PL233763B1

PL233763B1 - Sposob syntezy nanoczastek miedzi o dzialaniu biologicznie czynnym przy zastosowaniu swiatla jako katalizatora procesu

Info

Publication number: PL233763B1
Application number: PL413187A
Authority: PL
Inventors: Rafal Banasiuk; Dawid Nidzworski
Original assignee: Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2015-07-20
Publication date: 2019-11-29
Also published as: PL413187A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy bioaktywnych nanocząstek miedzi wykazujących szerokie spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego obejmującego swym działaniem lekooporne gram dodatnie i gram ujemne bakterie oraz grzyby. Synteza nanocząstek odbywa się z wykorzystaniem światła diodowego o długości fali 420 nm jako katalizatora procesu.

Nanocząstki miedzi (CuNPs) stanowią jeden z nurtów nowoczesnej inżynierii materiałowej. Ich rozmiary zgodnie z ich nazwą wahają się od 1 do 100 nanometrów. Nanocząstki miedzi, składają się z metalicznego pierwiastka oraz jego tlenków. Zainteresowanie miedzią i materiałami, które ją zawierają rośnie w ostatnich latach. Z tego też względu wciąż trwają poszukiwania metod syntezy stabilnych CuNPs. Obecnie największym problemem z jakimi borykają się metody syntezy nanocząstek to samorzutne utlenianie się na powietrzu. Od dawna metaliczna miedź jest używana jako substancja przeciwbakteryjna. Znajduje zastosowanie jako materiał na powierzchnie, który powinien wykazywać się czystością mikrobiologiczną (np. klamki w szpitalach, tubusy na pipety szklane itp.). Nanocząstki miedzi, ze względu na swój ogromny współczynnik powierzchni do masy, wykazują silne właściwości biologiczne w niskim stężeniu. Dzięki posiadanej nanostrukturze mogą istnieć w roztworze w postaci zdyspergowanej. Dzięki tym dwóm właściwościom i relatywnie niskiej toksyczności możliwe jest ich zastosowanie w produkcji hydrożelowych materiałów opatrunkowych i farb przeciwgrzybicznych.

Wzrastająca lekooporność bakterii stanowi coraz większy problem. Wciąż poszukuje się nowych metod walki z zakażeniami, w tym również przy wykorzystaniu nanotechnologii. W literaturze dostępne są dane dotyczące syntezy CuNPs, jak również prace na temat ich aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Prezentowana poniżej nowa metoda odznacza się niskim zużyciem odczynników i energii potrzebnej do wytworzenia CuNPs, jak również wysoką odpornością nanocząstek na utlenianie.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania aktywnych nanocząstek miedzi CuNPs, który sposób obejmuje następujące etapy:

a. Łączy się wodne roztwory reagentów takich jak:

- środek blokujący powstawanie agregatów Cu⁰, który jest wybrany z grupy polimerów: PVP, PVA, Poloxamer 407 o stężeniu 100 mg/ml,

- azotanu miedzi (Cu(NO3)2) o stężeniu 1 M,

- źródła jonów Cl^-, CIO^- bądź ich mieszanin, które dodawane są w postaci roztworu NaClO o stężeniu 5,25%,

- kwasu askorbinowego o stężeniu 1 M i

- środek zobojętniający pH, który stanowi Tris-HCI o pH=8,5, Na2CO3, o stężeniu 1 M,

b. Naświetlania tak przygotowanej mieszaniny światłem o długości fali 420 nm.

Sposób gdzie stężenie soli miedzi w mieszaninie reakcyjnej przed rozpoczęciem naświetlania jest wyższe niż 0,1 mg/ml.

Sposób gdzie próbkę filtruje się przez filtr celulozowy o średnicy porów 0,2 μm.

Sposób gdzie powstałe nanocząstki miedzi zatęża się przy użyciu wirowania przy prędkości 14 000 rcf przez 15 minut.

Zastosowanie aktywnych CuNPs otrzymanych sposobem zdefiniowanym powyżej do wytwarzania środka o działaniu bakteriobójczym i grzybobójczym w stosunku do patogenów takich jak: Staphylococcus aureus [G(+)] oraz Candida albicans.

Opis figur i tabel:

Fig. 1 - przedstawia zdjęcie z mikroskopu elektronowego obrazujące próbkę przygotowaną metodyką opisaną w przykładzie 1.

Fig. 2 - przedstawia zdjęcie z mikroskopu elektronowego obrazujące próbkę przygotowaną metodyką opisaną w przykładzie 2.

Tabela 1 - przedstawia właściwości przeciwdrobnoustrojowe uzyskanych nanocząstek miedzi (MIC - minimalne stężenia hamujące wzrost drobnoustrojów; MBC - minimalne stężenia bakteriobójcze; MFC - minimalne stężenie grzybobójcze).

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia:

P r z y k ł a d 1

Tworzenie CuNPs z wykorzystaniem poliwinylopirolidonu (PVP), alkoholu poliwinylowego (PVA) i kwasu askorbinowego.

Przygotowano roztwory:

[A] 1 M Cu(NO3)2;

PL 233 763 B1 [B] 1 M kwas askorbinowy;

[C] 100 mg/ml PVP;

[D] 100 mg/ml PVA;

[E] 5,25% NaClO;

[F] 0,5 M Tris-HCI (pH=8,5);

[G] 1 M Na2CO3.

1. Do kolby miarowej o objętości 200 ml wlano 100 ml dejonizowanej wody, następnie dodano 1 ml roztworu [A], 8 ml roztworu [B], po 4 ml roztworu [C] i [D] oraz po 1 ml roztworu [E] i [F].

