PL232661B1 - Ester kwasu betulonowego i sposób jego otrzymywania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest ester kwasu betulonowego o wzorze 1 przedstawionym na rysunku.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania tego estru. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym.

Kwas betulonowy jest otrzymywany na drodze chemicznego utlenienia z betuliny, wtórnego metabolitu występującego m.in. w korze brzozowej. Kwas betulonowy posiada aktywność cytotoksyczną wobec linii komórkowych czerniaka Mel 1-4 (Chatterjee S.A. et al.; Appl Environ Microbiol 2000, 66, 3850-3855), linii czerniaka A375, linii raka żołądka MGC-803, linii raka piersi Bcap-37 i MCF-7 (Yang S.J. et al.; Eur J Med Chem 2015, 96, 58-65). Kwas betulonowy wykazuje aktywność przeciwwirusową (Flekhter O.B. et al.; Russ J Bioorg Chem 2004, 30, 80-88) i efekt przeciwzapalny (Govdi A.l. et al.; Chem Sust Dev 2010, 18, 397-402; Vasilevsky S. F. et al.; Bioorg Med Chem 2009, 17, 5164-5169).

Kwas winowy jest kwasem organicznym występującym w wielu roślinach, m.in. w winogronach. Kwas ten jest pochodną dihydroksylową kwasu bursztynowego. Kwas winowy i jego sole są stosowane jako dodatki do żywności w celach przeciwutleniających, do regulacji pH oraz jako emulgatory. Kwas ten jest również wykorzystywany do chelatowania jonów metali, jak kationów wapnia, magnezu i miedzi (II). Występuje w postaci stereoizomerów: (+)-(R,R) czyli L; (-)-(S,S) czyli D; także w postaci mieszaniny racemicznej (DL) oraz jako forma mezo (R,S). Naturalnie występuje enancjomer L-(+) kwasu winowego. Kwas winowy wykazuje działanie prebioteczne, w małych stężeniach działa przeciwbiegunkowo, a w większych - przeczyszczająco. W dermatologii korzysta się z jego ściągających, antyseptycznych i przeciwzapalnych właściwości.

Dotąd nie został otrzymany ester kwasu betulonowego z kwasem winowym.

Istotą wynalazku jest ester kwasu betulonowego.

Istotą sposobu według wynalazku jest to, że kwas betulinowy 33-hydroksylup-20(29)-en-28-owy poddaje się utlenieniu kompleksem trójtlenku chromu z pirydyną z dodatkiem octanu sodu w środowisku chlorku metylenu w celu otrzymania kwasu betulonowego 3-oksolup-20(29)-en-28-owego. Następnie kwas betulonowy przeprowadza się w chlorek kwasowy za pomocą odczynnika chlorującego. Kwas (DL)-winowy (DL)-2,3-dihydroksybutanodiowy przeprowadza się w ester metylowy za pomocą metanolu z dodatkiem H2SO4 w środowisku benzenu. Chlorek kwasu betulonowego i (DL)-winian dimetylu poddaje się estryfikacji w chlorku metylenu. Następnie otrzymany ester kwasu betulonowego poddaje się selektywnej hydrolizie za pomocą lipazy w etanolu, po czym otrzymuje się ester kwasu betulonowego z kwasem (DL)-winowym.

Korzystnie jest, gdy czynnikiem chlorującym jest chlorek oksalilu.

Korzystnie jest, gdy w etapie estryfikacji stosuje się dwukrotny nadmiar (DL)-winianu dimetylu.

Korzystnie jest, gdy do selektywnej hydrolizy wiązań estrowych we fragmencie kwasu winowego stosuje się enzym lipazy immobilizowany z Mucor miehei, w środowisku etanolu.

Sposób, według wynalazku, przedstawiony jest dokładniej w przykładzie wykonania. P r z y k ł a d: Do 500 mg kwasu betulinowego 33-hydroksylup-20(29)-en-28-owego (1,096 mmol) rozpuszczonego w 50 cm3 chlorku metylenu dodaje się kompleksu trójtlenku chromu (VI) z pirydyną (849 mg, 3,289 mmol) oraz bezwodnego octanu sodu (54 mg, 0,658 mmol). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie z mieszaniny reakcyjnej odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt ekstrahuje się z pozostałości heksanem (3 x 50 cm3), następnie ekstrakt przefiltrowuje się przez sączek na lejku. Ekstrakt przenosi się do rozdzielacza i przemywa się 1M HCI. Frakcję organiczną osusza się MgSO4 i odparowuje się heksan. Surowy produkt oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, heksan -aceton 5:1), otrzymując 473 mg kwasu betulonowego 3-oksolup-20(29)-en-28-owego (wydajność 95%).

