PL232187B1 - Polisacharyd oraz jego pochodne posiadające powinowactwo do fikoliny-3, sposób ich otrzymywania i zastosowania - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy lipopolisacharydu bakteryjnego oraz jego elementów, zwłaszcza natywnych i chemicznie zmodyfikowanych polisacharydów izolowanych z lipopolisacharydów Hafnia alvei, a także koniugatów tych polisacharydów z nośnikami oraz sposobów ich otrzymywania oraz wykorzystania tych substancji jako ligandów dla ludzkiej fikoliny-3.

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy lipopolisacharydu bakteryjnego oraz jego elementów, zwłaszcza natywnych i chemicznie zmodyfikowanych polisacharydów izolowanych z lipopolisacharydów Hafnia alvei, koniugatów tych polisacharydów z nośnikami i wykorzystania samych polisacharydów jak i ich koniugatów jako ligandów dla ludzkiej fikoliny-3 (fikoliny H\antygenu Hakata) w testach pomiaru stężenia funkcjonalnej fikoliny-3, w testach aktywacji układu dopełniacza na drodze lektynowej zależnej od fikoliny-3, procedurach izolacji i oczyszczania fikoliny-3 z płynów ustrojowych człowieka oraz w procedurach uzyskiwania surowicy lub innych płynów ustrojowych pozbawionych fikoliny-3. Polisacharydy izolowane z lipopolisacharydów H. alvei oraz koniugaty tych polisacharydów z nośnikami mogą być również wykorzystane jako ligandy dla rekombinowanych form ludzkiej fikoliny-3, homologów i analogów ludzkiej fikoliny-3 występujących u innych gatunków, rekombinowanych form homologów i analogów ludzkiej fikoliny-3 występujących u innych gatunków.

Lipopolisacharydy (LPS, endotoksyny), zbudowane z części polisacharydowej oraz lipidowej, są amfifilowymi cząsteczkami umiejscowionymi na powierzchni komórek bakterii Gram-ujemnych (Rietschel et al., 1996). Stanowią integralne, a zarazem unikatowe składniki błony zewnętrznej bakteryjnej osłony komórkowej i są niezbędne do funkcjonowania i przeżywalności Gram-ujemnych bakterii. Lipopolisacharydy odgrywają istotną rolę, jako czynniki wirulencji Gram-ujemnych bakterii, w przypadkach sepsy i wstrząsu septycznego (Holst et al., 1996). Z powodu swoich biologicznych aktywności LPS nazywany jest także endotoksyną.

Niezależnie od pochodzenia lipopolisacharydu, cząsteczka ta, wyizolowana z gładkich form bakterii, charakteryzuje się ogólnym planem budowy obejmującym trzy regiony: (1) łańcuch O-swoisty (polisacharyd O-swoisty) - polimer złożony z powtarzających się podjednostek oligosacharydowych, charakteryzujący się wysoką zmiennością strukturalną i determinujący serologiczną swoistość LPS (swoistość O-antygenową); (2) oligocukier rdzenia - region o ograniczonej zmienności w obrębie gatunku, w którym można wyróżnić część dystalną względem lipidu A, nazywaną rdzeniem zewnętrznym lub regionem heksozowym oraz część proksymalną względem lipidu A (rdzeń wewnętrzny, region heptozowy), (3) lipid A - region kotwiczący LPS w błonie zewnętrznej ściany komórkowej bakterii Gram -ujemnych, zbudowany w przypadku większości Enterobacteriaceae z dwucukru 3-D-GlcpN-(1 ^6)-a-DGlcpN podstawionego kwasami tłuszczowymi, grupami fosforanowymi oraz cukrowymi lub niecukrowymi podstawnikami (Rietschel, Brade et al., 1996). Lipid A podstawiony jest oligocukrem rdzenia poprzez wiązanie ketozydowe pomiędzy cząsteczką K do oligocukru rdzenia i resztą β-D-GlcN na końcu nieredukującym szkieletu cukrowego lipidu A. Przypisywane lipopolisacharydowi aktywności biologiczne są ściśle powiązane z cechami strukturalnymi tego regionu, który stanowi centrum toksyczności lipopolisacharydu.

Lipopolisacharydy, podobnie jak bakteryjne DNA, wirusowe RNA, glikolipidy mykobakterii, kwasy lipotejchojowe, mannany drożdży czy lipoproteiny Gram-dodatnich bakterii stanowią tzw. wzorce molekularne związane z patogenami (ang. pathogen-associated molecular pattern, PAMP). Cząsteczki takie to charakterystyczne struktury obecne na patogenach, obce dla organizmów wyższych oraz na tyle ważne dla mikroorganizmu, że nie podlegają częstym zmianom w procesie ewolucji (Aderem i Ulevitch, 2000). W związku z tym, komórki układu odpornościowego wykształciły uniwersalny system receptorów zdolnych do rozpoznawania takich struktur i indukcji szybkiej reakcji obronnej (receptory „Toll-like” TLR, receptory wymiatające „scavenger”, receptor mannozowy oraz różnorodne rozpuszczalne cząsteczki rozpoznające wzorce molekularne PAMP, do których zaliczamy składniki układu dopełniacza, kolektyny oraz antybakteryjne peptydy).

W przypadku lipopolisacharydów, głównym regionem odpowiedzialnym za ich aktywność biologiczną jest lipid A, region o najmniejszej zmienności strukturalnej. Kluczowym receptorem uczestniczącym w mechanizmach wrodzonej odporności i wiążącym region lipidu A w cząsteczce LPS jest kompleks receptorowy CD14/TLR4/MD-2 obecny między innymi na powierzchni makrofagów, monocytów, neutrofilów i limfocytów B (Aderem i Ulevitch, 2000). Następstwem aktywacji szlaku sygnałowego jest wytwarzanie prozapalnych mediatorów przez komórki docelowe dla LPS.

Pozostałe regiony LPS, polisacharyd O-swoisty oraz oligocukier rdzenia, stanowią w przypadku oddziaływania LPS z CD14/TLR4/MD-2 elementy modulujące aktywność lipidu A. Z racji swojej cechy charakterystycznej - wysokiej zmienności strukturalnej, polisacharyd O-swoisty oraz oligocukier rdzenia w mniejszym stopniu aktywują mechanizmy wrodzonej odporności. Niemniej jednak w grupie wszystkich dotychczas zbadanych struktur LPS zidentyfikowano cząsteczki, które zdolne są do aktywacji, innych

PL 232 187 B1 niż powyżej opisany, czynników odporności wrodzonej. Struktury cukrowe niektórych łańcuchów O-swoistych i oligocukrów rdzeni mogą być rozpoznawane przez takie składniki jak np.: lektyna wiążąca mannan (mannan-binding lectin; MBL), i inne ludzkie białka o charakterze lektyn. Lektyny wiążą się do specyficznych struktur cukrowych na powierzchni patogenów, a następnie aktywują odpowiednie mechanizmy efektorowe, takie jak: aktywacja układu dopełniacza lub jego hamowanie, aglutynacja, opsonizacja (ułatwiająca fagocytozę), zahamowanie wzrostu drobnoustrojów, modulacja odpowiedzi prozapalnej lub alegicznej. Selektywność i zdolność odróżniania przez lektyny struktur własnych gospodarza od obcych oparta jest na sterycznych różnicach między rozpoznawanymi węglowodanami (Thiel, 2007).

Z aktywacją układu dopełniacza, jednego z mechanizmów wrodzonej odporności, oprócz MBL, związana jest również odkryta niedawno i słabo scharakteryzowana pod kątem swoich ligandów grupa lektyn nazywanych fikolinami. W przypadku człowieka do grupy tej należy fikolina-1 (M), fikolina-2 (L) oraz fikolina-3 (H), a w przypadku myszy: fikoliny A i B (Thiel, 2007).

Układ dopełniacza to grupa kilkudziesięciu wzajemnie zależnych białek, obecnych we krwi oraz innych płynach ustrojowych. Działanie układu dopełniacza (komplementu) oparte jest na aktywacji kaskady enzymatycznej, prowadzącej do szeregu reakcji mających istotne znaczenie w przebiegu odpowiedzi odpornościowej i reakcji zapalnej. Wyróżniamy trzy drogi aktywacji układu dopełniacza: klasyczną, lektynową i alternatywną. Różnią się one przede wszystkim etapami inicjacji. Aktywacja każdej z dróg zachodzi w sposób kaskadowy i ostatecznie prowadzi do: (i) opsonizacji mikroorganizmów (wspomagania fagocytozy), (ii) chemotaksji komórek o właściwościach żernych do miejsca zapalenia, (iii) eliminacji zmodyfikowanych bądź też uszkodzonych komórek gospodarza, (iv) bezpośredniej lizy komórek bakteryjnych, wirusów, pasożytów i grzybów oraz (v) inicjacji reakcji zapalnej.

W przypadku aktywacji układu dopełniacza na drodze lektynowej, kluczowymi cząsteczkami rozpoznającymi wzorce PAMP są MBL, fikolina-1 (M), fikolina-2 (L), fikolina-3 (H). Wszystkie te białka charakteryzuje podobny plan budowy. Posiadają one strukturę oligomeryczną o podstawowej podjednostce zbudowanej z trzech łańcuchów polipeptydowych. Każdy łańcuch polipeptydowy zbudowany jest z domeny N-końcowej zawierającej dużą liczbę reszt cysteiny, regionu kolagenopodobnego oraz domeny rozpoznającej ligandy. W przypadku białka MBL jej role pełni typowa domena lektynowa CRD (ang. carbohydrate-recognition domain, domena rozpoznająca węglowodany). W przypadku fikolin jest to region fibrynogenopodobny (FBG), o odmiennej strukturze (Thiel, 2007).

Pośród wymienionych lektyn, obecny stan techniki najlepiej opisuje białko MBL i wiązane przez to białko ligandy pochodzące od patogenów. Wiadomo, że MBL wykazuje specyficzność dla następujących monocukrów: D-mannozy, L-fukozy, N-acetylo-D-glukozaminy, D-glukozy, występujących powszechnie jako składniki struktur powierzchniowych u patogenów, takich jak bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie, drożdże, pasożyty, mykobakterie i wirusy (Degn et al., 2009).

W odróżnieniu od molekularnych mechanizmów aktywacji drogi lektynowej zależnej od MBL, aktywacja układu dopełniacza na drodze lektynowej przy udziale fikolin, a w szczególności jej pierwsze etapy, czyli oddziaływanie fikolin z PAMP stanowią najmniej scharakteryzowany mechanizm w obrębie układu dopełniacza. Fikoliny stanowią dominującą, pod względem stężenia w surowicy, frakcję cząsteczek odpowiedzialnych za aktywację drogi lektynowej. Średnie stężenie w surowicy fikoliny-3 (H), fikoliny-2 (M) i fikoliny-1 (L) wynosi odpowiednio 25 pg/ml, 5 pg/ml i <0,1 pg/ml, przy poziomie MBL o wartości około 1-3 pg/ml (Garred et al., 2009). Swoistość fikolin względem ligandów jest słabo poznana. Wiedza na ten temat ogranicza się do obserwacji, że potencjalnymi ligandami dla fikolin mogą być N-acetylowe grupy naturalnie występujących cukrów takich jak, GlcNAc i GalNAc, czy N-acetylowanej glicyny. Pośród ligandów dla fikolin wymienia się również sztucznie uzyskiwane ligandy takie jak, N-acetylowana albumina surowicy wołowej (BSA-NAc), BSA-GlcNAc czy N-acetylowane lipoproteiny o małej gęstości (LDL-NAc). Wykazano, że fikoliny zdolne są również do wiązania białka C-reaktywnego (CRP) (Thiel, 2007). Wszystkie fikoliny, podobnie jak MBL, wiążą proteazy serynowe MASP (MBL-associated serine proteases), co pozwala im na inicjację lektynowej drogi aktywacji układu dopełniacza. W procesie tym kluczową rolę odgrywa enzym MASP-2. Wśród wzorców molekularnych związanych z patogenami rozpoznawanymi przez ludzkie fikoliny wymienia się w literaturze nieliczne, dość zróżnicowane z punktu widzenia struktury chemicznej, przykłady. Najwięcej wiadomo o ligandach dla fikoliny M i L. Pośród ligandów fikoliny-1 (M) identyfikowano: kwas lipotejchojowy bakterii Gram-dodatnich, antygeny powierzchniowe bakterii Staphylococcus aureus i Salmonella typhimurium, 1,3-p-D-glukan grzybów, kwasy sjalowe i ich O-acetylowane w pozycji 9 pochodne (Gout et al., 2009). Lektyna ta wykazuje powinowactwo do N-acetylo-D-glukozaminy (GlcNAc), N-acetylo-D-galaktozaminy (GalNAc) oraz

PL 232 187 B1 kwasu sjalowego (Neu5Ac), wiążąc je poprzez grupy acetylowe (Garlatti et al., Liu et al., 2005; Matsushita, 2007; Runza et al., 2008). Ta, typowa dla fikolin właściwość, umożliwia także przyłączanie się do ligandów niecukrowych, jak N-acetylo-L-cysteina czy acetylowana albumina (Wittenborn et al., 2010). Miejsce wiązania, zlokalizowane w domenie fibrynogenowej jest homologiczne z miejscem S1 tachylektyny. Fikolina M rozpoznaje struktury powierzchniowe niektórych szczepów gronkowców, paciorkowców, E. coli i S. enterica (Runza, Schwaeble et al., 2008).

