KR20170054190A - 진균 감염 치료 및 예방을 위한 신규한 키나아제 및 이들의 용도 - Google Patents

진균 감염 치료 및 예방을 위한 신규한 키나아제 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 크립토코쿠스 속 병원성 곰팡이에 의한 진균 뇌수막뇌염 치료 및 예방을 위한 키나아제들의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 크립토코쿠스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)의 병원성-조절 키나아제 단백질의 양 또는 활성, 또는 상기 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 항진균제 스크리닝 방법; 및 크립토코쿠스 네오포만스의 병원성-조절 키나아제 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자에 대한 저해제를 포함하는 항진균용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 항진균제 스크리닝 방법을 이용하여 뇌수막뇌염 등을 치료하기 위한 항진균제를 효과적으로 스크리닝할 수 있고, 본 발명에 따른 항진균용 약학 조성물을 이용하여 뇌수막뇌염 등을 효과적으로 치료할 수 있는바, 의약분야, 생명과학분야 등 관련 산업분야에서 널리 활용될 수 있다.

Description

진균 감염 치료 및 예방을 위한 신규한 키나아제 및 이들의 용도 {NOVEL KINASE FOR TREATMENT AND PREVENTION OF FUNGAL INFECTION AND THE USE THEREOF}
본 발명은 병원성 곰팡이에 의한 진균 감염의 예방 및 치료를 위한 신규한 키나아제 및 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 크립토코쿠스 네오포만스 (Cryptococcus neoformans)의 병원성-조절 키나아제 단백질의 양 또는 활성, 또는 상기 단백질을 인코딩 하는 유전자의 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 항진균제 스크리닝 방법; 및 크립토코쿠스 네오포만스의 병원성-조절 키나아제 단백질 또는 이를 인코딩 하는 유전자에 대한 저해제를 포함하는 항진균용 약학 조성물에 관한 것이다.
크립토코쿠스 네오포만스는 토양, 나무 및 새 구아노를 포함하는 다양한 자연환경에 분포하며 그 감염원이 다양하고, 하등 진핵세포에서 수생 및 육생 동물에 이르는 다양한 숙주를 사용하는 진균 병원균이다 (Lin, X. & Heitman, J. The biology of the Cryptococcus neoformans species complex. Annu. Rev. Microbiol. 60, 69-105, 2006). 크립토코쿠스 네오포만스는 진균 뇌수막염에 의한 사망의 주요원인으로, 전세계적으로 매년 약 백만명의 신규 감염자 및 약 육십만명의 사망자를 초래하는 것으로 알려졌다 (Park, B. J. et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS 23, 525-530, doi:10.1097/QAD.0b013e328322ffac, 2009). 그러나 전신성 크립토코쿠스증 (systemic Cryptococcus's)의 치료에는 제한적인 치료법만 이용되고 있는 실정이다 (Perfect, J. R. et al. Clinical practice guidelines for the management of cryptococcal disease: 2010 update by the infectious diseases society of america. Clin Infect Dis 50, 291-322, doi:10.1086/649858, 2010). 한편, C. 네오포만스는 담자균류 (basidiomycetes)에 대한 이상적인 진균 모델시스템으로 여겨지며, 이는 완전히 시퀀싱 되고 잘 설명된 게놈데이터베이스, 성분화 (sexual differentiation)를 통한 유전적 정밀분석방법, 효율적인 역방향 및 정방향 유전학방법, 및 다양한 이종성 숙주모델시스템의 유용성 덕택이다 (Idnurm, A. et al. Deciphering the model pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Nat. Rev. Microbiol. 3, 753-764, 2005).
C. 네오포만스의 병원성 메커니즘을 이해하기 위해, 광범위한 연구가 지난 수십 년간 수행되었다. 개별적인 유전자/단백질의 기능을 분석하기 위한 노력뿐만 아니라, 최근의 대규모 기능적 유전자 분석은 C. 네오포만스의 전체적 생물학적 회로 (circuitry)에 대한 보다 더 많은 이해를 가져왔다. 그러나, C . 네오포만스의 일반 생물학적 특성 및 병원성을 주관하는 신호 및 대사경로가 아직 완전하게 밝혀지지 않은 상태이다. 이의 주원인은 신호경로에서 중요한 역할을 수행하고, 전사인자 (TFs, transcription factors)의 활성화 또는 발현을 주관하는 키나아제의 기능이 게놈규모에서 충분히 특성확인 되지 않았기 때문이다. 일반적으로, 키나아제는 인산화를 통해 약 30%의 세포단백질에 영향을 미치며, 성장, 세포주기조절, 분화, 발달, 스트레스 반응 및 다른 많은 세포기능에서 핵심 역할을 수행한다 (Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem Sci 25, 596-601, 2000). 또한, 키나아제는 화합물과 같은 소분자 (small molecules) 또는 항체에 의해 그 활성 억제가 용이하므로, 약물개발의 주요 타겟이 되는 단백질 계열로 여겨진다 (Rask-Andersen, M., Masuram, S. & Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annu Rev Pharmacol Toxicol 54, 9-26, doi:10.1146/annurev-pharmtox-011613-135943, 2014). 따라서, 항진균 약물로서 개발될 수 있는 병독성-관련 키나아제를 찾기 위해, 인간 진균 병원체 내 진균 키나아제에 대한 체계적이고 기능적인 프로파일링이 그 어느 때보다 보다 더 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 114개의 추정 키나아제에 대해 상동재조합을 통해 높은 품질을 지닌 226개의 표식인자 유전자결실 균주 라이브러리를 구축하고, 성장, 분화, 스트레스반응, 항진균내성 및 병독성인자 생성 (캡슐, 멜라닌 및 우레아제)을 포함하는 30가지 다른 생체 외 (in vitro) 성장 조건하에서 이들의 표현형질을 조사함으로써, C. 네오포만스 뿐만 아니라 담자균류 내 키놈 (kinome) 네트워크의 체계적인 기능 프로파일링을 수행하였다. 또한, 본 발명자들은 이들의 잠재적 병원성 및 감염성을 곤충 및 생쥐 (murine) 숙주 모델에서 조사하였다.
본 발명의 목적은 병원성 곰팡이에 의한 진균 감염의 예방 및 치료를 위한 신규한 키나아제 및 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 크립토코쿠스 네오포만스 (Cryptococcus neoformans)의 병원성-조절 키나아제 단백질의 양 또는 활성, 또는 상기 단백질을 인코딩 하는 유전자의 발현량을 측정하여 항진균제를 스크리닝 하는 것을 제공한다. 또한, 본 발명은 크립토코쿠스 네오포만스의 병원성-조절 키나아제 단백질 또는 이를 인코딩 하는 유전자에 대한 저해제 및/또는 활성화제를 포함하는 항진균용 약제 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 크립토코쿠스증 또는 뇌수막염의 치료 및 예방을 위한 약물 후보물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 크립토코쿠스증 또는 뇌수막염의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 진균 감염을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 병원성조절 키나아제 단백질을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 신규한 병원성조절 키나아제는 Fpk1, Bck1, Gal83, Kic1, Vps15, Ipk1, Mec1, Urk1, Yak1, Pos5, Irk1, Hsl101, Irk2, Mps1, Sat4, Irk3, Cdc7, Irk4, Swe102, Vrk1, Fbp26, Psk201, Ypk101, Pan3, Ssk2, Utr1, Pho85, Bud32, Tco6, Arg5,6, Ssn3, Irk6, Dak2, Rim15, Dak202a, Snf101, Mpk2, Cmk1, Irk7, Cbk1, Kic102, Mkk2, Cka1, Bub1을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (a) 병원성조절 (pathogenicity-regulating) 키나아제 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 감소 또는 증가 조절 (down or up regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항진균제임을 판별하는 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 병원성조절 키나아제 단백질을 인코딩 하는 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 유전자의 발현량이 감소 또는 증가 조절 (down or up regulation) 되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항진균제임을 판별하는 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 항진균제 스크리닝에 이용되는 세포는 진균, 예를 들어 크립토코쿠스 네오포만스 일 수 있다.
본 발명에서, 상기 항진균제는 뇌수막염 (meningoencephalitis) 또는 크립토코쿠스증 (cryptococcosis)을 치료 및 예방 하기 위한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "시료"는 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 양 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미하는 것으로, 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA (small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "항진균제"는 세균 및/또는 곰팡이류의 번식을 억제하는 것으로, 무기계 항진균제, 유기계 천연물 추출계 항진균제, 유기계 지방족 화합물 항진균제 및 유기계 방향족 화합물 항진균제를 포함한다. 무기계 항진균제로서는, 차아염소나트륨으로 대표되는 염소화합물, 과산화수소로 대표되는 과산화물 붕산, 붕산나트륨으로 대표되는 붕산화합물, 황산구리로 대표되는 구리화합물, 황산아연, 염화아연으로 대표되는 아연화합물, 유황, 다황산 석회, 수화유황으로 대표되는 유황계물, 산화칼슘으로 대표되는 칼슘화합물, 티오황산나트륨, 은착염, 질산은으로 대표되는 은화합물, 그 밖에, 옥소, 실리코플루오리드 나트륨 등이 있고, 유기계 천연물 추출계 항진균제로서는, 히노키티올, 맹종죽 추출액, 크레오소트유 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 유전자 발현량 변화의 측정은 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, RTPCR (Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press, 2001), 노던 블롯팅 (Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRCpress), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응 (Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press, 2001) 또는 인 시투 (in situ) 혼성화 반응 (Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press, 2001)을 이용하여 실시할 수 있다. RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 먼저 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT프라이머 및 역전사효소를 이용하여 단일가닥 cDNA를 제조한다. 후속하여, 단일가닥 cDNA를 주형으로 이용하고, 유전자-특이적 프라이머세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 본 발명에서 사용한 유전자-특이적 프라이머세트는 하기 표 2 및 표 3에 제시된다. 다음, PCR 증폭산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 유전자의 발현량 변화를 측정할 수 있다.
본 발명에서, 단백질의 양 또는 활성의 변화는 공지된 다양한 면역분석방법을 통해 수행 될 수 있다. 예를 들어, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA (enzyme-linked immunosorbentassay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 다양한 문헌에 기재되어 있다 (Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). 예를 들어, 방사능면역분석을 이용하는 경우, 방사능동위원소 (예들 들어, C14, I125, P32 및 S35)로 표지 된 단백질-특이 항체가 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 ELISA를 이용하는 경우, (i) 시료가 처리된 세포의 추출물을 고체기질의 표면에 코팅하는 단계, (ii) 1차 항체로서의 키나아제 자체의 단백질 혹은 표지된 단백질-특이 항체와 상기 세포 추출물을 반응시키는 단계, (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 2차항체와 반응시키는 단계, 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 고체기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머 (예를 들어, 폴리스티렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 2차 항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬P450을 포함한다. 상기 2차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우, 기질로서 브로모클로로인돌일포스페이트 (BCIP), 니트로블루테트라졸리움 (NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응기질이 이용될 수 있으며, 호스래디쉬퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB (3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민 (OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다. 상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성측정 또는 시그널 측정은 일반적으로 공지된 다양한 방법에 따라 수행될 수 있다. 바이오틴이 표지로 이용되는 경우, 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 표지로 이용된 경우 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예는 진균의 병원성-조절 (pathogenicity-regulating) 키나아제 단백질에 대한 작용제 (저해제 또는 활성화제)를 포함하는 항진균용 약학 조성물을 제공한다. 다른 일 구현예에서 진균은 크립토코쿠스 네오포만스이다.
또한, 본 발명은 일 구현예는 진균의 병원성-조절 키나아제 단백질을 인코딩 하는 유전자에 대한 작용제 (저해제 또는 활성화제)를 포함하는 항진균용 약학 조성물을 제공한다. 일 구현예에서 진균은 크립토코쿠스 네오포만스이다.
본 발명에서, 약학 조성물이 뇌수막염 (meningoencephalitis) 또는 크립토코쿠스증 (Cryptococcosis)을 치료하기 위한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 작용제는 항체일 수 있다. 일 구현예에서 저해제는 단백질에 결합하여 단백질의 활성을 저해함으로써 신호전달을 차단하는 저해제일 수 있다. 예를 들어, 단백질과 결합하는 펩타이드 또는 화합물 일 수 있고, 이들 펩타이드 또는 화합물을 단백질 구조분석 등을 포함하는 스크리닝 방법으로 선정될 수 있으며, 일반적으로 공지된 방법으로서 설계될 수 있다. 또한, 단백질에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 경우, 일반적으로 공지된 항체 제작 방법을 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "항체"는 합성 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 인트라바디 (intrabody), 다중특이성 항체 (이중-특이성 항체 포함), 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단일-쇄 Fv (scFv) (이중-특이성 scFv 포함), BiTE 분자, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드-연결된 Fv (sdFv), 또는 상기 한 것 중의 어떤 것의 에피토프-결합 단편일 수 있다. 본 발명에서 항체는 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분 중의 어떤 것일 수 있으며, 임의의 이소타입 (isotype) 일 수 있다. 또한, 본 발명에서 항체는 가변 및 불변 부분을 포함하는 전장 (full-length) 항체, 또는 단일쇄 항체 또는 Fab 또는 Fab'2 단편과 같은 이것의 항원결합 단편일 수 있다. 본 발명에서 항체는 세포독소 또는 방사성 동위원소와 같은 치료제에 컨쥬게이션 되거나 연결될 수 있다.
본 발명에서, 작용제는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 (anti-sense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 저해제는 유전자의 발현을 저해하여 신호전달을 차단하거나, 유전자에 결합하여 전사를 방해하거나 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여 mRNA의 해독을 방해하는 저해제일 수 있다. 일 구현예에서, 저해제는 예를 들어, 유전자에 결합하는 펩타이드, 핵산 또는 화합물 등일 수 있고, 세포기반 스크리닝 등의 방법을 통해 선택될 수 있으며, 일반적으로 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있다. 예컨대, 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있으며, 이들은 일반적으로 공지된 방법으로 제작할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산서열을 갖는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이며, 보다 더 바람직하게는 10 내지 40 염기이다. 본 발명의 일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격 (backbone)의 위치에서 변형될 수 있다 (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 핵산골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 단쇄알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티 (sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크산틴 (hypoxanthine), 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘 (특히, 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이것의 활성 및 세포흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티 (moiety) 또는 컨쥬게이트 (conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 본 발명의 일구현예에서, 모이어티는 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티와 같은 지용성 모이어티 일 수 있으나, 이에 제한는 것은 아니다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 이것의 제조방법은 본 발명의 기술분야에 잘 알려져 있다 (미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호 참조). 본 발명의 일 구현예에서, 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다. 일 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 잘 알려진 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여되거나, 생체 내에서 합성될 수 있음은 물론이다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 일 예는 RNA중합효소I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 일 예는, 인식부위 (MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스RNA가 전사 되도록 하는 것이며, 이와 같은 안티센스RNA는 서열 내 번역중지 코돈을 삽입하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 용어 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산분자를 의미한다 (참조: WO00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제하므로, 효율적인 유전자 넉다운 (knock-down) 방법 또는 유전자치료 방법으로 제공될 수 있다. 본 발명에서, siRNA 분자는, 센스가닥 (mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스가닥 (mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 본 발명에서, siRNA 분자는 자기-상보성 (self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 미스매치 (대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지 (bulge) (일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 siRNA의 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기일 수 있다. 또한, 본 발명에서 siRNA 말단구조는 유전자 발현을 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt) 말단 혹은 점착 (cohesive) 말단 모두 가능하며, 점착 말단구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 본 발명에서, siRNA 분자는 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열 (예컨대, 약 5 내지 15 뉴클레오티드)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자 내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되고, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다.
본 발명에서, 용어 "shRNA"는 목적유전자 siRNA 염기서열의 센스 (sense)와 상보적인 넌센스 (nonsense) 사이에 3 내지 10개의 염기 링커 (linker)를 연결하는 올리고DNA를 합성한 후, 플라스미드벡터에 클로닝하거나 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스 (lentivirus) 및 아데노바이러스 (adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 생성되고 세포내 다이서 (Dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타내는 것을 말한다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낸다.
본 발명에서, 용어 "miRNA (microRNA)"는 18 내지 25 뉴클레오티드 (nt)의 단일가닥 RNA분자를 의미하며, 진핵생물의 유전자발현을 제어하는 조절물질이다. miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자 (posttranscriptional gene suppressor)로서 작용하며, 번역억제와 mRNA 불안정화를 유도하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서, 용어 "벡터"는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말하는 것으로, DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 약학 조성물은 플루코나졸 (fluconazole), 이트라코나졸 (itraconazole), 보리코나졸 (voriconazole) 및 케토코나졸 (ketoconazole)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아졸계열 항진균제; 또는 암포테리신 B (amphotericin B), 나타마이신 (natamycin), 리모시딘 (rimocidin), 니스타틴 (nystatin), 플루사이토신 (flucytosine) 및 플루디옥소닐 (fludioxonil)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 비-아졸계열 항진균제와 병용투여 될 수 있다.
본 발명에서, 항진균용 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 일 등의 가용화제 일 수 있다.
본 발명의 항진균용 약학 조성물은 유효성분 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 액상 용액으로 제제화되는 약학 조성물에 사용 되는 담체는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에서, 항진균용 약학 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 추가로 포함하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화될 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, MackPublishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명에서, 약학 조성물 중 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명에 따른 키나아제를 이용하여 신규한 항진균제 후보물질을 효과적으로 스크리닝 할 수 있다. 또한, 본 발명의 키나아제에 대한 작용제 (저해제 또는 억제제)를 포함하는 항진균용 약학 조성물을 이용하여 진균 감염을 효과적으로 예방, 치료 및/또는 진단 할 수 있다.
도 1에서 a는 크립토코쿠스 네오포만스 내 단백질 키나아제 사이의 계통발생적 상관관계를 나타낸 것이고, b는 크립토코쿠스 네오포만스, C. albicans 및 A. 푸미가투스 내 주요 키나아제를 비교하여 나타낸 것이다. 도 1의 a는 ClustalX2 (University College Dublin)를 사용하여 단백질서열기반 얼라인먼트 (protein sequence-based alignment)을 수행한 것이다. 얼라인먼트 데이터를 사용하고, Interactive Tree Of Life (http://itol.embl.de)를 이용하여 계통발생도를 작성하였다 (Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life v2: online annotation and display of phylogenetic trees made easy. Nucleic Acids Res 39, W475-478, doi:10.1093/nar/gkr201 (2011)). C . 네오포만스의 183개 키나아제로부터, 본 발명자들은 114개의 유전자 결실된 키나아제를 제작하고, S. 세레비지애 오솔로그의 유전자 명명에 기초하여 명명하였다. 색을 갖는 선은 Kinomer1.0 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/kinomer)에 의해 예측된 키나아제 클래스를 의미한다 (Martin, D. M., Miranda-Saavedra, D. & Barton, G. J. Kinomer v. 1.0: a database of systematically classified eukaryotic protein kinases. Nucleic Acids Res 37, D244-250, doi:10.1093/nar/gkn834 (2009)). 빨간색 글자는 60 개의 병원성 관련 키나아제, 및 전체 키나아제 및 다양한 클래스에 대한 이들 키나아제의 분포를 나타낸 것이다. 도 1의 b는 사람 감염성 진균 병원균인 C. 네오포만스, C. 알비칸스, 및 A. 푸미가투스에서 키나아제 클래스의 분포를 나타낸 것으로서, Kinomer1.0에 의해 예측된 키나아제 클래스에 대한 파이 차트이다.
도 2는 C. 네오포만스 내 단백질 키나아제의 표현형 클러스터링을 나타낸 것이다. 표현형을 7등급으로 스코어링 하였다 (-3: 강한 감수성/감소, -2: 중간 수준의 감수성/감소, -1: 약한 감수성/감소, 0: 야생형과 유사, +1: 약한 내성/중가, +2: 중간 수준의 내성/증가, +3: 강한 내성/증가). Gene-E 소프트웨어 (http://www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE-E/)에 각 키나아제 변이체의 표현형 스코어를 포함하는 엑셀파일을 로딩하였으며, 키나아제 페놈 (phenome) 클러스터링은 원마이너스 피어슨 코릴레이션을 (One minus Pearson correlation) 이용하여 도출될 수 있다. 도 2에서 사용된 약어는 다음과 같은 의미를 갖는다: [T25: 25 ℃, T30: 30 ℃, T37: 37 ℃, T39: 39 ℃, CAP: 캡슐 생성, MEL: 멜라닌 생성, URE: 우레아제 생성, MAT: 메이팅 필라멘테이션 (mating filamentation), HPX: 과산화 수소 (hydrogen peroxide), TBH: 4차-부틸 하이드로퍼옥시드 (tert-butyl hydroperoxide), MD: 메나디온 (menadione), DIA: 디아미드 (diamide), MMS: 메틸메탄 설포네이트 (methyl methanesulfonate), HU: 하이드록시우레아 (hydroxyurea), 5FC: 5-플루사이토신 (5-flucytosine), AMB: 암포테리신 B (amphotericin B), FCZ: 플루코나졸 (fluconazole), FDX: 플루디옥소닐 (fludioxonil), TM: 투니카마이신 (tunicamycin), DTT: 디티오트레이톨 (dithiothreitol), CDS: 카드뮴 설페이트 (cadmium sulfate), SDS: 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), CR: 콩고 레드 (congo red), CFW: 칼코플루어 화이트 (calcofluor white), KCR: YPD + KCl, NCR: YPD + NaCl, SBR: YPD + 솔비톨 (sorbitol), KCS: YP + KCl, NCS: YP + NaCl, SBS: YP + 솔비톨 (sorbitol)]
도 3은 gal83 △ 변이체와 snf1 △ 변이체의 표현형질을 관찰한 결과이다. 도 3의 a는 다양한 스트레스 조건에서 야생형 균주, snf1 △, gal83 △ 변이체 사이의 표현형질 비교해 본 결과로, 1 ㎍/㎖ 플루디옥소닐(FDX) 조건에서 snf1 △, gal83 △ 변이체가 야생형 균주보다 감수성이 증가하는 결과를 나타냈고, 0.65 mM 4차-부틸 하이드로퍼옥시드 (tBOOH)에서는 snf1 △, gal83 △ 변이체가 야생형 균주에 비해 저항성이 증가하는 결과를 나타냈다. 도 3의 b는 야생형 균주, snf1 △, gal83 △ 변이체의 탄소원 사용 능력을 비교해 본 결과이다. 2% 글루코오스(glucose), 2% 갈락토오스(galactose), 3% 글리세롤(glycerol), 3% 에탄올(ethanol), 2% 말토오스(maltose), 2% 수크로오스(sucrose), 2% 아세트산나트륨(sodium acetate), 1% 아세트산칼륨(potassium acetate)조건에서 실험을 수행하여 snf1 △, gal83△ 변이체가 에탄올, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨을 탄소원으로 사용하는데 필요하다는 결과를 나타냈다.
도 4는 Fpk1이 C. 네오포만스 Ypk1-의존성 표현형 특징을 조절하는 여부를 확인하기 위한 실험 결과이다. (a) FPK1 프로모터를 히스톤 H3 프로모터로 치환하여 과발현균주를 만드는 실험도이다. (b) FPK1 과발현균주는 서던 블랏 분석을 통해 확인되었고, ypk1 △ 변이체를 모체로 FPK1을 과발현시킴으로써 YSB3986과 YSB3981 균주를 생성하였다. (c) FPK1의 과발현을 노던블랏 정량을 통해 확인하였다. rRNA 양은 대조군으로 사용되었다. (d) 야생형 H99S균주와 ypk1 △ (YSB1736) 변이체, FPK1 과발현 균주 (YSB3986과 YSB3981)을 16시간동안 YPD 액체배지에 배양한 뒤 고체배지에 찍어 표시된 온도에서 자라는 정도를 관찰하였다. (e와 f) 1.5 M NaCl과 0.04 % 소듐 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulphate), 1 ㎍/㎖ 플루디옥소닐, 1 ㎍/㎖ 암포테리신 B, 3 mM 과산화수소 (hydrogen peroxide), 3 mg/ml 칼코플루어 화이트 (calcofluor white), 100 mM 하이드록시우레아 (hydroxyurea), 2 mM 다이아마이드 (diamide), 300 ㎍/㎖ 플루사이토신 (flucytosine)과 5 mg/ml 플루코나졸 (fluconazole)을 포함하는 YPD배지에서 테스트하였다. 세포는 3일 더 배양한 뒤 사진으로 촬영하였다. (g) 실험 결과로 예상할 수 있는 C. 네오포만스의 Ypk1과 Fpk1 키나아제의 조절 모델이다.