Do roztworu kwasu (DL)-winowego (DL)-2,3-dihydroksybutanodiowy (2 g, 13,3 mmol) w bezwodnym metanolu (6,05 cm3, 0,1492 mol) wkrapla się 0,37 cm3 (6,57 mmol) H2SO4 o stężeniu 95%. Do mieszaniny dodaje się 20 cm3 bezwodnego benzenu i całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze wrzenia mieszaniny przez 2 godziny. Po tym czasie mieszaninę reakcyjną ochładza się do temperatury pokojowej, przenosi się do rozdzielacza i rozcieńcza się octanem etylu (50 cm3). Frakcję organiczną przemywa się wodą destylowaną (25 cm3), 5% NaHCO3 (25 cm3), solanką (25 cm3), a następnie osusza się za pomocą MgSO4. Rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymuje się 1,661 g produktu w postaci (DL)-winianu dimetylu z wydajnością 70%. Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektroskopowymi: 1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 3,34 (d, J = 8,4 Hz, 2H, 2x -OH), 3,85 (s, 6H, CH3O-I’ i CH3O-I”), 4,55 (d, J = 8,4 Hz, 2H, H-2 i H-3). 13C NMR (150 MHz, CDCI3) δ: 53,07 (C-1' i C-1”), 72,00 (C-2 i C-3), 171,89 (C-1 i C-4). IR (KBr, cm-1): 3471 (s), 3021 (m), 2957 (s), 1747 (s), 1439 (s), 1234 (s), 1131 (m), 1091 (m).

Do 200 mg (0,440 mmol) kwasu betulonowego rozpuszczonego w 10 cm3 chlorku metylenu do-daje się chlorku oksalilu (75 μΙ, 0,880 mmol) i miesza się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodaje się (DL)-winianu dimetylu (157 mg, 0,880 mmol) i miesza się przez 24 godziny. Po tym czasie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się 10 cm3 chlorku metylenu i przemywa się 5% NaHCO3 (10 cm3) oraz solanką (10 cm3). Frakcję organiczną osusza się za pomocą MgSO4, a potem odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszcza się stosując chromatografię kolumnową (żel krzemionkowym, eluent - chlorek metylenu). Otrzymuje się 211 mg estru kwasu betulonowego z (DL)-winianem dimetylu z wydajnością 78%. Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektroskopowymi:

Ester kwasu betulonowego z (DL)-winianem dimetylu 1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 0,85 (m, 1H, H-5); 0,91,0,96, 0,98, 1,00 i 1,05 (pięć s, 15H, CH3-w kwasie betulonowym); 1,09-1,64 (m, 15H, CH2, CH); 1,67 (s, 3H, CH3-30); 1,68-1,92 (m, 4H); 2,16 2,53 (m, 4H, CH2-1 i CH2-2); 2,91 (m, 1H, H-19); 3,11 (d, J = 7,5 Hz, 1H, -OH); 3,80 (s, 3H, CH3O-1”'); 3,81 (s, 3H, CH3O-1”); 4,59 i 4,72 (dwa m, 2H, CH2-29); 4,78 (d, J = 3,9 Hz, 1H, H-3'); 5,42 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-2'). 13C NMR (150 MHz, CDCI3) δ: 14,50 (C-27); 15,66 (C-26); 15,92 (C-25); 19,26 (C-30); 19,60 (C-6); 20,97 (C-24); 21,35 (C-11); 25,46 (C-12); 26,60 (C-23); 29,23 (C-21); 30,21 (C-15); 31,67 (C-16); 33,53 (C-7); 34,09 (C-2); 36,88 (C-10); 36,94 (C-22); 38,14 (C-13); 39,60 (C-1); 40,64 (C-8); 42,48 (C-14); 46,67 (C-18); 47,30 (C-4); 49,12 (C-19); 49,87 (C-9); 52,75 (C-1”); 53,02 (C-1”'); 54,93 (C-5); 56,66 (C-17); 70,57 (C-3'); 72,17 (C-2'); 109,85 (C-29); 150,08 (C-20); 167,12 (C-1'); 171,27 (C-4'); 174,41 (C-28); 218,17 (C-3). IR (KBr, cm-1): 3360 (s), 2951 (s), 2880 (m), 1741 (s), 1706 (s), 1645 (w), 1456 (m), 1376 (w), 1265 (m), 1125 (m), 886 (w).

