PL232995B1

PL232995B1 - Sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi

Info

Publication number: PL232995B1
Application number: PL415721A
Authority: PL
Inventors: Mariusz Szymczak
Original assignee: Zachodniopomorski Univ Technologiczny W Szczecinie; Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny W Szczecinie
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2019-08-30
Also published as: PL415721A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi. Kąpiel taka może być wykorzystana ponownie np. do marynowania śledzi.

Marynaty śledziowe są bardzo popularne w Europie oraz innych krajach na świecie. Przemysł rybny i mięsny ma problemy z prawidłowym dojrzewaniem i jakością sensoryczną ryb marynowanych, ryb solonych oraz produktów mięsnych dojrzewających. Dojrzewanie mięsa oparte jest głównie na proteolizie białek i skutkuje obniżeniem twardości tekstury przy jednoczesnym wzroście zawartości produktów hydrolizy białka (PHB). Aby przyspieszyć dojrzewanie i poprawić jakość gotowych produktów obecnie stosuje się dodatek m.in. preparatów enzymatycznych pochodzenia zwierzęcego, roślinnego, lecz najczęściej mikrobiologicznego. Enzymy te są niespecyficzne dla omawianego surowca, dlatego hydrolizują białka w sposób nie zapewniający właściwej jakości produktu, a ponadto mogą generować peptydy powodujące alergie. Dlatego przemysł poszukuje źródło naturalnych enzymów, jakimi są katepsyny występujące naturalnie w dużych ilościach np. w tkance mięśniowej. Jednakże ze względu na ograniczenia ilościowe i cenowe tego typu surowca, preparaty katepsyn są zbyt drogie, aby opłacało się je stosować w przemyśle rybnym.

W publikacji Szymczak, M. & Kołakowski, E. (2012). Losses of nitrogen fractions from herring to brine during marinating. Food Chemistry, 132(1), 237-243 wykazano, że podczas marynowania z mięsa śledzi do kąpieli dyfundują o PHB. W publikacji Szymczak, M. & Lepczyński A. (2016). Occurrence of aspartylproteases in brine after herring marinating. Food Chemistry, 194, 470-475 wykazano, że oprócz PHB podczas marynowania z mięsa śledzi do kąpieli dyfundują również aktywne katepsyny w formie rozpuszczonej. Straty katepsyn aspartylowych i cysteinowych obniżają aktywność proteolityczną w dojrzewającym mięsie, niekorzystnie zmieniając skład ilościowy i jakościowy produktów hydrolizy białka w półprodukcie marynat oraz w gotowych marynatach.

Lizosomy są to organelle zawierające liczne enzymy hydrolityczne, co zostało opisane w publikacji Voet, D. and Voet, J.G. 1990 Biochemistry. John Wilej & Sons, New York. Katepsyna D, kwaśna fosfataza, β-glukuronidaza i β-N-acetyl-glukozaminidaza powszechnie uznawane są za markery lizosomów (Karvinen, V.P., Bamford, D.H., & Granroth, B. 1982. Changes in muscle subcellular fractions of Baltic herring (Clupea harengus membras) during cold and frozen storage. J. Sci. Food Agric. 33: 763; Ueno R., Liston J., & Horiguchi Y. 1986. Intracellular distribution of enzymes and particle properties of lysosomes in mackerel muscle tissue. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 52(5), 895-900). Z publikacji znane jest zwiększanie aktywności proteolitycznej mięsa poprzez jego tzw. powolne zamrażanie-rozmrażanie, sonifikację lub zastosowanie wysokiego ciśnienia (McGann, L.E., Yang, H.Y., Walterson M. (1988). Manifestations of cell damage after freezing and thawing. Cryobiology, 25(3):178-85; Weiss, J., Kristbergsson, K., and Kjartansson, G.T. (2011). Engineering foodingredients with high-intensity ultrasound, In: Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing (Eds. H. Feng, G.V. Barbosa-Canovas, J. Weiss), Springer Science, New York, 239-285).

Nieoczekiwanie okazało się, że w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi występują nie tylko rozpuszczone katepsyny, ale również lizosomy, w których obecne są enzymy odpowiedzialne za dojrzewanie mięsa, między innymi katepsyna D, która dominuje w ogólnej aktywności proteolitycznej zarówno we frakcji rozpuszczonych białek - enzymu oraz we frakcji lizosomalnej marynat. Enzym ten rozpoczyna proces dojrzewania, decyduje o teksturze oraz produkuje peptydy będące substratami dla innych proteaz.