도 5는 곤충사멸분석을 통한 병원성 키나아제 실험 결과이다. 각각의 변이체는 YPD 액체 배지에서 16시간 배양하여 PBS 버퍼로 세 번 씻은 후에 G. mellonella 유충에 주입한다. 이 때 각각의 변이체 당 15마리의 유충을 사용하고, 유충 한 마리 당 4,000개의 변이체 세포를 주입한다. 이 후 37℃에서 유충을 배양하면서 매일 생존여부를 확인하였다. 실험결과의 통계 분석은 로그 랭크 맨텔-콕스(Log-rank Mantel-Cox) 테스트를 이용하여 수행하였다. 도 5a의 a는 각각의 키나아제에 대해서 2개의 독립적인 변이체를 이용하여 수행한 실험 결과이다. 도 5의 b는 1개의 변이체만이 만들어진 키나아제에 대해서 두 번의 반복 실험을 수행한 결과이다.
도 6은 표식인자변이 (STM)-기반 생쥐모델 감염성 테스트 결과를 나타낸 것이다. STM 연구를 위한 병원성 및 비병원성 조절을 위해 ste50 △ 및 hxl1 △ 균주를 사용하였다. STM 정량 수치는 표 2에 표기된 것처럼 균주에 표지된 STM 번호 특이적인 프라이머를 사용하여 qPCR방법을 통해 생물학적 삼반복 실험을 분석하여 정량하였다. (a-d) 전체 키나아제 변이체는 4개의 그룹으로 나뉘어 실험되었다. 각 세트의 유전자들은 독립된 두 균주의 변이체로 구성되었고, 한 개의 변이체가 존재할 경우 두 번의 실험을 수행하였다.
도 7은 C. 네오포만스의 병원성에 관여하는 키나아제에 대해 정리된 도표이다. STM 스코어를 정량적 PCR 방법으로 계산하고, 숫자 및 색깔을 사용하여 구별하였다 (도 7의 a). 빨간색 글자는 감염성 관련 키나아제로서 본 발명에서 새롭게 밝혀진 것이다. 25개 키나아제가 곤충 및 생쥐모델 둘 모두 분석에서 공동으로 확인되었으며, 이들 25개 키나아제의 유전자 명을 STM 제로선에 기입하였다. 대조군과 변이체 균주 사이의 P 값을, STM 세트당 3마리의 마우스를 사용하고 본페로니 방법 (Bonferroni correlation)에서 일원분산분석 (one-way ANOVA)으로 계산하였다. 각 세트는 각각 독립적인 균주를 사용하고 2회 반복 수행하였다. 단일 균주 변이체에 대해서는, 각 단일 균주로 2회의 독립적인 실험을 반복 수행하였다. STM 연구에서는, C. 네오포만스의 감염성에서 총 54개 키나아제의 역할을 분석하였다. 도 4와 5를 참조하면 6개의 키나아제가 생쥐모델 감염성 테스트에서는 병원성 조절 기능이 확인되지 않았지만 왁스나방 사멸분석에 의해서 병원성 관련 키나아제로서 확인되었다 (도 7의 b). bub1 및 kin4의 단일 변이체 균주에 대해, 2회 반복 수행하였다.
도 8은 C. 네오포만스와 다른 진핵 단백질 키나아제에서의 병원성 관련 키나아제 사이의 계통발생학적 관련성을 나타낸다. 도 8의 a는 60개 병원성 관련 키나아제에 대해 CFGP (Comparative Fungal Genomics Platform, http://cfgp.riceblast.snu.ac.kr) 데이터베이스를 사용한 BLAST 매트릭스를 나타낸 것으로서, 병원성 관련 60개 키나아제 단백질 서열을 조회한 결과, 이종상동 (orthologue) 단백질이 35종 게놈 데이터베이스에서 일치하였다. 도 8의 b는 진균 병원균에서 병원성 관련 키나아제의 상관관계를 나타낸 것이다. 이종상동 단백질을 확인하기 위해, 각 단백질 서열을 게놈 데이터베이스 (CGD; C. 알비칸스 대해 칸디다 게놈 데이터베이스, F. graminearum 및 C. 네오포만스에 대해 브로드 인스티투트 데이터베이스)를 사용하는 BLAST 및 역-BLAST로 분석하였다. 21개 키나아제가 F. graminearum 및 C. 네오포만스 둘 모두에서 병원성과 관련되었다. 13개 키나아제가 C. 네오포만스 및 C. 알비칸스의 병원성에 관련되었다. 이들 중, Sch9, Snf1, Pka1, Hog1 및 Swe1를 포함하는 5개 키나아제가 3개 진균 병원균 모두의 병독성에 관련되었으며, 빨간색으로 나타냈다.
도 9는 크립토코쿠스 네오포만스 내 Ipk1의 다면발현성 역할을 나타낸 것이다. WT (야생형) 및 ipk1Δ 변이체 (YSB2157 및 YSB2158)를 사용하여 다양한 실험을 수행하였다. 도 9의 a에서 ipk1 △ 변이체는 곤충기반 생체내 병독성 분석에서 감소된 병독성을 나타냈다. 이 분석에서 대조군은 WT 및 PBS만을 주입하였다. 도 9의 b에서, ipk1 △ 변이체는 캡슐을 유도하였다. 하룻밤 배양한 세포를 DME 플레이트상에 37 ℃에서 2일간 두었다. 각 모세관 튜브에 50 ㎕의 1.5 X 108 세포를 패킹하고 패킹된 세포 부피를 매일 모니터링 하였다. 세포가 중력에 의해 떨어지는 3일 후, 전체 부피에서 패킹된 세포 부피를 계산하고 WT에 대해 표준화 하였다. 각 균주의 P 값은 0.05 미만 이었다. (*) 에러 선은 SEM을 나타낸다. 도 9의 c에서 ipk1 △ 변이체는 멜라닌-결핍 표현형을 나타낸다. 멜라닌 생성을 0.2 % 글루코오스를 함유하는 니거 시드 플레이트 (Niser seed plate)상에서 3일 후 확인하였다. 도 9의 d에서 ipk1 △ 결실 변이체는 우레아제 생성에 결함이 있었다. 우레아제 생성은 30 ℃의 크리스텐센 (Christensen's) 아가 배지에서 2일 후 확인 하였다. 도 9의 e에서 ipk1 △ 변이체는 균사의 성장에 심각한 결함을 나타냈다. 교배 (mating) 분석은 V8 배지 (pH 5, 1L 기준: V8 juice 50 ㎖ (Campbell), KH2PO4 (Bioshop, PPM302) 0.5g, Agar (Bioshop, AGR001.500) 40g) 플레이트 상에서 9일 후에 확인하였다. 도 9의 f, g는 10배 희석된 스폿 분석으로부터 수득한 현미경 사진이다 (102 내지 105 배 희석). 사진에 표시된 다양한 성장 조건에서 성장률을 측정하였다. 화학적 감수성 분석을 위해, 하기 화학물질을 YPD 배지 상에 처리하였다: HU; DNA 손상 시약으로서 하이드록시우레아 (hydroxyurea) 100 mM, TM; ER 스트레스 (endoplasmic reticulum stress) 유도 시약으로서 투니카마이신 (tunicamycin) 0.3 ㎍/㎖, CFW; 세포벽 손상 시약으로서 칼코플루어 화이트 (calcofluor white) 3 ㎎/㎖, SDS; 막 안정성 시험을 위한 소듐 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate) 0.03 %, CDS; 중금속 스트레스 시약으로서 CdSO4 30 M, HPX; 산화제 시약으로서 과산화수소 (Hydrogen peroxide) 3 mM, 삼투압 쇼크를 위한 1M NaCl, 및 항진균 약물 감수성 분석을 위한 AmpB (암포테라신 B) 0.9 ㎎/㎖, FCZ (플루코나졸) 14 ㎍/㎖, 5-FC (플루사이토신) 300 ㎍/㎖, 및 FDX (플루디옥소닐) 1 ㎍/㎖.
도 10은 크립토코쿠스 네오포만스의 성장 및 병원성에 관련된 단백질 키나아제를 나타낸 것이다. 기존에 보고된 CryptoNet (http://www.inetbio.org/cryptonet)에 의한 C. 네오포만스의 60개 병원성-조절 키나아제의 기능성 네트워크 분석 (Kim, H. et al. Network-assisted genetic dissection of pathogenicity and drug resistance in the opportunistic human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Scientific reports 5, 8767, doi:10.1038/srep08767 (2015))을 나타낸다. 상기 네트워크는 CryptoNet에 의해 60개 병원성-조절 키나아제와 기능적 관련성이 있는 것으로 예측된 100개 후보 유전자에 기초하여 작성되었다. 본 병원성 네트워크에서, 유전자들은 유전자 온톨로지 (Gene Ontology (GO) term)의 정보에 기재된 예측된 생물학적 기능에 따라 구분되었다. CryptoNet에서 6개 키나아제 (Arg5/6, Ipk1, Irk2, Irk4, Irk6 및 vrk1)는 기능적으로 관련성이 있는 유전자를 갖지 않았다.
도 11은 cdc7 △, cbk1 △ 및 kic1 △ 변이체를 사용한 실험결과를 나타낸다. (a-c) cdc7 △ 변이체 (YSB2911, YSB2912), met1 △ 변이체 (YSB3063, YSB3611) 및 cka1 (YSB3051, YSB3052)를 YPD배지에서 하룻밤 키워 10배씩 연속희석하여 고체 YPD배지 및 100 mM hydroxyurea (HU), 0.06 % methyl methanesulphonate (MMS), 1 ㎍/㎖ amphotericin B (AmpB), 1 ㎍/㎖ fludioxonil (FDX), 3 mM hydrogen peroxide (HPX), 300 ㎍/㎖ flucytosine (5-FC)이 포함된 YPD배지에 스폿팅하였다. 스폿팅된 세포들은 30 ℃ 또는 지시된 온도에서 3일 동안 추가로 배양된 후 사진촬영되었다. (d) 야생형 및 하기 변이체들을 [kic1 △ (YSB2915, YSB2916), cbk1 △ (YSB2941, YSB2942), cka1 △ (YSB3051, YSB3052)] YPD배지에서 16시간 이상 배양 후 10% 파라포름알데하이드로 15분 동안 고정시키고 PBS용액으로 두번 세척하였다. 고정된 세포는 10 ㎍/㎖ 의 Hoechst 용액(Hoechst 33342, Invitrogen)으로 30분동안 염색된 후 형광현미경(Nikon eclipse Ti microscope)으로 관찰되었다.
도 12는 bud32 △ 변이체에 대한 실험 결과이다. (a) 야생형 및 bud32Δ 변이체 (YSB1968, YSB1969)를 YPD배지에서 하룻밤 배양하여 10배씩 연속희석한 후 하기 화학물질이 포함된 YPD 배지에 스폿팅하여 다양한 성장 조건에서의 성장률을 관찰하였다. [1.5 M NaCl, 1.5 M KCl, 2 M Sorbitol, 1 ㎍/㎖ amphotericin B (AmpB), 14 ㎍/㎖ fluconazole (FCZ), 1 ㎍/㎖ fludioxonil (FDX), 300 ㎍/㎖ flucytosine, 100 mM hydroxyurea (HU), 0.04 % methyl methanesulphonate (MMS), 3 mM hydrogen peroxide (HPX), 0.7 mM tert-butyl hydroperoxide (tBOOH), 2 mM diamide (DIA), 0.02 mM menadione (MD), 0.03% sodium dodecyl sulphate (SDS)] 이러한 화학물질이 포함된 YPD배지에 스폿팅된 세포는 30 ℃에서 추가 배양된 후 사진촬영되었다. (b) 야생형 및 bud32Δ 변이체의 멜라닌 생성능은 0.1 % 글루코오스를 함유한 니거시드플레이트 (Niser seed plate)상에서, 우레아제 생성은 30 ℃의 크리스텐센 (Christensen's) 아가 배지에서 배양 후 확인되었다. 캡슐 생성능을 확인하기 위하여 하룻밤 배양한 세포를 DME 플레이트상에 37 ℃에서 2일간 두었다. 1.5 X 108 개의 세포 50 ㎕를 모세관 튜브에 주입하고, 3일 후 중력에 의해 패킹된 세포 부피를 매일 모니터링 하여 전체 부피에서 패킹된 세포 부피를 계산하고 WT에 대해 표준화 하였다. 그 결과값은 본페로니 방법 (Bonferroni correlation)에서 일원분산분석 (one-way ANOVA)으로 계산하였고, 3회 반복 수행하였다. (c) 야생형과 bud32Δ 변이체의 교배능 (mating efficacy)을 비교하기 위하여 V8 배지에 스폿팅 후 9일동안 암실에서 배양하였다. (d) 야생형 및 bud32Δ 변이체를 30 ℃에서 대수증식기까지 배양한 후, 배양액을 2개의 샘플로 나누어 하나는 플루코나졸 (FCZ)로 90분간 처리하고 다른 하나는 처리하지 않았다. 각각의 샘플로부터 전체 RNA를 추출하고 ERG11의 발현량을 노던분석을 통해 확인하였다.
도 13은 arg5 ,6△ 변이체 및 met3 △에 대한 실험결과이다. (a, b) 야생형 (H99S)과 arg5 , 6Δ 변이체 (YSB2408, YSB2409, YSB2410), 그리고 met3Δ 변이체(YSB3329, YSB3330)는 YPD배지에서 하룻밤 배양된 후 PBS로 세척되었다. 세척된 세포들은 10배씩 연속희석되어 고체 합성 완전 배지에 스폿팅 되었다. [SC; yeast nitrogen base without amino acids (Difco) supplemented with the indicated concentration of the following amino acids and nucleotides: 30 mg/l L-isoleucine, 0.15 g/l L-valine, 20 mg/l adenine sulphate, 20 mg/l L-histidine-HCl, 0.1 g/l L-leucine, 30 mg/l L-lysine, 50 mg/l L-phenylalanine, 20 mg/l L-tryptophan, 30 mg/l uracil, 0.4 g/l L-serine, 0.1 g/l glutamic acid, 0.2 g/l L-threonine, 0.1 g/l L-aspartate, 20 mg/l L-arginine, 20 mg/l L-cysteine, and 20 mg/l L-methionine]. SC-arg (a), SC-met and SC-met-cys (b) media indicate the SC medium lacking arginine, methionine and/or cysteine supplements. (b) 메티오닌과 시스테인의 생합성경로 모식도. (c) 야생형과 arg5,6Δ 변이체, met3Δ 변이체를 YPD배지에서 하룻밤 배양하여 10배씩 연속희석한 후 하기 화학물질이 포함된 YPD 배지에 스폿팅하여 다양한 성장 조건에서의 성장률을 관찰하였다. [1 ㎍/㎖ amphotericin B (AmpB), 14 ㎍/㎖ fluconazole (FCZ), 1 ㎍/㎖ fludioxonil (FDX), 3 mM hydrogen peroxide (HPX)]. 스폿팅된 세포들은 30 ℃ 또는 지시된 온도에서 3일간 배양 후 사진촬영되었다.
도 14는 크립토코쿠스 네오포만스의 병원성을 조절하는 역행 액포수송 (retrograde vacuole trafficking)을 나타낸다. 역행 액포수송은 C. 네오포만스의 병원성을 조절한다. WT 및 vps15Δ 변이체 [YSB1500, YSB1501]를 사용하여 다양한 실험을 수행하였다. 도 14의 a에서, Vps15는 C. 네오포만스의 병독원성에 필요하다. WT 및 PBS 완충액은 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용되었다. 도 14의 b에서, vps15Δ 변이체는 증가된 액포 생성을 나타낸다. 눈금은 10 ㎕를 나타낸다. 도 14의 c에서, vps15Δ 변이체는 ER스트레스 하에서 심각한 성장결함을 보였다. 하룻밤 배양된 세포를 15 mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol) (DTT) 또는 0.3 ㎍/㎖ 투니카마이신 (tunicamycin) (TM)을 함유하는 YPD 배지상에 스폿팅 하고, 30 ℃에서 3일간 추가로 배양한 후, 사진을 수득하였다. 도 14의 d에서, vps15Δ 변이체는 고온, 세포막 스트레스 및 세포벽 스트레스에 대해 심각한 성장결함을 보였다. 하룻밤 배양한 세포를 YPD 배지상에 스폿팅 한 후 지시된 온도에서 추가로 배양하거나, 0.03 % SDS 또는 5 ㎎/㎖ 칼코플루어 화이트 (CFW)를 함유하는 YPD 배지상에 스폿팅 하고 30 ℃에서 추가로 배양하였다. 3일 후 플레이트를 사진촬영 하였다. 도 14의 e에서, Vps15는 C. 네오포만스에서 칼시뉴린 경로에 관여하지 않았다. 정량적 RT-RCR (qRT-PCR)을 위해, RNAs를 WT 및 vps15Δ 변이체의 3개의 복제물로부터 얻었다. CNA1, CNB1, CRZ1, UTR2 발현수준을 대조군인 ACT1 발현수준으로 표준화 하였다. 3개 복제물로부터 데이터를 수집하였다. 에러 선은 표준오차 (sem: standard error of means)를 나타낸다. 도 14의 f에서, Vps15는 Hxl1 스플라이싱을 음성 조절한다. RT-PCR을 위해, RNAs를 WT 및 vps15Δ 변이체로부터 수득하고 cDNAs를 합성하였다. RT-PCR을 위해 HXL1 및 ACT1-특이적 프라이머쌍을 사용하였다 (표 3). 실험을 2회 반복하였고, 대표적으로 1개 실험을 나타냈다.
도 15는 vrk1Δ 변이체에 대한 실험 결과이다. 도 15의 a는 WT 및 vrk1Δ 균주를 YPD 배지 상, 및 2.5 mM 과산화수소 (HPX), 600 ㎍/㎖ 플루사이토신 (5-FC) 또는 1 ㎍/㎖ 플루디옥소닐 (FDX)를 함유하는 YPD 배지 상에 스폿팅 한 것을 나타낸다. 균주를 30에서 3일간 배양하고 사진촬영하였다. 도 15의 b는 패킹된 세포 부피를 상대적 정량화한 결과이다. 3개의 독립적인 측정은 WT 및 vrk1Δ 균주 간에 현저한 차이를 보여준다 (***; 0.0004 및 **; 0.0038, s.e.m). 도 15의 c는 Vrk1-매개 인산화의 상대적 정량화를 나타낸다. 독립적인 실험에서 펩타이드 샘플을 평균 3회 분석하였고, 펩타이드는 2회 독립적인 실험에서 수득하였다. 결과값은 2회 독립적인 실험의 평균 ± s.e.m이다. 스투던츠 t-테스트 (Student's unpaired t-test)를 통계적 유의성 검토를 위해 적용하였다. ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05. PSMs은 펩타이드 스펙트럼 매칭을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
동물 보호 및 모든 실험은 연세대학교의 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 윤리적 가이드라인에 따라 수행하였다. 연세대학교 IACUC는 모든 척추동물 연구를 승인하였다.
실시예
실시예 1: 크립토코쿠스 네오포만스 ( Cryptococcus neoformans ) 내 단백질 키나아제 동정
C. 네오포만스 변종 그루비 (C. neoformans var. grubii; H99 균주)의 게놈에서 추정 키나아제 유전자를 선택하기 위해, 두 가지 접근법을 이용하였다. 첫번째로, 키노머 v. 1.0 데이터베이스 (Kinome v. 1.0 database; www.compbio.dundee.ac.uk/kinomer/)를 사용하였는데, 이것은 고감도 및 고정밀도의 마르코브 모델 (highly sensitive and accurate hidden Markov model; HMM)-기초 방법에 기반하여 진핵 단백질 키나아제를 체계적으로 예측하고 분류하기 위한 것이다 (Martin, D. M., Miranda-Saavedra, D. & Barton, G. J. Kinomer v. 1.0: a database of systematically classified eukaryotic protein kinases. Nucleic Acids Res 37, D244-250, doi:10.1093/nar/gkn834, 2009). 키노머 데이터베이스로, 혈청형 D C. 네오포만스 (JEC21 균주)의 게놈에서 97개의 추정 키나아제를 예측했다. 다음, 각각의 JEC21 키나아제 유전자 ID를 가장 최신의 게놈어노테이션 (버전 7)에 기초하여 H99 균주와 맵핑하고, 95개의 추정 키나아제를 검색하였다. 그러나, 이들 키노머 리스트는 모든 히스티딘 키나아제 및 Hog1과 같은 몇몇 알려진 키나아제를 제시하지 못하여 불완전한 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명자들은 브로드 인스티튜트 (Broad Institute)에서 제공된 H99 게놈 데이터베이스 (www.broadinstitute.org/annotation/genome/cryptococcus_neoformans) 및 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 JEC21 게놈 데이터베이스에서 제작된 어노테이션을 조사하는 추가의 접근법을 이용하였다. 키나아제-관련 어노테이션을 가지는 각각의 유전자에 대해, 실제 키나아제 도메인의 존재를 확인하고, 포스파타아제 또는 키나아제 레귤레이터와 같은 어노테이션을 가지는 어떠한 유전자도 제외하기 위하여 Pfam (http://pfam.xfam.org/)을 이용하여 단백질 도메인 분석을 수행하였다. 이러한 분석을 통해, 추가의 88개 추정 키나아제 유전자를 검색했다. 그 결과 C. 네오포만스에서 총 183개의 추정 키나아제 유전자를 확인했다. 이들의 계통발생 관계를 도 1에 나타내었다.
진핵 단백질 키나아제 수퍼패밀리 (superfamily)는 크게 두 개의 그룹으로 분류된다: 6개의 통상적인 (conventional) 단백질 키나아제 그룹 (ePKs) 및 3개의 비전형적인 (atypical) 그룹 (aPKs) (Miranda-Saavedra, D. & Barton, G. J. Classification and functional annotation of eukaryotic protein kinases. Proteins 68, 893-914, doi:10.1002/prot.21444, 2007). ePKs는 AGC 그룹 (고리형 뉴클레오티드 및 칼슘-포스포리피드-의존성 키나아제, 리보솜 S6-인산화 키나아제, G단백질-연결 키나아제 및 이들 세트의 모든 유사한 동족류를 포함), CAMKs (칼모듈린-조절 키나아제); CK1 그룹 (카세인 키나아제 1, 및 유사한 동족류), CMGC 그룹 (사이클린-의존성 키나아제, 미토겐-활성화 단백질 키나아제, 글리코겐 생성효소 키나아제 및 CDK-유사 키나아제 포함), RGC 그룹 (수용체 구아닐레이트 시클라아제), STEs (MAP 키나아제 캐스케이드에서 많은 키나아제 기능 포함), TKs (티로신 키나아제) 및 TKLs (티로신 키나아제-유사 키나아제)를 포함한다 (도 1). aPKs는 알파-키나아제 그룹, PIKK (포스파티딜이노시톨 3-키나아제-관련 키나아제), RIO 및 PHDK (피루베이트 디하이드로게나제 키나아제)를 포함한다. 이러한 기준에 따라 183개 C. 네오포만스 키나아제를 분류하기 위해, 키노머 데이터베이스에서 이들의 아미노산 서열을 조회하였다. 기존에 분류된 바 있는 몇몇 키나아제 (Martin, D. M., Miranda-Saavedra, D. & Barton, G. J. Kinomer v. 1.0: a database of systematically classified eukaryotic protein kinases. Nucleic Acids Res 37, D244-250, doi:10.1093/nar/gkn834, 2009)는 아마도 JEC21 및 H99 사이의 서열 차이로 인하여 달리 분류되었다 (95개 중 14개). 어노테이션 검색에 의해 동정된 대부분의 다른 키나아제는 기존의 카테고리에 상응하지 않았고 (88개 중 82개), 이를 "기타" (others)로 분류했다. 그러므로, C . 네오포만스 키놈은 89개의 ePKs (18 AGC, 22 CAMK, 2 CK1, 24 CMGC, 2 PDHK, 18 STE, 3 TKL), 10개의 aPKs (2 PDHK, 6 PIKK, 2 RIO), 및 84개의 "기타" 그룹으로 구성된 것으로 확인되었다 (도 1). 기타 그룹은 7개의 히스티딘 키나아제를 포함한다 (도 1). 수퍼패밀리 (version 1.73) (Wilson, D. et al. SUPERFAMILY--sophisticated comparative genomics, data mining, visualization and phylogeny. Nucleic Acids Res 37, D380-386, doi:10.1093/nar/gkn762 (2009)) (Supplementary Data 2 and Fig. 1b)의 HMMER 서열 프로파일에 의한 예측에 기반하여, 2종류의 사람 진균 병원체인 C. 알비칸스 및 A. 푸마가투스가 각각 188개 및 269개의 단백질 키나아제를 갖는 것이 확인되었다. 병원성 진균 키나아제 중에서, CMGC (12-13%), CAMK (12-18%), STE (6-10%), 및 AGC (6-10%)가 가장 흔한 클레이드인 것으로 보인다 (도 1).
