PL231671B1 - Syntetyczna pochodna aromatyczna i jej zastosowanie do zapobiegania lub leczenia grzybic wywołanych Candida spp. - Google Patents
Syntetyczna pochodna aromatyczna i jej zastosowanie do zapobiegania lub leczenia grzybic wywołanych Candida spp.Info
- Publication number
- PL231671B1 PL231671B1 PL410019A PL41001914A PL231671B1 PL 231671 B1 PL231671 B1 PL 231671B1 PL 410019 A PL410019 A PL 410019A PL 41001914 A PL41001914 A PL 41001914A PL 231671 B1 PL231671 B1 PL 231671B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- candida
- cells
- candida spp
- compound
- albicans
- Prior art date
Links
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 title claims abstract description 45
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 title abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 42
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 24
- DXGIRFAFSFKYCF-UHFFFAOYSA-N propanehydrazide Chemical compound CCC(=O)NN DXGIRFAFSFKYCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 9
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- -1 4-chloromethylsulfonyl-2-nitrophenylamino Chemical group 0.000 description 7
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 7
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 6
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 5
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- IHDAZBUKRRGSFP-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-2-chloro-2-(4-chlorophenyl)sulfonyl-1-phenylethanone Chemical compound BrC(C(=O)C1=CC=CC=C1)(S(=O)(=O)C1=CC=C(C=C1)Cl)Cl IHDAZBUKRRGSFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000197813 Camelina sativa Species 0.000 description 4
- 241000675278 Candida albicans SC5314 Species 0.000 description 4
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 4
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100352909 Homo sapiens PPP3CC gene Proteins 0.000 description 4
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 4
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 4
- 102100040320 Serine/threonine-protein phosphatase 2B catalytic subunit gamma isoform Human genes 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 4
- 150000003851 azoles Chemical class 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 101150032598 hisG gene Proteins 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000222126 [Candida] glabrata Species 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 208000032343 candida glabrata infection Diseases 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 3
- 150000004291 polyenes Chemical class 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 3
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 108010049047 Echinocandins Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 206010042938 Systemic candida Diseases 0.000 description 2
- JHVAMHSQVVQIOT-MFAJLEFUSA-N anidulafungin Chemical compound C1=CC(OCCCCC)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N3C[C@H](C)[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C2)[C@@H](C)O)[C@H](O)[C@@H](O)C=2C=CC(O)=CC=2)[C@@H](C)O)=O)C=C1 JHVAMHSQVVQIOT-MFAJLEFUSA-N 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000008686 ergosterol biosynthesis Effects 0.000 description 2
- RFHAOTPXVQNOHP-UHFFFAOYSA-N fluconazole Chemical compound C1=NC=NN1CC(C=1C(=CC(F)=CC=1)F)(O)CN1C=NC=N1 RFHAOTPXVQNOHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004884 fluconazole Drugs 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BQPPJGMMIYJVBR-UHFFFAOYSA-N (10S)-3c-Acetoxy-4.4.10r.13c.14t-pentamethyl-17c-((R)-1.5-dimethyl-hexen-(4)-yl)-(5tH)-Delta8-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren Natural products CC12CCC(OC(C)=O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C BQPPJGMMIYJVBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- CHGIKSSZNBCNDW-UHFFFAOYSA-N (3beta,5alpha)-4,4-Dimethylcholesta-8,24-dien-3-ol Natural products CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21 CHGIKSSZNBCNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYTLYKGXLMKYMV-UHFFFAOYSA-N 14alpha-methylzymosterol Natural products CC12CCC(O)CC1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C XYTLYKGXLMKYMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPTJELQXIUUCEY-UHFFFAOYSA-N 3beta-Hydroxy-lanostan Natural products C1CC2C(C)(C)C(O)CCC2(C)C2C1C1(C)CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 FPTJELQXIUUCEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 108010064760 Anidulafungin Proteins 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001508813 Clavispora lusitaniae Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 244000057399 Dalea candida Species 0.000 description 1
- 101710140859 E3 ubiquitin ligase TRAF3IP2 Proteins 0.000 description 1
- 102100026620 E3 ubiquitin ligase TRAF3IP2 Human genes 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKLIAINBCQPSOV-UHFFFAOYSA-N Gluanol Natural products CC(C)CC=CC(C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(O)C(C)(C)C4CC3 BKLIAINBCQPSOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001106406 Homo sapiens Rho GTPase-activating protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000807008 Homo sapiens Uracil phosphoribosyltransferase homolog Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- LOPKHWOTGJIQLC-UHFFFAOYSA-N Lanosterol Natural products CC(CCC=C(C)C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(C)(O)C(C)(C)C4CC3 LOPKHWOTGJIQLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010021062 Micafungin Proteins 0.000 description 1
- CAHGCLMLTWQZNJ-UHFFFAOYSA-N Nerifoliol Natural products CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C CAHGCLMLTWQZNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 102100021433 Rho GTPase-activating protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150093701 SAP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100502554 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FCY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100502558 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FCY2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001092180 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RHO GTPase-activating protein RGD1 Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000005782 Squalene Monooxygenase Human genes 0.000 description 1
- 108020003891 Squalene monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 201000007096 Vulvovaginal Candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 229960003348 anidulafungin Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- DVECBJCOGJRVPX-UHFFFAOYSA-N butyryl chloride Chemical compound CCCC(Cl)=O DVECBJCOGJRVPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 208000017773 candidemia Diseases 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- QBSJHOGDIUQWTH-UHFFFAOYSA-N dihydrolanosterol Natural products CC(C)CCCC(C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(C)(O)C(C)(C)C4CC3 QBSJHOGDIUQWTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000028564 filamentous growth Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- CAHGCLMLTWQZNJ-RGEKOYMOSA-N lanosterol Chemical compound C([C@]12C)C[C@@H](O)C(C)(C)[C@H]1CCC1=C2CC[C@]2(C)[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@]21C CAHGCLMLTWQZNJ-RGEKOYMOSA-N 0.000 description 1
- 229940058690 lanosterol Drugs 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960002159 micafungin Drugs 0.000 description 1
- PIEUQSKUWLMALL-YABMTYFHSA-N micafungin Chemical compound C1=CC(OCCCCC)=CC=C1C1=CC(C=2C=CC(=CC=2)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N3C[C@H](C)[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](O)[C@H](O)C2)[C@H](O)CC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](O)C=2C=C(OS(O)(=O)=O)C(O)=CC=2)[C@@H](C)O)=O)=NO1 PIEUQSKUWLMALL-YABMTYFHSA-N 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960003255 natamycin Drugs 0.000 description 1
- NCXMLFZGDNKEPB-FFPOYIOWSA-N natamycin Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C[C@@H](C)OC(=O)/C=C/[C@H]2O[C@@H]2C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 NCXMLFZGDNKEPB-FFPOYIOWSA-N 0.000 description 1
- 235000010298 natamycin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004311 natamycin Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 1
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 231100000075 skin burn Toxicity 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002722 terbinafine Drugs 0.000 description 1
- DOMXUEMWDBAQBQ-WEVVVXLNSA-N terbinafine Chemical compound C1=CC=C2C(CN(C\C=C\C#CC(C)(C)C)C)=CC=CC2=C1 DOMXUEMWDBAQBQ-WEVVVXLNSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest syntetyczna pochodna aromatyczna: 2-[(4-chlorometylosulfonylo-2-nitrofenyloamino)-4'-fenoksy]-propionohydrazyd o wzorze I i jej zastosowanie medycynie, w szczególności w zapobieganiu lub leczeniu grzybic, zwłaszcza wywołanych Candida spp.