Fikolina-2 (L) wykazuje powinowactwo do N-acetylo-D-glukozaminy, N-acetylo-D-galaktozaminy oraz kwasu sjalowego, ale może łączyć się też z ligandami niecukrowymi, takimi jak N-acetylocysteina, N-acetyloglicyna, acetylocholina, elastyna czy niektóre kortykosteroidy, a także utleniona i acetylowana forma LDL, czy DNA (Matsushita, 2007; Thiel, 2007; Runza, Schwaeble et al., 2008; Garred, Honore et al., 2009; Garred et al., 2010; Matsushita, 2010). Wykazano, że fikolina L rozpoznaje niektóre lipopolisacharydy, wielocukry otoczkowe, 3-1-3-D-glukany grzybowe oraz kwasy lipotejchojowe. Dzięki temu wiąże się do niektórych szczepów S. enterica i E. coli, ale przede wszystkim do gronkowców i paciorkowców: Staphylococus aureus, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes i S. agalactiae (Matsushita, 2007). Prawdopodobnie, szczególnie ważne jest wiązanie do beta-hemolizujących paciorkowców grupy B (Streptococcus agalactiae), które są najczęstszą przyczyną zapalenia opon mózgowych i sepsy u noworodków. Pośród ligandów dla tej lektyny opisano także (Gout, Garlatti et al., 2009): trójcukry i tetrasacharydy zawierające terminalną LacNAc (3-Gal[3OSO3][6OSO3]-(1->4)-|i-GlcNAc-nośnik) lub GlcNAc, heparynę (jej domenę fibrynogenową), wysokosiarczanowane glikozoaminoglikany.

Fikolina H (określana także jako fikolina 3 lub antygen Hakata, początkowo opisana jako termolabilna β2 makroglobulina) jest syntetyzowana w hepatocytach, komórkach nabłonka przewodów żółciowych, pęcherzykowych typu II, nabłonka oskrzeli i glejowych. Niski poziom ekspresji stwierdzono także w komórkach serca, nerek, trzustki, śledziony, i łożyska. Białko wydzielane jest do krwi, przewodów żółciowych oraz śluzu pokrywającego drogi oddechowe. Ponieważ ilość fikoliny H syntetyzowanej w płucach jest wyższa niż w wątrobie, prawdopodobnie lektyna ta pełni nie tylko ogólnoustrojową (jako wydzielana do krwi), ale też miejscową rolę ochronną w układzie oddechowym. Jej stężenie w surowicach zdrowych, dorosłych ludzi jest stosunkowo wysokie. Według oryginalnej, powszechnie cytowanej pracy (Yae et al., 1991) wynosi od 7 do 23 pg/ml (przeciętnie około 18 pg/ml). Ostatnie dane opublikowane przez Andersen i wsp. (Andersen et al., 2009) wskazują, że może być ono nawet wyższe (przeciętnie powyżej 32 pg/ml (zakres od 10 do ponad 80 pg/ml). Pośród ligandów fikoliny-3 (H) identyfikowano (Gout, Garlatti et al., 2009): polisacharyd izolowany z bakterii Aerococcus viridans 86965 (prawdopodobnie polisacharyd otoczkowy) (Sugimoto et al., 1998; Matsushita et al., 2002), BSA-NAc (Lacroix et al., 2009; Munthe-Fog et al., 2009), BSA-Gal, D-fukozę i D-galaktozę (Gout, Garlatti et al., 2009), antygeny powierzchniowe komórek linii białaczkowej limfocytów T (linii komórkowej Jurkat). Fikolina-3 wiąże się z LPS Salmonella Minnesota i Typhimurium oraz E. coli, co wykazana pośrednio w testach na aglutynację i hamowanie aglutynacji ludzkich erytrocytów (Sugimoto, Yae et al., 1998). Cytowane powyżej badania Gout i wsp. (Gout, Garlatti et al., 2009) należą jak na razie do najbardziej precyzyjnych prób określenia specyficzności fikolin względem ligandów cukrowych. W badaniach wykorzystano matryce (ang. glyco-array) zawierające 377 związanych glikanów. Przeszukiwane, naturalnie występujące i syntetyczne glikany obejmowały głównie struktury pochodzące z komórek ssaków.

Jak pokazano, specyficzność fikoliny-3 (H) względem ligandów jest bardzo słabo scharakteryzowana. Ponadto pod względem sekwencji aminokwasowej fikolina-3 (H) w dużym stopniu różni się od pozostałych fikolin, wykazując jedynie 45% homologii w stosunku do fikoliny-1 i 2 oraz 58% homologii w obrębie domeny FGB. Jeśli chodzi o różnego rodzaju związki syntetyczne, ostatnio wykazano, że fikolina-3 wiąże również BSA-NAc (Munthe-Fog, Hummelshoj et al., 2009). Ligand BSA-NAc użyto w cytowanych badaniach do indukcji aktywacji drogi lektynowej przez ludzką surowicę. Zarówno oddziaływanie fikoliny-3 z BSA-NAc jak i z bakteriami A. viridans 86965 i ich polisacharydem nie zostały scharakteryzowane na poziomie molekularnym (Tsujimura et al., 2002). Jak wspomniano, swoistość fikolin jest bardzo słabo poznana i obecnie trwają spory o charakter chemiczny ligandów przez nie rozpoznawanych. Struktura chemiczna niektórych PAMP, czy też obecność we krwi specyficznych przeciwciał pozwala przypuszczać, że mogą one aktywować układ dopełniacza jednocześnie na wszystkich drogach: klasycznej, lektynowej i alternatywnej. Ponadto, drogi aktywacji układu dopełniacza są na pewnych etapach od siebie zależne. Dotychczas opisano mechanizm amplifikacji drogi klasycznej i lektynowej przez aktywację drogi alternatywnej (Degn, Hansen et al., 2009).

Badania mające na celu wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw tych procesów prowadzone in vitro, in vivo czy też na wyizolowanych układach modelowych typu ligand-białko wymagają

PL 232 187 B1 całego repertuaru narzędzi eksperymentalnych pozwalających na izolację i oczyszczenie kluczowych białek, wykrywanie ich poziomu w płynach ustrojowych, testowanie ich aktywności przy użyciu metod immunochemicznych czy blokowanie ich aktywności. Tak jak w przypadku większości badań dotyczących mechanizmów układu odpornościowego, sam układ dopełniacza stanowi złożony problem z punktu widzenia technik badawczych.

Obecnie duży nacisk kładzie się na wytworzenie takich narzędzi eksperymentalnych, które pozwalają badać poszczególne drogi aktywacji komplementu niezależnie, w warunkach zbliżonych do fizjologicznych (Herpers et al., 2009; Inoshita et al., 2009). Kluczowym w tych badaniach wydaje się być dobór odpowiedniego ligandu, co w przypadku fikolin jest niezwykle trudne w związku z brakiem odpowiednich danych. Opisanym i wykorzystywanym do takich celów ligandem dla fikoliny-3 (H) jest koniugat BSA-NAc, który jednak nie występuje w naturze, a otrzymany został w wyniku syntezy chemicznej.

Oznaczanie poziomu, aktywności i zdolności fikolin do aktywacji układu dopełniacza ma istotne znaczenie z punktu widzenia diagnozowania i charakterystyki niedoborów odporności dotyczących dopełniacza, często związanych z polimorfizmami w obrębie genów kodujących te le ktyny. Skutkami mutacji mogą być, jak pokazuje to dość dobrze scharakteryzowany przykład ludzkiego MBL, zaburzenia struktury i funkcji, krótszy okres półtrwania i obniżone stężenie w surowicy. W przypadku MBL konsekwencje takich niedoborów są szczególnie poważne u osób z niedojrzałym lub niesprawnym układem odpornościowym i najczęściej obejmują nasiloną podatność na zakażenia (niekiedy zagrażające życiu). Można przypuszczać, że w wyniku dalszych badań nad znaczeniem fikolin zostanie wyjaśniona i udokumentowana ich rola w odpowiedzi odpornościowej oraz skutki kliniczne związane z ich niedoborami. Przykładowo, dane literaturowe na temat potencjalnych zagrożeń, jakie mogą być skutkiem niedoborów fikoliny-2 (L) są jeszcze bardzo skąpe. Wyższą częstość występowania niedoboru (definiowanego ilościowo) zaobserwowano u kobiet, u których dochodziło do nawrotowych poronień (Kilpatrick et al., 1999). Znacząco niższe stężenia fikoliny L obserwuje się też u kobiet ciężarnych, u których występują stany przedrzucawkowe, w porównaniu ze zdrowymi ciężarnymi (Wang et al., 2007). Badanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów genu kodującego fikolinę-2 - FCN2 i stężenia białka może być w przyszłości pożytecznym narzędziem diagnostycznym. U dzieci z niedoborami fikoliny L występuje znacząco więcej mutacji w pozycjach -64 i 6424 niż u dzieci z wysokimi stężeniami tego białka. Przeciwnie, częstość alleli wariantywnych pary -4 i 6359, jest istotnie niższa u dzieci z niedoborami fikoliny L (Cedzynski et al., 2007). Zaobserwowano też wyższą częstość występowania niedoboru ilościowego fikoliny L u dzieci z nawracającymi zakażeniami układu oddechowego z towarzyszącą astmą/alergicznym nieżytem nosa, w porównaniu z dziećmi zdrowymi (lecz nie wśród dzieci z nawracającymi zakażeniami z wykluczonymi chorobami alergicznymi) (Atkinson et al., 2004; Cedzynski et al., 2009). Wykazano, że niedobory fikoliny L istotnie nasilają ryzyko przedwczesnego porodu, niskiej wagi urodzeniowej i zakażeń okołoporodowych (Swierzko et al., 2009).

Wiedza na temat fizjologicznej roli fikoliny H i klinicznego znaczenia jej niedoborów jest dotychczas bardzo wąska. Wykazano istotnie niższe stężenia tej lektyny u osób z sarkoidozą, w porównaniu z grupą kontrolną (Svendsen et al., 2008). Nie udało się jednak stwierdzić, czy niedobór tego czynnika wpływa na ryzyko wystąpienia choroby, czy też procesy chorobowe wpływają na regulację ekspresji genu FCN3 lub aktywne białko jest konsumowane. Niższe stężenia fikoliny H występują również u chorych na systemowy toczeń rumieniowaty, co jak wspomniano, jest związane z wytwarzaniem autoprzeciwciał skierowanych przeciwko temu białku, nie zaś z genetycznie uwarunkowanymi zaburzeniami syntezy (Yae, Inaba et al., 1991; Andersen, Munthe-Fog et al., 2009). Surowicze stężenie fikoliny H wzrasta kilkukrotnie w czasie ciąży, co może sugerować jej istotne znaczenie ochronne. Jednakże, jak wspomniano wyżej, u kobiet ciężarnych, u których występują stany przedrzucawkowe obserwuje się znacząco niższe stężenia tej lektyny, w porównaniu ze zdrowymi ciężarnymi. W syncytiotrofoblastach pochodzących z łożysk kobiet chorych wykrywa się znaczne ilości fikoliny H, co przypuszczalnie ma związek z lokalnym procesem zapalnym, a więc prawdopodobnym udziałem białka w patologii (Wang, Yim et al., 2007). Ostatnio, Schlapbach i wsp. wykazali, że niskie stężenia fikoliny H w surowicy dzieci poddawanych chemioterapii przeciwnowotworowej nasilają ryzyko wystąpienia gorączki neutropenicznej i sepsy (Schlapbach et al., 2009). Fukutomi i wsp. zaobserwowali, że stężenie fikoliny H obniża się też wraz z postępowaniem marskości wątroby, w związku z czym badanie jej stężenia może być markerem diagnostycznym wskazującym na stopień upośledzenia czynności tego narządu (Fukutomi et al., 1996).

PL232 187 Β1

Leczenie niektórych niedoborów odporności polega na podawaniu (substytucji) odpowiedniego czynnika otrzymanego od zdrowych dawców lub jego formy rekombinowanej. Rekombinowane lub natywne białko MBL poddawane jest obecnie próbom klinicznym, jako potencjalny lek w przypadkach niedoboru tej lektyny.

Punktem wyjścia dla diagnostyki niedoborów, monitorowania terapii takich niedoborów, jak i wyjaśniania ich mechanizmów są metody oznaczania stężeń i aktywności kluczowych w płynach ustrojowych. Punktem wyjścia dla leczenia tego typu niedoborów jest także uzyskanie aktywnych, dobrze oczyszczonych preparatów natywnych lub ich rekombinowanych form.

W przypadku fikoliny-3, obecnie wykorzystuje się głównie dwie metody oznaczania stężenia tego białka w płynach ustrojowych. Jedna z nich (typu ,,sandwich”-ELISA), opiera się na użyciu monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiej fikolinie-3 (H) zarówno jako tzw. „przeciwciała wychwytującego”, jak i do detekcji białka. Druga metoda polega na użyciu zmodyfikowanej chemicznie, poprzez N-acetylację, surowiczej albuminy wołowej - (BSA-NAc). Obecnie, na rynku dostępny jest test firmy Hycult pozwalający na określenie całkowitego stężenia fikoliny-3 (H) metodą ELISA typu „sandwich”. Jeśli chodzi o drugą metodę, wykorzystującą jako ligand koniugat BSA-NAc, ostatnio ukazało się doniesienie o możliwości jej zastosowania do oceny aktywności kompleksów fikolina-3\MASP (Munthe-Fog, Hummelshoj et al., 2009).