대부분의 진핵 게놈이 게놈의 약 1-2% 비율로 키나아제를 포함하는 것으로 예측되는 것을 고려할 때, C. 네오포만스의 단백질 키나아제 비율 (~2.6%)은 예상보다 더 높았다. 이는 C. 네오포만스가, 병원성 효모가 더 다양한 환경적 신호 및 숙주 신호와 접촉하는, 부생균 (saprobic) 및 기생 (parasitic) 생활 주기를 모두 가지고 있다는 사실을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 이러한 예측된 모든 키나아제가 생물학적으로 의미 있는 키나아제 활성을 갖는지는 아직 설명이 필요하다. 183개 추정 C. 네오포만스 키나아제의 다른 균류 및 상등 진핵 생물에서와의 계통발생적 비교는, 키나아제가 TFs (transcription factors) 보다 균류 및 다른 진핵 생물 중에서 훨씬 더 높은 수준으로 보존되는 것을 것을 제시한다. 결론적으로, 키놈 네트워크는 진균류 중에서 적어도 서열유사성에 있어서 진화론적으로 보존된 것으로 보이며, 이는 TF 네트워크가 진화론적으로 분산된 것과 극명하게 대조된다.
실시예 2: C. 네오포만스 내 키나아제 유전자-결실 변이체 라이브러리의 제작
크립토코쿠스 키놈 네트워크의 생물학적 기능 및 이들의 복합성을 이해하기 위해, 각각의 키나아제에 대한 유전자-결실 변이체를 제작하고, 기능적 특성을 확인하였다. 분석한 키나아제 중에서, 22개 키나아제에 대한 변이체 (TCO1 , TCO2 , TCO3 , TCO4 , TCO5 , TCO7 , SSK2 , PBS2 , HOG1 , BCK1 , MKK1 /2, MPK1, STE11 , STE7 , CPK1 , PKA1 , PKA2 , HRK1 , PKP1 , IRE1 , SCH9 , 및 YPK1)는 본 발명자들에 의해 이미 부분적으로 특성확인 된 바 있다. (Bahn, Y. S., Geunes-Boyer, S. & Heitman, J. Ssk2 mitogen-activated protein kinase kinase kinase governs divergent patterns of the stress-activated Hog1 signaling pathway in Cryptococcus neoformans. Eukaryot. Cell 6, 2278-2289 (2007); Bahn, Y. S., Hicks, J. K., Giles, S. S., Cox, G. M. & Heitman, J. Adenylyl cyclase-associated protein Aca1 regulates virulence and differentiation of Cryptococcus neoformans via the cyclic AMP-protein kinase A cascade. Eukaryot. Cell 3, 1476-1491 (2004); Bahn, Y. S., Kojima, K., Cox, G. M. & Heitman, J. Specialization of the HOG pathway and its impact on differentiation and virulence of Cryptococcus neoformans. Mol. Biol. Cell 16, 2285-2300 (2005); Bahn, Y. S., Kojima, K., Cox, G. M. & Heitman, J. A unique fungal two-component system regulates stress responses, drug sensitivity, sexual development, and virulence of Cryptococcus neoformans. Mol. Biol. Cell. 17, 3122-3135 (2006); Kim, H. et al. Network-assisted genetic dissection of pathogenicity and drug resistance in the opportunistic human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Scientific reports 5, 8767, doi:10.1038/srep08767 (2015); Kim, M. S., Kim, S. Y., Yoon, J. K., Lee, Y. W. & Bahn, Y. S. An efficient gene-disruption method in Cryptococcus neoformans by double-joint PCR with NAT-split markers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 390, 983-988, doi:S0006-291X(09)02080-4 [pii]10.1016/j.bbrc.2009.10.089 (2009); Kim, S. Y. et al. Hrk1 plays both Hog1-dependent and -independent roles in controlling stress response and antifungal drug resistance in Cryptococcus neoformans. PLoS One 6, e18769, doi:doi:10.1371/journal.pone.0018769 (2011); Kojima, K., Bahn, Y. S. & Heitman, J. Calcineurin, Mpk1 and Hog1 MAPK pathways independently control fludioxonil antifungal sensitivity in Cryptococcus neoformans. Microbiology 152, 591-604 (2006); Maeng, S. et al. Comparative transcriptome analysis reveals novel roles of the Ras and cyclic AMP signaling pathways in environmental stress response and antifungal drug sensitivity in Cryptococcus neoformans. Eukaryot. Cell 9, 360-378, doi:EC.00309-09 [pii];10.1128/EC.00309-09 (2010); Cheon, S. A. et al. Unique evolution of the UPR pathway with a novel bZIP transcription factor, Hxl1, for controlling pathogenicity of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathog. 7, e1002177, doi:10.1371/journal.ppat.1002177 (2011)).
다른 161개 키나아제에 대하여, 대규모 상동 재조합과 시험관내 및 생체내 표현형질을 분석하여, 유전자-결실 변이체를 제작하고 이를 기탁하였다 (기탁번호: KCCM 51297). 생쥐 숙주에서 대규모 감염성 시험을 수행하기 위해, 일련의 구분되는 올리고뉴클레오티드 서열의 표식인자 (signature tag) (표 1)를 포함하는, 우성 노르세오트리신 저항 마커 (dominant nourseothricin resistance marker; NAT)를 사용하였다. 정확한 유전자 결실 및 각각의 유전자-붕괴 카세트의 이소성 통합의 부재를 증명하기 위해, 서던블롯 분석을 수행하였다.
26개 키나아제 유전자 결실균주
CNAG_Num. 유전자 명 실험 일련번호 (YSB #) 유전자형
CNAG_00047 PKP1 558, 608 MATα pkp1Δ::NAT-STM#224
CNAG_00106 TCO5 286, 287 MATα tco5Δ::NAT-STM#125
CNAG_00130 HRK1 270, 271 MATα hrk1Δ::NAT-STM#58
CNAG_00363 TCO6 2469, 2554 MATα tco6Δ::NAT-STM#58
CNAG_00396 PKA1 188, 189 MATα pka1Δ::NAT-STM#191
CNAG_00405 KIC1 2915, 2916 MATα kic1Δ::NAT-STM#201
CNAG_00415 CDC2801 2370, 3699 MATα cdc2801Δ::NAT-STM#191
CNAG_00636 CDC7 2911, 2912 MATα cdc7Δ::NAT-STM#213
CNAG_00745 HRK1 / NPH1 1438, 1439 MATα hrk1 / mph1Δ::NAT-STM#210
CNAG_00769 PBS2 123, 124 MATα pbs2Δ::NAT-STM#213
CNAG_00782 SPS1 3229, 3325 MATα sps1Δ::NAT-STM#288
CNAG_00826 DAK2 1912, 1913 MATα dak2Δ::NAT-STM#282
CNAG_01062 PSK201 1989, 1990 MATα psk201Δ::NAT-STM#191
CNAG_01155 GUT1 1241, 2761 MATα gut1Δ::NAT-STM#242
CNAG_01162 MAK322 3824, 3825 MATα mak322Δ::NAT-STM#159
CNAG_01165 LCB5 3789, 3790 MATα lcb5Δ::NAT-STM#213
CNAG_01209 FAB1 3172 MATα fab1Δ::NAT-STM#169
CNAG_01294 IPK1 2157, 2158 MATα ipk1Δ::NAT-STM#184
CNAG_01333 ALK1 1571, 1573 MATα alk1Δ::NAT-STM#122
CNAG_01523 HOG1 64, 65 MATα hog1Δ::NAT-STM#177
CNAG_01612 PSK202 3922, 3924 MATα psk202Δ::NAT-STM#208
CNAG_01704 IRK6 3830, 3831 MATα irk6Δ::NAT-STM#5
CNAG_01730 STE7 342, 343 MATα ste7Δ::NAT-STM#225
CNAG_01850 TCO1 278, 279 MATα yco1Δ::NAT-STM#102
CNAG_01905 KSP1 1807, 1808, 1809 MATα ksp1Δ::NAT-STM#159
CNAG_01938 KIN1 3930, 3931 MATα kin1Δ::NAT-STM#6
CNAG_01988 TCO3 284, 285 MATα tco3Δ::NAT-STM#119
CNAG_02233 MEC1 3063, 3611 MATα mec1Δ::NAT-STM#204
CNAG_02296 RBK1 1510, 1511 MATα rbk1Δ::NAT-STM#219
CNAG_02357 MKK2 330, 331 MATα mkk2Δ::NAT-STM#224
CNAG_02389 YPK101 1885, 1886 MATα ypk101Δ::NAT-STM#242
CNAG_02511 CPK1 127, 128 MATα cpk1Δ::NAT-STM#184
CNAG_02531 CPK2 373, 374 MATα cpk2Δ::NAT-STM#122
CNAG_02542 IRK2 1904, 1905 MATα irk2Δ::NAT-STM#232
CNAG_02551 DAK3 1940, 1941 MATα dak3Δ::NAT-STM#295
CNAG_02675 HSL101 1800, 1801 MATα hsl101Δ::NAT-STM#146
CNAG_02680 VPS15 1500, 1501 MATα vps15Δ::NAT-STM#123
CNAG_02712 BUD32 1968, 1969 MATα bud32Δ::NAT-STM#295
CNAG_02799 DAK202A 2487, 2489 MATα dak202aΔ::NAT-STM#119
CNAG_02802 ARG2 1503, 1504 MATα arg2Δ::NAT-STM#125
CNAG_02820 PKH201 1234, 1235, 1236 MATα pkh201Δ::NAT-STM#219
CNAG_02859 POS5 3714, 3715 MATα pos5Δ::NAT-STM#58
CNAG_02947 SCY1 2793, 2794 MATα scy1Δ::NAT-STM#150
CNAG_03024 RIM15 1216, 1217 MATα rim15Δ::NAT-STM#191
CNAG_03048 IRK3 1486, 1487 MATα irk3Δ::NAT-STM#273
CNAG_03167 CHK1 1825, 1828 MATα chk1Δ::NAT-STM#205
CNAG_03184 BUB1 3398 MATα bub1Δ::NAT-STM#201
CNAG_03216 SNF101 1575, 1576 MATα snf101Δ::NAT-STM#146
CNAG_03258 TPK202A 2443, 2444 MATα psk202aΔ::NAT-STM#208
CNAG_03290 KIC102 3211, 3212 MATα kic102Δ::NAT-STM#201
CNAG_03355 TCO4 417, 418 MATα tco4Δ::NAT-STM#123
CNAG_03367 URK1 1266, 1267 MATα urk1Δ::NAT-STM#43
CNAG_03369 SWE102 1564, 1565 MATα swe102Δ::NAT-STM#169
CNAG_03567 CBK1 2941, 2942 MATα cbk1Δ::NAT-STM#232
CNAG_03592 THI20 3219, 3220 MATα THI20Δ::NAT-STM#231
CNAG_03670 IRE1 552, 554 MATα ire1Δ::NAT-STM#224
CNAG_03811 IRK5 2952, 2953 MATα irk5Δ::NAT-STM#213
CNAG_03843 ARK1 1725, 1726 MATα ark1Δ::NAT-STM#43
CNAG_03946 GAL302 2852, 2853 MATα gal302Δ::NAT-STM#218
CNAG_04040 FPK1 2948, 2949 MATα fpk1Δ::NAT-STM#211
CNAG_04108 PKP2 2439, 2440 MATα pkp2Δ::NAT-STM#295
CNAG_04162 PKA2 194, 195 MATα pka2Δ::NAT-STM#205
CNAG_04197 YAK1 2040, 2096, 4139 MATα yak1Δ::NAT-STM#184
CNAG_04215 MET3 3329, 3330 MATα met3Δ::NAT-STM#205
CNAG_04221 FBP26 3669 MATα fbp26Δ::NAT-STM#146
CNAG_04230 THI6 1468, 1469 MATα thi6Δ::NAT-STM#290
CNAG_04282 MPK2 3236, 3238 MATα mpk2Δ::NAT-STM#102
CNAG_04316 UTR1 2892, 2893 MATα utr1Δ::NAT-STM#5
CNAG_04408 CKI1 1804, 1805 MATα cki1Δ::NAT-STM#218
CNAG_04433 YAK103 3736, 3737 MATα YAK103Δ::NAT-STM#231
CNAG_04514 MPK1 3814, 3816 MATα mpk1Δ::NAT-STM#240
CNAG_04631 RIK1 1579, 1580 MATα CNAG _ 04631Δ::NAT-STM#150
CNAG_04678 YPK1 1736, 1737 MATα ypk1Δ::NAT-STM#58
CNAG_04755 BCK1 273, 274 MATα bck1Δ::NAT-STM#43
CNAG_04821 PAN3 2809, 2810 MATα pan3Δ::NAT-STM#204
CNAG_04927 YFH702 2826, 3716 MATα yfh702Δ::NAT-STM#220
CNAG_05005 ATG1 1935, 1936 MATα atg1Δ::NAT-STM#288
CNAG_05063 SSK2 264, 265 MATα ssk2Δ::NAT-STM#210
CNAG_05097 CKY1 1245, 1246 MATα CNAG _ 05097Δ::NAT-STM#282
CNAG_05216 RAD53 3785, 3786 MATα rad53Δ::NAT-STM#184
CNAG_05220 TLK1 3153, 3188 MATα tlk1Δ::NAT-STM#116
CNAG_05243 XKS1 2851 MATα xks1Δ::NAT-STM#125
CNAG_05439 CMK1 1883, 1901, 1902 MATα cmk1Δ::NAT-STM#227
CNAG_05558 KIN4 2955 MATα kin4Δ::NAT-STM#225
CNAG_05590 TCO2 281, 282 MATα tco2Δ::NAT-STM#116
CNAG_05600 IGI1 1514, 1515 MATα CNAG _ 05600Δ::NAT-STM#230
CNAG_05694 CKA1 3051, 3052, 3053 MATα cka1Δ::NAT-STM#6
CNAG_05753 ARG5 ,6 2408, 2409, 2410 MATα arg5 / 6Δ::NAT-STM#220
CNAG_05771 TEL1 3844, 3845 MATα tel1Δ::NAT-STM#225
CNAG_05965 IRK4 2806, 2808 MATα irk4Δ::NAT-STM#211
CNAG_06033 MAK32 　 3240, 3241 MATα mak32Δ::NAT-STM#169
CNAG_06051 GAL1 2829, 2830 MATα gal1Δ::NAT-STM#224
CNAG_06086 SSN3 3038, 3039 MATα ssn3Δ::NAT-STM#219
CNAG_06161 VRK1 2216, 2217 MATα vrk1Δ::NAT-STM#123
CNAG_06193 CRK1 1709, 1710 MATα crk1Δ::NAT-STM#43
CNAG_06278 TCO7 348 MATα tco7Δ::NAT-STM#209
CNAG_06301 SCH9 619, 620 MATα sch9Δ::NAT-STM#169
CNAG_06310 IRK7 2136, 2137 MATα irk7Δ::NAT-STM#208
CNAG_06366 HRR2502 2053 MATα hrr2502Δ::NAT-STM#125
CNAG_06552 SNF1 2372, 2373 MATα snf1Δ::NAT-STM#204
CNAG_06553 GAL83 2415, 2416 MATα gal83Δ::NAT-STM#288
CNAG_06568 SKS1 1410, 1411 MATα sks1Δ::NAT-STM#211
CNAG_06632 ABC1 2072, 2797 MATα CNAG _ 06632Δ::NAT-STM#119
CNAG_06671 YKL1 3926, 3927 MATα CNAG _ 06671Δ::NAT-STM#122
CNAG_06697 MPS1 3632, 3633 MATα mps1Δ::NAT-STM#116
CNAG_06730 GSK3 2038, 2039 MATα gsk3Δ::NAT-STM#123
CNAG_06809 IKS1 1310, 2119 MATα iks1Δ::NAT-STM#116
CNAG_06980 STE11 313, 314 MATα ste11Δ::NAT-STM#242
CNAG_07359 IRK1 1950, 1951 MATα irk1Δ::NAT-STM#5
CNAG_07580 TRM7 3056, 3057 MATα trm7Δ::NAT-STM#102
CNAG_07667 SAT4 3612 MATα sat4Δ::NAT-STM#212
CNAG_07744 PIK1 1493, 1494 MATα pik1Δ::NAT-STM#227
CNAG_07779 TDA10 2663, 3223 MATα tda10Δ::NAT-STM#102
CNAG_08022 PHO85 3702, 3703 MATα pho85Δ::NAT-STM#218
*CNAG: Cryptococcus neoformans serotype A genome database의 약자로 브로드 인스티튜트 (Broad Institute)에서 제공된 H99 게놈 데이터베이스 유전자 번호이다.
상동재조합을 통한 유전자결실을 위해, 표식인자 서열로 나타낸 노르세오트리신-저항성 (NAT; nourseothricin acetyl transferase) 마커를 포함하는 유전자-붕괴 카세트를 통상의 오버랩 PCR 또는 NAT 스플릿마커 (split marker)/이중연결 (double-joint; DJ) PCR 방법으로 제작하였다 (Davidson, R. C. et al. A PCR-based strategy to generate integrative targeting alleles with large regions of homology. Microbiology 148, 2607-2615 (2002); Kim, M. S., Kim, S. Y., Jung, K. W. & Bahn, Y. S. Targeted gene disruption in Cryptococcus neoformans using double-joint PCR with split dominant selectable markers. Methods Mol Biol 845, 67-84, doi:10.1007/978-1-61779-539-8_5 (2012) (상기 표 1). 변이체 표현형을 평가하고, 관련 없는 변이효과를 제외하기 위해, 각 키나아제 변이체에 대해 2개 초과의 독립적인 결실균주를 제조하였다 (표 1 참조). 2개의 독립적인 키나아제 변이체가 상이한 표현형 (inter-isolate inconsistency) 을 나타낸 경우, 3개 이상의 변이체를 제작하였다. 결과적으로 114개의 키나아제에 해당하는 220개 유전자결실 변이체 (이전에 보고된 것과 함께)를 성공적으로 제조하였다 (상기 표 1). 106개 키나아제에 대하여 2개 이상의 독립적인 변이체를 제조하였다. 이전에 보고된 몇몇 키나아제들은 생체외 (시험관내) 및 생체내 표현형 분석을 수행하기 위하여, 독특한 표식인자 마커로 독립적으로 결실시켰다. 두 개의 독립적인 키나아제 변이체가 일치하지 않는 표현형 (상호-격리 불일치로 알려진)을 나타낸 경우, 3개 이상의 변이체를 제조하였다.
나머지 69개 키나아제에 대해서는, 본 발명자들의 반복적인 시도에도 불구하고, 어떠한 변이체도 만들 수 없었다. 이들 중, 많은 경우 생존가능 한 형질전환체를 전혀 얻을 수 없거나, 붕괴 대립유전자에 덧붙여 야생형 대립유전자가 유지 되는 것이 관찰되었다. 키나아제에 대한 변이체 제작 비율 (183개 중 114개 [62%])은 이전에 보고된 TFs (178개 중 155개 [87%])에 비해 낮았다 (Jung, K. W. et al. Systematic functional profiling of transcription factor networks in Cryptococcus neoformans. Nat Comms 6, 6757, doi:10.1038/ncomms7757, 2015). 이는 일반적으로 키나아제가 TFs에 비해 진균류 중에서 훨씬 더 진화론적으로 보존되고, 보다 더 많은 수의 필수적인 유전자가 존재하기 때문일 것이다. 실제로, 키나아제 중 24개 (35%)는 S. 세레비지애 성장에 필수적인 키나아제에 대해 이종상동 (orthologous)이다. 특히, 그 중 C. 네오포만스에서 결실 변이체를 만들 수 있었던 8개 (RAD53, CDC28, CDC7, CBK1, UTR1, MPS1, PIK1, 및 TOR2)는 S. 세레비지애에서 필수적인 것으로 알려져 있으며, 이는 자낭균류와 담자균류 진균 사이에 몇몇 단백질 키나아제에서 기능적인 분화가 있음을 제시한다.
PCR의 1차 라운드에서, 타겟 키나아제 유전자에 대한 5'- 및 3'-플랭킹 영역을 H99S 게놈 DNA를 주형으로 사용하고, 프라이머쌍 L1/L2와 R1/R2로 각각 증폭시켰다. 오버랩 PCR을 위하여, 전체 NAT 마커를 각각 독특한 표식인자서열을 가진 NAT유전자를 포함하는 플라스미드 pNATSTM (입수처: 미국 듀크대학교 Joeseph Heitman 연구실로부터 입수)을 사용하여, 프라이머 M13Fe (연장된 순방향 M13) 및 M13Re (연장된 역방향 M13)로 증폭시켰다. 스플릿마커/DJ-PCR을 위하여, NAT 마커의 스플릿 5'- 및 3'-영역을 각각 프라이머쌍 M13Fe/NSL 및 M13Re/NSR를 이용하고 pNATSTM으로 증폭시켰다. 오버랩 PCR을 위한 PCR의 2차 라운드에서, 키나아제 유전자-붕괴 카세트를 조합된 1차 라운드 PCR 산물을 주형으로 사용하여, 프라이머 L1 및 R2로 증폭시켰다. 분열 마커/DJ-PCR을 위한 PCR의 2차 라운드에서, NAT-분열 유전자-붕괴 카세트를, 조합된 상응하는 1차 라운드 PCR 산물을 주형으로 사용하고, 키나아제 유전자 및 NAT 마커의 5'- 및 3'-영역에 대하여 각각 프라이머쌍 L1/NSL 및 R2/NSR2로 증폭시켰다. 형질전환을 위하여, H99S 균주 (입수처: 미국 듀크대학교 Joeseph Heitman 연구실로부터 입수)를 30에서 50 ml의 효모 추출물-펩톤-덱스트로스 (YPD) 배지 [Yeast extract (Becton, Dickison and company #212750), Peptone (Becton, Dickison and company #211677), Glucose (Duchefa,#G0802)] 에서, 하룻밤 배양하여 펠렛화 하고, 5 ml의 증류수에서 다시 현탁시켰다. 약 200 ㎕의 세포 현탁액을 1 M 소르비톨을 포함하는 YPD 고체 배지 상에 펼쳐, 30에서 3 시간 동안 추가로 배양하였다. PCR-증폭된 유전자 붕괴 카세트를 0.6 ㎛ 금 마이크로캐리어 비드 (PDS-100, BioRad)의 600 ㎍ 상에 코팅하고, 입자수송시스템 (PDS-100, BioRad)으로 세포내로 생물학적으로 주입하였다. 형질전환 된 세포를 세포막 완전성의 복구를 위하여 30에서 배양하고, 3시간 후에 긁어내었다. 긁어 낸 세포를 선택배지 (100 ㎍/㎖ 노르세오트리신을 포함하는 YPD 고상플레이트; YPD+NAT) 로 옮겼다. YPD+NAT 플레이트 상 둘 이상의 패시지를 통해 안정적인 노르세오트리신-저항성 (NATr) 형질전환체를 선택하였다. 모든 NATr 균주를 표 2에 나열된 각각의 스크리닝 프라이머를 이용한 PCR로 확인하고, 정확한 유전자형을 서던블롯 분석으로 최종적으로 확인하였다 (Jung, K. W., Kim, S. Y., Okagaki, L. H., Nielsen, K. & Bahn, Y. S. Ste50 adaptor protein governs sexual differentiation of Cryptococcus neoformans via the pheromone-response MAPK signaling pathway. Fungal Genet. Biol. 48, 154-165, doi:S1087-1845(10)00191-X [pii] 10.1016/j.fgb.2010.10.006 (2011).
