarzystwo Diabetologiczne: Zalecenia kliniczne dotyczące postępowania u chorych na cukrzycę. Diab Klin. 2016; 5 (Supl. A): A1-A76.

Claims (4)

Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób wykrywania i diagnozowania przebiegu cukrzycy, znamienny tym, że bada się zmianę składu w mikropęcherzykach obecnych w moczu (UEV) pobranym od pacjenta, a zmiana ta świadczy o obecności cukrzycy i jej przebiegu, przy czym:
a) z próbki moczu izoluje się mikropęcherzyki UEV,
b) rejestruje się widma Ramana i dokonuje analizy rozkładu intensywności pasm charakterystycznych, przy czym pasma charakterystyczne w widmie Ramana są położone w zakresach od 980 cm-1 do 1020 cm-1, od 1110 cm-1 do 1140 cm-1, od 1420 do 1470 cm-1, od 1565 cm-1 do 1710 cm-1,
c) w przypadku stwierdzenia spadku wartości współczynnika Rl dla intensywności widma Ramana w porównaniu z Rl dla widma Ramana uzyskanego w analogiczny sposób dla próbki pobranej od osoby zdrowej uznaje się, że pacjent cierpi na cukrzycę, gdzie wartość współczynnika Rl oblicza się na podstawie wzoru:
Rl = 'Amid! χ a + hliMy
I Fenyloalanina I Fenyloalanina przy czym uznaje się, iż wartości współczynnika Rl:
- dla grupy pacjentów zdrowych wynosi powyżej 1000, korzystnie od 1144 do 1164,
- dla grupy pacjentów chorych wynosi poniżej 600,
- dla grupy pacjentów z cukrzycą kontrolowaną wynosi od 550 do 600, natomiast
- dla grupy pacjentów z cukrzycą niekontrolowaną wynosi od 390 do 410.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) próbkę moczu poddaje się wirowaniu, korzystnie przy 2000 x g przez około 30 minut.
PL 235 682 B1
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) próbkę moczu poddaje się zagęszczaniu przy użyciu membrany dializacyjnej o dużej średnicy porów, korzystnie przepuszczalnej dla cząsteczek o średniej masie cząsteczkowej nie większej niż 1000 kDa (MWCO), a następnie przemywaniu.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do przepłukiwania stosuje się roztwór zawierający chlorek srebra i dichloroizocyjanuran sodu, korzystnie w ilości 1 mg chlorku srebra i 4,5 mg dichloroizocyjanuranu sodu na litr próbki moczu.
PL423634A 2017-11-29 2017-11-29 Sposób wykrywania i diagnozowania przebiegu cukrzycy PL235682B1 (pl)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL423634A PL235682B1 (pl) 2017-11-29 2017-11-29 Sposób wykrywania i diagnozowania przebiegu cukrzycy
EP18884407.0A EP3717902B1 (en) 2017-11-29 2018-11-29 A method of detecting and diagnosing the progression of diabetes
PCT/PL2018/050059 WO2019108076A1 (en) 2017-11-29 2018-11-29 A method of detecting and diagnosing the progression of diabetes
US16/767,208 US11506609B2 (en) 2017-11-29 2018-11-29 Method of detecting and diagnosing the progression of diabetes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL423634A PL235682B1 (pl) 2017-11-29 2017-11-29 Sposób wykrywania i diagnozowania przebiegu cukrzycy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL423634A1 PL423634A1 (pl) 2019-06-03
PL235682B1 true PL235682B1 (pl) 2020-10-05

Family

ID=66649295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL423634A PL235682B1 (pl) 2017-11-29 2017-11-29 Sposób wykrywania i diagnozowania przebiegu cukrzycy

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11506609B2 (pl)
EP (1) EP3717902B1 (pl)
PL (1) PL235682B1 (pl)
WO (1) WO2019108076A1 (pl)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024008522A1 (en) * 2022-07-05 2024-01-11 Trinamix Gmbh Generating a spectrum of a sample

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160222456A1 (en) 2012-10-05 2016-08-04 Hitachi Chemical Company Ltd. URINE EXOSOME mRNAs AND METHODS OF USING SAME TO DETECT DIABETIC NEPHROPATHY
WO2016089732A2 (en) * 2014-12-01 2016-06-09 University Of South Florida Methods and compositions for diagnosis and management of diabetes and metabolic syndrome

Also Published As

Publication number Publication date
EP3717902B1 (en) 2025-02-26
EP3717902A4 (en) 2021-09-15
WO2019108076A1 (en) 2019-06-06
PL423634A1 (pl) 2019-06-03
US20210010939A1 (en) 2021-01-14
US11506609B2 (en) 2022-11-22
EP3717902A1 (en) 2020-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gurjar et al. Imaging human epithelial properties with polarized light-scattering spectroscopy
Chandra et al. Unveiling the molecular secrets: a comprehensive review of Raman spectroscopy in biological research
Li et al. Monitoring the changes of pH in lysosomes during autophagy and apoptosis by plasmon enhanced Raman imaging
Zhang et al. Noninvasive diagnostic devices for diabetes through measuring tear glucose
McKeating et al. Biosensors and nanobiosensors for therapeutic drug and response monitoring
Vargas-Obieta et al. Breast cancer detection based on serum sample surface enhanced Raman spectroscopy
US12390112B2 (en) Atherosclerotic plaque detection
Wang et al. Rapid diagnosis and intraoperative margin assessment of human lung cancer with fluorescence lifetime imaging microscopy
Gregório et al. Analysis of human bodily fluids on superabsorbent pads by ATR-FTIR
Zheng et al. The use of Au@ SiO2 shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy for human breast cancer detection
EP1495309A1 (en) Systems and methods for spectroscopy of biological tissue
Farajdokht et al. Inhibition of PTEN protects PC12 cells against oxygen-glucose deprivation induced cell death through mitoprotection
Lambert et al. Raman spectroscopy: the gateway into tomorrow's virology
Kanter et al. Effect of hormonal variation on Raman spectra for cervical disease detection
Pietrucha et al. Comparison of Selected Parameters of Redox Homeostasis in Patients with Ataxia‐Telangiectasia and Nijmegen Breakage Syndrome
Kawase et al. Association between serum uric acid level and activity of daily living in Japanese patients with ischemic stroke
Osiac et al. Optical coherence tomography investigation of ischemic stroke inside a rodent model
Wang et al. Recent advances in spontaneous Raman spectroscopic imaging: instrumentation and applications
Lee et al. Label‐free atherosclerosis diagnosis through a blood drop of apolipoprotein E knockout mouse model using surface‐enhanced Raman spectroscopy validated by machine learning algorithm
PL235682B1 (pl) Sposób wykrywania i diagnozowania przebiegu cukrzycy
Berus et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy analysis of menstrual cycle: from biochemical changes to diagnostics of vaginal infections
Lieber et al. Characterization of pediatric Wilms' tumor using Raman and fluorescence spectroscopies
JP2011196840A (ja) 急性大動脈解離の検査方法
NO179344B (no) Fremgangsmåte for undersökelse av en blodpröve og måling av polarisert fluorescensutstråling
Yang et al. Influence of drugs on the prospective diagnostic method for coronary heart disease with urine