Pierwszy sposób pozwala oznaczyć poziom białka w surowicy, który niekoniecznie musi korelować z formą aktywną fikoliny-3. Drugi sposób posiada słabo opisany molekularny mechanizm oddziaływania fikoliny-3 (H) z grupami N-acetylowanymi, a BSA-NAc nie jest ligandem naturalnie występującym w przyrodzie.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie ligandów specyficznie wiążących się z fikoliną 3 oraz sposobu ich otrzymywania, które mogłyby być wykorzystane do oznaczenia stężenia formy aktywnej fikoliny 3 oraz, dodatkowo, do określania jej aktywności.

Nieoczekiwanie tak określony cel został zrealizowany w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest polisacharyd posiadający powinowactwo do fikoliny-3 lub jego pochodna charakteryzujący się tym, że jego struktura jest opisana ogólnym wzorem:

PDt-(PD)_n-[Hep]-Kdo gdzie:

n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 100, korzystnie mniejszą od 50, szczególnie korzystnie mniejszą od 40, a w przypadku polisacharydów pochodzenia bakteryjnego zazwyczaj mniejszą od 30,

PDt oznacza:

- podjednostkę oligocukrową PD1t o wzorze:

p-D-Quip4NAc-Cl-41)-Gi^,o4’3-P--?3>p“D-Gal/>(l—>3)-α-Γ-01ορΝΆο(1·4 * [5-1.)-(/0.^^^0-0-41)-(-3^-(3^-43/-^-^-13-312/-(1-43)-^-0-(3-1.02^.^0(] —* ΐ 'Τι ,.1 β D-GlCft/NAc β-D-GlcfNAc ^J3

II

OAcOAc (50-80%) (5Π-8ΰ%) podjednostkę oligocukrową PD2_t o wzorze:

C<-L>-G'iCp

p-D-QuiMKAc-(l 1 )-Gro-(:5 -P->3 } B-D-Gal/>·(v->3> «-!> Gk;j MAc(l -* >	p-i)-Quip4N Ac-(1 -41 )-G ro-( 3-P—>3>-(5’j3-Ga 12/-(1-43)-0^)3-0 IcjiNAcfl - 6
?	6
	0Ac (50-80%)	0Ac (5lL8i)%)
3		3
CAc		OAc
(50-80%)		(50-80%)

PL232 187 Β1

- podjednostkę oligocukrową PD3t o wzorze:

<x-D-G'.cp

I

... ⁴.

^-D-Quij>4NAe-(l—>l)-Gto-(3-P—*3)-P-.D-Gaip^j —»3)-a-.D-G!cpi«Ae(l-» .

i p-D-GlapNAc

I OAc (50-80%)

p.D.<?uv)4NAc.('.->l)-Gn>-(3-P-»j}.p-D-Oal/!-(1->3>«-D-OkBNAc(l-» i

i

3-D.GiCpNAc

I

OAc (50-80%)

PD oznacza:

- podjednostkę oligocukrową PD1 o wzorze:

Λϋ-αΐψ i

t β-ΠΌΙόρΝΑυ 3

OAc (50-«ΰ%)

-+3)-3·Π<?ιηρ4ΚΑβ-(1-4ί>ί3; υ-(.νΡ-κ3}-β-ΙΜί4ΐ/ί< L-*3> ίχ-[ J.tf IcpNAcf i -4 β-D-Gl^NAc 3

OAc (50-80%)

- podjednostkę oligocukrową PD2 o wzorze:

^3V^D-Quj/?4NAc-fl—1>*><3j.oG-P-»3>fl*I)-0·;!WI •^^,3)-(t'E>-Cł1c/>NAci 1 , 2' 6 ’ i i

P-fr^HAc ^OAc(50-80%)

I

OAc (50^0%) —ł31“3*O-Quy?1tiAę\i—*1)·Οαι·ί3··Ρ—*3>·β· ί)-04)ρ-( ί—>3/·α·Ρ· )

3-McpNAc

I OAc (50-80%) ^0Ac (50-30%) lub

- podjednostkę oligocukrową PD3 o wzorze:

a-D-Gląp i

-4 3 H^D-OuhMNAc-ą-f 1 yC’iO<i-IM3j-p-Ii-Galp-t t -*3> ct-D-Gk^NAtiJ -ł , f

I β-Π-ζΙΙορΝΑβ

I OAc (50-80%)

-[Hep]-Kdo oznacza dwucukier o wzorze:

L-tŁ-D-Hepp i

“4 7}·Κ<Ιο

-*3)*β-Ρ·0*.ιΐ;4ΝΑ,·;-ί.ΐ—»·,Ι)Ότο-(.·Ι-Ρ—D-Cral/J-< I —*3 J-gł- U -ΟΚ'^ΝΆ cf J —» Ϊ

P-D-Gic/iNAt

I

OAc (50-80%)

Korzystnie polisacharyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera cząsteczki wybrane spośród polisacharydów o ogólnym wzorze: PD1t-PD1-[Hep]-Kdo, PD2t-PD2-[Hep]-Kdo lub PD3tPD3-[Hep]-Kdo.

PL 232 187 B1

Równie korzystnie pochodna polisacharydu według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest wybrana z grupy obejmującej zredukowany polisacharyd PDt-(PD)n-[Hep]-Kdo, koniugat tego polisacharydu ze znanym nośnikiem białkowym lub złożem chromatograficznym.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zredukowany polisacharyd PDt(PD)n-[Hep]-Kdo oznacza, że reszta Kdo w wyniku redukcji, zwłaszcza w wyniku reakcji z borowodorkiem sodu, występuje w formie linearnego polialkoholu z grupą karboksylową na pierwszym węglu i grupą deoksy na węglu trzecim -1-karboksy-3-deoksyoktitol.

Znanymi nośnikami białkowymi, które mogą być wykorzystane do uzyskania koniugatu według wynalazku są: albumina surowicy kręgowców, albumina jaja.

Znanymi złożami chromatograficznymi, które mogą być wykorzystane do uzyskania koniugatu według wynalazku są: korzystnie modyfikowana agaroza, celuloza lub poliakryloamid.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania polisacharydów lub ich pochodnych posiadających powinowactwo do fikoliny-3 charakteryzujący się tym, że:

a) izoluje się lipopolisacharyd bakteryjny ze szczepu H. alvei, przy czym prowadzi się hodowlę szczepu H. alvei wybranego spośród szczepów: H. alvei 981 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00030, H. alvei 1200 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00031, H. alvei 1203 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00032, H. alvei 1205 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00033 lub H. alvei 1208 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00034,

b) uzyskany lipopolisacharyd poddaje się degradacji i oddziela się frakcję polisacharydową,

c) z uzyskanej frakcji polisacharydowej wyodrębnia się frakcję zawierającą polisacharydy składające się z podjednostek o masie cząsteczkowej od 2400 kDa do 2600 kDa,

d) otrzymane polisacharydy ewentualnie redukuje się, zwłaszcza w obecności NaBH4, i korzystnie sprzęga się ze znanym nośnikiem białkowym lub złożem chromatograficznym.

Powyższe szczepy zostały zdeponowane dn. 07.06.2010 w działającej zgodnie z traktatem budapesztańskiem Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu pod numerami przedstawionymi powyżej.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w etapie a) prowadzi się ekstrakcję lipopolisacharydu z masy bakteryjnej w roztworze wodnym fenolu, korzystnie roztworem fenolu o stężeniu około 45%, w temperaturze około 65°C przez około 15 minut, a następnie odzyskuje się lipopolisacharyd z oddzielonej fazy wodnej.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w etapie b) oddzielony lipopolisacharyd poddaje się łagodnej hydrolizie w roztworze kwasu octowego o stężeniu około 1 -1.5% w temperaturze około 100°C przez około od 15 do 60 min.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w etapie c) frakcję polisacharydową rozdziela się chromatograficznie oddzielając łańcuchy O-swoiste od polisacharydów o krótszych łańcuchach oraz oligocukrów rdzenia, korzystnie na kolumnie wypełnionej złożem poliakryloamidowym, takim jak np. komercyjnie dostępny Bio-Gel P-10, zrównoważonej 0.05 M buforem zawierającym pirydyna/kwas octowy/woda w stosunku 10/4/986 w pH około 5.6.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w etapie d) otrzymane polisacharydy redukuje się i sprzęga z nośnikiem białkowym, zwłaszcza albuminą surowicy bydlęcej lub złożem chromatograficznym, szczególnie korzystnie modyfikowaną agarozą, taką jak np. komercyjnie dostępne złoże Sepharose.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie lipopolisacharydu bakteryjnego lub zawartego w nim polisacharydu lub jego pochodnej jako ligandu dla fikoliny-3, zwłaszcza do oczyszczania lub wykrywania fikoliny-3 lub jej pochodnych.

Określenie fikolina-3 lub jej pochodne stosowane w niniejszym opisie oznacza ludzką fikolinę-3, przy czym może to być białko pochodzenia naturalnego lub uzyskiwane sztucznie, zwłaszcza białko rekombinowane, w tym ewentualne mutanty i inne pochodne posiadające zasadniczo aktywność naturalnej fikoliny-3.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosowany jest lipopolisacharyd uzyskany ze szczepów: H. alvei 981,1200, 1203, 1205, 1208, które jak opisano powyżej zostały zdeponowane w związku z niniejszym zgłoszeniem w PCM, lub zawarty w nim polisacharyd lub jego pochodna.

PL 232 187 B1

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosowany jest polisacharyd lub jego pochodna według wynalazku określony powyżej lub otrzymany sposobem według wynalazku określonym powyżej.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że pochodną fikoliny-3 jest kompleks fikoliny-3 z proteazami serynowymi MASP z surowicy lub osocza.

Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że wykrywanie prowadzi się w celu określenia aktywności i/lub poziomu fikoliny-3 lub jej pochodnych w surowicy lub innych płynach ustrojowych.

Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że oczyszczanie prowadzi się w celu uzyskania surowicy lub osocza pozbawionych fikoliny-3.

Przechodząc do szczegółowego omówienia jego wybranych korzystnych realizacji, należy nadmienić, że punktem wyjścia dla przedstawionego wynalazku było odkrycie silnego oddziaływania lipopolisacharydów bakteryjnych, w szczególności LPS izolowanych ze szczepów H. alvei 2, 23, 37, 38, 981, 1200, 1203, 1205, 1208 w reakcji dot-blot z ludzką fikoliną-3 (H). Para ta: LPS-fikolina stanowi kolejny przykład kluczowego dla odporności wrodzonej oddziaływania. Lipopolisacharyd (LPS) stanowi bowiem jeden z wzorców molekularnych PAMP - antygen powierzchniowy i główny czynnik wirulencji bakterii Gram-ujemnych, a fikolina-3 (H) składnik układu dopełniacza (kluczowego mechanizmu wrodzonej odporności), który wiąże LPS i aktywuje kaskadę dopełniacza na drodze lektynowej.

W toku prac badawczych prowadzących do niniejszego wynalazku, twórcy wynalazku zidentyfikowali i wypreparowali ligandy pochodzenia bakteryjnego specyficznie i silnie wiążące m.in. ludzką fikolinę-3 (H). W korzystnym przykładzie wykonania, ligandy te stanowią polisacharydowe fragmenty lipopolisacharydów H. alvei otrzymywane na drodze chemicznej degradacji lipopolisacharydu. W wyniku badań przesiewowych lipopolisacharydów H. alveizidentyfikowano 9 LPS posiadających w swojej strukturze regiony wiązane przez ludzką fikolinę-3 (H): LPS H. alvei 2, 23, 37, 38, 981, 1200, 1203, 1205, 1208. Pełna struktura tych lipopolisacharydów nie była dotychczas poznana i opublikowana. Jedyne dostępne informacje dotyczyły struktur powtarzających się podjednostek łańcuchów O-swoistych LPS 2, 23, 38, 1200, 1203, 1205, 1208 (Gamian et al., 1991; Katzenellenbogen et al., 1992; Katzenellenbogen et al., 1999; Dag et al., 2004). Struktury te ustalono wykorzystując do analizy instrumentalnej i chemicznej wysokocząsteczkowe frakcje polisacharydów O-swoistych odpowiadające liczbie podjednostek większej lub równej 4. Frakcje takie uzyskiwano przez poddanie lipopolisacharydów kwaśnej hydrolizie w obecności detergentu (1.5% CH3COOH, 2% SDS) w temp. 100°C przez 15 min. W warunkach takich hydrolizie ulega kwasolabilne wiązanie ketozydowe pomiędzy lipidem A a częścią cukrową LPS (oligocukrem rdzenia podstawionym łańcuchem O-swoistym). Po oddzieleniu lipidu A, uzyskaną mieszaninę poli- i oligosacharydów frakcjonowano przy użyciu chromatografii żelowej. W odniesieniu do dotychczasowej wiedzy na temat ogólnej budowy enterobakteryjnych lipopolisacharydów, niedegradowalne w takich warunkach wiązanie glikozydowe pomiędzy oligocukrem rdzenia a łańcuchem O-swoistym powinno skutkować zazwyczaj produktami zawierającymi w swojej strukturze oligocukier rdzenia jak i frakcje polisacharydów zbudowane z oligocukru rdzenia podstawionego różną liczbą powtarzających się podjednostek łańcucha O-swoistego. W toku badań nad lipopolisacharydami H. alvei prowadzącymi do niniejszego wynalazku natrafiono na nietypowy, w odniesieniu do dotychczas poznanych enterobakteryjnych LPS, element strukturalny - obecność cząsteczki Kdoll w regionie dystalnym oligocukru rdzenia (Lukasiewicz et al., 2009). Wyizolowano fragment LPS H. alvei 32 zawierający część cukrową lipidu A podstawioną oligocukrem rdzenia zakończonym trójcukrowym fragmentem [L-a-D-Hepp-(1^4)-[a-DGalp6OAc-(1 >7)] -a-Kdop-(2>]. Obecność dwóch regionów Kdo w obrębie cząsteczki LPS zmienia zasadniczo skład mieszaniny poli- i oligosacharydów powstałych w wyniku kwaśnej hydrolizy LPS. W przypadku LPS H. alveidochodzi do hydrolizy wiązania ketozydowego w dwóch miejscach: pomiędzy lipidem A i podstawiającą go cząsteczką Kdol oraz pomiędzy Kdoll w regionie zewnętrznym oligocukru rdzenia a pozostałą strukturą regionu rdzeniowego. W przypadku lipopolisacharydów, których fragmenty polisacharydowe stanowią podstawę jednego z aspektów niniejszego wynalazku, udowodniono, że cząsteczka Kdoll stanowi miejsce podstawienia dla łańcucha O-swoistego. W związku z tym w wyniku kwaśnej hydrolizy LPS H. alvei 23, 1200, 1203, 1205 udało się uzyskać polisacharydy pozbawione niemal całego regionu rdzeniowego z elementem Hep-Kdo na ich końcu redukującym. Niniejsze doniesienie stanowi tym samym pierwsze ujawnienie dotyczące obecności tego elementu we frakcjach polisacharydów O-swoistych izolowanych z LPS H. alvei 1200, 1203 i 1205, złożonych z jednej, dwóch i większej liczby podjednostek cukrowych. Jednocześnie niniejszy wynalazek stanowi pierwsze doniesienie dotyczące struktury biologicznej podjednostki polisacharydu O-swoistego LPS H. alvei 1200, 1203, 1205.