아제 변이체 라이브러리 제작에 사용된 프라이머 목록
No. H99 locus tag (Broad ID) Cn gene name Primer name Primer description Primer sequence (5'-3')
1 CNAG_00047 PKP1 L1 CNAG_00047 5' flanking region primer 1 AATGAAGTTCCTGCGACAG
L2 CNAG_00047 5' flanking region primer 2 GCTCACTGGCCGTCGTTTTACAATGGGATGAGAACGCAC
R1 CNAG_00047 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGCATTTTCCAGCATCAGC
R2 CNAG_00047 3' flanking region primer 2 GGTGTGGAACATCTTTTGAG
SO CNAG_00047 diagnostic screening primer, pairing with B79 CCTCTGACAGCCACATACTG
PO1 CNAG_00047 Southern blot probe primer 1 CTGGTTCATCTTGGGTGTC
PO2 CNAG_00047 Southern blot probe primer 2 TCTGAGCATACCACTCCTTTAC
STM NAT#224 STM primer AACCTTTAAATGGGTAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
2 CNAG_00106 TCO5 L1 CNAG_00106 5' flanking region primer 1 TACACGAGATTGGCTGGCAACC
L2 CNAG_00106 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACAAGTGAACGCCACACCGATGAG
R1 CNAG_00106 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGTCTCCCGAGGATGTCTTAG
R2 CNAG_00106 3' flanking region primer 2 TGCCAAAGCGTGTAAGTG
SO CNAG_00106 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATGGGAAAGGTCAGTAGCACCG
PO1 CNAG_00106 Southern blot probe primer 1 TCGTCTTTTCTTGGTCCAG
PO2 CNAG_00106 Southern blot probe primer 2 TGAGGGCGTAGTTGATAATG
STM NAT#125 STM primer CGCTACAGCCAGCGCGCGCAAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
3 CNAG_00130 HRK1 L1 CNAG_00130 5' flanking region primer 1 TTCCAGTCAACCGAGTAGC
L2 CNAG_00130 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACCTGTATTCATCATTGCGGC
R1 CNAG_00130 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGCGTCAAATCCAAGAACATCGTG
R2 CNAG_00130 3' flanking region primer 2 GCCTTCATCGTCGTTAGAC
SO CNAG_00130 diagnostic screening primer, pairing with B79 AAGACGACCACATCTCAGAG
PO1 CNAG_00130 Southern blot probe primer 1 AGGACTCTGCTCCATCAAG
PO2 CNAG_00130 Southern blot probe primer 2 GAAAGAGCCTCAGAAAAGTAGG
STM NAT#58 STM primer CGCAAAATCACTAGCCCTATAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
4 CNAG_00266 L1 CNAG_00266 5' flanking region primer 1 GGTCGTATCTCTCTTTCAAGC
L2 CNAG_00266 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTGACGAGTTGTTCAGGGG
R1 CNAG_00266 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGATGTGGATGAGAAGGTAGC
R2 CNAG_00266 3' flanking region primer 2 GTGCCGACGAGAAGATAAC
SO CNAG_00266 diagnostic screening primer, pairing with B79 AAGGGATAATGGATGACCAC
PO CNAG_00266 Southern blot probe primer TCAGTGAGATTCAAGGATGC
STM NAT#213 STM primer CTGGGGATTTTGATGTGTCTATGT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
5 CNAG_00363 TCO6 L1 CNAG_00363 5' flanking region primer 1 GAGAGAATAACAAAAGGGCG
L2 CNAG_00363 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACACACGAGGGTTAGAGTTGG
R1 CNAG_00363 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAGCGTCTTTGTAACCCG
R2 CNAG_00363 3' flanking region primer 2 GCAGGTATCTTACACTCCGTTG
SO CNAG_00363 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATTAGACACACGACCTGGG
PO CNAG_00363 Southern blot probe primer TGAGGATACTGGTTGACGC
STM NAT#58 STM primer CGCAAAATCACTAGCCCTATAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
6 CNAG_00388 L1 CNAG_00388 5' flanking region primer 1 TTTTGAGCGGGGAAACAC
L2 CNAG_00388 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGGTCTCGTCTGTATTTTCG
R1 CNAG_00388 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGATACCCAGGATTCCACTG
R2 CNAG_00388 3' flanking region primer 2 ACCATTATCGTCGCCTTCG
SO CNAG_00388 diagnostic screening primer, pairing with B79 CAATCCCAATGGCTTTCAG
PO CNAG_00388 Southern blot probe primer CGGGTCAAGATGAAAATGTTCGTC
STM NAT#208 STM primer TGGTCGCGGGAGATCGTGGTTT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
7 CNAG_00396 PKA1 L1 CNAG_00396 5' flanking region primer 1 AAACGACTGTGTAATGCGAG
L2 CNAG_00396 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACGGAGCCAGAATAAAGGAGTTG
R1 CNAG_00396 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGGCACTAAATGGGTGAGCAC
R2 CNAG_00396 3' flanking region primer 2 CGATTTGTCCAGTGATTCAGTGAC
SO CNAG_00396 diagnostic screening primer, pairing with B79 GTTGGAAGTAGCAGTGTCTTG
PO CNAG_00396 Southern blot probe primer TGTCGGAGGAGAATGAACG
STM NAT#191 STM primer ATATGGATGTTTTTAGCGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
8 CNAG_00405 KIC1 L1 CNAG_00405 5' flanking region primer 1 AAGATGAGCGTTGCGAAG
L2 CNAG_00405 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGCGTGGTGCTAAGAACAAC
R1 CNAG_00405 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGAGGTAGACTCCCAGAATGC
R2 CNAG_00405 3' flanking region primer 2 TAATGTGTCAACTGCCGC
SO CNAG_00405 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTGGTTTCAAGGGGGAAC
PO CNAG_00405 Southern blot probe primer AAAGTGGACCGTTTGGAG
STM NAT#201 STM primer CACCCTCTATCTCGAGAAAGCTCC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
9 CNAG_00415 CDC2801 L1 CNAG_00415 5' flanking region primer 1 CGCATTCTGGACAAAAGC
L2 CNAG_00415 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTTGCCGTATCTTCCTGG
R1 CNAG_00415 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGATGTATCTAATCCCTCCG
R2 CNAG_00415 3' flanking region primer 2 AGATTCGGTGCTTTGTGTC
SO CNAG_00415 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTGGTCTGGGAACCTTTAC
PO CNAG_00415 Southern blot probe primer AATGTGCTACTGCCGACAG
STM NAT#191 STM primer ATATGGATGTTTTTAGCGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
10 CNAG_00556 L1 CNAG_00556 5' flanking region primer 1 GAACCGAAAAGGGCATTC
L2 CNAG_00556 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGGAGCAGGTGGTTCTAAG
R1 CNAG_00556 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCAGGAGAGAGGAATGAAAC
R2 CNAG_00556 3' flanking region primer 2 CCACCGTCCATTACTTACTG
SO CNAG_00556 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGTCAACCCGCTCAAACAC
PO CNAG_00556 Southern blot probe primer AGAGAAGTCCTTGCGATTG
STM NAT#290 STM primer ACCGACAGCTCGAACAAGCAAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
11 CNAG_00636 CDC7 L1 CNAG_00636 5' flanking region primer 1 GCTGGAAGCGTGATGATAC
L2 CNAG_00636 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGTGTAGGAGGGGAGATGAG
R1 CNAG_00636 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAGGACATCCACCAGAGAGG
R2 CNAG_00636 3' flanking region primer 2 CAAATGGGTGTCTCAGAGC
SO CNAG_00636 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGAGTGATGCCTTACGCTG
PO CNAG_00636 Southern blot probe primer CCCTGTAGACTTACCTTCCC
STM NAT#213 STM primer CTGGGGATTTTGATGTGTCTATGT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
12 CNAG_00683 L1 CNAG_00683 5' flanking region primer 1 GAAAACGAGTCCTGGATAGTTC
L2 CNAG_00683 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACATGGTTGGATGGGTAGGAG
R1 CNAG_00683 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCTGCCAACAGACATCAAC
R2 CNAG_00683 3' flanking region primer 2 AGAAAAACTCGGACACCTG
SO CNAG_00683 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGTAAAAAACAGAGGAGCCC
PO CNAG_00683 Southern blot probe primer TTCAGAGTCATCCCACGGTG
STM NAT#273 STM primer GAGATCTTTCGGGAGGTCTGGATT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
13 CNAG_00745 HRK1 / NPH1 L1 CNAG_00745 5' flanking region primer 1 GCAAAAATGGGGAAGATAGG
L2 CNAG_00745 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTCCCCAAAATCACTCCC
R1 CNAG_00745 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGGAGATGAGTGGGTGAAG
R2 CNAG_00745 3' flanking region primer 2 TGTGTCAGACCTGTTATCGTTC
SO CNAG_00745 diagnostic screening primer, pairing with CTCAACCACTCTCTTACGGA
PO CNAG_00745 Southern blot probe primer CGAGGTTAGGAGGAAAGGTC
STM NAT#210 STM primer CTAGAGCCCGCCACAACGCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
14 CNAG_00769 PBS2 L1 CNAG_00769 5' flanking region primer 1 AGGAAGGTGGAGTGTTGTG
L2 CNAG_00769 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACATGCGAGGAAGAAAGGTCG
R1 CNAG_00769 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGAACCGACGACCGACTTATGC
R2 CNAG_00769 3' flanking region primer 2 GTAAGGTAGTCGCAACAACG
SO CNAG_00769 diagnostic screening primer, pairing with B79 CGATACCCTTCTTGCCTGTAG
PO1 CNAG_00769 Southern blot probe primer 1 AACACGACAGGAAATCCG
PO2 CNAG_00769 Southern blot probe primer 2 TGGAAGGTTACAAGCCGAC
STM NAT#213 STM primer CTGGGGATTTTGATGTGTCTATGT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
15 CNAG_00782 SPS1 L1 CNAG_00782 5' flanking region primer 1 CCCGATGAAAGTAATGGC
L2 CNAG_00782 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAATGTCCTCTCTTCTGCTCTC
R1 CNAG_00782 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGATGACTGCGAAGAAAGGC
R2 CNAG_00782 3' flanking region primer 2 CTTACATCCAGACATCCCAC
SO CNAG_00782 diagnostic screening primer, pairing with B79 GGGTGAGCAACAAGAAATG
PO CNAG_00782 Southern blot probe primer CTCCTCCTTTCTTTTATGCC
STM NAT#288 STM primer CTATCCAACTAGACCTCTAGCTAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
16 CNAG_00826 DAK2 L1 CNAG_00826 5' flanking region primer 1 AGTTTGAATGAAGGGGCG
L2 CNAG_00826 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGAAGATGTGTCGGTCTGTC
R1 CNAG_00826 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGGAAGGTATTCTCAAGGC
R2 CNAG_00826 3' flanking region primer 2 GCTGTTCAGTTTCCTCTCTATG
SO CNAG_00826 diagnostic screening primer, pairing with B79 ACAGCGATGTGGGGATAAG
PO CNAG_00826 Southern blot probe primer CATACTTTCCTCGGGATTTC
STM NAT#282 STM primer TCTCTATAGCAAAACCAATC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
17 CNAG_00877 L1 CNAG_00877 5' flanking region primer 1 TCCACACACGAATGGTATC
L2 CNAG_00877 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTGTCAGCAAGGGAATGGGCAGTG
R1 CNAG_00877 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGGATGATTTGAGGGATAG
R2 CNAG_00877 3' flanking region primer 2 ATTGAAACTACCAGTGGCACCCCG
SO CNAG_00877 diagnostic screening primer, pairing with B79 CCAATACGGTGCTTATGTGAC
PO CNAG_00877 Southern blot probe primer CGCAGAGTAGGTTGTGTTG
STM NAT#204 STM primer GATCTCTCGCGCTTGGGGGA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
18 CNAG_01061 L1 CNAG_01061 5' flanking region primer 1 AAAAGGGGTGGGTCAAAG
L2 CNAG_01061 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGGTATTGGGTTTCCTCTG
R1 CNAG_01061 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCCATTAGCATTCGGAGAG
R2 CNAG_01061 3' flanking region primer 2 GAAGTATCAGAGGAGTCCCG
SO CNAG_01061 diagnostic screening primer, pairing with B79 CGTGGTCACTTATGTCCTTC
PO CNAG_01061 Southern blot probe primer AAAAGTGCGAAGGGAGGTC
STM NAT#220 STM primer CAGATCTCGAACGATACCCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
19 CNAG_01062 PSK201 L1 CNAG_01062 5' flanking region primer 1 GTCCACTTTATTTTTCGGGC
L2 CNAG_01062 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGAGGAGTAATGACCGTGACC
R1 CNAG_01062 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGGTAAAAAGGGGTGGGTC
R2 CNAG_01062 3' flanking region primer 2 GGTATTGGGTTTCCTCTGTG
SO CNAG_01062 diagnostic screening primer, pairing with B79 GATTAGTATTCCTGTGCCACC
PO CNAG_01062 Southern blot probe primer GGAAATGTAGGGGGTAGACG
STM NAT#191 STM primer ATATGGATGTTTTTAGCGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
20 CNAG_01155 GUT1 L1 CNAG_01155 5' flanking region primer 1 AATCGTTCCCTTCCTAAGC
L2 CNAG_01155 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAAACCGAGACCTCTGAAGG
R1 CNAG_01155 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGAGAAAGCCAGACTGAAG
R2 CNAG_01155 3' flanking region primer 2 ATGGTAGTTTTGCGGGTG
SO CNAG_01155 diagnostic screening primer, pairing with B79 CAGAGAAGTTGACTGGGATG
PO CNAG_01155 Southern blot probe primer GTTCATCGCTTCAACCAG
STM NAT#242 STM primer GTAGCGATAGGGGTGTCGCTTTAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
21 CNAG_01162 MAK322 L1 CNAG_01162 5' flanking region primer 1 GACCGCAGTAGAACTTACACC
L2 CNAG_01162 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGAGGAAATGTTGAAGGTGTG
R1 CNAG_01162 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGGAAGGAAAGAGTTTAGACG
R2 CNAG_01162 3' flanking region primer 2 ATCAGGCAACCGCATAAC
SO CNAG_01162 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATGCTGCCAGAACACTTG
PO CNAG_01162 Southern blot probe primer TCCTCCCAAATAAGTGCC
STM NAT#159 STM primer ACGCACCAGACACACAACCAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
22 CNAG_01165 LCB5 L1 CNAG_01165 5' flanking region primer 1 CCCAAATCTCGTTCGTTG
L2 CNAG_01165 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTGTGTGGCTGTAGAGGTG
R1 CNAG_01165 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCCATCGCACATAACTTTC
R2 CNAG_01165 3' flanking region primer 2 ATTCTGAAGGCGTAAGTCG
SO CNAG_01165 diagnostic screening primer, pairing with B79 AAAAGGGTCGTAAGATGGG
PO CNAG_01165 Southern blot probe primer ACGCCGAATAGGTTTGTG
STM NAT#213 STM primer CTGGGGATTTTGATGTGTCTATGT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
23 CNAG_01209 FAB1 L1 CNAG_01209 5' flanking region primer 1 TTTCTGATGGGAGGGAGTG
L2 CNAG_01209 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGCGTGGTATGGATAGACAAG
R1 CNAG_01209 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAAAGATTTGGGGGCTGG
R2 CNAG_01209 3' flanking region primer 2 GCTGAAGGTGAGCGATAAG
SO CNAG_01209 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGTCAGTGTCCAAACTTCTGTC
PO CNAG_01209 Southern blot probe primer AAAGGGAATCCAGGAACG
STM NAT#169 STM primer ACATCTATATCACTATCCCGAACC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
24 CNAG_01250 L1 CNAG_01250 5' flanking region primer 1 GCTTTTTCGTTGGAGGTG
L2 CNAG_01250 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGCTCTGTCATCTTCCAGC
R1 CNAG_01250 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGATAGCGTGTTACCACAGGC
R2 CNAG_01250 3' flanking region primer 2 CGTCCTCAAAATACAACTCG
SO CNAG_01250 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGGTAAATCCTCGTGCTG
PO CNAG_01250 Southern blot probe primer GCGAAAGTAACCCAGATGC
STM NAT#227 STM primer TCGTGGTTTAGAGGGAGCGC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
25 CNAG_01285 L1 CNAG_01285 5' flanking region primer 1 CAATAACCCATTACCACTGC
L2 CNAG_01285 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTGTTGGCAAGACCACTG
R1 CNAG_01285 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGTTTCTCCTGAAGCCACTG
R2 CNAG_01285 3' flanking region primer 2 TTAGAGGCGGTAGTTACGG
SO CNAG_01282 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTACGATACTTGGCTGAAGC
PO CNAG_01285 Southern blot probe primer AGCATTTTGGCTGTAGGC
STM NAT#240 STM primer GGTGTTGGATCGGGGTGGAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
26 CNAG_01294 IPK1 L1 CNAG_01294 5' flanking region primer 1 GGAAAAGAGAAGAGCACGG
L2 CNAG_01294 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCATCAACCATAGCAAGCAAC
R1 CNAG_01294 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGCTGGTCAAAGAATGGAC
R2 CNAG_01294 3' flanking region primer 2 TGGTAGGATGTGTTGTGGAG
SO CNAG_01294 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTTGCTCTCTTCGCCAAC
PO CNAG_01294 Southern blot probe primer CGCATTCTCATCTTATCCC
STM NAT#184 STM primer ATATATGGCTCGAGCTAGATAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
27 CNAG_01333 ALK1 L1 CNAG_01333 5' flanking region primer 1 GCATTTTCATTGCTGGTCAC
L2 CNAG_01333 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACACGGAAGGAGGAGATAACTAAC
R1 CNAG_01333 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGAGTTGTATGGCGAGGATG
R2 CNAG_01333 3' flanking region primer 2 GTCCTGTGAATCGGGAGAT
SO CNAG_01333 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGTTTCACCAGAGTCAGCC
PO CNAG_01333 Southern blot probe primer ACGGGAGTGTTGTATGAGC
STM NAT#122 STM primer ACAGCTCCAAACCTCGCTAAACAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
28 CNAG_01364 L1 CNAG_01364 5' flanking region primer 1 TCGCTCGCCTTGATTTGAC
L2 CNAG_01364 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAAGTGGCTGTTGTGGAGGTCTG
R1 CNAG_01364 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTGCGGTGATACCTTGCCAG
R2 CNAG_01364 3' flanking region primer 2 TCCCCCGTTACCTTTATG
SO CNAG_01364 diagnostic screening primer, pairing with B79 CAGCCAATCTTTTCCCTG
PO CNAG_01364 Southern blot probe primer TTTTCGCCAGCCACCTTCAG
STM NAT#5 STM primer TGCTAGAGGGCGGGAGAGTT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
29 CNAG_01523 HOG1 L1 CNAG_01523 5' flanking region primer 1 TGTGGTAGGTGCGTTATCG
L2 CNAG_01523 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACAGAAAGCCCATCCATCAG
R1 CNAG_01523 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGTCTTGGTAAGTCTCTGTGCC
R2 CNAG_01523 3' flanking region primer 2 TACTCAACCCCATACTCACTCCCG
SO CNAG_01523 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGAAGACAAAAGGCGTGGG
PO1 CNAG_01523 Southern blot probe primer 1 TCACAGAGCGTTGATTACG
PO2 CNAG_01523 Southern blot probe primer 2 CAGGCTCATCGGTAGGATCA
STM NAT#177 STM primer CACCAACTCCCCATCTCCAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
30 CNAG_01612 PSK202 L1 CNAG_01612 5' flanking region primer 1 ACGCTTGTTTCTTCGTCC
L2 CNAG_01612 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTCGGGATGATAAAGTGAGG
R1 CNAG_01612 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTCTTCCCCTTTCTGATGG
R2 CNAG_01612 3' flanking region primer 2 CCGACCAAAAACAGGTTC
SO CNAG_01612 diagnostic screening primer, pairing with B79 AACTGGCATTGAAGGTGTC
PO CNAG_01612 Southern blot probe primer GACAAGCATTGGGAAACC
STM NAT#208 STM primer TGGTCGCGGGAGATCGTGGTTT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
31 CNAG_01664 L1 CNAG_01664 5' flanking region primer 1 CCTACATCCAGGACAAACG
L2 CNAG_01664 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCACCTTCTCCGACCTTTTC
R1 CNAG_01664 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCCGCATAAAGAAAAGCC
R2 CNAG_01664 3' flanking region primer 2 AAAGCGAGGTTGAAGAGGG
SO CNAG_01664 diagnostic screening primer, pairing with B79 CGTCGTAGTGGGTGTAGATG
PO CNAG_01664 Southern blot probe primer AGGACAACAAGTCTGGATAGC
STM NAT#218 STM primer CTCCACATCCATCGCTCCAA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
32 CNAG_01687 L1 CNAG_01687 5' flanking region primer 1 GCTCCTAAATACCTGCCACTC
L2 CNAG_01687 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTCATCCGCAGAAATGTATC
R1 CNAG_01687 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTTCGCTTATGGTCTATGG
R2 CNAG_01687 3' flanking region primer 2 TTGCGACCTTTTTCTCGG
SO CNAG_01687 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGTTAGAAAAGCCTGTGACG
PO CNAG_01687 Southern blot probe primer CCCAAGATAGTCTCGTTTGC
STM NAT#290 STM primer ACCGACAGCTCGAACAAGCAAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
33 CNAG_01704 IRK6 L1 CNAG_01704 5' flanking region primer 1 GGTCAACTTTCCCTTGTCG
L2 CNAG_01704 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTGAGAGAGCGTGATAAAGC
R1 CNAG_01704 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCACATTGACCTTCCTGTAAC
R2 CNAG_01704 3' flanking region primer 2 GCCCTAAACAAACTAACTCTGTCC
SO CNAG_01704 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGCCTCCTCTTTCCTTACAG
PO CNAG_01704 Southern blot probe primer GCTGGTGCCTCTTTGATTC
STM NAT#5 STM primer TGCTAGAGGGCGGGAGAGTT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
34 CNAG_01730 STE7 L1 CNAG_01730 5' flanking region primer 1 TTGTAAGGCTCTCATTCGC
L2 CNAG_01730 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACTGAAGGCAAAACTGGTGC
R1 CNAG_01730 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGCCTTACCGTGCTTTTCTGC
R2 CNAG_01730 3' flanking region primer 2 TTACTTCCGCCCAACGACAC
SO CNAG_01730 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCCTCGCTCACAAAATGGGC
PO1 CNAG_01730 Southern blot probe primer 1 CCAATAGACATCAAGCCGTC
PO2 CNAG_01730 Southern blot probe primer 2 AAACAGAGAAGAGAAGGGACC
STM NAT#225 STM primer CCATAGAACTAGCTAAAGCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
35 CNAG_01820 L1 CNAG_01820 5' flanking region primer 1 TCAGAAGCAGACAAGGCGTC
L2 CNAG_01820 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTTTGGGGAGGAAGTGCTGAGG
R1 CNAG_01820 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGTTGGTCATTTGTGCGAC
R2 CNAG_01820 3' flanking region primer 2 GGCATTATGAGCAAATCGG
SO CNAG_01820 diagnostic screening primer, pairing with B79 TAGCAGAAGGAGAGGACGGTTC
PO CNAG_01820 Southern blot probe primer CCTTGACGATGTTGGTCTG
STM NAT#6 STM primer ATAGCTACCACACGATAGCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
36 CNAG_01845 L1 CNAG_01845 5' flanking region primer 1 GAATAATCAGCAGCGGTG
L2 CNAG_01845 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGTTCGTTGTTGGTTGTCG
R1 CNAG_01845 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGGAGCCAATAATGTGGAG
R2 CNAG_01845 3' flanking region primer 2 TCTTCATCCTTCCCTTGC
SO CNAG_01845 diagnostic screening primer, pairing with B79 TAAGGGCAAAAGGGTCAG
PO CNAG_01845 Southern blot probe primer TTTTTAGCGTCCGTCTCG
STM NAT#205 STM primer TATCCCCCTCTCCGCTCTCTAGCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
37 CNAG_01850 TCO1 L1 CNAG_01850 5' flanking region primer 1 GTTTCTGCTTCCACCTCAC
L2 CNAG_01850 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACTTTACACACACGGGCGATGTCCTG
R1 CNAG_01850 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGACTGAGCAAATCGGCGTAGG
R2 CNAG_01850 3' flanking region primer 2 AAGTGAGGGGCATTACAGG
SO CNAG_01850 diagnostic screening primer, pairing with B79 CGACACAATACTCTAACTGCG
