PL235562B1

PL235562B1 - Method for removing petroleum contaminations from soil by way of biodegradation, using humic acids and yeast hydrolyzate

Info

Publication number: PL235562B1
Application number: PL424320A
Authority: PL
Inventors: Roman Marecik; Paweł Cyplik; Agnieszka Piotrowska-Cyplik; Łukasz Chrzanowski; Łukasz Wolko; Róża Biegańska-Marecik
Original assignee: Univ Przyrodniczy W Poznaniu
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2020-09-07
Also published as: PL424320A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób usuwania z gleby zanieczyszczeń ropopochodnych metodą biologiczną.The subject of the invention is a biological method of removing petroleum pollutants from soil.

Z polskiego patentu nr 209361 znany jest sposób fitoremediacji gleb z produktów ropopochodnych metodą „in situ” wspomaganej biopreparatem bakteryjnym. Jako preparat bakteryjny stosuje się autochtoniczne bakterie pobrane z próbek gruntu przeznaczonego do oczyszczania. Z próbek izoluje się bakterie dominujące, o największej zdolności do rozkładu węglowodorów, namnaża się je na podłożu i wprowadza do gruntu przeznaczonego do oczyszczania przez zraszanie. Po wprowadzeniu grunt obsiewa się rekultywowany teren roślinami.The Polish patent no. 209361 describes a method of phytoremediation of soils from petroleum products using the "in situ" method supported by bacterial biopreparation. As a bacterial preparation, autochthonous bacteria collected from soil samples intended for cleaning are used. Dominant bacteria with the greatest capacity to decompose hydrocarbons are isolated from the samples, multiplied on the substrate and introduced into the soil to be treated by sprinkling. After introducing the land, the reclaimed area is sown with plants.

Z patentu polskiego nr 207237 znany jest sposób mikrobiologicznego oczyszczania gruntów z węglowodorów, przeznaczony do remediacji gruntów metodą in situ i ex situ. Remediację prowadzi się w zamkniętym obiegu wodnym w sposób ciągły. Grunt nawilża się do poziomu 50% pojemności wodnej wodą lub odciekami zawierającymi autochtoniczne mikroorganizmy zdolne do rozkładu węglowodorów. Odcieki wprowadza się do bioreaktora i dodaje szczepionkę z namnażania organizmów autochtonicznych. Wyhodowany zaszczep wprowadza się do bioreaktora na początku procesu oczyszczania, a kolejne partie odcieków z remediowanego gruntu są głównym źródłem węgla organicznego, stanowiącego substrat pokarmowy dla kolejnych partii zawiesiny bakteryjnej zawracanej do remediacji gruntu. W procesie namnażania mikroorganizmów zapewnia im się odpowiednią dawkę pożywki w postaci związków azotu i fosforu. Proces namnażania prowadzi się w bioreaktorze w warunkach tlenowych.Polish patent no. 207237 describes a method of microbiological soil remediation from hydrocarbons, intended for land remediation by in situ and ex situ methods. Remediation is carried out continuously in a closed water cycle. The soil is moistened to 50% of its water capacity with water or leachate containing indigenous microorganisms capable of decomposing hydrocarbons. The effluents are introduced into the bioreactor and the autochthonous multiplication vaccine is added. The cultivated inoculum is introduced into the bioreactor at the beginning of the purification process, and subsequent batches of leachate from the remediated soil are the main source of organic carbon, which is a nutrient substrate for subsequent batches of bacterial suspension returned to soil remediation. In the process of multiplication of microorganisms, they are provided with an appropriate dose of nutrient solution in the form of nitrogen and phosphorus compounds. The multiplication process is carried out in a bioreactor under aerobic conditions.