PL 232 187 B1

Opisanego elementu strukturalnego Hep-Kdo nie identyfikowano we wcześniej przytoczonych publikacjach dotyczących analizy strukturalnej podjednostek łańcuchów O-swoistych LPS H. alvei, przeprowadzonych na frakcjach zawierających polimery o liczbie podjednostek większej niż 4-5, ze względu na przewagę składników samej podjednostki (Jachymek et al., 1995; Niedziela et al., 1996; Petersson et al., 1997; Jachymek et al., 1999; Dag et al., 2004). Jedynie w przypadku LPS H. alvei 2, wyizolowano fragment łańcucha O-swoistego, zawierający 4 z 8 reszt cukrowych podjednostki łańcucha O-swoistego, posiadający na końcu redukującym dwucukier Hep-Kdo (Gamian, Romanowska et al., 1991).

Przykładowe ligandy fikoliny-3 ujawnione w niniejszym zgłoszeniu stanowią polisacharydowe fragmenty lipopolisacharydów H. alvei 1200, 1203, 1205, a szczególnie LPS 1200, otrzymywane na drodze chemicznej degradacji lipopolisacharydu. Polisacharydy te posiadają struktury o ogólnych wzorach:

PS1: PD1t-(PD1)n-[Hep]-Kdo,

PS2: PD2t-(PD2)n-[Hep]-Kdo,

PS3: PD3t-(PD3)n-[Hep]-Kdo, w których symbolem PD oznaczono podjednostkę łańcuchów O-swoistych izolowanych odpowiednio z lipopolisacharydów H. alvei 1200 (PD1), 1203 (PD2) i 1205 (PD3). Przy tym wszystkie polisacharydy są dodatkowo O-acetylowane (Rye. 1). Liczba n oznacza liczbę większą lub równą 0. Dwucukier oznaczony symbolem „[Hep]-Kdo” posiada strukturę —>7)-[L-glycero-D-manno-Hep-(1 ->8)-]-Kdo. Dwucukier ten jest podstawiany przez pierwszą resztę podjednostki łańcucha O-swoistego, niezależnie od tego czy jest to podjednostka PD1, PD2 czy PD3, w pozycji 7 reszty Kdo. W przypadku PD1, PD2, PD3 tą pierwszą resztą jest >3)-a-D-GlcpNAc. Struktury fragmentów PD1t-(PD1)n-[Hep]-Kdo (n=1), PD2t-(PD2)n-[Hep]-Kdo (n=1), PD3t-(PD3)n-[Hep]-Kdo (n=1) przedstawiono na Ryc. 1. Symbolami PD1t, PD2t, i PD3t oznaczono terminalne podjednostki na końcu nieredukującym każdego polisacharydu. W przypadku PD1t, PD2t i PD3t terminalnym cukrem terminalnej podjednostki jest reszta cukrowa na końcu nieredukującym: 3-D-Quip4NAc-(1 >.

Wszystkie opisane polisacharydy, PS1, PS2 i PS3, stanowią polisacharydy otrzymywane na drodze chemicznej degradacji lipopolisacharydów. PS1 jest otrzymywany na drodze chemicznej degradacji lipopolisacharydu H. alvei 1200 (przykład 5). PS2 jest otrzymywany na drodze chemicznej degradacji LPS H. alvei 1203. PS3 jest otrzymywany na drodze chemicznej degradacji LPS H. alvei 1205. Frakcja polisacharydu może zawierać 1 i więcej powtarzających się podjednostek łańcucha O-swoistego. Użyty w przykładach przedstawionych w sekcji eksperymentalnej polisacharyd PS1 i jego zredukowana forma zawierały co najmniej 4 i więcej podjednostek łańcucha O-swoistego.

Jednym z aspektów wynalazku są również zredukowane polisacharydy, w jednej z korzystnych realizacji PS1red, PS2red, PS3red, zachowujące cechy strukturalne pozwalające na wiązanie ludzkiej fikoliny-3 i jej rekombinowanej formy. Zredukowane polisacharydy charakteryzują się, w porównaniu z natywnymi polisacharydami, obecnością na końcu redukującym poli-hydroksylowego kwasu 3-deoksyoktonowego powstałego w wyniku redukcji Kdo. Redukcję polisacharydów prowadzi się przy pomocy NaBH4. Produkt redukcji oczyszczany jest przez chromatografię żelową. Szczegółowy opis przykładu otrzymywania zredukowanych polisacharydów przedstawiono w części eksperymentalnej (przykład 6).

Inny aspekt wynalazku dotyczy zastosowania zredukowanych polisacharydów według wynalazku, w szczególności PS1red, PS2red i PS3red, jako ligandów dla ludzkiej fikoliny-3 i jej rekombinowanych form, innych składników układu dopełniacza i ich rekombinowanych form, o specyficzności podobnej do specyficzności fikoliny-3 oraz białek układu dopełniacza innych organizmów o podobnej specyficzności i aktywatorów układu dopełniacza w układach in vitro i in vivo. Szczególnie korzystne jest ich zastosowanie jako ligandów pozwalających wykluczyć oddziaływanie tych polisacharydów z MBL, fikoliną L i IgG.

Kolejny aspekt wynalazku dotyczy kowalencyjnych koniugatów polisacharydów według wynalazku, korzystnie PS1red, PS2red i PS3red, z białkami nośnikowymi, takimi jak na przykład BSA oraz innymi nośnikami mogącymi posłużyć do immobilizacji polisacharydów na nośnikach stałych, takich jak np.: powierzchnia płytki do testu ELISA. Szczegółowy opis otrzymywania przykładowego koniugatu PS 1red z BSA (PS1200-BSA) przedstawiono w części eksperymentalnej (przykład 7).

Pokazano, że koniugaty tego typu mogą stanowić element funkcjonalnego testu diagnostycznego, testu do pomiaru stężenia oraz testu do selektywnego pomiaru aktywności kompleksów fikoliny3/MASP-2 w surowicy oraz innych płynach ustrojowych, a także do oznaczania pod tym względem kompleksów jej rekombinowanych form. Szczegółowy opis przykładu zastosowania koniugatów opisano w części eksperymentalnej. Przykład 9 opisuje test ELISA na wiązanie rekombinowanej fikoliny-3 (H)

PL 232 187 B1 do lipopolisacharydu H. alvei 1200 i koniugatu PS1200-BSA. Przykład 10 opisuje porównanie wiązania surowiczej fikoliny-3, -2, MBL oraz naturalnych immunoglobulin do różnych ligandów (BSA, BSA-Ac, LPS 1200 i PS1200-BSA), z zastosowaniem buforu zawierającego Hepes lub buforu o wysokiej sile jonowej. Przykład 11 opisuje porównanie oznaczania surowiczego stężenia fikoliny-3 (H) w oparciu o test ELISA z wykorzystaniem ligandu PS1200-BSA i metody typu „sandwich”. Przykłady 12 i 13 opisują odpowiednio oznaczanie stężeń fikoliny-3 i aktywności kompleksów fikolina-3\MASP-2 u zdrowych, dorosłych dawców za pomocą testu ELISA z wykorzystaniem ligandu PS1200-BSA. W oparciu o informacje znane każdemu specjaliście w tej dziedzinie, można przyjąć, że koniugaty według wynalazku mogą stanowić element funkcjonalnego testu diagnostycznego do selektywnego pomiaru aktywności kompleksów fikoliny-3/MASP-1, fikoliny-3/MASP-3 oraz kompleksów fikoliny-3 z każdym innym czynnikiem lub czynnikami modulującymi aktywność fikoliny-3 i jej homologów i/lub analogów, oraz podobnego typu kompleksów utworzonych z rekombinowanymi formami fikoliny-3, ich analogami i/lub homologami.

Kolejny aspekt wynalazku dotyczy kowalencyjnych koniugatów polisacharydów według wynalazku, w szczególności PS1 red, PS2red i PS3red, z nośnikami innymi niż białka, takimi które mogą posłużyć do immobilizacji zredukowanych polisacharydów na nośnikach stałych, a następnie mogą zostać wykorzystane jako ligandy dla fikoliny-3, jej homologów i/lub analogów, rekombinowanej fikoliny-3 i jej homologów lub analogów oraz podobnego typu kompleksów utworzonych z rekombinowanymi formami fikoliny-3 i rekombinowanymi formami analogów i homologów fikoliny-3, do testów typu ELISA, immunobloting, do metod oczyszczania fikoliny-3 z surowicy oraz innych płynów ustrojowych oraz metod uzyskiwania surowicy pozbawionej fikoliny-3, opartych na chromatografii powinowactwa. Takim nośnikiem w przypadku wykorzystania wspomnianych koniugatów w chromatografii powinowactwa mogą być modyfikowana agaroza, celuloza lub poliakryloamid, przykładowo komercyjnie dostępne złoża, np.: Sepharose 4B (przykład 8).

Koniugaty takie mogą być również wykorzystane do otrzymywania surowicy/osocza lub innych płynów ustrojowych pozbawionych fikoliny-3 (H) przy pomocy chromatografii powinowactwa.

Szczególną realizacją wynalazku jest zastosowanie do ww. celów polisacharydów izolowanych z LPS innych szczepów H. alvei, które wiązane były przez fikolinę-3 podczas testu dot-blot (przykład 1). Do takich polisacharydów należą te izolowane z LPS H. alvei 2, 23,37,38, 981, 1208.

Dalsze cechy wynalazku są opisane w pełniejszy sposób w następujących przykładach popartych wynikami przedstawionymi na załączonych rycinach.