PO1 CNAG_01850 Southern blot probe primer 1 CTTTCGTCTTTGCCACAC
PO2 CNAG_01850 Southern blot probe primer 2 AATCACCCTTTGCTACGG
STM NAT#102 STM primer CCATAGCGATATCTACCCCAATCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
38 CNAG_01905 KSP1 L1 CNAG_01905 5' flanking region primer 1 CGATTTTGTCTGGGCTCTC
L2 CNAG_01905 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAAGATGATTCGGGCACAG
R1 CNAG_01905 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCCTCTTTCTCAATCATCG
R2 CNAG_01905 3' flanking region primer 2 ACAACATCTTCGCCAACG
SO CNAG_01905 diagnostic screening primer, pairing with B79 TACCGACTCGCAATACACC
PO CNAG_01905 Southern blot probe primer ATACCTTTGTGGCTTCGC
STM NAT#159 STM primer ACGCACCAGACACACAACCAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
39 CNAG_01907 L1 CNAG_01907 5' flanking region primer 1 GCATTCTCTCAACTCGCTC
L2 CNAG_01907 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTCGTAGCCTCTGTCTCTATCCC
R1 CNAG_01907 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGTTTCAGCCAATACCAGG
R2 CNAG_01907 3' flanking region primer 2 TGAACCCCTTTGACCCATCC
SO CNAG_01907 diagnostic screening primer, pairing with B79 CCTCTTCTGTATGCTGCGAG
PO CNAG_01907 Southern blot probe primer TCTGGAATGGAGGCTTTC
STM NAT#282 STM primer TCTCTATAGCAAAACCAATC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
40 CNAG_01938 KIN1 L1 CNAG_01938 5' flanking region primer 1 AGAGACAAAGGTGAGGTCG
L2 CNAG_01938 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCACGGGATAATGTTGACG
R1 CNAG_01938 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCAGTATCAAATGCTGGC
R2 CNAG_01938 3' flanking region primer 2 AGATAATAAGGGTGCGGC
SO CNAG_01938 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGAGGTGGAGGCTTGTCTAC
PO CNAG_01938 Southern blot probe primer GGACTTCTTTGGTTGGGAG
STM NAT#6 STM primer ATAGCTACCACACGATAGCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
41 CNAG_01988 TCO3 L1 CNAG_01988 5' flanking region primer 1 CCCAGAAAAGAAGGTTGG
L2 CNAG_01988 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACTTGTGGTTTGTGGGTAGCGTGG
R1 CNAG_01988 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGGGCATCATTGCTCATTCTTGTG
R2 CNAG_01988 3' flanking region primer 2 AAAAGGTGAAATAGGGGCGGCG
SO CNAG_01988 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGTTCCTCAATGAAGTGTCC
PO CNAG_01988 Southern blot probe primer 1 ATGGGGAGGTCTATGCGTTAGC
PO2 CNAG_01988 Southern blot probe primer 2 TAAAGTCTCTTCCCCACCCG
STM NAT#119 STM primer CTCCCCACATAAAGAGAGCTAAAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
42 CNAG_02007 L1 CNAG_02007 5' flanking region primer 1 GAGCAGCGAAATAACCAAG
L2 CNAG_02007 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCAGTAGCGAGGTGACAGATG
R1 CNAG_02007 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCGATTGGACACTTACCAC
R2 CNAG_02007 3' flanking region primer 2 AGCCCGAGTTCTTTTTAGAC
SO CNAG_02007 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGAAATAGCGTTGCCACC
PO CNAG_02007 Southern blot probe primer GCTTGTTTGGTAGATAGTCAGC
STM NAT#232 STM primer CTTTAAAGGTGGTTTGTG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
43 CNAG_02028 L1 CNAG_02028 5' flanking region primer 1 AAATCCGCAGGGGAAAAC
L2 CNAG_02028 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGGGAAAAGGATGGACAGG
R1 CNAG_02028 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCTCCGTCCTCAAAGAAAAATACC
R2 CNAG_02028 3' flanking region primer 2 TTCCGTTCCAATCGCAAG
SO CNAG_02028 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTTTGCCCTTGCCCTGTTG
PO CNAG_02028 Southern blot probe primer ATCTTGCTCATACCGAACC
STM NAT#225 STM primer CCATAGAACTAGCTAAAGCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
44 CNAG_02194 L1 CNAG_02194 5' flanking region primer 1 TTGGTCCTCTGCGAAAAC
L2 CNAG_02194 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGCTGTTGCTGAGAGTTTGTG
R1 CNAG_02194 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTCAAACCCGAAGGTGAAG
R2 CNAG_02194 3' flanking region primer 2 ACGACTTATTCCCCATCCC
SO CNAG_02194 diagnostic screening primer, pairing with B79 CACCTCGTTTGATGAATGC
PO CNAG_02194 Southern blot probe primer CTCTCTCCTTCTCGTATCTGG
STM NAT#273 STM primer GAGATCTTTCGGGAGGTCTGGATT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
45 CNAG_02202 L1 CNAG_02202 5' flanking region primer 1 AACAACCGAAACCAGCGAC
L2 CNAG_02202 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGAAGGTGATGTTTGTGGC
R1 CNAG_02202 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGCCGACAATGGTCTTATC
R2 CNAG_02202 3' flanking region primer 2 TCCTGGTCATCGTGCTAACC
SO CNAG_02202 diagnostic screening primer, pairing with B79 CTTATGCCACTCCTAACCG
PO CNAG_02202 Southern blot probe primer GCCGAGATACCTGTAAAGTCC
STM NAT#6 STM primer ATAGCTACCACACGATAGCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
46 CNAG_02233 MEC1 L1 CNAG_02233 5' flanking region primer 1 TTCCTCATCCACGATACTTC
L2 CNAG_02233 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGACAGAGGTTTGAGGATGC
R1 CNAG_02233 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTTTGTCCACGACCCTCTC
R2 CNAG_02233 3' flanking region primer 2 TCATTGCCACCTCCACCAAG
SO CNAG_02233 diagnostic screening primer, pairing with B79 CTGATTGAAGGAACTTACCTCG
PO CNAG_02233 Southern blot probe primer GGAGAAGTTCACGAAGGTCTG
STM NAT#204 STM primer GATCTCTCGCGCTTGGGGGA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
47 CNAG_02285 L1 CNAG_02285 5' flanking region primer 1 TCCTCTGTTCTTGTCGTGG
L2 CNAG_02285 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTGCTCAGTGGTAGACATTTTG
R1 CNAG_02285 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTCTCAGGCTTGGCTCTAC
R2 CNAG_02285 3' flanking region primer 2 CGCCCTGTGATGATAATAACCTTC
SO CNAG_02285 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGGACAAAGGGACACTTACC
PO CNAG_02285 Southern blot probe primer TGACAACACCAACGATGG
STM NAT#150 STM primer ACATACACCCCCATCCCCCC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
48 CNAG_02296 RBK1 L1 CNAG_02296 5' flanking region primer 1 TCACTCATCACCAGGTAACG
L2 CNAG_02296 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGAAACTGGAAAGCAGACG
R1 CNAG_02296 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTTGCTTAGGAAAATCACCC
R2 CNAG_02296 3' flanking region primer 2 GCACAAGAAAACCAGTCCAG
SO CNAG_02296 diagnostic screening primer, pairing with B79 GCTCGGTATGTTTATCACCTG
PO CNAG_02296 Southern blot probe primer GAGTGTGGAAGAGAGAGGAAC
STM NAT#219 STM primer CCCTAAAACCCTACAGCAAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
49 CNAG_02357 MKK2 L1 CNAG_02357 5' flanking region primer 1 GCGTCATTTCCCAATCAC
L2 CNAG_02357 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACTCGGTGTCTTCAGTTCAGAG
R1 CNAG_02357 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGACCCTACCCTTGGCAACTAC
R2 CNAG_02357 3' flanking region primer 2 CCCTTTGTTTGTTGCTGAC
SO CNAG_02357 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTTTGCCCACTCCCCCTTTACCAC
PO1 CNAG_02357 Southern blot probe primer 1 GCAAAGTCACATACACGGC
PO2 CNAG_02357 Southern blot probe primer 2 GATGTCCGAGTGATAACCTG
STM NAT#224 STM primer AACCTTTAAATGGGTAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
50 CNAG_02389 YPK101 L1 CNAG_02389 5' flanking region primer 1 TACCTGCCGACAAATGAC
L2 CNAG_02389 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACACATAGCGGCTGCTTTTC
R1 CNAG_02389 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGGGGGTTCTAAAAGACG
R2 CNAG_02389 3' flanking region primer 2 ACCATCATCTCTGCGTTG
SO CNAG_02389 diagnostic screening primer, pairing with B79 AACCGCAAGTAGGGCATAC
PO CNAG_02389 Southern blot probe primer TGAGCAAAAAAGGCGAGC
STM NAT#242 STM primer GTAGCGATAGGGGTGTCGCTTTAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
51 CNAG_02459 L1 CNAG_02459 5' flanking region primer 1 TCTCGGGGTCTTCAATCTC
L2 CNAG_02459 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGTGCGGATTCGTTATTTGG
R1 CNAG_02459 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAAGAGGGTTAGGTTTGGC
R2 CNAG_02459 3' flanking region primer 2 GCCACTTCCGTATCAAAAG
SO CNAG_02459 diagnostic screening primer, pairing with B79 GCACTGCTGCTTGAAATC
PO CNAG_02459 Southern blot probe primer ATAGATTCTGATGCGGCG
STM NAT#122 STM primer ACAGCTCCAAACCTCGCTAAACAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
52 CNAG_02511 CPK1 L1 CNAG_02511 5' flanking region primer 1 CTGTAGAAGATGTGAGTTTGGG
L2 CNAG_02511 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACTGATTGATGAGAGATACGGG
R1 CNAG_02511 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGGGCGGAGAAATAGAGGTTG
R2 CNAG_02511 3' flanking region primer 2 CGCACAAGAAGTAAGAGGTG
SO CNAG_02511 diagnostic screening primer, pairing with B79 GGCTATGGACCGTATTCAC
PO1 CNAG_02511 Southern blot probe primer 1 TATCTCACAAGCCACTCCC
PO2 CNAG_02511 Southern blot probe primer 2 ATGCTGCTCACCGTTAGTC
STM NAT#184 STM primer ATATATGGCTCGAGCTAGATAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
53 CNAG_02531 CPK2 L1 CNAG_02531 5' flanking region primer 1 ATGTGCTTGGTTTGCCCGAG
L2 CNAG_02531 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACAACCTGACTTTGCGAGGAGC
R1 CNAG_02531 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGGGAAGAGTTGAAGAGGCTG
R2 CNAG_02531 3' flanking region primer 2 ACTGTGGCTGTTGTTCAGGC
SO CNAG_02531 diagnostic screening primer, pairing with B79 CCAAGGGAAGTCTACCAATAC
PO1 CNAG_02531 Southern blot probe primer1 GGGGAAAGATTAGTGCGTC
PO2 CNAG_02531 Southern blot probe primer2 GTGCGTAGATGAACGAGTG
STM NAT#122 STM primer ACAGCTCCAAACCTCGCTAAACAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
54 CNAG_02542 IRK2 L1 CNAG_02542 5' flanking region primer 1 TGTGCTGGTATCTGATGAGC
L2 CNAG_02542 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGTGAGCGGCTTTGAAAATG
R1 CNAG_02542 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCGGCTATCTTTGTGTATGC
R2 CNAG_02542 3' flanking region primer 2 CCCTTTGCTCACTTTCATACC
SO CNAG_02542 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTTTTCGGGTCTGACGAC
PO CNAG_02542 Southern blot probe primer CTGTTCACCAAGTTCCCTAATC
STM NAT#232 STM primer CTTTAAAGGTGGTTTGTG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
55 CNAG_02551 DAK3 L1 CNAG_02551 5' flanking region primer 1 ATCTAATCCTCCCTGTCCAC
L2 CNAG_02551 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGCGTGATTTCAGGTTCAG
R1 CNAG_02551 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAGCGTGGTTTCCTGTAAG
R2 CNAG_02551 3' flanking region primer 2 GGTCATAACTCAGAGGGGTC
SO CNAG_02551 diagnostic screening primer, pairing with B79 GAGAGCGAAGCAATAGGAAG
PO CNAG_02551 Southern blot probe primer AAGCAATCTCCAGACTCCC
STM NAT#295 STM primer ACACCTACATCAAACCCTCCC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
56 CNAG_02675 HSL101 L1 CNAG_02675 5' flanking region primer 1 CAATGCCGTCATCATCAAAC
L2 CNAG_02675 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAAGGGCGAACAGGATAATAC
R1 CNAG_02675 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCTAATGTGAGAGCAGCAATAC
R2 CNAG_02675 3' flanking region primer 2 TATGTGGCAGAAACCGTG
SO CNAG_02675 diagnostic screening primer, pairing with B79 GCTGTCTTGTTTGCGTTG
PO CNAG_02675 Southern blot probe primer AGGAGTAGTTATCACTTCGGG
STM NAT#146 STM primer ACTAGCCCCCCCTCACCACCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
57 CNAG_02680 VPS15 L1 CNAG_02680 5' flanking region primer 1 AGGACCTTCATCAGGACGAC
L2 CNAG_02680 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAAACTACCTCCCCCGTTAC
R1 CNAG_02680 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCAAATGTATGGATTCGCC
R2 CNAG_02680 3' flanking region primer 2 CTGCGAATCTCGTCTAAGG
SO CNAG_02680 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTGAAAGGTCCCACCAGAC
PO CNAG_02680 Southern blot probe primer GGGAGGAAGTGAGGAGTATG
STM NAT#123 STM primer CTATCGACCAACCAACACAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
58 CNAG_02686 L1 CNAG_02686 5' flanking region primer 1 CACACTTTGCTCTTGTCTGAG
L2 CNAG_02686 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACATGGAGATGCGATAAGCG
R1 CNAG_02686 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGAATCCTCCCTCAACGAG
R2 CNAG_02686 3' flanking region primer 2 AAAGACGACGCCTACTCTGC
SO CNAG_02686 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGTTCCTCTTCCCTGACAG
PO CNAG_02686 Southern blot probe primer CACAATCAAAGCGTTAGGG
STM NAT#191 STM primer ATATGGATGTTTTTAGCGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
59 CNAG_02712 BUD32 L1 CNAG_02712 5' flanking region primer 1 ATAGGGGATGACCTTGGAG
L2 CNAG_02712 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGATGCCAAAGACCAGTG
R1 CNAG_02712 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGAGAAGAGGAAGGAAGAGAGAC
R2 CNAG_02712 3' flanking region primer 2 GAGCGATAATAGCCACCAC
SO CNAG_02712 diagnostic screening primer, pairing with B79 GGGCAATCTTTCTTCGTC
PO CNAG_02712 Southern blot probe primer CTCGTTCTCTGGTTCTTCTG
STM NAT#296 STM primer CGCCCGCCCTCACTATCCAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
60 CNAG_02787 L1 CNAG_02787 5' flanking region primer 1 AACCCCTTGTGTCCCCAAAC
L2 CNAG_02787 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGAGCAGGCGGATACGATAC
R1 CNAG_02787 3' flanking region primer 1 ATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCAAAAAGGACAGAAGAAGAGG
R2 CNAG_02787 3' flanking region primer 2 TTCTCCCATTTCTCCACCC
SO CNAG_02787 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGCAGAGCCAGATGGTAGAG
PO CNAG_02787 Southern blot probe primer TTCCACTTGGCAACTGTCC
STM NAT#227 STM primer TCGTGGTTTAGAGGGAGCGC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
61 CNAG_02799 DAK202A L1 CNAG_02799 5' flanking region primer 1 TTGATACTTTGGGTCTGGG
L2 CNAG_02799 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCGGGAGCCATTATTGGTAAG
R1 CNAG_02799 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTTTGGATGGCTTGCGAGGG
R2 CNAG_02799 3' flanking region primer 2 CCATACAATGACCTGGGAC
SO CNAG_02799 diagnostic screening primer, pairing with B79 AACCATCAACTGCCCTCAC
PO CNAG_02799 Southern blot probe primer GGTAGTATCGGTGATTTGAGTGAG
STM NAT#119 STM primer CTCCCCACATAAAGAGAGCTAAAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
62 CNAG_02802 ARG2 L1 CNAG_02802 5' flanking region primer 1 CCAGCAGTTAGGGATTCAG
L2 CNAG_02802 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCATCGTAGAGTCGTTATTACCG
R1 CNAG_02802 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGATTTGGAGTCCTATCGCC
R2 CNAG_02802 3' flanking region primer 2 ATGTCAATGGTAGCCCACC
SO CNAG_02802 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTTGTTGTTGCCTGACCC
PO CNAG_02802 Southern blot probe primer GTCGCTCAAAGTGTCTTCTC
STM NAT#125 STM primer CGCTACAGCCAGCGCGCGCAAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
63 CNAG_02820 PKH201 L1 CNAG_02820 5' flanking region primer 1 CCCTCGCCAGAATCAATAC
L2 CNAG_02820 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGAGAGGATGTTGAGGTTGC
R1 CNAG_02820 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTGGGATTAGGGCGTATC
R2 CNAG_02820 3' flanking region primer 2 TCTGCCTCTACAAACCACTG
SO CNAG_02820 diagnostic screening primer, pairing with B79 GGAGAGACAGGGGATAAAGC
PO CNAG_02820 Southern blot probe primer ATACCTCCCTTCTCCCAAC
STM NAT#219 STM primer CCCTAAAACCCTACAGCAAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
64 CNAG_02847 L1 CNAG_02847 5' flanking region primer 1 AGACCGATAAAAACAGGACC
L2 CNAG_02847 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAACAATGAAGGCACCTCG
R1 CNAG_02847 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGAACATTCAAACGGAGAC
R2 CNAG_02847 3' flanking region primer 2 ACCAGTTGACAAAGGTATCG
SO CNAG_02847 diagnostic screening primer, pairing with B79 AAGAATACTCCAGAAGGGACC
PO CNAG_02847 Southern blot probe primer GCTTCTGGGGATAAGGTGAG
STM NAT#296 STM primer CGCCCGCCCTCACTATCCAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
65 CNAG_02859 POS5 L1 CNAG_02859 5' flanking region primer 1 TACACGACAGTAACTCCCTCCG
L2 CNAG_02859 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGAAATAACACACACGCTGC
R1 CNAG_02859 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGAAAGTGGCTGGGTGAAG
R2 CNAG_02859 3' flanking region primer 2 AAAGAACTTGAGAAGACCCG
SO CNAG_02859 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGCAACGAGTCCACATACC
PO CNAG_02859 Southern blot probe primer TACACACCTCCAGTTTGACCTCGC
STM NAT#58 STM primer CGCAAAATCACTAGCCCTATAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
66 CNAG_02866 L1 CNAG_02866 5' flanking region primer 1 GAAGATAGTCAATCCGCAAG
L2 CNAG_02866 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACATCTACCACTATTCTCCTGGC
R1 CNAG_02866 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCTGATTGTTCTTGACATTCCG
R2 CNAG_02866 3' flanking region primer 2 AAGGAGGATGAAGGAAGGC
SO CNAG_02866 diagnostic screening primer, pairing with B79 ACAGGAACCTCCGTAACAG
PO CNAG_02866 Southern blot probe primer ATTGGTGAAGGTCTGGGCAGTTCG
STM NAT#102 STM primer CCATAGCGATATCTACCCCAATCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
67 CNAG_02897 L1 CNAG_02897 5' flanking region primer 1 GATGTAGCGGATTGTTTGAC
L2 CNAG_02897 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTCCTTCTGCCTGGGTGTTTC
R1 CNAG_02897 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGATTTGGTGTTTGCTAACGG
R2 CNAG_02897 3' flanking region primer 2 CTCCATCCAGCAACTCTATG
SO CNAG_02897 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGGAAGCAACGCTGACTGTC
PO CNAG_02897 Southern blot probe primer TGGTTGTAATGGCACCGTC
STM NAT#122 STM primer ACAGCTCCAAACCTCGCTAAACAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
68 CNAG_02915 PKH202 L1 CNAG_02915 5' flanking region primer 1 TGGTGGAAATGGACTGTG
L2 CNAG_02915 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCAGCCTCGGGTTTTTTTG
R1 CNAG_02915 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGCACGAAAAGCACGAAG
R2 CNAG_02915 3' flanking region primer 2 TCCTTGGACAACTGGTAGC
SO CNAG_02915 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGGTGGGATTGCTCAAAC
PO CNAG_02915 Southern blot probe primer TGAAGGCGTGCTCAAATG
STM NAT#177 STM primer CACCAACTCCCCATCTCCAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
69 CNAG_02947 SCY1 L1 CNAG_02947 5' flanking region primer 1 CGTCACCAACAAGTCACAG
L2 CNAG_02947 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGAGAAGAGGTTTGAGGCTG
R1 CNAG_02947 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAACCTGTCTGGGAGAAGAGC
R2 CNAG_02947 3' flanking region primer 2 TTCCAAGACTTCCCCAAC
SO CNAG_02947 diagnostic screening primer, pairing with B79 CCATTACCTTTATGTCCCCAC
PO CNAG_02947 Southern blot probe primer TTGCCCATTCCTGTCTTAG
STM NAT#150 STM primer ACATACACCCCCATCCCCCC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
70 CNAG_02962 L1 CNAG_02962 5' flanking region primer 1 CAAGGCGTTCTTCTTTGG
L2 CNAG_02962 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGTCGTGATAATGGCGTTTG
R1 CNAG_02962 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCTAAAAGATTGACTCCGAGG
R2 CNAG_02962 3' flanking region primer 2 GAATAGGTCGTGAATGGATGTC
SO CNAG_02962 diagnostic screening primer, pairing with B79 CTGATAAAAGAGCAGAGAGGG
PO CNAG_02962 Southern blot probe primer GGTGGCTATCAAAGTTGTTAGG
STM NAT#242 STM primer GTAGCGATAGGGGTGTCGCTTTAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
71 CNAG_02976 L1 CNAG_02976 5' flanking region primer 1 GCAAAGTGAAGAAGGCGAG
L2 CNAG_02976 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTGGTGACGGTCCCTTCAAG
R1 CNAG_02976 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAATCCTTGCTGGGGGAAGC
R2 CNAG_02976 3' flanking region primer 2 CGATTCATCTCCATAACCAGTG
SO CNAG_02976 diagnostic screening primer, pairing with B79 GGCATAATGAAACCAGGG
PO CNAG_02976 Southern blot probe primer CGCAAAAACTCGTCATAGG
STM NAT#169 STM primer ACATCTATATCACTATCCCGAACC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
72 CNAG_03024 RIM15 L1 CNAG_03024 5' flanking region primer 1 CTGAGTGCGATGATTGTTTG
L2 CNAG_03024 5' flanking region primer 2 GCTCACTGGCCGTCGTTTTACTTTCCTGACTTTGGGTGC
R1 CNAG_03024 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTGAGGACAGATTCTATGGC
R2 CNAG_03024 3' flanking region primer 2 CAGAGAATAAGGTCCCCTCC
SO CNAG_03024 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCAAGGGATAGAAGTTCGC
PO CNAG_03024 Southern blot probe primer GAGATAAACAGAGCCAAACG
STM NAT#191 STM primer ATATGGATGTTTTTAGCGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
73 CNAG_03048 IRK3 L1 CNAG_03048 5' flanking region primer 1 GATTGAGTTTCGGTTGGG
L2 CNAG_03048 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTAAAAACGGAGCGGAAG
R1 CNAG_03048 3' flanking region primer 1 ATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGAACTTCTCAAGCAACG
R2 CNAG_03048 3' flanking region primer 2 ATACAACCCCCATACTCCC
SO CNAG_03048 diagnostic screening primer, pairing with B79 AAAGGGATTCGGGCTTAC
PO CNAG_03048 Southern blot probe primer CCAGGGGTTGATGTCATAC
STM NAT#273 STM primer GAGATCTTTCGGGAGGTCTGGATT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
74 CNAG_03137 L1 CNAG_03137 5' flanking region primer 1 CAAGGAGGTCAACCCTACAG
L2 CNAG_03137 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGGCGTCTTCTGTCCATAG
R1 CNAG_03137 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGTCGTCCTCTTTTTGTGC
R2 CNAG_03137 3' flanking region primer 2 AGGACTTGTCGGTCTTCAG
SO CNAG_03137 diagnostic screening primer, pairing with B79 GGTAAGTTGCTTTATCCCCC
PO CNAG_03137 Southern blot probe primer GCTGTGAGCAGTTGATACG