Podczas badań zauważono, że aktywność proteolityczną w kąpieli można zwiększyć poprzez uszkodzenie błon lizosomów i uwolnienie enzymów stosując różne, dostępne powszechnie metody.

Pierwszy sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że kąpiel po usunięciu z niej tłuszczu i zawiesiny poddaje się co najmniej raz tak zwanemu powolnemu zamrażaniu, a następnie rozmrażaniu tak, aby utrzymać tak zwaną chłodniczą temperaturę (1-7°C) kąpieli. Powolne zamrażanie powinno odbywać się w temperaturze nie niższej niż -30°C, korzystnie w -18°C. Tłuszcz i zawiesinę usuwa się poprzez wirowanie lub filtrację. Korzystnie po zamrażaniu-rozmrażaniu usuwa się bakterie z kąpieli, na przykład, poddając kąpiel mikrofiltracji.

Drugi sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi, przez uszkodzenie błon występujących w niej lizosomów charakteryzuje się tym, że kąpiel po usunięciu z niej tłuszczu i zawiesiny poddaje się działaniu ultradźwięków o niskiej częstotliwości i dużej mocy

PL 232 995 B1 przez co najmniej 1-5 minut. Największą aktywność proteolityczną uzyskuje się jeśli po działaniu ultradźwiękami, kąpiel pozostawia się przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze chłodniczej wynoszącej 1-7°C. Tłuszcz i zawiesinę usuwa się poprzez wirowanie lub filtrację. Korzystnie z kąpieli po sonifikacji usuwa się bakterie na przykład poddając kąpiel mikrofiltracji.

Jeszcze inny sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi, charakteryzuje się tym, że kąpiel po usunięciu z niej tłuszczu i zawiesiny poddaje się działaniu homogenizacji mechanicznej przez co najmniej 1 min., lecz nie dłużej niż 2 min. Homogenizację prowadzi się w temperaturze chłodniczej wynoszącej 1-7°C. Tłuszcz i zawiesinę usuwa się poprzez wirowanie lub filtrację. Korzystnie po homogenizacji mechanicznej usuwa się bakterie z kąpieli, na przykład poddając kąpiel mikrofiltracji.

Kolejny sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi, charakteryzuje się tym, że kąpiel po usunięciu z niej tłuszczu i zawiesiny poddaje się nanofiltracji na filtrach o tzw. zdolności rozdzielczej (cut-off) od 1 do 1000 kDa. Katepsyna D ma masę cząsteczkową ok. 40 kDa, zaś wszystkie katepsyny biorące udział w dojrzewaniu mięsa charakteryzują się masą w zakresie ok. 20-200 kDa. Stosunkowo mała porowatość filtra wymaga zastosowania dużego ciśnienia, aby możliwe było przepchnięcie cieczy przez filtr. Ciśnienie to uszkadza błony lizosomów uwalniając enzymy, które przechodzą do permeatu lub zostają w retentacje, w zależności czy zastosowany cut-off ma odpowiednio większą lub mniejszą wartość od masy cząsteczkowej enzymu. W przypadku retentatu korzystnie po nanofiltracji usuwa się bakterie z kąpieli, na przykład poddając kąpiel mikrofiltracji, zaś w przypadku permeatu nie ma już takiej potrzeby.