Description
Przedmiotem wynalazku jest nowa syntetyczna pochodna aromatyczna, skuteczna jako inhibitor czynników wirulencji Candida spp.: proteazy serynowej i adhezji do powierzchni modelu monowarstwy komórek nabłonkowych in vitro i jej zastosowanie do zapobiegania lub leczenia grzybic, zwłaszcza wywołanych Candida spp.
Bardziej szczegółowo, przedmiotem wynalazku jest 2-[(4-chlorometylosulfonylo-2-nitrofenyloamino)-4'-fenoksy]propionohydrazyd jako związek hamujący wzrost planktoniczny Candida spp., skuteczny inhibitor zmian poziomu transkrypcji genu proteazy serynowej KEX2 w komórkach Candida spp. oraz inhibitor adhezji komórek Candida spp. do powierzchni modelu monowarstwy komórek nabłonkowych, w szczególności modelu monowarstwy nabłonka jelitowego Caco-2, a także związek do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu grzybic wywołanych Candida spp.
Candida albicans jest oportunistycznym patogenem, który u osób z zaburzeniami odporności wywołuje infekcje o charakterze powierzchniowym lub układowym (tzw. kandydozy). Do czynników sprzyjających rozwojowi kandydoz należy m.in. immunosupresja, długotrwałe cewnikowanie naczyń, leczenie steroidami, cukrzyca, wcześniactwo, długotrwała antybiotykoterapia, rozległe oparzenia skóry, inwazyjne procedury medyczne, zaburzenia funkcjonowania układu pokarmowego, zakażenie HIV. Kandydozy układowe o etiologii C albicans, ze względu na wysoką śmiertelność (30-70%), stanowią wyzwanie o wymiarze światowym. Z kolei, kandydozy o charakterze powierzchniowym zwykle nie stanowią zagrożenia dla życia, jednak znacznie obniżają jego standard. Ponadto, infekcje te stanowią problem diagnostyczny i terapeutyczny, a częstotliwość ich występowania wciąż wzrasta. Liczba dostępnych antymikotyków skutecznych przeciw C. albicans jest wciąż ograniczona, a ich stosowanie często wiąże się z efektami ubocznymi. Ze względu na mechanizm działania obecnie stosowane leki przeciwgrzybicze dzieli się na 5 grup: (1) inhibitory syntezy RNA i/lub DNA (fluorowane pochodne pirymidyny 5-FC); (2) substancje zaburzające funkcjonowania błony komórkowej (polieny: nystatyna, natamycyna, amfoterycyna B AmB); (3) inhibitory biosyntezy ściany komórkowej hamujące działanie syntazy P(1,3)-glukanu (echinokandyny: kaspafungina, mikafungina, anidulafungina); (4) inhibitory biosyntezy ergosterolu hamujące epoksydazę skwalenową i/lub akumulację toksycznych produktów pośrednich syntezy steroli (alliloaminy: terbinafina, naftifina); (5) związki hamujące syntezę ergosterolu poprzez inhibicję demetylazy lanosterolu (azole) [Perea S i Patterson TF. Antifungal resistance in pathogenic fungi. Clin Infect Dis 2002; 35:1073-1080; Spampinato C i Leonardi D. Candida infections, causes, targets, and resistance mechanisms: Traditional and alternative antifungal agents. Biomem Res Int 2013; 2013:204237.doi: 10.1155/203/204237].