W polskim patencie nr 205003 ujawniono sposób oczyszczania gleby gdzie w pierwszym etapie glebę natlenia się mechanicznie i wykonuje się rów odprowadzający odciek zawierający zanieczyszczenia ropopochodne. Gdy w odcieku nie będą się już pojawiały zanieczyszczenia ropopochodne glebę natlenia się mechanicznie i dodaje nawozów tak by stosunek azotu do fosforu wynosił 10:1 po czym proces bioremediacji prowadzi się od 1 do 2 lat do zahamowania procesów rozkładu. Następnie do tak oczyszczonej gleby dodaje się biopreparat sporządzony z wcześniej wyizolowanych i namnożonych autochtonicznych mikroorganizmów. Glebę natlenia się mechanicznie i zrasza wodą oraz prowadzi proces bioaugmentacji od 3 miesięcy do 1 roku.Polish patent no. 205003 discloses a method of soil purification, where in the first stage the soil is mechanically oxygenated and a drainage ditch containing petroleum contaminants is made. When the leachate no longer contains petroleum contamination, the soil is oxygenated mechanically and fertilizers are added so that the ratio of nitrogen to phosphorus is 10: 1, then the bioremediation process is carried out for 1 to 2 years until decomposition processes are inhibited. Then, a biopreparation made from previously isolated and multiplied autochthonous microorganisms is added to the soil thus cleaned. The soil is oxygenated mechanically and sprinkled with water, and the bioaugmentation process is carried out from 3 months to 1 year.

Z polskich opisów wynalazków zgłoszonych do opatentowania nr 212221, 212222, 212223 znane są sposoby usuwania zanieczyszczeń substancjami ropopochodnymi z gleby poprzez pobudzenie do biodegradacji zanieczyszczeń autochtonicznych mikroorganizmów, występujących w zanieczyszczonej glebie, w wyniku działania ekstraktów z soi, lucerny lub ekstraktu z mydlnicy lekarskiej.From the Polish descriptions of inventions submitted for patent no. 212221, 212222, 212223, there are known methods of removing contamination with petroleum substances from soil by stimulating the biodegradation of contamination of autochthonous microorganisms in the contaminated soil as a result of the action of soybean, alfalfa extracts or extract of medical soap.

Nieoczekiwanie okazało się, że dodatek kwasów humusowych, wymieszanych z hydrolizatem drożdży piwowarskich znacznie przyspiesza biologiczny rozkład oleju napędowego w glebie.Unexpectedly, it turned out that the addition of humic acids mixed with the brewer's yeast hydrolyzate significantly accelerates the biological decomposition of diesel fuel in the soil.

Istotą wynalazku jest sposób usuwania zanieczyszczeń substancjami ropopochodnymi, który polega na tym, że do zanieczyszczonego układu wprowadza się mieszaninę, zawierającą co najmniej 15% wagowych hydrolizatu odpadowych drożdży piwowarskich i co najmniej 60% wagowych kwasów humusowych, w ilości nie mniejszej niż 50 ml mieszaniny na kg gleby zanieczyszczonej węglowodorami. Hydrolizat drożdży piwowarskich uzyskuje się w procesie autolizy gęstwy drożdżowej. Jako źródło kwasów humusowych stosuje się dowolny preparat zawierający kwasy humusowe. Korzystne jest, gdy do zanieczyszczonego układu wprowadza się szczepionkę bakteryjną w ilości co najmniej 105 komórek na 1 g suchej masy gruntu. Szczepionkę może stanowić wyspecjalizowane w degradacji węglowodorów glebowe konsorcjum bakteryjne złożone ze szczepów: Achromobacter sp. i/albo Alcaligenes sp. i /albo Citrobacter sp. i /albo Comamonadaceae sp. i /albo Pseudomonas sp. i/albo Sphingobacterium sp. i/albo Bacillus sp. Mikroorganizmy przyczyniają się do realizacji skutecznego i wydajnego procesu usuwania zanieczyszczeń. W praktyce można wykorzystywać wyizolowane i namnożone mikroorganizmy autochtoniczne z zanieczyszczonego gruntu lub w przypadku ich braku do układu wprowadza się bakterie o znanej aktywności biodegradacyjnej.The essence of the invention is a method of removing contamination with petroleum derivatives, which consists in introducing a mixture containing at least 15% by weight of waste brewer's yeast hydrolyzate and at least 60% by weight of humic acids into the contaminated system, in an amount not less than 50 ml of the mixture per kg of soil contaminated with hydrocarbons. Brewer's yeast hydrolyzate is obtained in the process of autolysis of the yeast slurry. Any formulation containing humic acids is used as the source of humic acids. It is advantageous when a bacterial vaccine is introduced into the contaminated system in an amount of at least 105 cells per 1 g of dry weight of soil. The vaccine may be a soil-specific bacterial consortium specialized in the degradation of hydrocarbons, consisting of the following strains: Achromobacter sp. And / or Alcaligenes sp. And / or Citrobacter sp. And / or Comamonadaceae sp. And / or Pseudomonas sp. And / or Sphingobacterium sp. And / or Bacillus sp. Microorganisms contribute to the implementation of an effective and efficient process of removing pollutants. In practice, it is possible to use isolated and multiplied autochthonous microorganisms from the contaminated soil or, in their absence, bacteria of known biodegradation activity are introduced into the system.