Na Ryc. 1 zaprezentowano struktury polisacharydów PD1t-PD1-[Hep]-Kdo, PD2t-PD2-[Hep]-Kdo, PD3t-PD3-[Hep]-Kdo wyizolowanych odpowiednio z LPS H. alvei 1200, 1203, 1205. Na Ryc. 2 przedstawiona została reakcja ludzkiej fikoliny-3 (H) z lipopolisacharydami wybranych szczepów H. alvei w reakcji dot-blot. Kolejność LPS: (1) LPS H. alvei 1, (2) LPS 1M, (3) LPS 2, (4) LPS 17, (5) LPS 23, (6) LPS 31, (7) LPS 32, (8) LPS 37, (9) LPS 38, (10) LPS 39, (11) LPS 399, (12) LPS 481, (13) LPS 600, (14) LPS 537, (15) LPS 744, (16) LPS 974, (17) LPS 981, (18) LPS 1187, (19) LPS 1188, (20) LPS 1190, (21) LPS 1191, (22) LPS 1192, (23) LPS 1195, (24) LPS 1196, (25) LPS 1198, (26) LPS 1200, (27) LPS 1203, (28) LPS 1204, (29) LPS 1205, (30) LPS 1206, (31) LPS 1207, (32) LPS 1208, (33) LPS 1209, (34) LPS 1210, (35) LPS 1211, (36) LPS 1212, (37) LPS 1213, (38) LPS 1214, (39) LPS 1215, (40) LPS 1218, (41) LPS 1220, (42) LPS 1221, (43) LPS 1222, (44) LPS 1224, (45) LPS 114-60, (46) K. pneumoniae O3. Na Ryc. 3 przedstawiona została reakcja ludzkiej fikoliny-3 (H) z rozdzielonymi elektroforetycznie (SDS-PAGE) LPS wybranych szczepów H. alvei w odczynie Western blot. Od lewej: LPS 23, 1200, 1203, 1205, 1192. Na Ryc. 4 przedstawione zostały: (A) wiązanie ludzkiej fikoliny-3 (H) przez lipopolisacharydy wybranych szczepów H. alvei w ELISA (LPS 23, 1200, 981, 1203). (B) aktywacja kompleksów fikolina H-MASP-2 przez lipopolisacharydy wybranych szczepów H. alvei w ELISA (LPS 23, 1200, 981,1203). Na Ryc. 5 zaprezentowano wiązanie rekombinantowej fikoliny-3 (H) przez komórki szczepu H. alvei 1200 w cytometrii przepływowej. Na Ryc. 6 przedstawione zostały: (A) wiązanie rekombinantowej fikoliny-3 (H) przez lipopolisacharyd szczepu H. alvei 1200 w ELISA. (B) wiązanie rekombinantowej fikoliny-3 (H) przez PS1200-BSA w ELISA. Na Ryc. 7 zaprezentowano wiązanie surowiczej fikoliny-3 (H), fikoliny-2 (L), lektyny wiążącej mannan (MBL) oraz immunoglobulin do albuminy surowicy bydlęcej, jej acetylowanej pochodnej, lipopolisacharydu H. alvei 1200 oraz polisacharydu H. alvei 1200 skompleksowanego z BSA w buforze B1 (Munthe-Fog, Hummelshoj et al., 2009) i hipertonicznym buforze B2 (Petersen, Thiel et al., 2001). Surowicę ludzką rozcieńczono 1:50. Na Ryc. 8 zaprezentowano indywidualne wartości stężeń fikoliny-3 (H) u zdrowych, dorosłych dawców. Za pomocą czarnego odcinka zaznaczono medianę (17622 ng/ml). Ligandem dla fikoliny-3 (H) był przedmiot wyna

PL 232 187 B1 lazku - skompleksowany z albuminą bydlęcą wysokocząsteczkowy polisacharyd otrzymany z lipopolisacharydu H. alvei 1200. Na Ryc. 9 zaprezentowano indywidualne wartości aktywności kompleksów fikolina H-MASP-2 u zdrowych, dorosłych dawców. Za pomocą czarnego odcinka zaznaczono medianę (847 mU/ml). Ligandem dla fikoliny-3 (H) był przedmiot wynalazku - skompleksowany z albuminą bydlęcą wysokocząsteczkowy polisacharyd otrzymany z lipopolisacharydu H. alvei 1200. Na Ryc. 10 przedstawiona została korelacja pomiędzy stężeniem fikoliny-3 (H) i aktywnością jej kompleksów z MASP-2 (aktywacja składnika C4) u zdrowych, dorosłych dawców. Zaznaczono linię trendu. Ligandem dla fikoliny-3 (H) był skompleksowany z albuminą bydlęcą wysokocząsteczkowy polisacharyd otrzymany z lipopolisacharydu H. alvei 1200. R= 0.683, p<0.0002.

Poniższe przykłady jedynie ilustrują i zrozumiałe jest, że w żaden sposób nie ograniczają zakresu niniejszego wynalazku.

PRZYKŁAD 1. Wiązanie ludzkiej fikoliny-3 (H) do LPS H. alvei w teście dot-blot

Lipopolisacharydy izolowane z 45 różnych szczepów H. alvei (1 mg/ml) nanoszono na membranę PVDF w ilości 3 x 5 pl. Membranę inkubowano kolejno z normalną surowicą ludzką (źródło fikoliny-3), mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko fikolinie-3 (H) (przeciwciała klonu 4H5, HM2089, HyCult Biotechnology) i króliczymi przeciwciałami przeciwko immunoglobulinom mysim znakowanymi peroksydazą chrzanową (HRP) (DAKO). Wykazano, że ludzka fikolina-3 wiąże się do następujących LPS izolowanych z H. alvei: 2, 23, 37, 38, 981, 1200, 1203, 1205, 1208 (Ryc. 2).

PRZYKŁAD 2. Wiązanie ludzkiej fikoliny-3 (H) do LPS H. alvei w immunoblotingu

Badane lipopolisacharydy (LPS 23, 1200, 1203, 1205) rozdzielano w 15% żelu poliakryloamidowym i transferowano na membranę PVDF. Membranę inkubowano kolejno z normalną surowicą ludzką (źródło fikoliny-3), mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko fikolinie-3 (H) (przeciwciała klonu 4H5, HM2089, HyCult Biotechnology) i króliczymi przeciwciałami przeciwko immunoglobulinom mysim znakowanymi peroksydazą chrzanową (HRP) (DAKO). Analiza SDS-PAGE/Western-blot (Ryc. 3) wykazała, że za obserwowaną reakcję odpowiedzialne są wysokocząsteczkowe frakcje wymienionych lipopolisacharydów - łańcuchy O-swoiste.

PRZYKŁAD 3. Test ELISA na wiązanie fikoliny-3 i aktywację składnika C4 układu dopełniacza zależną od kompleksów fikolina-3/MASP-2 przez lipopolisacharydy H. alvei

Za pomocą testu ELISA wykazano, że LPS H. alvei 23, 981, 1200 i 1203 nie tylko wiążą fikolinę-3 (H) (Ryc. 4A), ale również aktywują składnik C4 dopełniacza przez kompleksy tej lektyny z proteazami MASP, na drodze niezależnej od przeciwciał (Ryc. 4B). Płytki titracyjne MaxiSorp U96 (Nunc) opłaszczano testowanymi lipopolisacharydami. Po etapie blokowania, dodawano badaną surowicę ludzką (źródło fikoliny-3) w buforze o wysokim stężeniu NaCl (Petersen et al., 2001), w celu wykluczenia aktywacji dopełniacza na drodze klasycznej (zależnej od kompleksów antygen-przeciwciało). Po 18-godzinnej inkubacji w temperaturze 4°C, wiązanie fikoliny-3 (H) z LPS wykrywano przy pomocy swoistych przeciwciał monoklonalnych (przeciwciała klonu 4H5, HM2089, HyCult Biotechnology) i króliczych przeciwciał skoniugowanych z HRP przeciwko mysim immunoglobulinom (Ryc. 4A). Alternatywnie, do powstałych kompleksów fikolina-3\LPS dodawano odpowiednio rozcieńczoną surowicę jako źródło składnika C4. Po 2 h inkubacji w temp. 37°C, związany produkt aktywacji C4 wykrywano przy pomocy króliczych przeciwciał przeciwko ludzkiemu C4 (Sigma) i znakowanych HRP kozich przeciwciał przeciwko króliczym immunoglobulinom (DAKO) (Ryc. 4B).

PRZYKŁAD 4. Ocena wiązania rekombinowanej fikoliny-3 (H) do komórek szczepu Hafnia alvei 1200 w cytometrii przepływowej

Komórki bakteryjne H. alvei 1200, inaktywowane i utrwalane za pomocą paraformaldehydu, inkubowano z rekombinantową fikoliną-3 (H) a następnie związane białko wykrywano za pomocą swoistych mysich przeciwciał monoklonalnych i przeciwciał przeciwko mysim immunoglobulinom znakowanych FITC (Ryc. 5B). Oznaczeń dokonywano przy pomocy cytometru przepływowego Cytomics FC 500 MPL Beckman-Coulter. Jako kontrolę zastosowano bakterie H. alvei PCM 1209, posiadające LPS, który nie wiąże fikoliny-3 (H) (Ryc. 5A). Stosując metodę cytometrii przepływowej stwierdzono także, że rekombinantowa fikolina-3 (H) wiąże się do struktur powierzchniowych komórek szczepu H. alvei 1200 (Ryc. 5B), lecz nie H. alvei 1209 (wyniki nie załączone).

PRZYKŁAD 5. Preparacja na drodze chemicznej degradacji i analiza strukturalna polisacharydu PS1 LPS H. alvei 1200.

Preparacja lipopolisacharydu ze szczepu H. alvei 1200 została opisana przez Dag. S i wsp. (Dag, Niedziela et al., 2004). Bakterie hodowano w temperaturze 37°C w płynnej pożywce Davisa. Po 48godzinnej hodowli bakterie inaktywowano 0.5% roztworem fenolu, odwirowywano przy użyciu wirówki

PL 232 187 B1 przepływowej CEPA LE (39000 obr./min.) i przemywano 3 l wody. Otrzymaną masę bakteryjną zawieszano w wodzie i liofilizowano. Zliofilizowaną masę bakteryjną dokładnie zawieszano w wodzie (2 g/25 ml) i dodawano równą objętość 90% fenolu. Tak uzyskanym 45% roztworem fenolu ekstrahowano lipopolisacharydy w temperaturze 65°C przez 15 min., według metody Westphala i Janna (Westphal i Jann, 1965). Zebrane i połączone fazy wodne dializowano do wody destylowanej. LPS oddzielano od kwasów nukleinowych przez trzykrotne ultrawirowanie (105000 x g, 6 godz.). Oczyszczony LPS (200 mg) poddawano łagodnej hydrolizie w 40 ml 1.5 % kwasu octowego w temperaturze 100°C przez 40 min. Roztwór wirowano w celu oddzielenia osadu lipidu A od frakcji poli- i oligosacharydów, znajdujących się w roztworze wodnym (13000 g, 20 min.). Procedurę trzykrotnie powtórzono. Supernatant zawierający rozpuszczone poli- i oligosacharydy liofilizowano, po czym frakcjonowano na kolumnie wypełnionej złożem Bio-Gel P-10 oddzielając łańcuchy O-swoiste od polisacharydów o krótszych łańcuchach oraz oligocukrów rdzenia. Kolumnę równoważono 0.05 M buforem pirydyna/kwas octowy/woda (10/4/986), pH=5.6. Zbierano frakcje o objętości 1.2 ml (100 kropli), rejestrując w sposób ciągły różnice współczynników załamania światła między fazą ruchomą (eluent z kolumny) i buforem odniesienia przy użyciu refraktometru Knauer (Niemcy). Uzyskane frakcje 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 poddano wstępnej analizie strukturalnej przy użyciu spektrometrii masowej MALDI-TOF i/lub ESI-MS w trybie ujemnym. Na podstawie uzyskanych widm wyodrębniono frakcje 1, 2, 3, 4 i 5 jako frakcje polisacharydowe zawierające w swojej strukturze łańcuch O-swoisty. Analiza widm masowych otrzymanych techniką MALDI-TOF MS dla frakcji 5 i 4 wskazywała na strukturę polisacharydów zawartych w tych frakcjach.

Widmo uzyskane techniką MALDI-TOF MS (tryb ujemny, matryca: 2,4,6-tri-hydroksyacetofenon) dla frakcji 5 zawierało jony molekularne odpowiadające masie cząsteczkowej polisacharydu PS1 o strukturze PD1t-PD1-[Hep]-Kdo (Ryc. 1). Jon dominujący o m/z 2452.08 [M-H]^- odpowiadał strukturze zbudowanej z dwóch podjednostek łańcucha O-swoistego podstawiających dwucukier Hep-Kdo i podstawionych jedną grupą O-acetylową (Ryc. 1a), przy czym jak wykazała analiza NMR tej frakcji pierwsza podjednostka pozbawiona jest terminalnej reszty α-D-Glcp. Obliczona masa monoizotopowa opisanej struktury wynosi 2452.79 Da. Jon o masie m/z 2494.08 odpowiada opisanej strukturze zawierającej dwie grupy O-acetylowe. Dodatkowo dla obu ww. jonów obserwowano również wersje [M-H2O-H]^- (m/z 2474.05, 2434.09) oraz [M+Na-H]^- (m/z 2516.06, 2474.07). Analiza widm MALDI-TOF wykazała w badanej frakcji obecność populacji cząsteczek pozbawionych obu terminalnych reszt α-D-Glcp oraz jednej lub obu grup O-acetylowych. Skład frakcji 5, sekwencje reszt cukrowych w tym polisacharydzie oraz anomerię wiązań glikozydowych ustalono na podstawie analizy ¹H, ¹³C- oraz ¹H, ³¹P-NMR. Przeprowadzono serię eksperymentów jedno- i dwuwymiarowych (COSY, TOCSY, HSQC-DEPT, HMQC, HMBC, NOESY, ROESY). Uzyskane widma pozwoliły na opisanie systemów spinowych reszt cukrowych wchodzących w skład polisacharydu frakcji 5, co przedstawiono w tabeli 1. Interpretacja widm uzyskanych w eksperymentach HMBC, NOESY oraz ROESY, wg reguł znanych specjaliście w dziedzinie, pozwoliła na ustalenie sekwencji w oparciu o międzycząsteczkowe połączenia obserwowane przez sprzężenie ³Jh,c oraz NOE dla protonów i węgli anomerycznych (tabela 2). Polisacharydy zawarte we frakcji 5 zbudowane są z dwóch podjednostek łańcucha O-swoistego (Ryc. 1 a) połączonych z dwucukrem L-glyceroD-manno-Hep-(1 >8)-Kdo. Połączenie to stanowi wiązanie α-(1 >7) glikozydowe pomiędzy pierwszą resztą pierwszej podjednostki łańcucha O-swoistego: GlcNAc (reszta C) a węglem C7 reszty Kdo (reszta A) dwucukru >7)-[L-glycero-D-manno-Hep-(1>8)-]-Kdo (wysoka wartość przesunięcia chemicznego atomu węgla C-7 - tabela 1). Strukturę tego polisacharydu przedstawiono na rycinie 1. Obecność grup O-acetylowych w pozycji C-3 reszt E' i e wpływa na opisaną powyżej heterogenność polisacharydu, obserwowaną na widmach masowych. Dodatkowo pierwsza podjednostka łańcucha O-swoistego pozbawiona jest terminalnej a-D-Glcp-(1> (Ryc. 1).