Ze względu na swoje grzybobójcze właściwości oraz szerokie spektrum działania, AmB długo była uważana za złoty standard w zwalczaniu zakażeń grzybiczych. Ograniczenia użycia AmB w leczeniu wynikają z wysokiego stopnia rozprzestrzeniania w tkankach, długiego okresu półtrwania oraz znaczącej toksyczności. Toksyczność wszystkich polienów wynika z ich powinowactwa do cholesterolu, który jest ludzkim odpowiednikiem ergosterolu występującego u grzybów [Vandeputte P i wsp. Antifungal resistance and new strategies to control fungal infections. Int J Microbiol 2012; 2012:713687. doi:10.1155/2012/713687]. Ze względu na dużą toksyczność polienów, azole szybko stały się lekami pierwszego wyboru w leczeniu grzybic. Jednak, prowadzone w ostatnich latach badania [Espinel-Ingroff A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: yeasts and filamentous fungi. Rev Iberoam Micol 2008, 25:101-106] wskazują, że grzybostatyczne działanie azoli doprowadziło do selekcji opornych szczepów Candida. Echinokandy stanowią grupę leków nowej generacji powszechnie stosowaną w leczeniu kandydemii (zakażenie krwi). Jednak, najnowsze doniesienia literaturowe świadczą o pojawieniu się oporności na tę grupę leków [Alexander BD i wsp. Increasing echinocandin resistance in Candida glabrata: clinical failure correlates with presence of FKS mutations and elevated minimum inhibitory concentrations. Clin Infect Dis 2013,56: 1724-1732]. Z kolei, hamująca syntezę kwasów nukleinowych flucytozyna nie wykazuje toksyczności względem komórek ludzkich. Jednak, ze względu na narastającą oporność wśród szczepów Candida na ten antymikotyk, flucytozynę stosuje się wyłącznie w terapii skojarzonej z AmB lub azolami. Dotychczas, oporność na flucytozynę jest obserwowana in vitro u 3-10% izolatów C. albicans. Natomiast, w trakcie terapii flucytozyną około 30% izolatów nabywa oporności na ten antymikotyk. Ponadto, geny kodujące enzymy metabolizmu flucytozyny są powiązane z opornością krzyżową Candida spp. na flukonazol [Papon N i wsp. Molecular mechanism of flucytosine resistance in Candida lusitaniae: contribution of the FCY2, FCY1 and FUR1 genes to 5-fluorouracil and fluconazole cross-resistance. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51:369371].
PL 231 671 Β1
Wzrastająca częstotliwość występowania kandydoz i trudność ich leczenia stwarzają konieczność poszukiwania nowych związków o właściwościach przeciwgrzybiczych. Uwzględniając gwałtownie narastającą oporność tego patogenu na obecnie stosowane leki, istnieje znaczna potrzeba zapewnienia nowych antymikotyków ukierunkowanych na czynniki wirulencji C. a/bicans. Twórcy wynalazku opracowali uprzednio nowy sposób badania adhezji komórek Candida spp. do powierzchni modelu monowarstwy komórek nabłonkowych in vitro z wykorzystaniem inhibicji adhezji C. albicans uzyskanej dzięki 2-bromo-2-chloro-2-(4'-chlorofenylosulfonylo)-1-fenyloetanonowi (Zgłoszenie patentowe P.408765). Jednak, wobec wciąż aktualnej potrzeby zapewnienia nowych, jeszcze bardziej skutecznych związków znajdujących zastosowanie w leczeniu infekcji grzybiczych, celem kolejnych prac badawczych było wskazanie i scharakteryzowanie takiego związku.
Przedmiotem wynalazku jest 4-[(4-chlorometylosulfonylo-2-nitrofenyloamino)-4'-fenoksy]propionohydrazyd (związek P7) o wzorze I:
O
nhnh2
CHa (I)
Następnym przedmiotem wynalazku jest związek (P7) o wzorze I do zastosowania w medycynie.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest związek (P7) o wzorze I do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu grzybic wywołanych Candida spp.
Wykazano, że związek według wynalazku jest korzystnym inhibitorem adhezji komórek Candida spp. do powierzchni modelu monowarstwy komórek nabłonkowych in vitro, w szczególności modelu monowarstwy nabłonka jelitowego Caco-2.
Bardziej szczegółowo, związek według wynalazku jest korzystnym inhibitorem wzrostu planktonicznego Candida spp. oraz inhibitorem zmian poziomu transkrypcji genu proteazy serynowej ΚΕΧ2 w komórkach Candida spp. podczas wzrostu w podłożu YEPD oraz inwazji monowarstwy komórek nabłonkowych, w szczególności modelu monowarstwy nabłonka jelitowego Caco-2.
W świetle nieoczekiwanie korzystnych właściwości związku według wynalazku, niniejszy wynalazek zapewnia wiele korzyści.
Proteaza serynowa to kluczowy czynnik regulatorowy enzymów hydro litycznych - proteaz aspartylowych, odgrywających rolę w patogenezie kandydoz. Ponadto, proteaza serynowa jest odpowiedzialna za wzrost i żywotność komórek Candida. Zastosowanie związku chemicznego P7 zapewnia zmianę (spadek) liczby transkryptów genu proteazy serynowej ΚΕΧ2 w komórkach Candida spp.
Adhezja jest jednym z kluczowych czynników wirulencji C. albicans niezbędnym do rozwoju infekcji. Stanowi pierwszy etap tworzenia biofilmu. Zastosowanie związku P7 przeciwko C. albicans obniża adhezję tego oportunistycznego patogenu do powierzchni biotycznych. Pochodna aromatyczna P7 charakteryzuje się wyższą skutecznością przeciw Candida spp. względem dotychczas znanych związków w stanie techniki (np. zgłoszenie patentowe nr P.408765; Bondaryk M. i wsp. Sulfone derivatives reduce growth, adhesion and aspartic protease SAP2 gene expression. World J Microbiol Biotechnol 2014; 30:2511—2521), co zilustrowano w Przykładzie 5.
Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach wykonania.
Przykład 1
Synteza 2-[(4-chlorometylosulfonylo-2-nitrofenyloamino)-4'-fenoksy]propionohydrazydu (P7)
Charakterystyka związku P7
Temperatura topnienia: 170-171°C
Analiza Elementarna dla wzoru: C16H17ON4O6S (428.85)
Obi. (%): C(44.81) H(4.00) N(13.06),
Znal. (%): C(44.87) H(3.95) N(13.11).
PL 231 671 B1
Synteza 2-[(4-chlorometylosulfonylo-2-nitrofenyloamino)-4'-fenoksy]propionohydrazydu (związek
P7):
Do 4.36g (0,1 mol) chlorku kwasu 2-[4-(chlorometylosulfonylo-2-nitrofenyloamino)-4'-]fenoksy]propanokarboksylowego w 80 mL DMF dodano równomolową ilość trietyloaminy oraz 4.2 mL 80% wodzianu hydrazyny. Całość mieszano w temperaturze 70°C przez 3.5 godziny. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, oddestylowano na wyparce próżniowej rozpuszczalnik a pozostałość przemyto wodą, wysuszono i krystalizowano z toluenu.