Do 10 mL 96% etanolu dodaje się 200 mg (0,326 mmol) betulonianu (DL)-winianu dimetylu oraz 333 mg (10 U) enzymu Lipozyme® (lipaza immobilizowana z Mucormiehei, aktywność >30 U/g, Sigma-Aldrich). Reakcję prowadzi się przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Następnie mieszaninę reakcyjną przesącza się przez lejek Schotta, enzym przemywa się metanolem, a potem odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Mieszaninę reakcyjną rozdziela się stosując chromatografię kolumnową (żel krzemionkowy, eluent : chlorek metylenu : metanol w gradiencie objętościowym od 100:0 do 0:100). Następnie czyste frakcje z produktem przeprowadza się w formę protonową z udziałem żywicy jonowymiennej DOWEX (H+). Otrzymuje się 126 mg betulonianu kwasu (DL)-winowego z wydajnością 66%. Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektroskopowymi:

Ester kwasu betulonowego z kwasem (DL)-winowym 1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 0,84 (m, 1H, H-5); 0,90, 0,94, 0,96, 1,01 i 1,06 (pięć s, 15H, CH3-w kwasie betulonowym); 1,11-1,46 (m, 14H, CH2, CH); 1,60 (m, 2H); 1,69 (s, 3H, CH3-30); 1,91 (m, 2H); 2,07 (m, 1H); 2,25 (m, 2H, CH2-1); 2,43 (m, 2H, CH2-2); 2,96 (m, 1H, H-19); 3,20 (d, J = 7,5 Hz, 1H, -OH); 4,58 i 4,71 (dwa m, 2H, CH2-29); 4,80 (d, J = 4,0 Hz, 1H, H-3'); 5,44 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-2'); 11,33 (bs, 2H, 2 x COOH). 13C NMR (150 MHz, CDCh) δ: 14,54 (C-27); 15,75 (C-26); 15,92 (C-25); 19,36 (C-30); 19,58 (C-6); 20,97 (C-24); 21,38 (C-11); 25,51 (C-12); 26,57 (C-23); 29,56 (C-21); 30,44 (C-15); 31,74 (C-16); 33,60 (C-7); 34,08 (C-2); 36,78 (C-10); 36,85 (C-22); 38,12 (C-13); 39,59 (C-1); 40,61 (C-8); 42,42 (C-14); 46,70 (C-18); 47,27 (C-4); 49,22 (C-19); 49,89 (C-9); 54,92 (C-5); 56,29 (C-17); 70,49 (C-3'); 72,22 (C-2'); 109,55 (C-29); 150,43 (C-20); 174,99 (C-4'); 175,15 (C-1'); 175,28 (C-28); 218,03 (C-3). IR (KBr, cm-1): 3355 (s), 2954 (s), 2850-2600 (bs), 1746 (s), 1726 (s), 1705 (s), 1641 (w), 1457 (m), 1378 (m), 1216 (s), 1156 (w), 1132 (w), 1099 (w), 885 (w).

Claims (5)

Zastrzeżenia patentowe

1. Ester kwasu betulonowego o wzorze 1 przedstawionym na rysunku.

2. Sposób otrzymania estru kwasu betulonowego, znamienny tym, że kwas betulinowy 33-hy-droksylup-20(29)-en-28-owy utleniony do kwasu betulonowego 3-oksolup-20(29)-en-28--owego, przeprowadza się w chlorek kwasowy w obecności odczynnika chlorującego, a następnie poddaje się estryfikacji z (DL)-winianem dimetylu (ester dimetylowy kwasu (DL)-2,3--dihydroksybutanodiowego), po czym w drodze selektywnej hydrolizy odblokowuje się grupy karboksylowe we fragmencie kwasu winowego metodą enzymatyczną, w wyniku czego otrzymuje się betulonian kwasu winowego.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako odczynnik chlorujący stosuje się chlorek oksalilu.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie estryfikacji stosuje się dwukrotny nadmiar (DL)-winianu dimetylu.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do selektywnej hydrolizy wiązań estrowych we fragmencie kwasu winowego stosuje się enzym lipazy immobilizowany z Mucormiehei, w środowisku etanolu.