Dzięki zastosowaniu sposobu według wynalazku następuje przyspieszenie biodegradacji substancji ropopochodnych pod wpływem dodania hydrolizatu odpadowych drożdży piwowarskich oraz kwasów humusowych.By using the method according to the invention, the biodegradation of petroleum substances is accelerated by adding the hydrolyzate of waste brewer's yeast and humic acids.

Hydrolizat odpadowych drożdży piwowarskich oraz kwasów humusowych zapewnia odpowiednią biodostępność zanieczyszczeń i dostarcza pożywki bez konieczności uzupełniania syntetycznymi składnikami. Hydrolizat odpadowych drożdży piwowarskich oraz kwasów humusowych jest przyjazny środowisku, jest całkowicie biodegradowalny, przez co nie powoduje zakłócenia w ekosystemie.Hydrolysate of waste brewer's yeast and humic acids ensures adequate bioavailability of contaminants and provides nutrient solution without the need to supplement with synthetic ingredients. Hydrolysate of waste brewer's yeast and humic acids is environmentally friendly, it is completely biodegradable, so it does not disturb the ecosystem.

PL 235 562 B1PL 235 562 B1

Opis doświadczenia przedstawiającego istotę wynalazku.Description of the experiment representing the essence of the invention.

Biodegradację prowadzono w dwóch układach bez i z dodatkiem hydrolizatów odpadowych drożdży piwowarskich oraz kwasów humusowych. Procesowi biodegradacji poddawany był olej napędowy. Hydrolizat drożdży piwowarskich uzyskano poddając gęstwę drożdżową procesowi autolizy w temperaturze 53°C przez 48 godzin. Jako źródło kwasów humusowych zastosowano komercyjnie dostępny preparat wytwarzany na bazie leonardytów, zawierający 85% kw. humusowych. Glebę skażano do 2% olejem napędowym po czym zraszano 50 ml/kg mieszaniny hydrolizatu odpadowych drożdży piwowarskich oraz kwasów humusowych w proporcji 1:3 oraz wprowadzano do układu zawiesinę mikroorganizmów Achromobacter sp., Alcaligenes sp., Citrobacter sp., Comamonadaceae, Pseudomonas sp., Sphingobacterium sp., Bacillus sp. i całość pozostawiono na 90 dni. Identyfikację mikroorganizmów konsorcjum przeprowadzono w oparciu o analizę regionu IV bakteryjnego 16S RNA. Po zamplifikowaniu, produkty PCR oczyszczano a następnie w reakcji reamplifikacji konstruowano biblioteki z wykorzystaniem starterów fuzyjnych dla systemu Illumina. Sekwencjonowanie przeprowadzono z wykorzystaniem sekwenatora Illumina MiSeq (Illumina, USA) używając sparowanych końców (2 x 250) MiSeq Reagent Kits v2 (Illumina, USA). Dane z sekwencjonowania zostały przetworzone z wykorzystaniem CLC Genomic Workbench 8.5 i CLC Microbial Genomics Module 1.2. (Qiagen, USA). Całkowita liczba odczytów obejmowała zakres 438216-461123. Odczyty porównano z bazą danych SILVA v119. Charakterystyczne sekwencje dla mikroorganizmów konsorcjum przedstawiono w tab 1.Biodegradation was carried out in two systems, with and without the addition of brewer's yeast waste hydrolysates and humic acids. Diesel fuel was subjected to the biodegradation process. Hydrolysate of brewer's yeast was obtained by subjecting the yeast slime to the autolysis process at 53 ° C for 48 hours. A commercially available leonardite-based preparation, containing 85% humic acid, was used as a source of humic acids. The soil was contaminated to 2% with diesel oil, then sprinkled with 50 ml / kg of the mixture of waste brewer's yeast hydrolyzate and humic acids in the proportion 1: 3, and the suspension of the microorganisms of Achromobacter sp., Alcaligenes sp., Citrobacter sp., Comamonadaceae, Pseudomonas sp. , Sphingobacterium sp., Bacillus sp. And all were left for 90 days. Identification of the consortium's microorganisms was performed based on the analysis of the IV region of the bacterial 16S RNA. After amplification, the PCR products were purified and the libraries were constructed by a reamplification reaction using the fusion primers for the Illumina system. Sequencing was performed on an Illumina MiSeq sequencer (Illumina, USA) using paired ends (2 x 250) of the MiSeq Reagent Kits v2 (Illumina, USA). Sequencing data was processed using CLC Genomic Workbench 8.5 and CLC Microbial Genomics Module 1.2. (Qiagen, USA). The total number of readings ranged from 438,216-461123. The readings were compared with the SILVA v119 database. Characteristic sequences for the consortium's microorganisms are presented in Table 1.