Otrzymano 3.28 g produktu, co stanowi 76% wydajności.
P r z y k ł a d 2. Wyznaczanie minimalnego stężenia hamującego wzrost komórek grzybów Candida albicans
Wyznaczenie minimalnego stężenia hamującego (wartości MIC) prowadzono zgodnie ze standardowym protokołem mikrorozcieńczeń CLSI M-27 A2 [Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly National Committee for Clinical and Laboratory Standards NCCLS): Method M27-A2, wyd. 2-gie. Wayne, PA: CLSI; 2002;22:1-29] dla grzybów drożdżopodobnych przy użyciu 96-studzienkowej płytki titracyjnej. Zgodnie z protokołem CLSI M-27 A2, MIC określono względem referencyjnego szczepu C. albicans 90028 (ATCC, USA).
Mikropłytki inkubowano w temp. 35°C w wytrząsarce poziomej (New Brunswick Scientific Co, Inc, USA) przez 18 i 48 godzin. Odczyt wyników - określenie wartości MIC przeprowadzono wizualnie po 18 i 48 godzinach. MIC określono jako najniższe stężenie związku, które całkowicie hamowało wzrost komórek grzyba po 48-godzinnym czasie inkubacji. W studzienkach odpowiadających wartości MIC nie obserwowano zmętnienia. Doświadczenie powtórzono trzykrotnie.
Badania wykazały, że związek P7 wykazuje znaczącą aktywność przeciwko szczepom Candida, efektywnie hamując wzrost grzyba po 48 godzinach w stężeniu 16 gg/mL. Na podstawie wyniku powyższego testu, do dalszych badań zastosowano związek P7 w stężeniu 16 gg/mL.
P r z y k ł a d 3
Związek P7 jako inhibitor poziomu transkrypcji genu proteazy serynowej KEX2 w komórkach blastokonidialnych Candida spp. podczas wzrostu w podłożu YEPD oraz podczas inwazji monowarstwy komórkowej Caco-2
W niniejszym przykładzie zastosowano związek (P7) według wynalazku o wzorze I.
Przygotowano dwa rodzaje zawiesiny komórek Candida spp. (A i B) (A) W probówkach typu Eppendorf umieszcza się 1.8 mL płynnego podłoża YEPD, następnie dodaje się 200 gL zawiesiny komórek Candida spp. o gęstości 1x104 jtk/mL (jednostek tworzących kolonie na mililitr). Inkubację prowadzi się w wytrząsarce w temp. 35°C przez 18 godzin.
(B) Sporządza się szereg stężeń związku chemicznego P7 w płynnym podłożu YEPD. W probówkach typu Eppendorf umieszcza się 1.8 mL odpowiedniego stężenia związku P7 i dodaje się 200 gL zawiesiny komórek Candida spp. o gęstości 1x104 jtk/mL. Ostateczne stężenie związku P7 w probówkach typu Eppendorf wynosi 16 gg/mL. Preinkubację blastokonidiów Candida ze związkiem P7 w stężeniu 16 gg/mL prowadzi się w wytrząsarce w temp. 35°C przez 18 godzin. Następnie, zawiesinę wiruje się przez 10 min w temp. 4°C przy prędkości 14000 rpm. Osad przemywa się wodą jałową i zawiesza w podłożu płynnym YEPD. Komórki Candida zawieszone w podłożu YEPD poddaje się inkubacji w temp. 35°C przez 18 godzin, a następnie izoluje się z nich RNA (zgodnie z opisem Izolacja RNA z morfotypów Candida, umieszczonym w dalszej części opisu). Komórki zawieszone w podłożu YEPD po przemyciu w PBS i zawieszeniu w świeżym roztworze RPMI przenosi się na 18-godzinną monowarstwę Caco-2 umieszczoną w 24 studzienkach plastikowej płytki i inkubuje w temp. 35°C w 5% CO2 przez 18 godzin. Następnie zawartość każdej studzienki płytki przenosi się do oddzielnych probówek typu Eppendorf i wiruje przez 10 min w temp. 4°C przy prędkości 14000 rpm. Osad dwukrotnie przemywano roztworem PBS.
IZOLACJA RNA Z MORFOTYPÓW CANDIDA ALBICANS
Izolację RNA z morfotypów Candida albicans przeprowadzano zgodnie z protokołem do izolacji RNA z drożdży według Amberg i wsp. [Amberg D.C., Burke D.J.: Yeast DNA isolation, techniques andprotocols 3. [w]: Amberg D.C., Burke D.J. (eds), Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2005]
PL 231 671 B1
1. Zawiesinę komórek C albicans wirowano z prędkością 5000 rpm przez 5 minut w temp. 4°C.
2. Supernatant zlewano a osad zawieszano w 500 pL buforu LETS (0.1 M LiCI, 0.01 M Na2EDTA, 0.01 M Tris-HCl (pH=7.4), 0.2% SDS, 0.1% pirowęglan dietylowy; rozpuszczalnik: woda miliQ; Sposób jałowienia: przesączanie przez filtr milipore 0 0.22.)
3. Zawiesinę przenoszono do nowych probówek Eppendorfa zawierających 250 pL mieszaniny fenol : LETS (1:1) oraz 137 mg kulek szklanych (0 0.45-0.5 mm).
4. Zawiesinę worteksowano przez 30 sek., a następnie inkubowano na lodzie przez kolejne 30 sekund. Ten etap powtarzano trzykrotnie.
5. Zawiesinę wirowano z prędkością 5000 rpm przez 10 min w temp. 4°C.
6. Supernatant przenoszono do sterylnego Eppendorfa zawierającego 400 pL mieszaniny fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (25:24:1) (Sigma, USA) i pozostawiano na noc w temp. 4°C.