STM NAT#211 STM primer GCGGTCGCTTTATAGCGATT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
75 CNAG_03167 CHK1 L1 CNAG_03167 5' flanking region primer 1 GTATCTCCATCCCACACATC
L2 CNAG_03167 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTGACAGAGAGGGGCTTAC
R1 CNAG_03167 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTACATTGGAGGGCGTTG
R2 CNAG_03167 3' flanking region primer 2 CTGACAACAAGCAGCCTATC
SO CNAG_03167 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATACCACCACAAACGCCTC
PO CNAG_03167 Southern blot probe primer GGACTACTTTCCGAAGGTTC
STM NAT#205 STM primer TATCCCCCTCTCCGCTCTCTAGCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
76 CNAG_03171 L1 CNAG_03171 5' flanking region primer 1 CGTCCAACCATCAATCAC
L2 CNAG_03171 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACACCTTGGTAGGAGTGTGGAG
R1 CNAG_03171 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTAGTTGCGATTCTGTGGG
R2 CNAG_03171 3' flanking region primer 2 TAGGGACGAGTATCAGGAGCAG
SO CNAG_03171 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCCTCTGTTCTTGTCGTGG
PO CNAG_03171 Southern blot probe primer TAAGCCTCGTAGAGCCAAG
STM NAT#159 STM primer ACGCACCAGACACACAACCAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
77 CNAG_03184 BUB1 L1 CNAG_03184 5' flanking region primer 1 CAACGCCATTGAGGAAAG
L2 CNAG_03184 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGCCTGATGTTCTCTTTCTGAG
R1 CNAG_03184 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAGCGACTTTGAGGGATGGC
R2 CNAG_03184 3' flanking region primer 2 ATCCCAGAACAGTGGCAGAC
SO CNAG_03184 diagnostic screening primer, pairing with B79 GGAGGATACATCAGGTGAGC
PO CNAG_03184 Southern blot probe primer AACAGCACTTTGGGGTAAC
STM NAT#201 STM primer CACCCTCTATCTCGAGAAAGCTCC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
78 CNAG_03216 SNF101 L1 CNAG_03216 5' flanking region primer 1 GGAGATGAAGGGAATGAGTC
L2 CNAG_03216 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCGACGCAAGAGGATAACAAC
R1 CNAG_03216 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGGCAGGAGATGAGGGATAG
R2 CNAG_03216 3' flanking region primer 2 CTGCTCTTGTTTAGCCACC
SO CNAG_03216 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCCGACTCTGATAACGACTG
PO CNAG_03216 Southern blot probe primer AAAGCCTCCTCTTCCAACC
STM NAT#146 STM primer ACTAGCCCCCCCTCACCACCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
79 CNAG_03258 TPK202A L1 CNAG_03258 5' flanking region primer 1 AGGGACTGAATCCAAAGGG
L2 CNAG_03258 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTCTCGTCTTCGGCAAGGCAAGTG
R1 CNAG_03258 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAGGACAAGGGCTAATGG
R2 CNAG_03258 3' flanking region primer 2 AAGGCTGGACTTTGTTGGGGAC
SO CNAG_03258 diagnostic screening primer, pairing with B79 GATTGCGAAGATGTGAACTC
PO CNAG_03258 Southern blot probe primer TTTCCCTGTTGCCATCTC
STM NAT#208 STM primer TGGTCGCGGGAGATCGTGGTTT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
80 CNAG_03290 KIC102 L1 CNAG_03290 5' flanking region primer 1 CGCTGACTTGGAGTATGTG
L2 CNAG_03290 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAAGTCTGCGGAAAGGTTC
R1 CNAG_03290 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTCACCTCTGCTTTTGTCTTG
R2 CNAG_03290 3' flanking region primer 2 CCGACAAGGATGAAACAAAGATGG
SO CNAG_03290 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGGATGTCTTAGAAGGGAGC
PO CNAG_03290 Southern blot probe primer GGAAGACAAGAACAAACGG
STM NAT#201 STM primer CACCCTCTATCTCGAGAAAGCTCC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
81 CNAG_03355 TCO4 L1 CNAG_03355 5' flanking region primer 1 AATGCCATAGGACACCTCTGACCC
L2 CNAG_03355 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACTGTGACTATGGTAAGCACCG
R1 CNAG_03355 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGAATGCCATAGGACACCTCTGACCC
R2 CNAG_03355 3' flanking region primer 2 TGTGACTATGGTAAGCACCG
SO CNAG_03355 diagnostic screening primer, pairing with B79 GTTGCTTGGTTTTTCTTCGG
PO1 CNAG_03355 Southern blot probe primer 1 AAACGGCAGCATTGACTAC
PO2 CNAG_03355 Southern blot probe primer 2 TATGTAAGCAGCCTGTTCG
STM NAT#123 STM primer CTATCGACCAACCAACACAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
82 CNAG_03358 L1 CNAG_03358 5' flanking region primer 1 GCAGAATCGTGAAACATTACCC
L2 CNAG_03358 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTCATTGAGGAGGTAGGGAGG
R1 CNAG_03358 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGAAAGGTGTCGGGGATAG
R2 CNAG_03358 3' flanking region primer 2 ACGGAGAAGCAGGAACATC
SO CNAG_03358 diagnostic screening primer, pairing with B79 CAGACAATCGCAGAGTGAG
PO CNAG_03358 Southern blot probe primer CTCTCGGAACTTCTTGACG
STM NAT#230 STM primer ATGTAGGTAGGGTGATAGGT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
83 CNAG_03367 URK1 L1 CNAG_03367 5' flanking region primer 1 ACCCTTCTTTTTGGTCCC
L2 CNAG_03367 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTGGTTTTTGCTCTGCGGC
R1 CNAG_03367 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGTTTGCTGTTGGATTCGC
R2 CNAG_03367 3' flanking region primer 2 ATTTCCCCGCATTTGCCAC
SO CNAG_03367 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCGCACATTCTTGTCAGAG
PO CNAG_03367 Southern blot probe primer GATGATGGAAAGAGTAGACCG
STM NAT#43 STM primer CCAGCTACCAATCACGCTAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
84 CNAG_03369 SWE102 L1 CNAG_03369 5' flanking region primer 1 TGCTACGCTAAGACTGGACTAC
L2 CNAG_03369 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGAGCGTGGTTGAAAGAAC
R1 CNAG_03369 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGACGAACTTGTGCTCTCTGC
R2 CNAG_03369 3' flanking region primer 2 ACAGTTTCCTGACGAGAATG
SO CNAG_03369 diagnostic screening primer, pairing with B79 GCCGATACATTTTGGGTAG
PO CNAG_03369 Southern blot probe primer TGGATGGTGAGGAGTTGAG
STM NAT#169 STM primer ACATCTATATCACTATCCCGAACC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
85 CNAG_03567 CBK1 L1 CNAG_03567 5' flanking region primer 1 CAACCGATTTGCCAAGAG
L2 CNAG_03567 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTGTTGTCCCTGGATTGG
R1 CNAG_03567 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTAAGGAGTGCGATGGATG
R2 CNAG_03567 3' flanking region primer 2 CGTTTTTCATCCTGCGAG
SO CNAG_03567 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCATTCCCACCATTCACG
PO CNAG_03567 Southern blot probe primer TCTGACTTCACCGAATGC
STM NAT#232 STM primer CTTTAAAGGTGGTTTGTG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
86 CNAG_03592 THI20 L1 CNAG_03592 5' flanking region primer 1 TTGTGAGCAGGTTTCCGTG
L2 CNAG_03592 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTACCTGAATACCAGCACCACCG
R1 CNAG_03592 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGATAGTGGCAGGACCTTGC
R2 CNAG_03592 3' flanking region primer 2 TTACATCGCCGCTGTTTCC
SO CNAG_03592 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGTCTCTGGTGTCTGGTTG
PO CNAG_03592 Southern blot probe primer GAAAGCAGTAGCGATAGCAG
STM NAT#231 STM primer GAGAGATCCCAACATCACGC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
87 CNAG_03670 IRE1 L1 CNAG_03670 5' flanking region primer 1 GCCCCATCATCATAATCAC
L2 CNAG_03670 5' flanking region primer 2 GCTCACTGGCCGTCGTTTTACACTATGTGTCCATCTGAGGC
R1 CNAG_03670 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGTGAGTTGAGGGAGGAAAG
R2 CNAG_03670 3' flanking region primer 2 GAAGAAGAGCGTCAAGAAGG
SO CNAG_03670 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGGAATACGAGGTTTATCGG
PO CNAG_03670 Southern blot probe primer AGCATTAGGGGTGTAGGTG
STM NAT#224 STM primer AACCTTTAAATGGGTAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
88 CNAG_03701 L1 CNAG_03701 5' flanking region primer 1 AGCGTATTCTTCAGGGCTC
L2 CNAG_03701 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAAGAAGGGAGAGTGGTTGTGACGG
R1 CNAG_03701 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGAAGTGTTTTCCCGTCCC
R2 CNAG_03701 3' flanking region primer 2 TAAAGGAGTGTTGGACCCC
SO CNAG_03701 diagnostic screening primer, pairing with B79 ACAAACCTCACTGTGCCTC
PO CNAG_03701 Southern blot probe primer CAATACCGACTGAGACACACTC
STM NAT#125 STM primer CGCTACAGCCAGCGCGCGCAAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
89 CNAG_03791 L1 CNAG_03791 5' flanking region primer 1 GAAGCATCCTCAAAAGGG
L2 CNAG_03791 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGGCTGGAGATTTGAAAGAG
R1 CNAG_03791 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTTTTGGAAGTAAACGGGG
R2 CNAG_03791 3' flanking region primer 2 GCAACTCGTCAAAGACCTG
SO CNAG_03791 diagnostic screening primer, pairing with B79 CGACTTCTTCAGCAATGG
PO CNAG_03791 Southern blot probe primer TATTCCAGTCCGAGTAGCG
STM NAT#210 STM primer CTAGAGCCCGCCACAACGCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
90 CNAG_03796 L1 CNAG_03796 5' flanking region primer 1 AGGTCGGAAGATTTTGCG
L2 CNAG_03796 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTAGGGTCGTTTGTGTTATCC
R1 CNAG_03796 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTTTTGGCTTTGGGTCAG
R2 CNAG_03796 3' flanking region primer 2 TGAGCAGTAGTGTATTGGGTG
SO CNAG_03796 diagnostic screening primer, pairing with B79 AATCTCCTCTTGGGCTCAG
PO CNAG_03796 Southern blot probe primer ATACCACAGCACCCACAAG
STM NAT#240 STM primer GGTGTTGGATCGGGGTGGAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
91 CNAG_03811 IRK5 L1 CNAG_03811 5' flanking region primer 1 TCTTTAGCGTTTGACCCTG
L2 CNAG_03811 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTCCAACACTCCGTAGCAG
R1 CNAG_03811 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTGATGGAAGATGTTGAAGC
R2 CNAG_03811 3' flanking region primer 2 GTCGCATCTTTTTGCTGG
SO CNAG_03811 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCACAATCATTCTGACCAGG
PO CNAG_03811 Southern blot probe primer CCGCAAAGGTAAAGTTCG
STM NAT#213 STM primer CTGGGGATTTTGATGTGTCTATGT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
92 CNAG_03821 L1 CNAG_03821 5' flanking region primer 1 GGGTCATTTTCACCGAATC
L2 CNAG_03821 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTTTGTGTGCCGTTCTAAAC
R1 CNAG_03821 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCCAGATGGTCATTTCTTC
R2 CNAG_03821 3' flanking region primer 2 GGAAATAGAAACAGCGGTG
SO CNAG_03821 diagnostic screening primer, pairing with B79 ACCAGGTCTTCCTCCATTG
PO CNAG_03821 Southern blot probe primer TGAGAGATTCTTGTTCCGAG
STM NAT#177 STM primer CACCAACTCCCCATCTCCAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
93 CNAG_03843 ARK1 L1 CNAG_03843 5' flanking region primer 1 CAATAGGCGTGAACAAGC
L2 CNAG_03843 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGGATACTGGTGTTTTTGG
R1 CNAG_03843 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGGTCAACAATGCGTCAG
R2 CNAG_03843 3' flanking region primer 2 GAAAGGAAGGAGCGAAAG
SO CNAG_03843 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATAGAGCGGGAGGAAATG
PO CNAG_03843 Southern blot probe primer TGGGTGGGAGTGATTTCTG
STM NAT#43 STM primer CCAGCTACCAATCACGCTAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
94 CNAG_03946 GAL302 L1 CNAG_03946 5' flanking region primer 1 AAAACTCACATCCGCTGC
L2 CNAG_03946 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGCAGAGAGTTGAAGACGGTG
R1 CNAG_03946 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCTGGAGGTGAGTTCTGTAATC
R2 CNAG_03946 3' flanking region primer 2 CCCTATTCCTTTCCTTGTTC
SO CNAG_03946 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGACCAATGTAGACCCTATGTG
PO CNAG_03946 Southern blot probe primer ACAAGCACATCCATTCCTAC
STM NAT#218 STM primer CTCCACATCCATCGCTCCAA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
95 CNAG_04040 FPK1 L1 CNAG_04040 5' flanking region primer 1 ATCGTCTCAGCCTCAACAG
L2 CNAG_04040 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTCTTCCACTTTGACGGTG
R1 CNAG_04040 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTCCGTTTGGGGAGTTTAG
R2 CNAG_04040 3' flanking region primer 2 GGCTATCTTCTTGGCTTGC
SO CNAG_04040 diagnostic screening primer, pairing with B79 CCTTTGGGTTTTTGGGAC
PO CNAG_04040 Southern blot probe primer ATTAGTCTGCCCAAACGG
STM NAT#211 STM primer GCGGTCGCTTTATAGCGATT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
OEL2 CNAG_04040 5' flaking region for overexpression construction CACTCGAATCCTGCATGCGGGATGTTTGTGTGACTGAG
OER1 CNAG_04040 5' coding region for overexpression construction CCACAACACATCTATCACATGTCGTCTCTCGCGTCACC
NP1 CNAG_04040 Northern blot probe primer TTCAAACTCGGGAGGACAG
96 CNAG_04083 L1 CNAG_04083 5' flanking region primer 1 TTCCTCCATCTTCGCATC
L2 CNAG_04083 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTCGTGCCCTTTTTGGTAG
R1 CNAG_04083 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAAGAAAGAACACCCCTCC
R2 CNAG_04083 3' flanking region primer 2 AACAGGTTGCGATTGTGC
SO CNAG_04083 diagnostic screening primer, pairing with B79 GCCGTTATGGGTGAAAGAG
PO CNAG_04083 Southern blot probe primer GAAAGGGAGAAGAGTGAAGG
STM NAT#210 STM primer CTAGAGCCCGCCACAACGCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
97 CNAG_04108 PKP2 L1 CNAG_04108 5' flanking region primer 1 AAAAGAGGAGGGAGAAGGG
L2 CNAG_04108 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGAAGTATCCACACACCCC
R1 CNAG_04108 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGTCTTTGAGTTAGGTGCTG
R2 CNAG_04108 3' flanking region primer 2 TGATTGGGGAAGCGTTAG
SO CNAG_04108 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGTCGGTTTTGTGGTTCC
PO CNAG_04108 Southern blot probe primer TTAGCCTCTTGCCAACTCC
STM NAT#295 STM primer ACACCTACATCAAACCCTCCC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
98 CNAG_04118 L1 CNAG_04118 5' flanking region primer 1 TCAGCGAGATGATAGGTCG
L2 CNAG_04118 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCCGCTATCTCTATCTCTGTCC
R1 CNAG_04118 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGACAAGATAAAGATTGGCGG
R2 CNAG_04118 3' flanking region primer 2 CGCCATCTCCTTTCTATCG
SO CNAG_04118 diagnostic screening primer, pairing with B79 CAAAAGAGAATCCTGGAGACC
PO CNAG_04118 Southern blot probe primer GGAGAATGAGTCAAATGCTG
STM NAT#212 STM primer AGAGCGATCGCGTTATAGAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
99 CNAG_04148 L1 CNAG_04148 5' flanking region primer 1 GAAGCCCTTGGTATTTTCC
L2 CNAG_04148 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCCTCGTAGCCCAAGAAATG
R1 CNAG_04148 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTCGTATTGGGTGAATGGC
R2 CNAG_04148 3' flanking region primer 2 TGCTGATACCCTGTTTCG
SO CNAG_04148 diagnostic screening primer, pairing with B79 CGATGATAGGTCCGAAATC
PO CNAG_04148 Southern blot probe primer AGACCAAACATCCCAAGC
STM NAT#224 STM primer AACCTTTAAATGGGTAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
100 CNAG_04156 L1 CNAG_04156 5' flanking region primer 1 TTCTCCTCCTTCTTTATGCC
L2 CNAG_04156 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGACAAGAGGGTTTACCTGC
R1 CNAG_04156 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGATTACTGAGGCTGCGTTCC
R2 CNAG_04156 3' flanking region primer 2 GCGGATAGAAGCACTGAAAC
SO CNAG_04156 diagnostic screening primer, pairing with B79 GTCCATCGGTAACAAGTCC
PO CNAG_04156 Southern blot probe primer GTGGTAAGCACGGCTAATC
STM NAT#177 STM primer CACCAACTCCCCATCTCCAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
101 CNAG_04162 PKA2 L1 CNAG_04162 5' flanking region primer 1 AATAACACACCAGCCGCTCTGACC
L2 CNAG_04162 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACTGATGGTGATGGATGTGC
R1 CNAG_04162 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGCGGCAGTAGAGATAGCACAG
R2 CNAG_04162 3' flanking region primer 2 GGAGTGGTGGAGAATGTTC
SO CNAG_04162 diagnostic screening primer, pairing with B79 TACCTGCTGCTATGACCCTACG
PO CNAG_04162 Southern blot probe primer CCACTTGCTTCAACCTCAC
STM NAT#205 STM primer TATCCCCCTCTCCGCTCTCTAGCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
102 CNAG_04191 L1 CNAG_04191 5' flanking region primer 1 CAAGTGGTGTCGCATTTC
L2 CNAG_04191 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCGCAACCTGTTTAGTCAGAC
R1 CNAG_04191 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCAAAAGAAGAGCAAGGC
R2 CNAG_04191 3' flanking region primer 2 GGGCTAAGAAGTTTGATGTTCC
SO CNAG_04191 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATGAGGGTTTTCAGCACC
PO CNAG_04191 Southern blot probe primer GGGAAGGAGTGACAAAGATAG
STM NAT#159 STM primer ACGCACCAGACACACAACCAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
103 CNAG_04197 YAK1 L1 CNAG_04197 5' flanking region primer 1 GTGTGTCATTGGGTTTTGC
L2 CNAG_04197 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAATGAATCTGCGGGAGTC
R1 CNAG_04197 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGAAGTTGACTCGGCATCG
R2 CNAG_04197 3' flanking region primer 2 GCTTCGTCATCAAACAGTTC
SO CNAG_04197 diagnostic screening primer, pairing with GGTGATTTTTCATCGCCC
PO CNAG_04197 Southern blot probe primer CAGCAGATGGCTCCTCTATC
STM NAT#184 STM primer ATATATGGCTCGAGCTAGATAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
104 CNAG_04215 MET3 L1 CNAG_04215 5' flanking region primer 1 CTCACAAATGAAAGCAGCAG
L2 CNAG_04215 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGAGAAGAGAATCGTGAAGAGC
R1 CNAG_04215 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCTTGTAGCGTTGTAGATGG
R2 CNAG_04215 3' flanking region primer 2 GCGTTGTTTATTCACAGGAG
SO CNAG_04215 diagnostic screening primer, pairing with B79 CTGTTCTTTGTGTCTTTGCG
PO CNAG_04215 Southern blot probe primer TCTTTCGGATAACGGCGTG
STM NAT#205 STM primer TATCCCCCTCTCCGCTCTCTAGCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
105 CNAG_04221 FBP26 L1 CNAG_04221 5' flanking region primer 1 TGGAGGTCAGTAATCGGTCG
L2 CNAG_04221 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGATTGGATGGATGTGAAC
R1 CNAG_04221 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTCCGATGTATGCTCTGGTC
R2 CNAG_04221 3' flanking region primer 2 TGTTTCTCCCCTTGTCACC
SO CNAG_04221 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGGAAATGAGTTCTCTTGGG
PO CNAG_04221 Southern blot probe primer TCCTAAAATCCCGCTCTGC
STM NAT#146 STM primer ACTAGCCCCCCCTCACCACCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
106 CNAG_04230 THI6 L1 CNAG_04230 5' flanking region primer 1 TCATCACCAGTAACGAAAGG
L2 CNAG_04230 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGGCTCAACAAAACCGAG
R1 CNAG_04230 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAGACTCGGACCCATTCAG
R2 CNAG_04230 3' flanking region primer 2 TGGTGAGTCTTTGCGAAG
SO CNAG_04230 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGACCCGAGGTAGAGAATC
PO CNAG_04230 Southern blot probe primer ATCAAGAATCTCGCCCAC
STM NAT#290 STM primer ACCGACAGCTCGAACAAGCAAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
107 CNAG_04272 L1 CNAG_04272 5' flanking region primer 1 GCCTGAAAAGAAGGAAACC
L2 CNAG_04272 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCCTTCCTAATGTCTTTCCAGTC
R1 CNAG_04272 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAGGAAGTGGAAGCGTTC
R2 CNAG_04272 3' flanking region primer 2 TCGTCTTCGCCAAACTCTGC
SO CNAG_04272 diagnostic screening primer, pairing with B79 GAACGCCGAAACAAAACC
PO CNAG_04272 Southern blot probe primer CTTGGGAGGAAAATCAGC
STM NAT#212 STM primer AGAGCGATCGCGTTATAGAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
108 CNAG_04282 MPK2 L1 CNAG_04282 5' flanking region primer 1 ATGGCAGCAAGCGTAACTC
L2 CNAG_04282 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGTTTTATGCCCGTTGTGTTG
R1 CNAG_04282 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCCAAAGTCAGTCTGGTAACC
R2 CNAG_04282 3' flanking region primer 2 ATACATCTTCGTAGCCCCG
SO CNAG_04282 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCCAAATAGACCAAGCCC
PO CNAG_04282 Southern blot probe primer CGTTGAGTGTTTGGTAGCC
STM NAT#102 STM primer CCATAGCGATATCTACCCCAATCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
109 CNAG_04314 L1 CNAG_04314 5' flanking region primer 1 CCATTCGTAGCCCTTATCTG
L2 CNAG_04314 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACACGGAGTCTGGTTTTCAGG
R1 CNAG_04314 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTTGATGGAAGGAGTCGC
R2 CNAG_04314 3' flanking region primer 2 AAGAGGGCATCACTAAGGC
SO CNAG_04314 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATTGGACTGGACCATAGCC
PO CNAG_04314 Southern blot probe primer GATAAAGACAGAACTCAGCACC
STM NAT#231 STM primer GAGAGATCCCAACATCACGC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
110 CNAG_04316 UTR1 L1 CNAG_04316 5' flanking region primer 1 GGTGATTGCCTGTTGTTG
L2 CNAG_04316 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGACGAAGGAGGAGGAGTAG
R1 CNAG_04316 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCAGTGGTTCAGAGGAATAAG
R2 CNAG_04316 3' flanking region primer 2 ACTTGCCCATACTGGAGGTC
SO CNAG_04316 diagnostic screening primer, pairing with B79 CAGGATGTAGTGGAGACTGC
PO CNAG_04316 Southern blot probe primer CCAGTAACCCATCACCTATTAG
STM NAT#5 STM primer TGCTAGAGGGCGGGAGAGTT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
111 CNAG_04335 L1 CNAG_04335 5' flanking region primer 1 CGATAGAGTAGTAGTTTTAGGGGG
L2 CNAG_04335 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTTACGAGTCCATCTTCGC
R1 CNAG_04335 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAACCGATTCCAGTTACAGC
R2 CNAG_04335 3' flanking region primer 2 AGATGGACGAGGTGGTGATG
SO CNAG_04335 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGATGTGCTACTGGAAGCC
PO CNAG_04335 Southern blot probe primer TCATCAATGTCAGGCTGGG
STM NAT#146 STM primer ACTAGCCCCCCCTCACCACCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