Ostatecznie, frakcja 5 stanowi mieszaninę polisacharydów zbudowanych z dwóch podjednostek łańcucha O-swoistego LPS H. alvei PCM 1200 o ogólnym wzorze PD1t-(PD1)n-[Hep]-Kdo (przy n=1), i strukturze przedstawionej na Ryc. 1a, a symbol „-[Hep]-Kdo” strukturę >7)-[L-glycero-D-manno-Hep(1 >8)-]-Kdo.

Analogiczną analizę przeprowadzono dla frakcji 4. Frakcja 4 stanowi mieszaninę polisacharydów zbudowanych z trzech podjednostek łańcucha O-swoistego LPS H. alvei PCM 1200 o ogólnym wzorze

PD1t-(PD1)n-[Hep]-Kdo (przy n=2). Widmo uzyskane techniką MALDI-TOF MS dla frakcji 4 zawierało grupę dominujących jonów typu [M-H]^- o m/z 3607.8 i m/z 3565.7. Jon o m/z 3607.8 [M-H]^- odpowiadał strukturze zbudowanej z trzech podjednostek łańcucha O-swoistego podstawiających dwucukier HepKdo i podstawionych dwoma grupami O-acetylowymi, przy czym jedna z podjednostek w tym polisa14

PL 232 187 B1 charydzie pozbawiona jest reszty heksozy: terminalnej α-D-Glcp. Obliczona masa monoizotopowa opisanej struktury wynosi 3608.17 Da. Jon [M-H]^- o masie m/z 3565.7 odpowiada opisanej strukturze zawierającej jedną grupę O-acetylową. Dodatkowo dla obu ww. jonów obserwowano również wersje [M+Na-H]^- (m/z 3629.8, 3587.7) oraz [M-H2O-H]^- (m/z 3591,3547.7). Analiza widm MALDI-TOF wykazała w badanej frakcji również obecność mniej licznej populacji cząsteczek pozbawionych dwóch terminalnych reszt α-D-Glcp oraz jednej lub obu grup O-acetylowych.

Nie udało się uzyskać widm MALDI-TOF dla frakcji 3, 2 i 1 zawierających więcej niż 25 reszt cukrowych. Jednak w oparciu o wyniki analiz MALDI-TOF MS oraz NMR dla frakcji 4 i 5 można założyć, że frakcje te będą zawierały polisacharydy zbudowane z więcej niż 4 podjednostek łańcucha O-swoistego podstawiających dwucukier Hep-Kdo, o ogólnym wzorze PD1-(PD1)n-[Hep]-Kdo (n>2), gdzie „-[Hep]-Kdo” oznacza strukturę >7)-[L-g/ycero-D-maaao-Hep-(1 >8)-]-Kdo.

PRZYKŁAD 6. Wytwarzanie zredukowanego polisacharydu PS1

Polisacharyd PS1 (22 mg) rozpuszczono w 1 ml wody i redukowano NaBH4 (10 mg) przez 16 godz. w temperaturze 37°C. Mieszaninę reakcyjną zakwaszano stężonym CH3COOH. Produkt oczyszczano na kolumnie ze złożem Bio-Gel P-2, zrównoważonej 0.05 M buforem pirydyna/kwas octowy/woda (10:4:986, pH 5.6). Zbierano frakcje o objętości 1.2 ml, rejestrując w sposób ciągły różnice współczynników załamania światła między fazą ruchomą (eluentu z kolumny) i buforem odniesienia przy użyciu refraktometru Knauer (Niemcy). Frakcję zredukowanego polisacharydu liofilizowano.

PRZYKŁAD 7. Uzyskiwanie koniugatu PS1-BSA

Zredukowany polisacharyd PS1 rozpuszczono w wodzie (2 ml) i doprowadzono pH do 4.75. Mieszając, dodano 50 mg chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropylo)karbodiimidu utrzymując przez 1 godz. pH 4.75 przez dodawanie 1 M HCl (Lonngren i Goldstein, 1978). Reakcje prowadzono dodatkowo przez 1 godz., a następnie dodano 0.4 ml wodnego roztworu BSA (5 mg/ml). Mieszaninę inkubowano przez 4 godz. w temperaturze pokojowej, a następnie neutralizowano 1 M K2HPO4. Produkt oczyszczano na kolumnie ze złożem Sephadex G-100, zrównoważonej 5% etanolem w wodzie. Zbierano frakcje o objętości 1.2 ml, rejestrując w sposób ciągły różnice współczynników załamania światła między fazą ruchomą i buforem odniesienia przy użyciu refraktometru Knauer (Niemcy) i analizowano na obecność białka za pomocą dot-blot. Frakcje odpowiadające koniugatowi zagęszczono za pomocą koncentratorów amicon-ultra 15 do objętości 1 ml. Połowę materiału zliofilizowano, a połowę przechowywano w 0.1% azydku sodu.

PRZYKŁAD 8. Chemiczna immobilizacja zredukowanego polisacharydu PS1 na złożu Sepharose 4B i jego wykorzystanie do oczyszczania fikoliny-3 z surowicy ludzkiej

Aktywację Sepharose 4b bromocyjanem (BrCN) prowadzono wg. metody opisanej przez Cuatrecasas i wsp. (Cuatrecasas, 1970). Aktywowaną bromocyjanem Sepharose 4b wiązano z diaminoheksanem. Żel (Sepharose-NH2) po odmyciu wodą zawieszano w 0.1 M NaHCO3 (pH 9.0). Następnie, Sepharose-NH2 wiązano z aktywowanym EDC PSred1200. Reakcję prowadzono w pH 7.5, 16 h w temp. 80°C. Złoże takie może posłużyć do oczyszczania fikoliny-3 z surowicy ludzkiej i innych płynów ustrojowych.

PRZYKŁAD 9. Test ELISA na wiązanie rekombinowanej fikoliny-3 (H) do lipopolisacharydu

H. alvei 1200 i koniugatu PS1200-BSA

Płytki titracyjne MaxiSorp U96 (Nunc) opłaszczano roztworami lipopolisacharydu 1200 (Ryc. 6A) lub koniugatu PS1200-BSA (Ryc. 6B). Po etapie blokowania, dodawano roztwory o różnych stężeniach rekombinowanej fikoliny-3 (H) (2367-FC, R&D Systems) w buforze o wysokim stężeniu NaCl (Petersen, Thiel et al., 2001), w celu wykluczenia aktywacji dopełniacza na drodze klasycznej (zależnej od kompleksów antygen-przeciwciało). Po 18-godzinnej inkubacji w temperaturze 4°C, wiązanie rekombinowanej fikoliny-3 (H) z LPS wykrywano przy pomocy swoistych przeciwciał monoklonalnych (przeciwciała klonu 4H5, HM2089, HyCult Biotechnology) i króliczych przeciwciał skoniugowanych z HRP przeciwko mysim immunoglobulinom. Rekombinowana fikolina-3 (H) wiąże nie tylko natywny LPS ale też koniugat PS1200-BSA (skompleksowany z BSA wielocukrowy produkt hydrolizy LPS 1200 - polisacharyd O-swoisty). Te dwa antygeny wiążą zarówno naturalną fikolinę-3 (H) surowicy ludzkiej jak i białko rekombinowane (Ryc. 6A, B).

PRZYKŁAD 10. Wiązanie surowiczej fikoliny-3 (H), fikoliny L, lektyny wiążącej mannan (MBL) oraz immunoglobulin do albuminy surowicy bydlęcej, jej acetylowanej pochodnej, lipopolisacharydu H. alvei 1200 oraz polisacharydu H. alvei 1200 skompleksowanego z BSA.

PL 232 187 B1

Porównanie wiązania surowiczej fikoliny-3 (H), fikoliny-2 (L), lektyny wiążącej mannan (MBL) oraz naturalnych immunoglobulin do acetylowanej BSA, lipopolisacharydu i koniugatu PS1200-BSA (polisacharydu H. alvei 1200 skompleksowanego z BSA) oraz nie modyfikowanej BSA, w dwóch różnych buforach: zalecanym przez Munthe-Fog i wsp. (Munthe-Fog, Hummelshoj et al., 2009) buforze zawierającym Hepes - oznaczony jako B1 (25 mM Hepes, 155 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% BSA; pH 7.4) i hipertonicznym buforze według Petersena i wsp. (Petersen, Thiel et al., 2001) (B2: 20 mM TRIS-HCl, 1M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton X100, 0.1% BSA; pH 7.4) (Ryc. 7). Wykazano znacznie silniejsze wiązanie fikoliny-3 (H) do LPS i PS-BSA H. alvei 1200 niż do acetylowanej albuminy, przy nieznacznym wiązaniu pozostałych badanych składników surowicy, co świadczy o wysokiej swoistości reakcji.

PRZYKŁAD 11. Porównanie oznaczeń stężenia fikoliny-3 (H) u zdrowych, dorosłych dawców w oparciu o test ELISA z wykorzystaniem ligandu PS1200-BSA i metody typu „sandwich”

W czterech próbach surowic otrzymanych od zdrowych, dorosłych ochotników określono w odczynie ELISA stężenie fikoliny-3 (H), stosując jako wzorzec rekombinantową formę fikoliny-3, dla której ligand stanowił PS1200-BSA (polisacharyd H. alvei 1200 skompleksowany z BSA). Uzyskano następujące wartości: 28030 ng/ml; 16926 ng/ml i 9973 ng/ml. Za pomocą opisanej w literaturze metody typu „sandwich” ELISA (Munthe-Fog, Hummelshoj et al., 2009) otrzymano wyniki, odpowiednio: 32700 ng/ml, 19500 ng/ml, 12000 ng/ml (dzięki uprzejmości Prof. Jensa C. Jenseniusa, Aarhus University, Dania). Były więc one, zgodnie z oczekiwaniem nieco wyższe, ze względu na oznaczanie całkowitego stężenia fikoliny-3 (H), podczas gdy proponowana metoda z użyciem koniugatu PS1200-BSA pozwala na oznaczenie ilości białka aktywnego biologicznie.

PRZYKŁAD 12. Oznaczanie stężeń fikoliny-3 w surowicach zdrowych, dorosłych dawców w oparciu o test ELISA z wykorzystaniem ligandu PS1200-BSA

Indywidualne wartości stężeń fikoliny-3 oznaczono w teście ELISA w surowicach otrzymanych od 25 dorosłych, zdrowych dawców. Do opłaszczenia płytek (MaxiSorp U96) wykorzystano koniugat PS1200-BSA (polisacharyd H. alvei 1200 skompleksowany z BSA). Po etapie blokowania, dodawano badane surowice rozcieńczone 1:200 w buforze B2 (20 mM TRIS-HCl, 1M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton X100, 0.1% BSA; pH 7.4). Związane białko wykrywano przy pomocy przeciwciał monoklonalnych przeciwko fikolinie-3 (H) (klon 4H5) i skoniugowanych z peroksydazą chrzanową przeciwciał przeciwko mysim immunoglobulinom. Jako wzorzec zastosowano surowicę ludzką o określonym wcześniej (względem białka rekombinatowego) stężeniu fikoliny-3 (H). Otrzymane wyniki indywidualnych oznaczeń stężenia fikoliny-3 (H) przedstawiono na Ryc. 8. Średnie stężenie wynosiło 19251 ng/ml (mediana: 17622 ng/ml, zakres: 8751-34675 ng/ml).

PRZYKŁAD 13. Oznaczanie aktywności kompleksów fikolina-3\MASP-2 u zdrowych, dorosłych dawców w oparciu o test ELISA z wykorzystaniem ligandu PS1200-BSA.

Płytki MaxiSorp U96 opłaszczono PS-BSA H. alvei 1200 i wykorzystano do oznaczania zdolności kompleksów fikolina-3\MASP-2 do aktywacji egzogennego składnika C4. Jako wzorzec użyto ponownie surowicę o znanym stężeniu fikoliny-3. Arbitrarnie przyjęto, że aktywność kompleksów fikolina-3\MASP-2 tej surowicy wynosi 1000 mU/ml. Średnia aktywność kompleksów fikolina-3\MASP-2 wśród 25 badanych surowic wynosiła 822 mU/ml (mediana: 847 mU/ml, zakres: 421-1309 mU/ml). Otrzymane wyniki indywidualnych oznaczeń aktywności kompleksów fikolina-3\MASP-2 przedstawiono na Ryc. 9.