Aktywność katepsyny D w kąpieli pozostałej po marynowaniu mrożonych-rozmrażanych śledzi atlantyckich rosła do 180% wraz z ilością cykli zamrażania-rozmrażania lub do 200% wraz z czasem sonifikacji (Rysunek 1). Wzrost aktywności katepsyny D pod wpływem zamrażania-rozmrażania był istotnie mniejszy niż pod wpływem sonifikacji. W pierwszym przypadku aktywność rosła liniowo, zaś w drugim logarytmicznie. Trzy cykle zamrażania-rozmrażania odpowiadały jednej minucie sonifikacji. Na wzrost aktywności katepsyny D miał również wpływ czas wykonanego pomiaru aktywności po sonifikacji. Aktywność proteolityczna zmierzona w tych samych próbach godzinę później była istotnie większa o 20-30 punktów procentowych. Wyniki pokazują, że wpływ sonifikacji i wielokrotnego zamrażaniarozmrażania jest inny na uszkadzanie błon lizosomów występujących w kąpieli. Wyniki nasze pokazują, że uwalnianie katepsyny D z lizosomów następuje również podczas mechanicznej homogenizacji kąpieli. Jednak wzrost aktywności katepsyny D stwierdzono tylko podczas pierwszych 2 min. procesu. Po 3 min homogenizacji aktywność zaczęła maleć i po 5 min. wynosiła 2/3 aktywności próby kontrolnej. Najprawdopodobniej wzrost aktywności był skutkiem zarówno mechanicznego uszkadzania lizosomów oraz przez ultradźwięki powstające podczas szybko obracającego się noża homogenizatora. Z kolei spadek aktywności można wiązać z denaturacją białek - enzymu w wyniku intensywnie powstającej piany. W przypadku zastosowania nanofiltracji kąpieli użycie filtru o niższym parametrze cut-off bardziej przyczyniało się do zwiększenia aktywności katepsyny D. Największy wzrost aktywności do 244% wykazano w retentacje 10 kDa, a najmniejszy 120% w retentacje 100 kDa. Różnice te były spowodowane również przechodzeniem enzymu do permeatu, najbardziej w przypadku filtra 100 kDa.

Sposób według wynalazku przedstawiony jest w przykładach wykonania i na rysunku, na którym na wykresie przedstawiono wpływ wielokrotnego zamrażania-rozmrażania i wpływ działania ultradźwięków oraz czasu homogenizacji na aktywność katepsyny D w kąpieli pozostałej po marynowaniu mrożonych-rozmrożonych filetów śledzia atlantyckiego.

P r z y k ł a d 1

Świeże oraz mrożone-rozmrażane filety ze śledzia bałtyckiego i atlantyckiego poddano marynowaniu metodą klasyczną powszechną w przemyśle rybnym. Po 7 dobach dojrzewania kąpiel oddzielono od ryby i poddano ją wirowaniu przy 4°C i 10000 x g przez 10 min. Otrzymany supernatant kąpieli poddano dezintegracji lizosomów poprzez cykl zamrażania i rozmrażania. W tym celu supernatant kąpieli w ilości 100 ml w szczelnych woreczkach składowano 60 min. w temperaturze -18°C w celu zamrożenia, po czym rozmrażano 30 min. przy 4-7°C. Cykl zamrażania i rozmrażania powtarzano do pięciu razy. Kąpiel po wielokrotnym zamrażaniu-rozmrażaniu poddano analizie na aktywności katepsyny D wobec specyficznego syntetycznego fluorogennego peptydu, zwanego dalej substratem. Aktywność katepsyny D+E i katepsyny E w próbach była mierzona z i bez pepstatyny A wobec substratów, odpowiednio: Mca-GKPILFFRLK(Dnp)-r-NH2 i Mca-GSPAFLAK(Dnp)-rNH2. Fluorescencję mierzono w spektro

PL 232 995 Β1 fluorymetrze (Hitachi F7000, Japan) stosując wzbudzenie i emisję 328 i 393 nm. Aktywność katepsyny D obliczano z różnicy D+E do E. Jedną jednostkę aktywności proteazy zdefiniowano jako 1 nmol MCA uwolniony z 1 ml próby w ciągu 1 min. przy 37°C.

Przed cyklem zamrażania-rozmrażania kąpiel przesączono przez filtry 2.7, 0.6 i 0.3 μΐη i stwierdzono, że charakteryzuje się coraz mniejszą aktywnością katepsyny D pochodzenia lizosomalnego. Filtr 0.3 μΐη obniżył od 50 do 70% aktywność katepsyny D z lizosomów. Z kolei w kąpieli zamrażanej tzw. metodą szybką stosując -80°C nie wykazano wzrostu aktywności katepsyny D. Relatywną aktywność katepsyny D [%] przedstawiono w tabeli 1 oraz na rysunku.

Tabela 1

Kąpiel	Kąpiel zamrażana-rozmrażana
Filety świeże	Filety mrożone-rozmrażane
Kontrola	100	100
Supernatant	165.2	279.4
2.7 pm filtrat	149.1	248.1
0.6 pm filtrat	131.8	206.9
0.3 pm filtrat	125.6	194.6

Wielokrotne zamrażanie-rozmrażanie powodują/powoduje mniejszy przyrost aktywności proteolitycznej w kąpieli surowej (nieodwirowanej) niż w supernatancie, prawdopodobnie w wyniku łączenia się białek - enzymu z innymi białkami, lipidami i innymi związkami. Dlatego konieczne jest usunięcie tłuszczu i zawiesiny przed dezintegracją lizosomów czterema opisanymi metodami.