PL 235 562 Β1PL 235 562 Β1

Tabela 1Table 1

Identyfikowany mikroorganizm Identified microorganism Sekwencja nukleotydowa Nucleotide sequence Sphingobacterium sp. Sphingobacterium sp. GTGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGAACCGTCCAAACGTTATTCGGTAT CACTGGGCTTAAAGCGTGCGTAGGCGGCCTGGAAGGTGAGATGTGAAA GCCCACGGCTCAACCGTGGAATTGCGTTTCAAACCGCCAGGCTTGAGGA AGACAGGGGTGTAGGGAACTTATGGTGGAGCGGTGAAATGCGTTGATA TCATAGGGAACACCGGTGGCGAAGGCGCAACACTGGGTCTTTTCTGACG CTGAGGCACGAAAGCTAGGGTAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAG GTGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGAACCGTCCAAACGTTATTCGGTAT CACTGGGCTTAAAGCGTGCGTAGGCGGCCTGGAAGGTGAGATGTGAAA GCCCACGGCTCAACCGTGGAATTGCGTTTCAAACCGCCAGGCTTGAGGA AGACAGGGGTGTAGGGAACTTATGGTGGAGCGGTGAAATGCGTTGATA TCATAGGGAACACCGGTGGCGAAGGCGCAACACTGGGTCTTTTCTGACG CTGAGGCACGAAAGCTAGGGTAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAG Bacillus sp. Bacillus sp. GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATT AC TGGGCG TAAAGCG TGCGTAGGTGGTlCGITAAG TC TGATGTGAAAGC CCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTGGATACTGGCGGGCTAGAGTACG GTAGAGGGTGGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATC AGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCCACCTGGACCAGTACTGACAC TGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT C GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATT AC TGGGCG TAAAGCG TGCGTAGGTGGTlCGITAAG TC TGATGTGAAAGC CCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTGGATACTGGCGGGCTAGAGTACG GTAGAGGGTGGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATC AGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCCACCTGGACCAGTACTGACAC TGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT C Achromobacter sp. Achromobacter sp. GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTGTTCGGAATT ATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTCTTTAAGTCTCTTGGTGAAAG GCCGGGGCTCAACCCTGAGCATGCCGGGGATACTGGGGAGCTGGAGAC AGGCAGAGGCCAGCGGAATTCCGGG1G1AGCGG1GGAATGCG1AGAGA TCCGGAAGAACACCGGAGGCGAAGGCGGCTGGCTGGGCCTGATCTGAC GCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAAGATTAGATACCCTGGTA GT GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTGTTCGGAATT ATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTCTTTAAGTCTCTTGGTGAAAG GCCGGGGCTCAACCCTGAGCATGCCGGGGATACTGGGGAGCTGGAGAC AGGCAGAGGCCAGCGGAATTCCGGG1G1AGCGG1GGAATGCG1AGAGA TCCGGAAGAACACCGGAGGCGAAGGCGGCTGGCTGGGCCTGATCTGAC GCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAAGATTAGATACCCTGGTA GT Alcaligenes sp. Alcaligenes sp. GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGGATTTA CTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGGCTGGTCAGTCCGGGGTGAAATC TCACGGCICAACCGTGAGCGGTCCCCGGATACTGCCAGTCTTGAGGTGT CTAGAGGAGAGCGGAATTCCCGGTGTAGTGGTGGAATGCGTAGATATC GGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGGGACCACCTGACGC TGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACCGGATTAGATACCCGGGTAGT C GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGGATTTA CTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGGCTGGTCAGTCCGGGGTGAAATC TCACGGCICAACCGTGAGCGGTCCCCGGATACTGCCAGTCTTGAGGTGT CTAGAGGAGAGCGGAATTCCCGGTGTAGTGGTGGAATGCGTAGATATC GGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGGGACCACCTGACGC TGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACCGGATTAGATACCCGGGTAGT C Citrobacter sp. Citrobacter sp. G TGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGAG TGCGAGCG TTAATCGGAATT ACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGTGGATATTTAAGTCAGATGTGAAAG CCCCGGGCTTAACCTGGGAATTGCATTTGATACTGGATGTCTTGAATAT AGTAGAGGGAGGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATAT CGGAAGGAACATCAGTGGCGAAAGCGGCCTCCTGGACTAATATTGACA CTTAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TC G TGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGAG TGCGAGCG TTAATCGGAATT ACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGTGGATATTTAAGTCAGATGTGAAAG CCCCGGGCTTAACCTGGGAATTGCATTTGATACTGGATGTCTTGAATAT AGTAGAGGGAGGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATAT CGGAAGGAACATCAGTGGCGAAAGCGGCCTCCTGGACTAATATTGACA CTTAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TC Comamonadaceae sp. Comamonadaceae sp. GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAACTGTGCAAACGTTATTCGGAATCA CTGGGCTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCTGTCTAAGCAGGGTGTGAAAGC CCCCGGCICAACCGGGGA A TTGCGT TCTGAACTGGACGGCTGGAG TGGG ATAGAGGTGTGCGGAACTTCCGGTGGAGCGGTGAAATGTGTTGATATCG GAAGGAACGCCGGTGGCGAAAGCGGCACACTGGGTCTCAACTGACGCT GAGGCACGAAAGCCAGGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAACTGTGCAAACGTTATTCGGAATCA CTGGGCTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCTGTCTAAGCAGGGTGTGAAAGC CCCCGGCICAACCGGGGA A TTGCGT TCTGAACTGGACGGCTGGAG TGGG ATAGAGGTGTGCGGAACTTCCGGTGGAGCGGTGAAATGTGTTGATATCG GAAGGAACGCCGGTGGCGAAAGCGGCACAAGACGCGGCACAAGACGCGGCACAGACGACGGCACAGACGACG Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATT ACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTCGTAAGACAGACGTGAAAT CCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCGTTTGTGACTGCGAGGCTAGAGTTT GGCAGAGGGGGGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGAT GTGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACG CTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATT ACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTCGTAAGACAGACGTGAAAT CCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCGTTTGTGACTGCGAGGCTAGAGTTT GGCAGAGGGGGGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGAT GTGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACG CTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TC