Zaobserwowano istotną statystycznie korelację pomiędzy stężeniem fikoliny-3 a aktywnością jej kompleksów z MASP-2 w badanych surowicach (współczynnik korelacji Pearsona R= 0.683, p<0.0002) (Ryc. 10)

PL232 187 B1 oo u i co cd

CO

Γy rrt ΓE

Przesunięcia chemiczne [ppm] o

y

C

X lT} y un

gj

CM y

CM

X

S

N co υ Cci

o Ό -oo rd ud oo cd

Cs	Cs	Cs T
O	o	O	Φ
sD	MD	md	so
—M	en		ud
Cs	Cs		Cs
cd	cd	cd	cd
cd	cm'	sd
i>	i>	Γ-	□c
cd	cd	cd	cd

CM		CM
MO	—;	;
mD	r-	r-
Μ	Cs	O
	UD	CM
d	cd	d

O) cmrud MDs sO MDsD in ODV)

O CCp d CG fr

CM
'd·
cd	GC	p
ud	O r-	cś r-
o
CM	CM	ud
	CO	Cs
00	<d	cd
P

Cs	Cs	O	CM	—		CM
d	d	ud	MD	MO	MO	CM
r-	o	r-	Γ—	Γ—	Γ-	<—
	o	UD	CO	—.	ΓΟ
	(>	r-	dT	UD	UD	o
cd	cd	cd	cd	cd	cd	rd

	Γ-	Cs	o	O	p	UD
Γ—	s	mD	o	oc	r—	CS	___	.	MO
MO	MD	Γ—	l>	MD	MO	MO	Ό	Cs	UD
							t—	--
	O	Cs	UD	Os	r-	OC	O	O	—
	—	“	d;	UD	MO	d
d	d	d	cd	cd	rd	cd			cd

MD MOO

CM CÓ00 κ r-i>

mo »o.

CM(M cd -d-d

UD A CM

md 7«co

CD y,Ό· d cdd r— J· roo os d

Cs

CD

—

—

MO

ud

O

CS

CM

ur-

V)

iTi

Γ—

OŚ

CM

ud

U~i

d

•d

cd

GŚ

CŚ

CM

mjD

MO

UD

r-

Γ—

r-

UD

ΜΊ

UD

r-

MO

MD

Γ-

Cs

—·.

—.

-~-

—_

Cs

cc

Γ-

—<

r-

MO

•ΤΓ

Γ-

----------1

t--

1

0Φ

Φ

ΟΟ

Cs

Os

r-

oo

ΟΟ

u!

p

p

τΓ

cd

d

cd

rd

cd

cd

cd

cd

cd

d

rd

r— os o cd

O ud

ts cd r-

		T		T	T				ΐ
T	ΐ	ΐ	ó					u
			<	<				<
cd	3, ιύ	iS 0	ó	0 OD U	0 m o	t	J	i	Z •D,¾.
o Q COL	Ο ά cęu OD	Φ CQ-	< z	< z &	< Z &	d u	OD □	OD Ó	7 ά
	tF cd		c	O		y	φ	ci.
ri	CM	om'	ώ	Q	Q	ά	p·	c?	rd
T	T	T	ci.	ca.	có_	8	T	T	T
Q	Q	a			OJ		0	on	X

u-, Ό

CM run cd

>·> N cs i (Λ O 'O

Ό o¹

O & ctf bj Cfl

L. ω aceton (δη 2.225, Sc 31.05); n - wartości przesunięcia chemicznego nie ustalono, a) wartość sugerowana, zgodna z odnośnikiem literaturowym (Dag. Niedziela cl al., 2004); b, c, d. e, f) sygnały iliero zdziel one.

PL232 187 Β1

Tabela 2. Wybrane wewnętrzne i międzycząsteczkowe połączenia obserwowane przez

sprzężenie JH,c oraz NOE dla protonów i węgli anomerycznyc LPS H. alvei 1200.	h frakcji 5 wyizolowanej z
	Reszta	Atom	Połączenie do	Interpretacja sygnału
		8h /Sc (ppm)		Sn
B		4.77 / 99.3	64.2		C-8 reszty A
			71.4		C-5 reszty B
			70.9		C-3 reszty B
c	~^3)-0t-D-Glc/7NAc-(l—>	5.05/97.3	77.2	3.68*	C-3, H-3 reszty H
D	- >2,3) -[r-D-Gal;?-( 1 —>	4.58/ 100.7		3.71	H-5 reszty D’
			82.3	3.86	C-3, H-3 reszty c
D’	-»2,3)-|3-D-Galp-(l—»	4.57 / 100.8		3.71	H-5 reszty D
			82.3	3.86	C-3, H-3 reszty c
d	->2,3,4)-p-D-Galp-(l->	4.66 / 100.2	79.3	3.94*	C-3, H-3 reszty C
				3.74	H-5 reszty d
E	p-D-Glc/iNAc-(l—»	4.91 /100.4	75.1	3.87/3.91	C-2, H-2 reszty D/D’
E’	p-D-Glc/?NAc3OAc-(l—>	5.03/99.7	75.2	3.87/3.91	C-2, H-2 reszty D/D’
f	a-D-Glcp-(l -»	5.00/ 100.3	73.0	4.19	C-3 reszty f H-4 reszty d
G	-»l)-Gro-(3-P—>b)	H-3a,b/C-3
		4.01,3.93/66.5
		δΡ; 0.76		4.28	H-3 reszty D,D’
g	-»l)-Gro-(3-P-»w	H-3a,b/C-3 4.04, 3.98 / 66.5
		δΡ: 0.19		4.35	H-3 reszty d
H	—>3)-p-D-Quip4NAc-(l —>	4.45 / 102.8	70.9	3.69, 4.00 C-l, H-a,b reszty G
h	p-lj-Qu ip4NAc-( 1 —»	4.44/ 102.8	70.9	3.69, 4.00 C-l, H-a,b reszty g

³ Widma ‘H, ^l3C NMR uzyskano w wykorzystaniem spektrometru 600 MHz Broker Avance II w temperaturze 303K. Reszty oznaczone wielkimi literami reprezentują pierwszą podjednostkę względem końca redukującego polisacharydu, a reszty oznaczone małą literą reprezentują składniki drogiej podjednostki. a) Wartości oznaczone gwiazdką reprezentują połączenia obserwowane jedynie przez NOE; b) w przypadku reszt G i g pokazano korelację atomu fosforu grupy fosforanowej obserwowaną w eksperymencie 'H, ³¹P HSQC.

Literatura:

Aderem, A. and R. J. Ulevitch (2000). Toll-like receptors in the induction ot the innate immune response. Naturę 406: 787.

Andersen, T., L. Munthe-Fog, P. Garred and S. Jacobsen (2009). Serum levels of ficolin-3 (Hakata antigen) in patients with systemie lupus erythematosus. J Rheumatol 36(4): 757-9.

Atkinson, A. P., M. Cedzynski, J. Szemraj, A. St Swierzko, L. Bak-Romaniszyn, M. Banasik, K. Zeman, M. Matsushita, M. L. Turner and D. C. Kilpatrick (2004). L-ficolin in children with recurrent respiratory infections. Clin Exp Immunol 138(3): 517-20.

Cedzynski, M., A. P. Atkinson, A. St Swierzko, S. L. MacDonald, A. Szala, K. Zeman, K. Buczylko,

L. Bak-Romaniszyn, M. Wiszniewska, M. Matsushita, J. Szemraj, M. Banasik, M. L. Turner and D. C. Kilpatrick (2009). L-ficolin (ficolin-2) insufficiency is associated with combined allergic and infectious respiratory disease in children. Mol Immunol 47(2-3): 41-9.

Cedzynski, M., L. Nuytinck, A. P. Atkinson, A. St Swierzko, K. Zeman, J. Szemraj, A. Szala,

M. L. Turner and D. C. Kilpatrick (2007). Extremes of L-ficolin concentration in children with recurrent infections are associated with single nucleotide polymorphisms in the FCN2 qene.Clin Exp Immunol 150(1): 99-104.

Cuatrecasas, P. J. (1970). Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of Agarose and polyacrylamide Beads. Journal of Biological Chemistry 245: 3059-3065.

PL 232 187 B1

Dag, S., T. Niedziela, M. Dzieciatkowska, J. Lukasiewicz, W. Jachymek, C. Ługowski and L. Kenne (2004). The O-acetylation patterns in the O-antigens of Hafnia alvei strains PCM 1200 and 1203, serologically closely related to PCM 1205. Carbohydr Res 339(15): 2521-7.

Degn, S. E., A. G. Hansen, R. Steffensen, C. Jacobsen, J. C. Jensenius and S. Thiel (2009). MAp44, a human protein associated with pattern recognition molecules of the complement system and regulating the lectin pathway of complement activation. J Immunol 183(11): 7371-8.

Fukutomi, T., B. Ando, S. Sakamoto, H. Sakai and H. Nawata (1996). Thermolabile beta-2 macroglycoprotein (Hakata antigen) in liver disease: biochemical and immunohistochemical study. Clin Chim Acta 255(2): 93-106.

Gamian, A., E. Romanowska, U. Dabrowski and J. Dabrowski (1991). Structure of the O-specific, sialic acid containing polysaccharide chain and its linkage to the core region in lipopolysaccharide from Hafnia alvei strain 2 as elucidated by chemical methods, gas-liquid chromatography/mass spectrometry, and 1H NMR spectroscopy. Biochemistry. 30(20): 5032-8.

Garlatti, V., L. Martin, M. Lacroix, E. Gout, G. J. Arlaud, N. M. Thielens and C. Gaboriaud Structural Insights into the Recognition Properties of Human Ficolins. Journal of Innate Immunity 2(1): 17-23.

Garred, P., C. Honore, Y. J. Ma, S. Rorvig, J. Cowland, N. Borregaard and T. HummelshAj (2010). The Genetics of Ficolins. Journal of Innate Immunity 2(1): 3-16.

Garred, P., C. Honore, Y. J. Ma, L. Munthe-Fog and T. Hummelshoj (2009). MBL2, FCN1, FCN2 and FCN3-The genes behind the initiation of the lectin pathway of complement. Mol Immunol 46(14): 2737-44.

Gout, E., V. Garlatti, D. F. Smith, M. M. Lacroix, C. Dumestre-Perard, T. Lunardi, L. Martin, J. Y. Cesbron, G. J. Arlaud, C. Gaboriaud and N. M. Thielens (2010). Carbohydrate recognition properties of human ficolins: Glycan array screening reveals the sialic acid binding specificity of M-ficolin. J Biol Chem. 285(9): 6612-22.

Herpers, B. L., B. A. de Jong, B. Dekker, P. C. Aerts, H. van Dijk, G. T. Rijkers and H. van VelzenBlad (2009). Hemolytic assay for the measurement of functional human mannose-binding lectin: a modification to avoid interference from classical pathway activation. J Immunol Methods 343(1): 61-3.

Holst, O., A. J. Ulmer, H. Brade, H. Flad and E. Rietschel (1996). Biochemistry and cell biology of bacterial endotoxins. FEMS Immunology and Medical Microbiology 16: 83-104.

Inoshita, H., M. Matsushita, S. Koide, G. Kusaba, M. Ishii, K. Onda, M. J. Gi, M. Nakata, I. Ohsawa, S. Horikoshi, H. Ohi and Y. Tomino (2009). A novel measurement method for activation of the lectin complement pathway via both mannose-binding lectin (MBL) and L-ficolin. Journal of Immunological Methods 349(1-2): 9-17.

Jachymek, W., J. Czaja, T. Niedziela, C. Lugowski and L. Kenne (1999). Structural studies of the O-specific polysaccharide of Hafnia alvei strain PCM 1207 lipopolysaccharide. European Journal of Biochemistry 266(1): 53-61.

Jachymek, W., C. Petersson, A. Helander, L. Kenne, C. Lugowski and T. Niedziela (1995). Structural studies of the O-specific chain and a core hexasaccharide of Hafnia alvei strain 1192 lipopolysaccharide. Carbohydrate Research 269(1): 125-38.

Katzenellenbogen, E., N. A. Kocharova, G. V. Zatonsky, M. Bogulska, D. Witkowska, A. S. Shashkov, Y. A. Knirel and E. Romanowska (1999). Structure of the O-specific polysaccharide of Hafnia alvei 23 having an oligosaccharide-phosphate repeating unit. Journal of Carbohydrate Chemistry 18(5): 545-558.

Katzenellenbogen, E., E. Romanowska, N. A. Kocharova, Y. A. Knirel, A. S. Shashkov and N. K. Kochetkov (1992). The structure of a glycerol teichoic acid-like O-specific polysaccharide of Hafnia alvei 1205. Carbohydr Res. 231: 249-60.

Kilpatrick, D. C., T. Fujita and M. Matsushita (1999). P35, an opsonic lectin of the ficolin family, in human blood from neonates, normal adults, and recurrent miscarriage patients. Immunol Lett 67(2): 109-12.

Lacroix, M., C. Dumestre-Perard, G. Schoehn, G. Houen, J. Y. Cesbron, G. J. Arlaud and N. M. Thielens (2009). Residue Lys57 in the collagen-like region of human L-ficolin and its counterpart Lys47 in H-ficolin play a key role in the interaction with the mannan-binding

PL 232 187 B1 lectin-associated serine proteases and the collectin receptor calreticulin. J Immunol 182(1): 456-65.

Liu, Y., Y. Endo, D. Iwaki, M. Nakata, M. Matsushita, I. Wada, K. Inoue, M. Munakata and T. Fujita (2005). Human M-ficolin is a secretory protein that activates the lectin complement pathway. J Immunol 175(5): 3150-6.

Lonngren, J. and I. J. Goldstein (1978). Carbohydrate antigens: coupling melibionic acid to bovine serum albumin using water-soluble carbodiimide. Methods in Enzymology V. Ginsburg. New York, San Francisco, London, Academic Press. 50: 160-162.