Przykład 2

Sposób jak w przykładzie pierwszym, z tym, że kąpiel poddano działaniu ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz i moc 70 W przez 2 minuty przy 4-7°C. Relatywną aktywność katepsyny D [%] przedstawiono w tabeli 2 oraz na rysunku.

Tabela 2

Kąpiel	Kąpiel sonifikowana
Filety mrożone-rozmrażane
Kontrola	100
Supernatant	286.5
2.7 pm filtrat	264.7
0.6 pm filtrat	252.9
0.3 pm filtrat	226.3

Przykład 3

Sposób jak w przykładzie pierwszym, z tym, że supernatant kąpieli w ilości 100 ml w naczyniu szklanym poddano homogenizacji mechanicznej stosując homogenizator laboratoryjny przy prędkości noża 24000 obrotów/min. i 4-7°C. Wyniki badań przedstawiono na rysunku.

PL 232 995 Β1

Przykład 4

Sposób jak w przykładzie pierwszym z tym, że supernatant kąpieli w ilości 15 ml poddano nanofiltracji stosując filtry wirówkowe o cut-off 100, 30 i 10 kDa. Kąpiel zatężano przy 4000 x g w temperaturze chłodniczej, uzyskując 1/20 - 1/50 pierwotnej objętości kąpieli. Zastosowanie filtra 100 kDa do filtrowania kąpieli spowodowało wzrost aktywności katepsyny D w porównaniu do próby kontrolnej, jednak aktywność rozłożyła się pomiędzy retentatem a permeatem. Kiedy zastosowano filtr o cut-off 30 i 10 kDa, czyli mniejszym od masy katepsyny D, to jej aktywność wzrosła najbardziej, i prawie w całości występowała tylko w retentacie. Relatywną aktywność katepsyny D [%] przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Kąpiel	Kąpiel filtrowana przez nanofiltiy
Filety mrożone rozmrażane
Supernatant	100
Retentat	100 kDa	120
30 kDa	200
10 kDa	244
Permeat	100 kDa	60
30 kDa	25
10 kDa	0

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi, znamienny tym, że kąpiel po usunięciu z niej tłuszczu i zawiesiny poddaje się co najmniej raz powolnemu zamrażaniu oraz rozmrażaniu tak, aby utrzymać chłodniczą temperaturę kąpieli wynoszącą 1-7°C.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że tłuszcz i zawiesinę usuwa się przed zamrażaniem poprzez wirowanie lub filtrację.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że z kąpieli po zamrażaniu i rozmrażaniu usuwa się bakterie, poddając ją mikrofiltracji.
4. Sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi, znamienny tym, że kąpiel po usunięciu z niej tłuszczu i zawiesiny poddaje się działaniu ultradźwięków o niskiej częstotliwości i dużej mocy przez co najmniej 1-5 minut.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że po działaniu ultradźwiękami kąpiel pozostawia przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze chłodniczej wynoszącej 1-7°C.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że tłuszcz i zawiesinę usuwa się poprzez wirowanie lub filtrację.
7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że z kąpieli po sonifikacji usuwa się bakterie, poddając ją mikrofiltracji.
8. Sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi, znamienny tym, że kąpiel po usunięciu z niej tłuszczu i zawiesiny poddaje się działaniu homogenizacji mechanicznej przez co najmniej 1 min., lecz nie dłużej niż 2 min.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że homogenizację prowadzi się w temperaturze chłodniczej wynoszącej 1-7°C.

PL 232 995 Β1
10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że tłuszcz i zawiesinę usuwa się poprzez wirowanie lub filtrację.
11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że z kąpieli po homogenizacji mechanicznej usuwa się bakterie, poddając ją mikrofiltracji.
12. Sposób zwiększenia aktywności proteolitycznej w kąpieli pozostałej po marynowaniu śledzi, znamienny tym, że kąpiel po usunięciu z niej tłuszczu i zawiesiny poddaje się nanofiltracji na filtrach o zdolności rozdzielczej (cut-off) od 1 do 1000 kDa, najkorzystniej nie mniejszej niż 200 kDa lub nie większej niż 10 kDa.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że nanofiltrację prowadzi się w temperaturze chłodniczej wynoszącej 1-7°C.