7. Fazę wodną przenoszono do nowego Eppendorfa i dodawano 5M LiCl w ilości 1/10 wyekstrahowanej fazy wodnej.
8. Fazę wodną precypitowano w 5M LiCl przez 3 godziny w -20°C.
9. Następnie osad umieszczano w wodzie NFW (pozbawionej nukleaz) (SIGMA, USA). Uzyskany precypitat RNA przechowywano w -20°C. Stężenie RNA (ng/ml) określano za pomocą spektrofotometru (Nano Drop 2000, Thermo SCIENTIFIC, USA).
ILOŚCIOWE OKREŚLENIE ZMIAN POZIOMU TRANSKRYPTÓW mRNA KEX2 W KOMÓRKACH CANDIDA
Ekspresję genu KEX2 w komórkach Candida podczas inwazji ludzkich tkanek określano przy użyciu qRT-PCR według Naglika i wsp. [Naglik J.R., Moyes D., Makwana J. i wsp.: Quantitative expression of the Candida albicans secreted aspartyl proteinase gene family in human oraland vaginal candidiasis. Microbiology 2008, 154(11): 3266-3280]:
ETAPY BADANIA ZMIAN POZIOMU TRANSKRYPCJI mRNA KEX2 MORFOTYPÓW C. ALBICANS
Przepisanie RNA na cDNA (zgodnie z instrukcją producenta, Enhanced Avian HS RT-PCR Kit.
Sigma USA)
Etap 1:
Mieszanina reakcyjna (10 pL): 1 pL RNA, 1 pL dNTPs Mix (dATP, dGTP, dCTP, dTTP; SIGMA, USA), 1 pL oligoDT, 7 pL woda NFW (ang. nuclease free water) (SIGMA, USA)
Inkubacja 70°C 10 min
Etap 2:
Mieszanina reakcyjna (20 pL): 1 pL RT transkryptaza (AMV-RT 1U/1 pL), 2 pL buforu dla RT transkryptazy, 7 pL woda NFW
Inkubacja 50°C 45 min Ilościowa reakcja RT-PCR
Mieszanina reakcyjna (25 pL): 2.25 pL każdego ze starterów F i R; 0.75 pL sonda; 1.5 pL cDNA; 12 pL QuantiTect Probe PCR Kit (Qiagen, Niemcy), 6.25 pL woda NFW
Wstępna denaturacja 95°C 15 min
Denaturacja właściwa 94°C 15 sek.
Wydłużanie 60°C 1 min (45 cykli)
Startery komplementarne do sekwencji C. albicans SC5314 KEX2 mRNA (ref. XP_723441.1) zaprojektowano przy użyciu programu Primer 3 Input® (version 0.4.0). Starter odwrotny o sekwencji zasad (5'-GTTTTCGCTTCTGGAAATGG-3') amplifikował fragment genu KEX2 o długości 238 par zasad (pz) z pozycji 1036 pz, natomiast starter zgodny (5'-CAGCAGCAGAAGTACCACCA-3') z pozycji 1273 pz.
PL 231 671 Β1
Następnie, określano ilościowo transkrypty mRNA ΚΕΧ2 w próbkach RNA. Analizę przeprowadzano przy użyciu aparatu LightCycler® 96 Real-Time PCR Instrument (Roche, Szwajcaria). Znakowanie badanych sekwencji umożliwiło zastosowanie QuantiTect®Probe PCR Kit, zgodnie z instrukcją producenta (Qiagen, Niemcy).
Względne ilościowe zmiany tempa transkrypcji genu ΚΕΧ2 określano (po 18 godz. inkubacji szczepów na linii Caco-2, a także po 18 godz. inkubacji szczepów w płynnym YEPD) za pomocą metody 2 AACt (Livak KJ i Shmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001; 25:402-408.). Wartości Ct zostały wyznaczone automatycznie za pomocą aparatu LightCycler® 96 Real-Time PCR Instrument. Wyniki analizowano stosując następujące wzory:
ACt = śr.CtKEX2 - śr. Ct aktyna oraz AACt = ACt - ACt szczep rodzicielski
Jako kontrolę wewnętrzną (housekeeping gene) użyto genu aktyny (AC77)· Każdą analizę powtarzano trzykrotnie. Normalizację wyników dla zmian poziomu transkrypcji genu ΚΕΧ2 wykonywano względem określonych szczepów rodzicielskich.
W przykładzie użyto szczepu referencyjnego Candida albicans SC5314 (ATCC, Manassas, VA USA), szczep przedstawiono w Tabeli 1.
Tabela 1. Zastosowanie w badaniu szczepy Candida albicans oraz Candida glabrata
| Szczep | Szczep wyjściow y | Charakterystyka lub genotyp | Odnośnik literaturowy |
| SC5314 | - | Szczep dziki, szczep odnośnikowy | [Gillum i wsp. Mol Gen Genet 1984; 198:1791821 |
| 90028 | - | Szczep dziki, szczep odnośnikowy | [Pfaller MA i wsp. J Clin Microbiol 1994; 32:1650-1653] |
| CNA1 | CAR | A ura3::imm434/Aura3::imm43 4K£X2tex2: :hisG URA3hisG | Newport i Agabian. J Biol Chem 1997; 272:28954-28961 |
| CNA2 | CAR | Aura3::imm434/Aura3::imm434KEX2kex2::hisG | |
| CNA3 | CAI4 | Aura3:: imm434/A ura3 : imm434kex2::hisGkex2: hisG(JRA3 hisG | |
| CNA4 | CAR | A«ra3::imm434/Aura3::imm434kex2::hisGkex2::kisG | |
| C. glabrata CgAHTó his3 trpl kex2::MS3 1006 | Bader i wsp. Mol Microbiol 2001; 41:1431-1444 | ||
| C. glabrata 1008 | CgAIITó | his3 trp! kex2::HIS3 pKRT 1 (ΚΕΧ2 TRPt) | |
| C. glabrata 1010 | CgAHTÓ | his3 trpl kex2::HfS3 pACT-/4(TRPt) |
Na potrzeby procedury badawczej, związek P7 przygotowano w RPMI-1640 (Sigma, USA) w stężeniu końcowym 16 pg/mL po uprzednim dodaniu inokulum.