PL 235 562 B1PL 235 562 B1

Po tym czasie sprawdzono stopień biodegradacji oleju napędowego w układzie bez dodatku hydrolizatu odpadowych drożdży piwowarskich oraz kwasów humusowych w stosunku do układu z ekstraktem. Stopień degradacji oleju napędowego analizowano metodą wagową poprzez ekstrakcje eterem 5 dietylowym. Uzyskano 91% wzrost stopnia biodegradacji oleju w układach z hydrolizatem odpadowych drożdży piwowarskich oraz kwasów humusowych.After that time, the degree of diesel oil biodegradation was checked in the system without the addition of the waste brewer's yeast hydrolyzate and humic acids in relation to the system with the extract. The diesel oil degradation degree was analyzed by the gravimetric method by extracting with diethyl ether. A 91% increase in the degree of oil biodegradation was achieved in the systems with the hydrolyzate of waste brewer's yeast and humic acids.

Claims

Patent claims

Method of removing pollutants with petroleum substances from the environment with the use of surfactants, characterized in that a mixture containing at least 15% by weight of waste brewer's yeast hydrolyzate and at least 60% by weight of humic acids is introduced into the contaminated system, and in an amount not less than than 50 ml of the mixture per kg of soil contaminated with hydrocarbons.

Method according to claim 1, characterized in that a soil consortium containing bacteria of the genus Achromobacter sp. And / or Alcaligenes sp. And / or Citrobacter sp. And / or Comamonadaceae sp. And / or Pseudomonas sp. And / is introduced into the system. or Sphingobacterium sp. and / or Bacillus sp. in an amount of at least 105 cells per 1 g of dry weight of soil.