Lukasiewicz, J., T. Niedziela, W. Jachymek, L. Kenne and C. Lugowski (2009). Two Kdo-heptose regions identified in Hafnia alvei 32 lipopolysaccharide: the complete core structure and serological screening of different Hafnia O serotypes. J Bacteriol. 191(2): 533-44. Epub 2008 Nov 14.

Matsushita, M. (2007). The ficolin family: an overwiev. Collagen-related lectins in innate immunity. D. Kilpatrick. Kerala, Trivandrum, Research Signpost: 17-32.

Matsushita, M. (2010). Ficolins: complement-activating lectins involved in innate immunity. Journal of Innate Immunity 2(1): 24-32.

Matsushita, M., M. Kuraya, N. Hamasaki, M. Tsujimura, H. Shiraki and T. Fujita (2002). Activation of the lectin complement pathway by H-ficolin (Hakata antigen). J Immunol 168(7): 3502-6.

Munthe-Fog, L., T. Hummelshoj, C. Honore, H. O. Madsen, H. Permin and P. Garred (2009). Immunodeficiency associated with FCN3 mutation and ficolin-3 deficiency. N Engl J Med 360(25): 2637-44.

Niedziela, T., C. Petersson, A. Helander, W. Jachymek, L. Kenne and C. Lugowski (1996). Structural studies of the O-specific polysaccharide of Hafnia alvei strain 1209 lipopolysaccharide. European Journal of Biochemistry 237(3): 635-41.

Petersen, S. V., S. Thiel, L. Jensen, R. Steffensen and J. C. Jensenius (2001). An assay for the mannan-binding lectin pathway of complement activation. J Immunol Methods. 257(1-2): 107-16.

Petersson, C., W. Jachymek, L. Kenne, T. Niedziela and C. Lugowski (1997). Structural studies of the O-specific chain of Hafnia alvei strain PCM 1190 lipopolysaccharide. Carbohydrate Research 298(3): 219-27.

Rietschel, E. T., H. Brade, O. Holst, L. Brade and e. al. (1996). Bacterial endotoxin: chemical constitution, biological recognition, host response, and immunological detoxification. Pathology of Septic Shock. E. T. Rietschel and H. Wagner. Berlin, Heidelberg, New York, SpringerVerlag: 40-81.

Runza, V. L., W. Schwaeble and D. N. Mannel (2008). Ficolins: novel pattern recognition molecules of the innate immune response. Immunobiology 213(3-4): 297-306.

Schlapbach, L. J., C. Aebi, A. G. Hansen, A. Hirt, J. C. Jensenius and R. A. Ammann (2009). H-ficolin serum concentration and susceptibility to fever and neutropenia in paediatric cancer patients. Clin Exp Immunol 157(1): 83-9.

Sugimoto, R., Y. Yae, M. Akaiwa, S. Kitajima, Y. Shibata, H. Sato, J. Hirata, K. Okochi, K. Izuhara and N. Hamasaki (1998). Cloning and characterization of the Hakata antigen, a member of the ficolin/opsonin p35 lectin family. J Biol Chem 273(33): 20721-7.

Svendsen, C. B., T. Hummelshoj, L. Munthe-Fog, N. Milman, P. Garred, I. A. Laursen, M. Christiansen and K. A. Krogfelt (2008). Ficolins and Mannose-Binding Lectin in Danish patients with sarcoidosis. Respir Med 102(9): 1237-42.

Swierzko, A. S., A. P. Atkinson, M. Cedzynski, S. L. MacDonald, A. Szala, I. Domzalska-Popadiuk, M. Borkowska-Klos, A. Jopek, J. Szczapa, M. Matsushita, J. Szemraj, M. L. Turner and D. C. Kilpatrick (2009). Two factors of the lectin pathway of complement, L-ficolin and mannan-binding lectin, and their associations with prematurity, low birthweight and infections in a large cohort of Polish neonates. Mol Immunol 46(4): 551-8.

Thiel, S. (2007). Complement activating soluble pattern recognition molecules with collagen-like regions, mannan-binding lectin, ficolins and associated proteins. Mol Immunol 44(16): 3875-88.

Tsujimura, M., T. Miyazaki, E. Kojima, Y. Sagara, H. Shiraki, K. Okochi and Y. Maeda (2002). Serum concentration of Hakata antigen, a member of the ficolins, is linked with inhibition of Aerococcus viridans growth. Clin Chim Acta 325(1-2): 139-46.

PL232 187 Β1

Wang, C. C„ K. W. Yim, T. C. Poon, K. W. Choy, C. Y. Chu, W. T. Lui, T. K. Lau, M. S. Rogers and T. N. Leung (2007). Innate immune response by ficolin binding in apoptotic płacenia is associated with the clinical syndrome of preeclampsia. Clin Chem 53(1): 42-52.

Westphal, O. and K. Jann (1965). Bacterial lipopolysacharides : Extraction with phenol-water and further applications of the procedurę. Methods Carbohydr. Chem. 5: 83-89.

Wittenborn, T., S. Thiel, L. Jensen, H. J. Nielsen and J. C. Jensenius (2010). Characteristics and biological variations of M-ficolin, a pattern recognition molecule, in plasma. J Innate Immun 2(2): 167-80.

Yae, Y., S. Inaba, H. Sato, K. Okochi, F. Tokunaga and S. Iwanaga (1991). Isolation and characterization of a thermolabile beta-2 macroglycoprotein ('thermolabile substance' or 'Hakata antigen') detected by precipitating (auto) antibody in sera of patients with systemie lupus erythematosus. Biochim Biophys Acta 1078(3): 369-76.

Zastrzeżenia patentowe

Claims (15)

1. Polisacharyd posiadający powinowactwo do fikoliny-3, znamienny tym, że jest związkiem o ogólnym wzorze:

PDt-(PD)_n-[Hep]-Kdo gdzie:

n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 100, korzystnie mniejszą od 50, PDt oznacza:

- podjednostkę oligocukrową PD1t o wzorze:

ct-D-GIcjj

I

0»D»Qui;4NAc-n^l)-Grn-(3-P->3>p*D-Gnlp-(l—?3)-a-D-GlcpNAc(l->

p-D-CrlcpNAc i

OAc (5Ci-8iJ°o) lub fJ-D-<}uip4b.^rAc-(l -»1 >Gra -(3-P-i 3 > I -»3)-a-D-GIcj>NAc( l -» f

l fl-D-GlcpNAc

I

OAc (50-80%) albo

- podjednostkę oligocukrową PD2t o wzorze:

ιϊ-D-GIcb t

p-D-Quip4NA c-( 1 -+l)-Gro-(3-P-»3)-P-D-Galp< l->3)-a-D-Glc;NAi( 1 -»

2 6 t I

P-D-GIępNAc ^OAc(50-80%)

I

OAc (50-80%) lub

PL232 187 Β1 β-D-ęuy>4NA c< 1 -łl)-Gro-(3-P->J)-|i D-Galp-( I -^3)-a-D-Gl<#4Ac( 1-»

2 ó ; i

P-D-GliyNAc ^OAc(50-80%) ł

OAc (5D-BO%) albo

- podjednostkę oligocukrową PD3t o wzorze:

CtD-Glc^ _n 4 p-D-Qmp4NAc-(l->l)-Gn><3-P-»3)p-l>.Ga|p.(l-»3)-<i-D-Glc^HAc(l-ł i β-D-GtcpNAc

I

OAc (50-80%) lub

P-D-Qui^4NA c-( l -»I )-Gro-(3-P ->3)·β -D-G alp-( l ->3)-a-D GlcaNA c( I —

T i

β-0-GlępNAc

OAc (50-80%)

PD oznacza:

- podjednostkę oligocukrową PD1 o wzorze:

a-D-Glc;

!

—>3)-p-D-Quip4NAc-(l—>Ł)-Gro(3-P—*3)-P-D-Gai,p-(l—ł3)-a-D-GlcpNAc(l—>

T i β-D-GigjNAc 3

I

OAc (50-80%) lub

-»3H-I>Quyi4NAc-(l -»l)-Gro-(3-P-»3)-PI>-Galp-(l ->3)-a-D-GląiNAc(l -»

T i

β-D-GlcpNAc

I OAc (50-80%) albo

- podjednostkę oligocukrową PD2 o wzorze:

PL232 187 Β1 α-D-Glc^ l

-»3>p-D-Quip4NAc< I -»1 ł-Gro-iS-P-^łJ-P-D-GalH I ->3>a-D-GlcpNAc(l -».

2 6 i ¹ β-D-GlcpNAc ^OAc (50-80%)

I

OAc (50-805 o) lub

->3)-p-D-Quy,4NAc-(l->l)Oro<3-F->3)-p-D-Galp<l->3)-a.D-GlcpNńc(l-> 2’ 6

T I

P-D-GhpNAc ^OAc(50-80%)

OAc (50-80%) albo

- podjednostkę oligocukrową PD3 o wzorze:

ct-D-Gly

->3)-β-D-Qui^4NAc< 1 ->1)-Gra<3-P^3)-β-D GAp (I >3)-α-Γ.)-Ο1 cpNAcf 1 ->

T

0-D-GlęeNAc

I

OAc (50-80%) lub

->3)-|3-D-Quip4NAc-(l -»l)-Gro<3-P-»3)-p-D-Galp-(l -»3)-a-D-GlcpNAc(l ->

T i

p-D-G!g?NAc

I

OAc (50-80%) ’ natomiast [Hep]-Kdo oznacza podjednostkę oligocukrową o wzorze:

L-ct-D-Hepp i

8 —*7)-Kdo

2. Polisacharyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera podjednostki oligocukrowe wybrane spośród podjednostek o ogólnym wzorze: PD1t(PD1)_n-[Hep]-Kdo, PD2t-(PD2)_n-[HepjKdo lub PD3t-(PD3)n-[Hep]-Kdo.

3. Pochodna polisacharydu o ogólnym wzorze PDt-(PD)_n-[Hep]-Kdo określonym zastrz. 1, znamienna tym, że resztę Kdo zredukowano do 1-karboksy-3-deoksyoktitolu.

4. Koniugat polisacharydu określonego w zastrz. 1 albo 2 ze znanym nośnikiem białkowym lub złożem chromatograficznym.

5. Sposób otrzymywania polisacharydów lub ich pochodnych posiadających powinowactwo do fikoliny-3 określonych w zastrz. 1-4, znamienny tym, że:

a) izoluje się lipopolisacharyd bakteryjny ze szczepu /7. Alvei, przy czym prowadzi się hodowlę szczepu /7. alvei wybranego spośród szczepów: /7. alvei 981 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00030, /7. alvei 1200 zdeponowa

PL 232 187 B1 nego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00031, H. alvei 1203 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00032, H. alvei 1205 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00033 lub H. alvei 1208 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00034,

b) uzyskany lipopolisacharyd poddaje się degradacji i oddziela się frakcję polisacharydową,

c) z uzyskanej frakcji polisacharydowej wyodrębnia się frakcję zawierającą polisacharydy składające się z podjednostek o masie cząsteczkowej od 2 400 ku do 2 600 000 ku,

d) otrzymane polisacharydy ewentualnie redukuje się, zwłaszcza w obecności NaBH4, i korzystnie sprzęga się ze znanym nośnikiem białkowym lub złożem chromatograficznym.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie a) prowadzi się ekstrakcję lipopolisacharydu z masy bakteryjnej w roztworze wodnym fenolu, korzystnie roztworem fenolu o stężeniu około 45%, w temperaturze około 65°C przez około 15 minut, a następnie odzyskuje się lipopolisacharyd z oddzielonej fazy wodnej.

7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie b) oddzielony lipopolisacharyd poddaje się łagodnej hydrolizie w roztworze kwasu octowego o stężeniu około 1-1,5% w temperaturze około 100°C przez około od 15 do 60 min.

8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie c) frakcję polisacharydową rozdziela się chromatograficznie oddzielając łańcuchy O-swoiste od polisacharydów o krótszych łańcuchach oraz oligocukrów rdzenia, korzystnie na kolumnie wypełnionej złożem poliakrylamidowym zrównoważonej 0.05 M buforem zawierającym pirydyna/kwas octowy/woda w stosunku 10/4/986 w pH około 5.6.

9. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie d) otrzymane polisacharydy redukuje się i sprzęga z nośnikiem białkowym, korzystnie albuminą surowicy bydlęcej lub złożem chromatograficznym, korzystnie modyfikowaną agarozą.

10. Zastosowanie polisacharydu określonego w zastrz. 1-2 lub zawierającego go lipopolisacharydu bakteryjnego lub jego pochodnej określonej w zastrz. 3-4 jako ligandu dla fikoliny-3, zwłaszcza do oczyszczania lub wykrywania fikoliny-3 lub jej pochodnych in vitro.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że stosowany jest lipopolisacharyd uzyskany ze szczepu wybranego spośród: H. alvei 981 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00030, H. alvei 1200 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00031, H. alvei 1203 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00032, H. alvei 1205 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00033 lub H. alvei 1208 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00034.

12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że stosowany polisacharyd jest otrzymywany sposobem określonym w zastrz. 5-9.

13. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że pochodną fikoliny-3 jest kompleks fikoliny-3 z proteazami serynowymi MASP z surowicy lub osocza.

14. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że wykrywanie prowadzi się w celu określenia aktywności i/lub poziomu fikoliny-3 lub jej pochodnych w surowicy lub innych płynach ustrojowych.

15. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że oczyszczanie prowadzi się w celu uzyskania surowicy lub osocza pozbawionych fikoliny-3.