Związek P7 hamował poziom transkrypcji genu ΚΕΧ2 w komórkach C. albicans wyrosłych w podłożu YEPD. Obserwowano 1,5-krotny spadek transkrypcji w komórkach traktowanych związkiem P7 w porównaniu z wynikiem uzyskanym dla komórek nietraktowanych, inkubowanych w podłożu YEPD przez 18 godzin. W porównaniu z komórkami wyhodowanymi na powierzchni Caco-2, nietraktowanymi związkiem P7, zaobserwowano obniżony poziom transkrypcji genu ΚΕΧ2 (2.5-krotny), po uprzednim traktowaniu związkiem P7. Dane przedstawiono w Tabeli 2.
PL 231 671 Β1
Tabela 2. Wpływ związków P7 na zmianę poziomu transkrypcji genu ΚΕΧ2 w komórkach szczepu dzikiego w Candida albicans SC5314
| Związek | Podłoże | Czas (t | Odr.) | ΚΕΧ2 | ACT1 | ACt | |||
| Traktowania związkiem w RPMI | Inkubacji na podłożu docelowym | średnie Ct | SD* | Średnie Ct | SD* | Średnia | SD* | ||
| brak związku | YBPD | nic dotyczy | IS | 37.59 | ±0.70 | 31.01 | ±0.30 | 6.58 | ±0.81 |
| P7 | Yi;pp | IS | IS | 37.79 | ±0.25 | 33 56 | ±1.42 | 4.23 | ±1.57 |
| brak związku | Caco-2 | nic dotyczy | 2 | 36.22 | ±1.07 | 33.89 | ±0.37 | 2.34 | ±1.43 |
| brak związku | Caco-2 | nic dotyczy | 6 | 36.13 | ±0.44 | 40.31 | ±1.59 | -4.18 | ±1.80 |
| brak związku | Caco-2 | nic dotyczy | IS | 34.25 | ±0.69 | 39.97 | ±0.89 | -5.72 | ±1.57 |
| R7 | Caco-2 | 18 | IS | 37.24 | ±1.19 | 43.13 | ±0.00 | -5.89 | ±1.19 |
* odchylenie standardowe
Przykład 4
Związek P7 jako inhibitor adhezji komórek Candida spp. do monowarstwy komórek nabłonkowych w modelu Caco-2
W niniejszym przykładzie zastosowano związek (P7) według wynalazku o wzorze I.
Związek został syntetyzowany zgodnie z protokołem syntezy przedstawionym w Przykładzie 1.
W przykładzie zastosowano szczepy referencyjne Candida albicans SC5314 (ATCC, Manassas, VA, USA) oraz 90028 (ATCC, Manassas, VA, USA) oraz szczepy atenuowane C. albicans oraz C. glabrata (z delecją genów odpowiedzialnych za wirulencję Candida spp.). Szczepy pochodziły z kolekcji Uniwersytetu Medycznego w Góttingen w Niemczech (Newport G i Agabian N ΚΕΧ2 influences Candida albicans proteinase secretion and hyphal formation. J Biol Chem 1997; 272:28954-28961, Bader O. i wsp. The ΚΕΧ2 gene of Candida glabrata is required for celi surface integrity. Mol Microbiol 2001; 41:1431-1444). Wspomniane wyżej szczepy przedstawiono w Tabeli 1.
Szczepy przechowywano na kulkach ceramicznych umieszczonych w probówkach do krio-mrożenia w temperaturze -70°C (Microbanktube, Prolab Diagnostics, Richmond Hill, ON, Kanada). Bezpośrednio przed badaniem, szczepy posiewano na podłoże YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy) i inkubowano (CWE, Andrzejów, Polska) w temperaturze 30°C przez 18 godzin [Ness F i wsp. The Candida albicans Rgdl is a RhoGAP protein involved in the control of filamentous growth. Fungal Genet Biol 2010; 47:1001-1011],
Badanie hamowania adhezji komórek Candida spp. do powierzchni modelu monowarstwy komórek nabłonkowych Caco-2 przez P7 przeprowadzono według wystandaryzowanej procedury zaprojektowanej uprzednio przez twórców wynalazku (zgłoszenie patentowe nr P.408765).
Na podstawie oznaczenia wartości MIC, do badania wpływu związku P7 na adhezję komórek Candida spp. wybrano stężenie 16 μg/mL. Na potrzeby procedury badawczej, związek P7 przygotowano w RPMI-1640 (Sigma, USA) w stężeniu końcowym 16 μg/mL, po uprzednim dodaniu inokulum.
Linię Caco-2 (HTB-37 ATCC, Manassas VA, USA) hodowano zgodnie z zaleceniami producenta (ATCC, Manassas, VA, USA), tj. w podłożu Eagle'a (Minimum Essential Medium Modified EMEM, 30-2003, ATCC, Manassas, VA, USA) uzupełnianym kolejno: inaktywowaną surowicą bydlęcą (w stężeniu końcowym 10% w podłożu EMEM; 30-2020 ATCC, Manassas, VA, USA) oraz roztworem mieszaniny antybiotyków penicyliny i streptomycyny (w stężeniu końcowym 1% w podłożu EMEM; 30-2300 ATCC, Manassas, VA, USA). Inkubację linii komórkowej prowadzono w cieplarce (Memmert, GmbH Co. KG, Schwabach, Niemcy) w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 przez 18 godzin. W celu przeprowadzenia analizy hamowania adhezji Candida spp. do monowarstwy Caco-2 przy użyciu związku P7, komórki nabłonkowe przygotowano zgodnie z opisaną uprzednio procedurą (zgłoszenie patentowe P.408765). Komórki nabłonkowe w ilości 1.2 x 105/ mL podłoża EMEM wprowadzono do każdej studzienki plastikowej płytki 24-studzienkowej (Corrning, Nowy Jork, NY, USA). Inkubację prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 przez 18 godzin. Przed transfekcją, płyn znad linii komórkowej usuwano za pomocą pipety pasterowskiej.