2. Dopełniono kolbę do objętości 200 ml, przelano do naczynia reakcyjnego (butelka ze szkła borokrzemianowego), dodano 2 ml roztworu [G] i intensywnie mieszano przez 10 sekund.

3. Butelkę z próbą naświetlano przy użyciu lampy diodowej generującej światło o długości fali ~420 nm przez 10 minut.

4. W celu dalszych analiz próbka została przefiltrowana przez filtr celulozowy o średnicy porów 0,2 μm w celu usunięcia większych powstałych agregatów miedzi.

5. Powstałe nanocząstki miedzi zostały zatężone przy użyciu wirowania przy prędkości 14 000 rcf (relative centrifugal force) przez 15 minut.

Zdjęcie powstałych nanocząstek uzyskane przy pomocy mikroskopii elektronowej przedstawiono na figurze 1, informacje na temat właściwości przeciwdrobnoustrojowych uzyskanych CuNPs przedstawiono w tabeli 1.

P r z y k ł a d 2

Tworzenie CuNPs z wykorzystaniem Poloxameru 407 i kwasu askorbinowego.

Przygotowano roztwory:

[A] 1 M Cu(NO3)2;

[B] 1 M kwas askorbinowy;

[C] 100 mg/ml Poloxamer 407;

[D] 5,25% NaClO;

[E] 0,5 M Tris-HCI (pH=8,5);

[F] 1 M Na2CO3.

1. Do kolby miarowej o objętości 200 ml wlano 100 ml dejonizowanej wody, następnie dodano 1 ml roztworu [A], 8 ml roztworu [B] oraz po 1 ml roztworu [C], [D] i [E].

2. Dopełniono kolbę do objętości 200 ml, przelano do naczynia reakcyjnego (butelka ze szkła borokrzemianowego), dodano 2 ml roztworu [F] i intensywnie zamieszano przez 10 sekund.

3. Butelkę wraz z próbą naświetlano przy użyciu lampy diodowej generującej światło o długości fali ~420 nm przez 10 minut.

4. W celu dalszych analiz próbkę filtrowano przez filtr celulozowy o średnicy porów 0,2 μm w celu usunięcia większych powstałych agregatów miedzi.

5. Powstałe nanocząstki miedzi zatężano przy użyciu wirowania przy prędkości 14 000 rcf (relative centrifugal force) przez 15 minut.

Zdjęcie powstałych CuNPs uzyskane przy pomocy mikroskopii elektronowej przedstawiono na figurze 2.

P r z y k ł a d 3

Badanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej CuNPs - metoda mikrorozcieńczeń pożywki (ang. Broth Microdilutions Method).

Aktywność bakteriobójczą i grzybobójczą nanocząstek miedzi uzyskanych w przykładzie 1 sprawdzono względem następujących patogenów ludzkich: Staphylococcus aureus oraz Candida albicans. Do eksperymentu wybrano szczepy oporne na więcej niż jedną grupę antybiotyków. Hodowle drobnoustrojów prowadzono w 37°C w pożywce BHI (BioMerieux).

W celu określenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej otrzymanych CuNPs ustalono ich minimalne stężenia hamujące wzrost drobnoustrojów (ang. Minimal Inhibiction Concentraction, MIC) oraz minimalne stężenia bakteriobójcze (ang. Minimal Bactericidal Concentration, MBC) lub minimalne stężenia grzybobójcze (ang. Minimal Fungicidal Concentration, MFC). Na płytki 96-dołkowe nanoszono seryjne rozcieńczenia badanych CuNPs (zakres testowanych stężeń od 0,2 do 20 μΙ/100 μθ w pożywce BHI w objętości 100 μΕ Następnie do zawartości dołków dodano po 10 μl zawiesiny drobnoustrojów o stężeniu około 2 x 105 CFU/ml, otrzymanej z płynnej hodowli nocnej. Mikropłytki następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Stężenia CuNPs, przy których nie obserwowano zmętnienia pożywki (wzrostu drobnoustrojów), określano jako MIC. Następnie zawartość dołków

PL 233 763 B1 nie wykazujących wzrostu drobnoustrojów wysiano na pożywkę BHI zestaloną agarem. Brak wzrostu kolonii drobnoustrojów po 24 godzinnej inkubacji płytki wskazuje na stężenie CuNPs zabijające 99,9% patogenów w wyjściowym inokulum (MBC). Wszystkie eksperymenty powtórzono 3-krotnie, a wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Sposób otrzymywania aktywnych nanocząstek miedzi CuNPs, znamienny tym, że sposób obejmuje następujące etapy:

a. Łączy się wodne roztwory reagentów takich jak:

- azotanu miedzi (Cu(NO3)2) o stężeniu 1 M,

- kwasu askorbinowego o stężeniu 1 M i

- środek zobojętniający pH, który stanowi Tris-HCl o pH=8,5, Na2CO3, o stężeniu 1 M,

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie soli miedzi w mieszaninie reakcyjnej przed rozpoczęciem naświetlania jest wyższe niż 0,1 mg/ml.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę filtruje się przez filtr celulozowy o średnicy porów 0,2 μm.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że powstałe nanocząstki miedzi zatęża się przy użyciu wirowania przy prędkości 14 000 rcf przez 15 minut.

5. Zastosowanie aktywnych CuNPs otrzymanych sposobem zdefiniowanym w zastrzeżeniach 1-4 do wytwarzania środka o działaniu bakteriobójczym i grzybobójczym w stosunku do patogenów takich jak: Staphylococcus aureus [G(+)] oraz Candida albicans.