PL 231 671 Β1
Z osiemnasto-godzinnych hodowli Candida spp. prowadzonych na podłożu YEPD za pomocą plastikowej ezy zebrano po 1-2 kolonie i wprowadzono do buforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS, Biomed, Lublin). Zawiesiny blastokonidiów w ilości 200 μί o gęstości 1x106 komórek/mL za pomocą pipety automatycznej (Eppendorf, Research plus, Hamburg, Niemcy) wprowadzono kolejno do probówek typu Eppendorf zawierających 1800 μί związku P7 w RPMI [Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly National Committee for Clinical and Laboratory Standards NCCLS): Method M27-A2, wyd. 2-gie. Wayne, PA: CLSI; 2002;22:1-29], Następnie, prowadzono inkubację z wytrząsaniem w temp. 35°C przez 90 min. W celu usunięcia związku, przeprowadzono szereg płukań zawiesiny komórek Candida spp. roztworem PBS, za każdym razem zawiesinę komórek odwirowując (12 000 rpm przez 5 min). Osad komórek Candida zwieszono w 1 mL podłoża RPMI i całość (1 mL) przenoszono do odpowiednich studzienek płytki 24-studzienkowej, zawierających osiemnasto-godzinną monowarstwę komórek Caco-2 (jak wyżej). Inkubację prowadzono w temperaturze 37°C w 5% CO2 przez 90 min. Równocześnie przeprowadzono pomiar kontrolny - badanie adhezji szczepów Candida spp. niepoddanych działaniu P7.
Po 90-minutowej inkubacji ww. warunkach płyn znad hodowli usuwano a samą hodowlę dwukrotnie przepłukano roztworem PBS. Przeprowadzono lizę monowarstwy Caco-2 w celu odzyskania komórek Candida spp. wykazujących adhezję do monowarstwy Caco-2 (zgłoszenie patentowe nr P.408765). Odzyskaną zawiesinę adherentnych komórek C. albicans odwirowano i zawieszono w świeżym roztworze PBS. Tak przygotowaną zawiesinę adherentnych komórek wysiewano na podłoże stałe YEPD i inkubowano (CWE, Andrzejów, Polska) w temperaturze 35°C przez 18 godzin.
Następnie, obliczono procent komórek adherentnych poddanych działaniu P7 oraz próby kontrolnej. Obliczono procent redukcji (R%) adhezji komórek C. albicans do monowarstwy Caco-2 pod wpływem działania związku P7 w stężeniu 16 μg/mL względem adhezji komórek C. albicans niepodanych działaniu związku, wyliczonej analogicznie jak w zgłoszeniu patentowym nr P.408765. Procent redukcji (R%) obliczono zgodnie ze wzorem:
00%-[(%komórek adherentnych traktowanych / % komórek adherentnych nietraktowanych) X 100
Wyniki przedstawiono w Tabeli 3.
Tabela 3. Hamowanie adhezji komórek Candida spp. do powierzchni monowarstwy
| Szczep | Próba kontrolna | Komórki poddane działaniu P7 | R%** | ||
| % komórek adherentnych | SD* | % komórek adherentnych | SD* | 82.81 | |
| SC5314 | 59.34 | ±0.06 | 10.20 | ±0.10 | 84.11 |
| CNA1 | 55.80 | ±0.18 | 8.87 | ±0.09 | 95.41 |
| CNA2 | 62.45 | ±0.27 | 2.87 | ±0.01 | 77.88 |
| CNA3 | 52.33 | ±0.16 | 11.58 | ±0.11 | 16.10 |
| CNA4 | 22.20 | ±0.06 | 18.63 | ±0.08 | 71.40 |
| 1006 | 56.99 | +0.24 | 16.30 | ±0.19 | 70.50 |
| 1008 | 82.15 | ±0. !9 | 24.23 | ±0.26 | 87.26 |
| Ι0Κ) | 53.85 | ±0.28 | 6.86 | ±005 | 82.81 |
* odchylenie standardowe ** procent redukcji adhezji
Przykład 5
Analiza porównawcza wpływu związku P7 na adhezję komórek Candida spp. do komórek nabłonka w odniesieniu do efektywnego inhibitora adhezji 2-bromo-2-chloro-2-(4'-chlorofenylosulfonylo)-1-fenyloetanonu
V\i niniejszym przykładzie zastosowano 2-[(4-chlorometylosulfonylo-2-nitrofenyloamino)-4'-fenoksyjpropionohydrazyd (związek P7). Aktywność związku P7 przeciw Candida spp. została porównana z aktywnością efektywnego inhibitora adhezji 2-bromo-2-chloro-2-(4'-chlorofenylosulfonylo)-1-fenyloetanonu (związku 0-21). Dane przedstawiono w Tabeli 4.
PL 231 671 Β1
Tabela 4. Porównanie działania inhibitorów adhezji komórek Candida spp. do powierzchni monowarstwy komórek nabłonkowych
| Redukcja ad hezji {%) | ||
| Szczep | P7 | 0-21 |
| SC5314 | 82.31 | 49.61 |
| CNA1 | 84.11 | 32.2 |
| CNAZ | 95.41 | 64.0 |
| CNA3 | 77.88 | 3.0 |
| CNA4 | 16.10 | 67,0 |
| 1006 | 71.40 | 20,8 |
| 1008 | 7D.50 | 78.8 |
| 1010 | 87,26 | 65.9 |
*procent redukcji
2-bromo-2-chloro-2-(4'-chlorofenylosulfonylo)-1-fenyloetanon (związek 0-21) jest efektywnym inhibitorem adhezji C. albicans, który redukuje ilość komórek adherentnych szczepu dzikiego SC5314 niemal o połowę (% redukcji = 49,61, Tabela 4, zgłoszenie nr P.408765). Natomiast, stwierdzono, że zastosowanie związku P7 redukowało ilość komórek adherentnych szczepu dzikiego SC5314 odpowiednio o 1.67. Ponadto, związek P7 generalnie wykazuje większą skuteczność w hamowaniu adhezji wobec szczepów atenuowanych Candida spp. względem związku 0-21. Dane przedstawiono w poniższej Tabeli 5.
Tabela 5. Względna skuteczność związku P7 w odniesieniu do związku 0-21
| Szczep | Redukcja zdolnoici adhezyjnych C. alblcons przez P71 PB względem 0-21 | |
| 0-21 w stężeniu 16 yg/mL | P7 w stężeniu 16 yg/mL | |
| SC5314 | l.O* | 1.67 |
| CNA1 | 1.0* | 2.61 |
| CNA2 | 1.0* | 1.49 |
| CNA3 | 1.0* | 9.74 |
| CNA4 | 1.0* | 0.24 |
| 1006 | 1.0* | 3.43 |
| 1008 | 1.0* | 0.89 |
| 1010 | 1.0* | 1.32 |
*K.alibrator
Zastrzeżenia patentowe
Claims (3)
1. Związek o wzorze I:
O
NHNHj
CH3 (I)
PL231 671 Β1
2. Związek ο wzorze I:
(Ο do zastosowania w medycynie.
3. Związek o wzorze I:
O
NHNHj
CH3 (I) do zastosowania w zapobieganiu lub leczeniu grzybic wywołanych Candida spp.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410019A PL231671B1 (pl) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | Syntetyczna pochodna aromatyczna i jej zastosowanie do zapobiegania lub leczenia grzybic wywołanych Candida spp. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410019A PL231671B1 (pl) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | Syntetyczna pochodna aromatyczna i jej zastosowanie do zapobiegania lub leczenia grzybic wywołanych Candida spp. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL410019A1 PL410019A1 (pl) | 2016-05-09 |
| PL231671B1 true PL231671B1 (pl) | 2019-03-29 |
Family
ID=55910533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410019A PL231671B1 (pl) | 2014-10-31 | 2014-10-31 | Syntetyczna pochodna aromatyczna i jej zastosowanie do zapobiegania lub leczenia grzybic wywołanych Candida spp. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL231671B1 (pl) |
-
2014
- 2014-10-31 PL PL410019A patent/PL231671B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL410019A1 (pl) | 2016-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Arevalo-Rodriguez et al. | Prolyl isomerases in yeast | |
| KR101311196B1 (ko) | 진균 감염 또는 뇌수막염 치료를 위한 ｕｐｒ 신호전달 유전자 ｉｒｅ1 및 ｈｘｌ1의 용도 | |
| Aydin et al. | In vitro antifungal and antibiofilm activities of novel sulfonyl hydrazone derivatives against Candida spp. | |
| Borah et al. | The Rho1 GTPase-activating protein CgBem2 is required for survival of azole stress in Candida glabrata | |
| KR101403862B1 (ko) | 진균 감염 또는 뇌수막염 치료를 위한 ｕｐｒ 신호전달 유전자 ｉｒｅ1 및 ｈｘｌ1의 용도 | |
| Kisly et al. | The functional role of eL19 and eB12 intersubunit bridge in the eukaryotic ribosome | |
| Cernicka et al. | Chemosensitisation of drug-resistant and drug-sensitive yeast cells to antifungals | |
| JP2004511756A (ja) | 抗真菌性化合物および使用法 | |
| Zeng et al. | Inactivating the mannose-ethanolamine phosphotransferase Gpi7 confers caspofungin resistance in the human fungal pathogen Candida albicans | |
| Lee et al. | The novel antifungal agent AB-22 displays in vitro activity against hyphal growth and biofilm formation in Candida albicans and potency for treating systemic candidiasis | |
| Dos Santos et al. | Genome-wide identification of genes required for yeast growth under imatinib stress: vacuolar H+-ATPase function is an important target of this anticancer drug | |
| KR20170054190A (ko) | 진균 감염 치료 및 예방을 위한 신규한 키나아제 및 이들의 용도 | |
| Bujdáková et al. | Susceptibility to caspofungin and fluconazole and Als1/Als3 gene expression in biofilm and dispersal cells of Candida albicans | |
| Finkel et al. | Application of the systematic “DAmP” approach to create a partially defective C. albicans mutant | |
| Dharmaiah et al. | Antifungal drug resistance: significance and mechanisms | |
| Alqysi et al. | Study of Gene Expression of Some Agglutination-Like Sequence Genes of Candida albicans Isolated from Iraqi Children with Inflammatory Bowel Disease | |
| Aydin et al. | Journal of Medical Mycology | |
| Kalem et al. | Puf4 Mediates Post-transcriptional Regulation of Caspofungin Resistance in Cryptococcus neoformans | |
| Bhetariya et al. | Human fungal pathogens and drug resistance against azole drugs | |
| Garcia-Rangel | Anti-Candida activity of the human gut metabolome | |
| Laswad | Investigation the roles of AZR1 and CDR1 genes of candida glabrata in antifungal drug resistance | |
| KR20170077064A (ko) | 진균 감염 치료 및 예방을 위한 신규한 키나아제 단백질 및 이의 용도 | |
| KR20170077848A (ko) | 진균 감염 치료 및 예방을 위한 Bud32 단백질 및 이의 용도 | |
| Simões | A contribution to further understand the molecular mechanisms of antifungal resistance in Candida glabrata mediated by the transcription factor CgPdr1 | |
| Razzaq | Analyzing the roles of the essential gene TRA1 and the novel extracellular vesicle EVP1 in regulating morphogenesis and the antifungal drug resistance response in the opportunistic fungal pathogen Candida albicans |