112 CNAG_04347 L1 CNAG_04347 5' flanking region primer 1 GAGTTTGAGCGGTCATTG
L2 CNAG_04347 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGGTCCTCAAGGTATGGAGC
R1 CNAG_04347 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCCCTCAATGTTATCCACG
R2 CNAG_04347 3' flanking region primer 2 GTAGCGAGAGCGATTCATC
SO CNAG_04347 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCCAGGGAACAGTGAGTAAC
PO CNAG_04347 Southern blot probe primer TTCAATGATGCCCGAGCAG
STM NAT#210 STM primer CTAGAGCCCGCCACAACGCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
113 CNAG_04408 CKI1 L1 CNAG_04408 5' flanking region primer 1 CGTCATTTCTGGGATAGACTG
L2 CNAG_04408 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTCCTTCTATGCCTGGGTAGC
R1 CNAG_04408 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAACGCAAGGATGTCCCAGCAG
R2 CNAG_04408 3' flanking region primer 2 TGCTTGTAGGCAATGGCTGG
SO CNAG_04408 diagnostic screening primer, pairing with B79 GATTTCATCCGCCTGTTG
PO CNAG_04408 Southern blot probe primer ATCTTCCGCTGCTTCAGAC
STM NAT#218 STM primer CTCCACATCCATCGCTCCAA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
114 CNAG_04433 YAK103 L1 CNAG_04433 5' flanking region primer 1 AGCCTGTGAGTTGTGCGTTG
L2 CNAG_04433 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGTTTTCCTGCTATCACGC
R1 CNAG_04433 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGACCTCAAAACTCAGCATTG
R2 CNAG_04433 3' flanking region primer 2 AAGAAACCTCTCCATTCCC
SO CNAG_04433 diagnostic screening primer, pairing with B79 AATACCTTGTTGGCGAGAC
PO CNAG_04433 Southern blot probe primer CATCAGGAGGTTTACCACC
STM NAT#231 STM primer GAGAGATCCCAACATCACGC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
115 CNAG_04514 MPK1 L1 CNAG_04514 5' flanking region primer 1 TTTGCTTGCTCCTCTTCTC
L2 CNAG_04514 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGAGAAGTAGAGGCAGTGACG
R1 CNAG_04514 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTGGAGAAACAGTTGGAGAG
R2 CNAG_04514 3' flanking region primer 2 TTCAGCAGGTCAATCAGG
SO CNAG_04514 diagnostic screening primer, pairing with B79 CGACTCACGATGTAACTTCC
PO CNAG_04514 Southern blot probe primer ACCTCAACTCTCTCAGACACC
STM NAT#240 STM primer GGTGTTGGATCGGGGTGGAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
116 CNAG_04577 L1 CNAG_04577 5' flanking region primer 1 AGGTTTGAGCCATCTGAAC
L2 CNAG_04577 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAAAGGGCATAACCAGTGAC
R1 CNAG_04577 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGTTGGAGTATGGGAGATGC
R2 CNAG_04577 3' flanking region primer 2 GTCTTTTCTTTCCCACTTGG
SO CNAG_04577 diagnostic screening primer, pairing with B79 GAGATGGGTAATGGTGATGAG
PO CNAG_04577 Southern blot probe primer GCTTGTAACCACGCTCTATC
STM NAT#282 STM primer TCTCTATAGCAAAACCAATC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
117 CNAG_04631 RIK1 L1 CNAG_04631 5' flanking region primer 1 TCATCAGTTTCGTCCAGC
L2 CNAG_04631 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACATAACGGGATTGGGGTTG
R1 CNAG_04631 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTGCTGATGAGGTCAAGG
R2 CNAG_04631 3' flanking region primer 2 ATCTCACTGCCCTATTCCC
SO CNAG_04631 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTCCACTCCTTCTCCCTCTG
PO CNAG_04631 Southern blot probe primer CAGGAAGGCTAAAACCACAG
STM NAT#150 STM primer ACATACACCCCCATCCCCCC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
118 CNAG_04678 YPK1 L1 CNAG_04678 5' flanking region primer 1 CGACTATGGGTTCGTTACTGG
L2 CNAG_04678 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGTCTATGCGTTTTCCGAC
R1 CNAG_04678 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGGTGTAGAATGGCAGAGC
R2 CNAG_04678 3' flanking region primer 2 GCACCGTGGAGGTAGTAATG
SO CNAG_04678 diagnostic screening primer, pairing with B79 TACCCATCATTCCCTGCTC
PO CNAG_04678 Southern blot probe primer ACACCGTATCAGCACAAGC
STM NAT#58 STM primer CGCAAAATCACTAGCCCTATAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
119 CNAG_04755 BCK1 L1 CNAG_04755 5' flanking region primer 1 GCTGTTGGTTCTCTCTTGC
L2 CNAG_04755 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACGGTTTGCGATGAATAGTCC
R1 CNAG_04755 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGTTCCGAACGCTCATACTCC
R2 CNAG_04755 3' flanking region primer 2 TTCCTTCGTTTGTCCGTCG
SO CNAG_04755 diagnostic screening primer, pairing with B79 CAGGCTTTTTTTCTGGCTAC
PO1 CNAG_04755 Southern blot probe primer 1 TACCTCCTTCATTCCTGCCGTC
PO2 CNAG_04755 Southern blot probe primer 2 GCTTCGTTATCAGTCGTCAC
STM NAT#43 STM primer CCAGCTACCAATCACGCTAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
120 CNAG_04821 PAN3 L1 CNAG_04821 5' flanking region primer 1 CTCTTACAGACGGTTCTTTAGG
L2 CNAG_04821 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTCTCCTTTGCCTTCTCCGAG
R1 CNAG_04821 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGAATGCGGGCAATAACC
R2 CNAG_04821 3' flanking region primer 2 GCCAAAAAGCAAAAAGTGGAGC
SO CNAG_04821 diagnostic screening primer, pairing with B79 GCAGGAAGAACAAGGTGTC
PO CNAG_04821 Southern blot probe primer GGAACGAGAGAGTGATACACG
STM NAT#204 STM primer GATCTCTCGCGCTTGGGGGA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
121 CNAG_04843 L1 CNAG_04843 5' flanking region primer 1 CAATCAAACAAGCGACCTC
L2 CNAG_04843 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGAAGATTTCTCAACAAGCGG
R1 CNAG_04843 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGACAGCATAGAGAGGGTGTG
R2 CNAG_04843 3' flanking region primer 2 TCCTCCACCATTTCAGACG
SO CNAG_04843 diagnostic screening primer, pairing with B79 GGGGAGCAAACTCTTGAAC
PO CNAG_04843 Southern blot probe primer CATCTCATCCGTTCTCTGC
STM NAT#116 STM primer GCACCCAAGAGCTCCATCTC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
122 CNAG_04927 YFH702 L1 CNAG_04927 5' flanking region primer 1 GGCATAACTTTCAACGGC
L2 CNAG_04927 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGTCTCCACGACATCTTCTG
R1 CNAG_04927 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTATGCCAGTGGTCAGGTTC
R2 CNAG_04927 3' flanking region primer 2 TCGTATTTGACTTCCCTGG
SO CNAG_04927 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGTTTTGAGAGTCCTTCGG
PO CNAG_04927 Southern blot probe primer TGTCTTTGTGCGTTATGGG
STM NAT#220 STM primer CAGATCTCGAACGATACCCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
123 CNAG_05005 ATG1 L1 CNAG_05005 5' flanking region primer 1 CGCAGAACAGTCCTACACAAC
L2 CNAG_05005 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTCCTTGCGAGTTTGAGTC
R1 CNAG_05005 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCCTGAGAAAAAAGTTGGC
R2 CNAG_05005 3' flanking region primer 2 CGGGAGGAAAACTTGTTC
SO CNAG_05005 diagnostic screening primer, pairing with B79 GATTCACACAAGAGAGCGG
PO CNAG_05005 Southern blot probe primer TTCCCCTCCTCATTTGTC
STM NAT#288 STM primer CTATCCAACTAGACCTCTAGCTAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
124 CNAG_05063 SSK2 L1 CNAG_05063 5' flanking region primer 1 CCTATCTTATTTTTGCGGGG
L2 CNAG_05063 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACTCCTCTTTGTGCCGTATTC
R1 CNAG_05063 5' flanking region primer 2 GTCATAGCTGTTTCCTGATGTTGGAGCAGATGGTG
R2 CNAG_05063 3' flanking region primer 2 CGACTCGTCAACCAAGTTAC
SO CNAG_5063 diagnostic screening primer, pairing with B79 CTAAGGATAGGATGTGGAAGG
PO1 CNAG_05063 Southern blot probe primer 1 AAGGACGACGAGAGTGAGTAG
PO2 CNAG_05063 Southern blot probe primer 2 TCCAAACGAACCTTGACAG
STM NAT#210 STM primer CTAGAGCCCGCCACAACGCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
125 CNAG_05097 CKY1 L1 CNAG_05097 5' flanking region primer 1 TGTTCTTCCTTGATGCTCTC
L2 CNAG_05097 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGCAGATACGGAGAAGTCAGAC
R1 CNAG_05097 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGAACATCCCTGTCCTTGC
R2 CNAG_05097 3' flanking region primer 2 ATTATGGGAGAGGCGATG
SO CNAG_05097 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATCTTTGTCGGTGTCAGCC
PO CNAG_05097 Southern blot probe primer AGTCCATCACTACCTTCGG
STM NAT#282 STM primer TCTCTATAGCAAAACCAATC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
126 CNAG_05104 L1 CNAG_05104 5' flanking region primer 1 GCTTTTTGACGAGACAACTG
L2 CNAG_05104 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGATAAAACCCGAGGACATTC
R1 CNAG_05104 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGTTGCTTCCGTATCTGTTG
R2 CNAG_05104 3' flanking region primer 2 AGCAAGTGAAAGAAGGGC
SO CNAG_05104 diagnostic screening primer, pairing with B79 TATCAGGGCTTGGGTGTAG
PO CNAG_05104 Southern blot probe primer TCTGATAGGGAGCCATACG
STM NAT#208 STM primer TGGTCGCGGGAGATCGTGGTTT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
127 CNAG_05125 L1 CNAG_05125 5' flanking region primer 1 TGGTTTTGGCTGCTTCTG
L2 CNAG_05125 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGTGAGCAGGTGTTAGAGTGC
R1 CNAG_05125 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGAGGACAGTTTATTGGGGG
R2 CNAG_05125 3' flanking region primer 2 CACCCAGTAAATACCATCCTG
SO CNAG_05125 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGGTTCAAGCGTGATGTG
PO CNAG_05125 Southern blot probe primer CGCTGACAACACAGATAAGAG
STM NAT#219 STM primer CCCTAAAACCCTACAGCAAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
128 CNAG_05200 L1 CNAG_05200 5' flanking region primer 1 TCCGACAACGAGATTGAAC
L2 CNAG_05200 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTCTCCATCTTGACACATTCC
R1 CNAG_05200 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTTTACACCTTACCTCCCAC
R2 CNAG_05200 3' flanking region primer 2 GGAATGGGCAAATGCTAC
SO CNAG_05200 diagnostic screening primer, pairing with B79 TATCCCCACCAAGAAGTCC
PO CNAG_05200 Southern blot probe primer ACAGACCCGTTCCAATGTC
STM NAT#224 STM primer AACCTTTAAATGGGTAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
129 CNAG_05216 RAD53 L1 CNAG_05216 5' flanking region primer 1 CCTTGGCTGACACTTTACC
L2 CNAG_05216 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTGTGTGTTTTGGGTTTGG
R1 CNAG_05216 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTCCATTATGAAGGAGTCGG
R2 CNAG_05216 3' flanking region primer 2 GTAGACCCTCTTCTTCCTCG
SO CNAG_05216 diagnostic screening primer, pairing with B79 TAGGAGCGATTGCTGAAG
PO CNAG_05216 Southern blot probe primer ACCAATCAATCAGCCGAC
STM NAT#184 STM primer ATATATGGCTCGAGCTAGATAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
130 CNAG_05220 TLK1 L1 CNAG_05220 5' flanking region primer 1 ATCGCTTCTCGTTTGACC
L2 CNAG_05220 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACATCAACGACCATCTGGGAC
R1 CNAG_05220 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGGCTACTGCTGTGTATTGC
R2 CNAG_05220 3' flanking region primer 2 GCGGTAAAGGTGGAAAGTC
SO CNAG_05220 diagnostic screening primer, pairing with B79 CTTTGAAACCGACCATAGG
PO CNAG_05220 Southern blot probe primer GGACCGAGACACTACTCACAAC
STM NAT#116 STM primer GCACCCAAGAGCTCCATCTC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
131 CNAG_05243 XKS1 L1 CNAG_05243 5' flanking region primer 1 GCACGAATAAATGCCTGC
L2 CNAG_05243 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTGAGCAAAGGACTTACCTG
R1 CNAG_05243 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGGATTGGAATGCCTGTAG
R2 CNAG_05243 3' flanking region primer 2 GGAGAGTGTTGGAATACGGTAG
SO CNAG_05243 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGCCGAAGCCATTTTGAG
PO CNAG_05243 Southern blot probe primer CATCATCACCAGCGATTG
STM NAT#125 STM primer CGCTACAGCCAGCGCGCGCAAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
132 CNAG_05274 L1 CNAG_05274 5' flanking region primer 1 ATGCTGTTTTGTGGGGGTAGGC
L2 CNAG_05274 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGCTTCTCCGTTTGTTTCG
R1 CNAG_05274 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTATCACAGGGCTTGACGGACTGAG
R2 CNAG_05274 3' flanking region primer 2 CACTTTTCTTTCTGTCCTCCC
SO CNAG_05274 diagnostic screening primer, pairing with B79 CAACAACGCCAAGAAAGC
PO CNAG_05274 Southern blot probe primer TTGGCGGAACGGATGAATCG
STM NAT#58 STM primer CGCAAAATCACTAGCCCTATAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
133 CNAG_05386 L1 CNAG_05386 5' flanking region primer 1 TTGCGGAATAAGAAGGGG
L2 CNAG_05386 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGTGCTTTATGTGGATTTGGG
R1 CNAG_05386 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCAATCCAAATGAGTGACG
R2 CNAG_05386 3' flanking region primer 2 ACAGGAAGAACAGCAGGAG
SO CNAG_05386 diagnostic screening primer, pairing with B79 GCTATGGGAGTTTTTCCG
PO CNAG_05386 Southern blot probe primer GCAAATGGGCGTTATTCC
STM NAT#177 STM primer CACCAACTCCCCATCTCCAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
134 CNAG_05439 CMK1 L1 CNAG_05439 5' flanking region primer 1 GGATTGTTAGGTAGGTAGGGG
L2 CNAG_05439 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAAGAAGGCGGCTGGATAAG
R1 CNAG_05439 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGAAGCCCACAATCAAAGTC
R2 CNAG_05439 3' flanking region primer 2 GTGTCATCGTAGGGGTTTC
SO CNAG_05439 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATTGCCTATCTGCCTGTGC
PO CNAG_05439 Southern blot probe primer TCAATGAAACGGGGTGTG
STM NAT#227 STM primer TCGTGGTTTAGAGGGAGCGC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
135 CNAG_05484 L1 CNAG_05484 5' flanking region primer 1 CCAACACCGCCTATTTATC
L2 CNAG_05484 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGTGAGTGCCGAGAAAAATG
R1 CNAG_05484 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCTGTGTTGTATGGGACGAG
R2 CNAG_05484 3' flanking region primer 2 TCTCACTCATCTCAAAACGC
SO CNAG_05484 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGCTGTTTTAGCCCTTGC
PO CNAG_05484 Southern blot probe primer AGAGATTGGTGATGGAGCC
STM NAT#205 STM primer TATCCCCCTCTCCGCTCTCTAGCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
136 CNAG_05549 L1 CNAG_05549 5' flanking region primer 1 GGAAGCAGAGGAAGTCTTTAG
L2 CNAG_05549 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGGGTTTTTCCAGACAGC
R1 CNAG_05549 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAGAGACCTCCTTCCGACAG
R2 CNAG_05549 3' flanking region primer 2 GATTCGTCCACAACAAAGAC
SO CNAG_05549 diagnostic screening primer, pairing with B79 GACGGCATCAAGGAAAATG
PO CNAG_05549 Southern blot probe primer GAGGTGGTGATGTAGAAATAGG
STM NAT#230 STM primer ATGTAGGTAGGGTGATAGGT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
137 CNAG_05558 KIN4 L1 CNAG_05558 5' flanking region primer 1 ATTCAATGGAGCGGGAGTG
L2 CNAG_05558 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCGAATAAGAATGATGGTGAGCG
R1 CNAG_05558 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGATTGAGTAAGTTCCGCCCC
R2 CNAG_05558 3' flanking region primer 2 AAGGCTGAGGACTGCTACTAC
SO CNAG_05558 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATTCTGGTATGAAGCCTCGCAGCC
PO CNAG_05558 Southern blot probe primer TTCCAACTTCAGGTCACG
STM NAT#225 STM primer CCATAGAACTAGCTAAAGCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
138 CNAG_05590 TCO2 L1 CNAG_05590 5' flanking region primer 1 CAAAACTGGAAGAAGCGAAG
L2 CNAG_05590 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACTTGCCAGATGAAGAGTCACGCC
R1 CNAG_05590 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGTCCCATCCTCTGTGATTCCC
R2 CNAG_05590 3' flanking region primer 2 ATTGTGGAGTGGTGGAGTGGAC
SO CNAG_05590 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGAGGAGGAAAGTTTTAGCG
PO1 CNAG_05590 Southern blot probe primer 1 GTTACCGATTCTGGACCTG
PO2 CNAG_05590 Southern blot probe primer 2 TGCTTCACCCTTTCAGTCTC
STM NAT#116 STM primer GCACCCAAGAGCTCCATCTC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
139 CNAG_05600 IGI1 L1 CNAG_05600 5' flanking region primer 1 TTCTTCTCCTCTATCCCCG
L2 CNAG_05600 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGATGATAGCGATGGTAGCC
R1 CNAG_05600 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGAAGAAGTTTGGGTTCG
R2 CNAG_05600 3' flanking region primer 2 TGGGGAAGAACCAGAAGTAG
SO CNAG_05600 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCCCTGTAAGATTCGCCAG
PO CNAG_05600 Southern blot probe primer TTCTCCATAGGTAGCCACG
STM NAT#230 STM primer ATGTAGGTAGGGTGATAGGT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
140 CNAG_05694 CKA1 L1 CNAG_05694 5' flanking region primer 1 TGTCAAAAGCACACTCAGG
L2 CNAG_05694 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGCGAATAGTTGCTGCTC
R1 CNAG_05694 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTGACCTGCCGTGTATTTAG
R2 CNAG_05694 3' flanking region primer 2 AAACATCACTCACCGTTCC
SO CNAG_05694 diagnostic screening primer, pairing with B79 CGACAAGTTGCTGAAGTTTC
PO CNAG_05694 Southern blot probe primer ACATTTGGAGTCGGTTGG
STM NAT#6 STM primer ATAGCTACCACACGATAGCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
141 CNAG_05753 ARG5 ,6 L1 CNAG_05753 5' flanking region primer 1 ATTTTCCAGTCGTCCGTC
L2 CNAG_05753 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTAATACTGAGGGCAGAGCG
R1 CNAG_05753 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGATCCTTTGACCATCCAGGG
R2 CNAG_05753 3' flanking region primer 2 TTGATGTTTCGCAGCACC
SO CNAG_05753 diagnostic screening primer, pairing with JOHE12579 ACCAGTCAGCAACGAAACG
PO CNAG_05753 Southern blot probe primer CGACAGCAAGGGTTTTTG
STM NAT#220 STM primer CAGATCTCGAACGATACCCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
142 CNAG_05771 TEL1 L1 CNAG_05771 5' flanking region primer 1 ACCCTCCATACATCCTTCC
L2 CNAG_05771 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGCTATCGTTTCGGTAAGG
R1 CNAG_05771 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCAGTATGGATGGGGAGTAATAG
R2 CNAG_05771 3' flanking region primer 2 AACTCCCAAAGATGAGCC
SO CNAG_05771 diagnostic screening primer, pairing with B79 TAGCAGCAAAAGTGAGCG
PO CNAG_05771 Southern blot probe primer GAAATCGTCAAACTCGTTCC
STM NAT#225 STM primer CCATAGAACTAGCTAAAGCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
143 CNAG_05935 L1 CNAG_05935 5' flanking region primer 1 GGTCAATCCAGATGCTATCAG
L2 CNAG_05935 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTTGGGTTTGGGTTTGGGCAGC
R1 CNAG_05935 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCCGTGTTGTTCTTTCGTAG
R2 CNAG_05935 3' flanking region primer 2 CAAGGGTGTTGGTATCTACG
SO CNAG_05935 diagnostic screening primer, pairing with B79 CGGAAGATTACATCCTGGG
PO CNAG_05935 Southern blot probe primer TTACTCATACGCAGGACCC
STM NAT#220 STM primer CAGATCTCGAACGATACCCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
144 CNAG_05965 IRK4 L1 CNAG_05965 5' flanking region primer 1 TCATAGACGATGTTGCCG
L2 CNAG_05965 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCAAGATGGAAGCCAGACTTAC
R1 CNAG_05965 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCCATCTTCCTTCTCCGAAC
R2 CNAG_05965 3' flanking region primer 2 TTTCGGGAGAGTTTTGCG
SO CNAG_05965 diagnostic screening primer, pairing with B79 GCTGTTGTTTCTCACTGTAACC
PO CNAG_05965 Southern blot probe primer GATGTATCTGGCAAAGGGTC
STM NAT#211 STM primer GCGGTCGCTTTATAGCGATT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
145 CNAG_05970 L1 CNAG_05970 5' flanking region primer 1 TGAAGCGTGAGTGTAAACG
L2 CNAG_05970 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGGCAAAGGAATGTGATG
R1 CNAG_05970 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTCATTCTTGGATTTCCCTG
R2 CNAG_05970 3' flanking region primer 2 ACAGAAAGGGGTGAAACG
SO CNAG_09570 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGACTTGCCCGATTTTGG
PO CNAG_05970 Southern blot probe primer TGGCGGTTTATCCTTTCC
STM NAT#212 STM primer AGAGCGATCGCGTTATAGAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
146 CNAG_06001 L1 CNAG_06001 5' flanking region primer 1 ATCTCCACCTCTTCGCCAACTTCC
L2 CNAG_06001 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCGTCATTTTTTTGGGATACGCC
R1 CNAG_06001 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAGAAGAAGTTGCGGAAGTC
R2 CNAG_06001 3' flanking region primer 2 GGAAGAAAGCGATTTACGG
SO CNAG_06001 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTCCTTGCCCTTCCAATCC
PO CNAG_06001 Southern blot probe primer GGATAAAAGCCTGTCAGTCG
STM NAT#119 STM primer CTCCCCACATAAAGAGAGCTAAAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
147 CNAG_06033 MAK32 L1 CNAG_06033 5' flanking region primer 1 CAAACAACAGATTCCGCC
L2 CNAG_06033 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTCGGATGGACGGATGTAG
R1 CNAG_06033 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGACATTTCTCTGCCATCC
R2 CNAG_06033 3' flanking region primer 2 AACGCTGGGAAAACTACC
SO CNAG_06033 diagnostic screening primer, pairing with B79 CAGCGTGAAAGTAGCATTG
PO CNAG_06033 Southern blot probe primer GCTCTTGTCATTCTCGTTCC
STM NAT#169 STM primer ACATCTATATCACTATCCCGAACC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
148 CNAG_06051 GAL1 L1 CNAG_06051 5' flanking region primer 1 GCGGTTGAGTGTGTTATTG
L2 CNAG_06051 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGCTCCCCTAACACATTGACTC
R1 CNAG_06051 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGTCCTGACGCTCTGATACTG
R2 CNAG_06051 3' flanking region primer 2 GCTATGGGTATGAATCGCC
SO CNAG_06051 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGAGACCAGAAGTGAGAGGAC
PO CNAG_06051 Southern blot probe primer GACGCTGACAACAAAAGC
STM NAT#224 STM primer AACCTTTAAATGGGTAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
149 CNAG_06086 SSN3 L1 CNAG_06086 5' flanking region primer 1 CGGAGTCTACATTGCTCAGAG
L2 CNAG_06086 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGTAATCGGTTATCCCACG
R1 CNAG_06086 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGAGGATAACGGTGATGCTAAG
R2 CNAG_06086 3' flanking region primer 2 CCACTTGTTTTGCTTGTGC
SO CNAG_06086 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGGCACGGGGATTTTTAG
PO CNAG_06086 Southern blot probe primer ATTTGAACCCACCGACAG
STM NAT#219 STM primer CCCTAAAACCCTACAGCAAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
150 CNAG_06161 VRK1 L1 CNAG_06161 5' flanking region primer 1 TATCGGCAGCGACTCTACTC
L2 CNAG_06161 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCGCAACCATCAACCTAAGC
R1 CNAG_06161 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGATAGACGCCAAACGCATC
R2 CNAG_06161 3' flanking region primer 2 CCAACCCAACTACTACATACTGC
SO CNAG_06161 diagnostic screening primer, pairing with B79 GAAGAACTGGAAGCATTGG
PO CNAG_06161 Southern blot probe primer CGAGAAGAGTGAGAAATGGG
STM NAT#123 STM primer CTATCGACCAACCAACACAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
151 CNAG_06174 L1 CNAG_06174 5' flanking region primer 1 GCTCACATCGTAACGGTTG
L2 CNAG_06174 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAATGAGCCGAGAACTTACG
R1 CNAG_06174 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTGGAGGGCTTTGTTAGC
R2 CNAG_06174 3' flanking region primer 2 GCTCAACAACAACAGCAAGAG
SO CNAG_06174 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCCGATGCTCACGAATAC
PO CNAG_06174 Southern blot probe primer GTCTCGCACTGTATCAATAAGC
STM NAT#119 STM primer CTCCCCACATAAAGAGAGCTAAAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
152 CNAG_06193 CRK1 L1 CNAG_06193 5' flanking region primer 1 TCCCCTGCTGTATTCATTG
L2 CNAG_06193 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTTGTGCTAATGTTGTCACG
R1 CNAG_06193 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTAACCAGTCTCATCCTCCAC
R2 CNAG_06193 3' flanking region primer 2 TATTCCAGAGGTAGCGGCGTCAAG
SO CNAG_06193 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATAAGGGGGAAAGACCGAG
PO CNAG_06193 Southern blot probe primer GGTTGCCTTCCATACACTC
STM NAT#43 STM primer CCAGCTACCAATCACGCTAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
153 CNAG_06278 TCO7 L1 CNAG_06278 5' flanking region primer 1 CCACCTTTCTCATTCGTATG
L2 CNAG_06278 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACTCTTCTTCAGATGGTTCCC
R1 CNAG_06278 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGCACACTCACTCAACGCATC
R2 CNAG_06278 3' flanking region primer 2 CTCCATTTGTTCCATTAGCC
SO CNAG_06278 diagnostic screening primer, pairing with B79 TAAGCCCTCGGAAACACTC
PO CNAG_06278 Southern blot probe primer CCTTTCTCATTCGTATGGTGTG
STM NAT#209 STM primer AGCACAATCTCGCTCTACCCATAA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
154 CNAG_06301 SCH9 L1 CNAG_06301 5' flanking region primer 1 TTCTTCGTGCTGAGAGGAG
L2 CNAG_06301 5' flanking region primer 2 GCTCACTGGCCGTCGTTTTACAGATGTGGCGTAGTCAGCAC
R1 CNAG_06301 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAATGAGAATGCGGTGGAC
R2 CNAG_06301 3' flanking region primer 2 GGATGGATGGATGCTCAT
SO CNAG_06301 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTCTTCGTGCTGAGAGGAG
PO CNAG_06301 Southern blot probe primer AACCGAAACCCTCAGAACC
STM NAT#169 STM primer ACATCTATATCACTATCCCGAACC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
155 CNAG_06310 IRK7 L1 CNAG_06310 5' flanking region primer 1 GGTGCTAAAGGATGGTATGG
L2 CNAG_06310 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGTTGCTGTTGTTTCTGTAGGTC
R1 CNAG_06310 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTGGTTATCCGCTTACGAC
R2 CNAG_06310 3' flanking region primer 2 GTATGGCTATCAACCTGCTG
SO CNAG_06310 diagnostic screening primer, pairing with B79 CCGACCAAGATGAAAAGC
PO CNAG_06310 Southern blot probe primer GATAGCAACTTTACCCCCC
STM NAT#208 STM primer TGGTCGCGGGAGATCGTGGTTT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
156 CNAG_06366 HRR2502 L1 CNAG_06366 5' flanking region primer 1 TTCTCGTCTTCGCTTTCG
L2 CNAG_06366 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGAGAAGGCATTGCTAAAC
R1 CNAG_06366 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGATTGTGCCCTCGTAATGG
R2 CNAG_06366 3' flanking region primer 2 TTCGCTGACTTGCTTGAG
SO CNAG_06366 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTCCTCGCTTTCAACTCC
PO CNAG_06366 Southern blot probe primer GTTTCCTTCTTCACCCTACC
STM NAT#125 STM primer CGCTACAGCCAGCGCGCGCAAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
157 CNAG_06432 L1 CNAG_06432 5' flanking region primer 1 CGTCACACAACACTGCTACAG
L2 CNAG_06432 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTGATTGACGAGGAACCG
R1 CNAG_06432 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGAACTTAGTGGGTCTTGACG
R2 CNAG_06432 3' flanking region primer 2 GCGGTGATGGGTTGTTATC
SO CNAG_06432 diagnostic screening primer, pairing with B79 ACTTGGCGGTAGTCTGAAG
PO CNAG_06432 Southern blot probe primer ATACCTGGCGGCTAATCAG
STM NAT#224 STM primer AACCTTTAAATGGGTAGAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
158 CNAG_06445 L1 CNAG_06445 5' flanking region primer 1 GCGATAGGTCAGTAGATTGGG
L2 CNAG_06445 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGCTTACATCTGTTGGCACG
R1 CNAG_06445 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGCCTCACAAGAGTCAAAG
R2 CNAG_06445 3' flanking region primer 2 CAATCAGGACAATCATACGC
SO CNAG_06445 diagnostic screening primer, pairing with B79 GAAGAGGAAATGTCAGGGTC
PO CNAG_06445 Southern blot probe primer CAGAAAGGAACTCACAGGC
STM NAT#122 STM primer ACAGCTCCAAACCTCGCTAAACAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
159 CNAG_06454 L1 CNAG_06454 5' flanking region primer 1 AACAAAACCGCTGGCAACACCC
L2 CNAG_06454 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTCCAGAGTCTTCTTCAGGCG
R1 CNAG_06454 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGACCAAGATGCCAAAAGC
R2 CNAG_06454 3' flanking region primer 2 AATGGTTGACAAGCGTGCC
SO CNAG_06454 diagnostic screening primer, pairing with B79 ACCCCTTACTGGCGAAAAC
PO CNAG_06454 Southern blot probe primer GGCAAAACTTACACCTCGC
STM NAT#232 STM primer CTTTAAAGGTGGTTTGTG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
160 CNAG_06489 L1 CNAG_06489 5' flanking region primer 1 TTCTGGAGACCCATCGTCAG
L2 CNAG_06489 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCAACGCCCTGTTATTTCTTC
R1 CNAG_06489 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTGGTCAGATGTGTGTCGG
R2 CNAG_06489 3' flanking region primer 2 CTACTTTGCCGAGTCTCAAG
SO CNAG_06489 diagnostic screening primer, pairing with B79 CAGGACTTGCGTAGCCTATC
PO CNAG_06489 Southern blot probe primer TGGGTGATGACGATGAGAC
STM NAT#125 STM primer CGCTACAGCCAGCGCGCGCAAGCG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
161 CNAG_06490 L1 CNAG_06490 5' flanking region primer 1 GGAGGGTGTTTTTGAGGTC
L2 CNAG_06490 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGGGACTTTTTTGATGGC
R1 CNAG_06490 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGAAGAGGAAGAGGAAGATGAAG
R2 CNAG_06490 3' flanking region primer 2 TCGTTCTGGTTGTCTGCTC
SO CNAG_06490 diagnostic screening primer, pairing with B79 GGTGAGAAAGTAGCCTTCG
PO CNAG_06490 Southern blot probe primer CAGGACTTGCGTAGCCTATC
STM NAT#231 STM primer GAGAGATCCCAACATCACGC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
162 CNAG_06500 L1 CNAG_06500 5' flanking region primer 1 GATACAGCGGGCAAAAAG
L2 CNAG_06500 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGAATGGGATGTGGTCGTC
R1 CNAG_06500 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGAACGGGGTTGTGTTTG
R2 CNAG_06500 3' flanking region primer 2 ATACAGACACTCCGATGCG
SO CNAG_06500 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATAAAGAGGGTTTGGGGC
PO CNAG_06500 Southern blot probe primer ATCGCATTTCAAGGGTGG
STM NAT#225 STM primer CCATAGAACTAGCTAAAGCA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
163 CNAG_06552 SNF1 L1 CNAG_06552 5' flanking region primer 1 CCATCATCCTTCGGTTTTTC
L2 CNAG_06552 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGTTGTTATTGCCAGCGG
R1 CNAG_06552 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTTTTTGGAGATGGCTTGC
R2 CNAG_06552 3' flanking region primer 2 ATACCACGGAAAGGCGTTC
SO CNAG_06552 diagnostic screening primer, pairing with B79 GGATTGTGGTGTTGAAGTCG
PO CNAG_06552 Southern blot probe primer ATGCTTGCCTTTCTGGAC
STM NAT#204 STM primer GATCTCTCGCGCTTGGGGGA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
164 CNAG_06553 GAL83 L1 CNAG_06553 5' flanking region primer 1 TGAGCACTTTGAGGTATTGG
L2 CNAG_06553 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGTGTGATGTATGGGTGTGTG
R1 CNAG_06553 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCATCTGCTGTGAAACATTGG
R2 CNAG_06553 3' flanking region primer 2 GGAAAGGGGTGAAAATGG
SO CNAG_06553 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATGCTTGCCTTTCTGGAC
PO CNAG_06553 Southern blot probe primer TATTGACCAGGAGGAAGGC
STM NAT#288 STM primer CTATCCAACTAGACCTCTAGCTAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
165 CNAG_06568 SKS1 L1 CNAG_06568 5' flanking region primer 1 AATAAGGTCTCCAGCCTCG
L2 CNAG_06568 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCCACCATCAATGAACTGC
R1 CNAG_06568 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAACGACCTGTTGATGACG
R2 CNAG_06568 3' flanking region primer 2 CAAGTTGAATGCTGGGAG
SO CNAG_06568 diagnostic screening primer, pairing with B79 AGCAAGTGGGCAAAGAAGC
PO CNAG_06568 Southern blot probe primer AACCGAAGTCACAGATGCG
STM NAT#211 STM primer GCGGTCGCTTTATAGCGATT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
166 CNAG_06632 ABC1 L1 CNAG_06632 5' flanking region primer 1 ACGACCTGGTAAAGAGTGTG
L2 CNAG_06632 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACAGATGGGCGAAATGTCTC
R1 CNAG_06632 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCACCTCTTATCACCTCAATGAC
R2 CNAG_06632 3' flanking region primer 2 ACCTTCACGACCAAGTGTC
SO CNAG_06632 diagnostic screening primer, pairing with B79 CTATCGCAGAAGAGGATGAG
PO CNAG_06632 Southern blot probe primer AATACCCCTACAACCTCGTC
STM NAT#119 STM primer CTCCCCACATAAAGAGAGCTAAAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
167 CNAG_06642 L1 CNAG_06642 5' flanking region primer 1 CCTTTTCCTTTTACCTGGC
L2 CNAG_06642 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCGCTGAAAGATGTTGTCG
R1 CNAG_06642 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGGATTGACTGGACGAAAC
R2 CNAG_06642 3' flanking region primer 2 CTGGTATGCGTAAAGACTTGAC
SO CNAG_06642 diagnostic screening primer, pairing with B79 CCTGCTGAACGGATGATAG
PO CNAG_06642 Southern blot probe primer GAAGGTTAGTTCGCAAATGG
STM NAT#43 STM primer CCAGCTACCAATCACGCTAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
168 CNAG_06671 YKL1 L1 CNAG_06671 5' flanking region primer 1 CCGACCTACTGATTCGTCTAC
L2 CNAG_06671 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTCGCCCCTTTTCATAATG
R1 CNAG_06671 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGTCCAATCAACAACAGCG
R2 CNAG_06671 3' flanking region primer 2 TGCGGAGGAGATTACCATAC
SO CNAG_06671 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTCGCCTTTGAAGTTCCC
PO CNAG_06671 Southern blot probe primer GGAAAGTGTAGATTGTCGGC
STM NAT#123 STM primer CTATCGACCAACCAACACAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
169 CNAG_06697 MPS1 L1 CNAG_06697 5' flanking region primer 1 GCGATAACTTTTCATCCCC
L2 CNAG_06697 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGTTTTTCCTTTCTCCAGTC
R1 CNAG_06697 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCGGAACTGTCAGATGGTAATC
R2 CNAG_06697 3' flanking region primer 2 CCTTCTTCACCCTACTCTGG
SO CNAG_06697 diagnostic screening primer, pairing with B79 CCAATCTCGCATTTACACC
PO CNAG_06697 Southern blot probe primer TCCTTAGTTATCCTATCCCAGC
STM NAT#116 STM primer GCACCCAAGAGCTCCATCTC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
170 CNAG_06730 GSK3 L1 CNAG_06730 5' flanking region primer 1 GTGAGTCTATCCTTCGTTTCTGTC
L2 CNAG_06730 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCGGCTTCCAAAAAAGTCAG
R1 CNAG_06730 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTGAACAACTGCGTGTCAC
R2 CNAG_06730 3' flanking region primer 2 CTTGAAAGATGACGCTCG
SO CNAG_06730 diagnostic screening primer, pairing with B79 ACATCCTTTGTCTCCCCCAC
PO1 CNAG_06730 Southern blot probe primer 1 CGGAAGACTTTGGTGAAGG
STM NAT#123 STM primer CTATCGACCAACCAACACAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
171 CNAG_06809 IKS1 L1 CNAG_06809 5' flanking region primer 1 TGGAAGAGGATGAAAGACC
L2 CNAG_06809 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACACAACTAAAGGCACAAGGG
R1 CNAG_06809 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGATGAGCGAGCAATGACCTGC
R2 CNAG_06809 3' flanking region primer 2 CAGAACGGTCTTTTGCTTC
SO CNAG_06809 diagnostic screening primer, pairing with B79 TACAGTATCGCTGGTTGCC
PO CNAG_06809 Southern blot probe primer AGCGAGACTGGAATGTGGAG
STM NAT#116 STM primer GCACCCAAGAGCTCCATCTC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
172 CNAG_06845 L1 CNAG_06845 5' flanking region primer 1 GTTATTTGGATGCCAGAGC
L2 CNAG_06845 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACATGCGGTTACCTCATTCG
R1 CNAG_06845 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAGGGAGAAGTAGTTTCGGG
R2 CNAG_06845 3' flanking region primer 2 TGGAGGTTTCGGGTATCAC
SO CNAG_06845 diagnostic screening primer, pairing with B79 GCAAAAACCGAGACTGTG
PO CNAG_06845 Southern blot probe primer TTGAGGGGTTATGCCTTC
STM NAT#201 STM primer CACCCTCTATCTCGAGAAAGCTCC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
173 CNAG_06980 STE11 L1 CNAG_06980 5' flanking region primer 1 TCTCAGCCACATCAGTTAGC
L2 CNAG_06980 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACGGGTGCTCTAAATCTCCTTG
R1 CNAG_06980 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGCCATTTTCCGAGTCAGTAGG
R2 CNAG_06980 3' flanking region primer 2 ATCCTGATGCCAGATTCG
SO CNAG_06980 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCATCTGTCTCACCAACTGC
PO1 CNAG_06980 Southern blot probe primer 1 GGACGCACAGTCTGGTTTAC
PO2 CNAG_06980 Southern blot probe primer 2 TGGGTCAAGTTTAGGGATG
STM NAT#242 STM primer GTAGCGATAGGGGTGTCGCTTTAG
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
174 CNAG_07359 IRK1 L1 CNAG_07359 5' flanking region primer 1 CGCATTTGGTGTATGATGAC
L2 CNAG_07359 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACGGAGGAAGAAGGAGATGAAG
R1 CNAG_07359 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGCTTCGCCTTGATTGTC
R2 CNAG_07359 3' flanking region primer 2 TGCTGAAGATTTCGGAGG
SO CNAG_07359 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGATGGTAGAAATGGCGG
PO1 CNAG_07359 Southern blot probe primer 1 GCATTCGGAGGTAGTTGAAG
STM NAT#5 STM primer TGCTAGAGGGCGGGAGAGTT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
175 CNAG_07372 L1 CNAG_07372 5' flanking region primer 1 CCAAACGGTGTGAAAAGG
L2 CNAG_07372 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGTAGTCGCCGATGGAGTAG
R1 CNAG_07372 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGGCAAGACGAGAAGTAGAGC
R2 CNAG_07372 3' flanking region primer 2 GAACCTGAACCTGAACCAG
SO CNAG_07372 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTTGTAGTTGGGTGTGGTG
PO CNAG_07372 Southern blot probe primer CTTCGCCTTTTGCCTTTC
STM NAT#295 STM primer ACACCTACATCAAACCCTCCC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
176 CNAG_07377 L1 CNAG_07377 5' flanking region primer 1 CGATAACGCAACTTACGG
L2 CNAG_07377 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTTTGGCTTGATTCTCCGC
R1 CNAG_07377 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTCTCAATCTCGCTCAAATG
R2 CNAG_07377 3' flanking region primer 2 CTGAGCCGATAGAGTTCAAC
SO CNAG_07377 diagnostic screening primer, pairing with B79 ACCAACGCACATCTACCTC
PO CNAG_07377 Southern blot probe primer TTATCTACCGAAGTTGGCTG
STM NAT#296 STM primer CGCCCGCCCTCACTATCCAC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
177 CNAG_07408 L1 CNAG_07408 5' flanking region primer 1 GCTGGCATAAAACCGTTC
L2 CNAG_07408 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTCTTACTCCACATAAATGCCC
R1 CNAG_07408 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTTGAAGTCACCCGAGAAAC
R2 CNAG_07408 3' flanking region primer 2 ACACTGCGGATTACGAAGC
SO CNAG_07408 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGTGGCTGAGATGAGGTAGG
PO CNAG_07408 Southern blot probe primer TCTGGGCTGAAGTCTACTAAAC
STM NAT#6 STM primer ATAGCTACCACACGATAGCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
178 CNAG_07427 CCK2 L1 CNAG_07427 5' flanking region primer 1 AGATTCACTCGTCATCGCC
L2 CNAG_07427 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTAAGATGCGATAGGTGGGCG
R1 CNAG_07427 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGCAGACTAAAGCCAGGGACAC
R2 CNAG_07427 3' flanking region primer 2 GGAAGGTCAAGCCATTAGC
SO CNAG_07427 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCAAGGCTTTCATCCCGAC
PO CNAG_07427 Southern blot probe primer CGAGACCAGTTATGTTTGAGAG
STM NAT#230 STM primer ATGTAGGTAGGGTGATAGGT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
179 CNAG_07580 TRM7 L1 CNAG_07580 5' flanking region primer 1 GGTGGAGAGATGTTATGGC
L2 CNAG_07580 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACATAGAGGACTTGGAGGTGGG
R1 CNAG_07580 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCAATGCTGTGAATCTTGTG
R2 CNAG_07580 3' flanking region primer 2 AGAGTAGGGCTGAGCAAGAC
SO CNAG_07580 diagnostic screening primer, pairing with B79 TGGAAAGACCTGTTGCGAC
PO CNAG_07580 Southern blot probe primer TCTTCGGGAAATGGACTG
STM NAT#102 STM primer CCATAGCGATATCTACCCCAATCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
180 CNAG_07667 SAT4 L1 CNAG_07667 5' flanking region primer 1 GATTTTGTGGCTGTTGTGC
L2 CNAG_07667 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGCTTCAAAACCTGGGCTCC
R1 CNAG_07667 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGGTGTAGATTGTTCAGGATGACG
R2 CNAG_07667 3' flanking region primer 2 AGATAGGCGTGCTACCGATG
SO CNAG_07667 diagnostic screening primer, pairing with ATCGGCTTACCATTCTGG
PO CNAG_07667 Southern blot probe primer TCGGTCCCATAATAGACGG
STM NAT#212 STM primer AGAGCGATCGCGTTATAGAT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
181 CNAG_07744 PIK1 L1 CNAG_07744 5' flanking region primer 1 TGGTAGTATGCCAAGAGGTG
L2 CNAG_07744 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACTGGGATACTCTCTCTCTCTGAG
R1 CNAG_07744 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGAAAGGGCAAAGGCAGAAG
R2 CNAG_07744 3' flanking region primer 2 GGAGATGAAGTCAAGATGCG
SO CNAG_07744 diagnostic screening primer, pairing with B79 TCATCTTCATTGTCCTCCC
PO CNAG_07744 Southern blot probe primer TAAAGAGCGGTAAGGCGAG
STM NAT#227 STM primer TCGTGGTTTAGAGGGAGCGC
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
182 CNAG_07779 TDA10 L1 CNAG_07779 5' flanking region primer 1 TGGGAAGCGTTACTTATGC
L2 CNAG_07779 5' flanking region primer 2 TCACTGGCCGTCGTTTTACCTGTAGCAGTCATAATGGCTTG
R1 CNAG_07779 3' flanking region primer 1 CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGAGCAGGTCCGACATTTC
R2 CNAG_07779 3' flanking region primer 2 CATCGCTCTTTCCTACTCG
SO CNAG_07779 diagnostic screening primer, pairing with B79 TTTGGAGCCAGTTTAGGG
PO CNAG_07779 Southern blot probe primer AAAACGAAGCCCTTTGCCCC
STM NAT#102 STM primer CCATAGCGATATCTACCCCAATCT
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
183 CNAG_08022 PHO85 L1 CNAG_08022 5' flanking region primer 1 CCTTGCTTTTTGAGCGAG
L2 CNAG_08022 5' flanking region primer 2 CTGGCCGTCGTTTTACCCTTCACCAAGTTTCTCAAG
R1 CNAG_08022 3' flanking region primer 1 GTCATAGCTGTTTCCTGCAAATGGCTCAACAAGGG
R2 CNAG_08022 3' flanking region primer 2 CCACAGTGCGTCTTTTTATC
SO CNAG_08022 diagnostic screening primer, pairing with B79 ATAGGGGTGATTATCGGGC
PO CNAG_08022 Southern blot probe primer TCGGCATTATCTCTTCCTC
STM NAT#218 STM primer CTCCACATCCATCGCTCCAA
STM common STM common primer GCATGCCCTGCCCCTAAGAATTCG
나아제 변이체 라이브러리 제작 및 기능규명에 사용된 프라이머
Primer name Primer description Primer sequence (5'-3')
B1026 M13 Forward extended GTAAAACGACGGCCAGTGAGC
B1027 M13 Reverse extended CAGGAAACAGCTATGACCATG
B1454 NAT split marker primer (NSR) AAGGTGTTCCCCGACGACGAATCG
B1455 NAT split marker primer (NSL) AACTCCGTCGCGAGCCCCATCAAC
B1886 NEO split marker primer (GSR) TGGAAGAGATGGATGTGC
B1887 NEO split marker primer (GSL) ATTGTCTGTTGTGCCCAG
B4017 Primer 1 for overexpression promoter with NEO marker GCATGCAGGATTCGAGTG
B4018 Primer 2 for overexpression promoter with NEO marker GTGATAGATGTGTTGTGGTG
B678 Northern probe primer1 for ERG11 TTCAGGGAACTTGGGAACAGC
B1598 Northern probe primer2 for ERG11 CAGGAGCAGAAACAAAGC
B3294 Northern probe primer1 for ACT1 GCACCATACCTTCTACAATGAG
B3295 Northern probe primer2 for ACT1 ACTTTCGGTGGACGATTG
B5251 RT-PCR primer for HXL1 of H99 CACTCCATTCCTTTCTGC
B5252 RT-PCR primer for HXL1 of H99 CGTAACTCCACTGTGTCC
B7030 qRT-PCR primer for CNA1 of H99 AGACTGTTTACAATGCCTGC
B7031 qRT-PCR primer for CNA1 of H99 TCTGGCGACAAGCCACCATG
B7032 qRT-PCR primer for CNB1 of H99 AAGATGGAAGTGGAACGG
B7033 qRT-PCR primer for CNB1 of H99 TTGAAAGCGAATCTCAGCTT
B7034 qRT-PCR primer for CRZ1 of H99 ACCACGGACATTATCTTCAG
B7035 qRT-PCR primer for CRZ1 of H99 AGCCCAGCCTTGCTGTTCGT
B7036 qRT-PCR primer for UTR2 of H99 TTTCTATGCCCATCTACAGC
B7037 qRT-PCR primer for UTR2 of H99 CTTCGTGGGAGTACAGTGGC
B679 qRT-PCR primer for ACT1 of H99 CGCCCTTGCTCCTTCTTCTATG
B680 qRT-PCR primer for ACT1 of H99 GACTCGTCGTATTCGCTCTTCG
실시예 3: 크립토코쿠스 키놈 네트워크의 체계적인 표현형 프로파일링 및 클러스터링 (clustering)
상기 실시예에서 제작한 키나아제 변이체 라이브러리로, 다음 6개의 주요 표현형 클래스, 성장, 분화, 스트레스 반응 및 적응, 항진균 약물내성, 및 병독성 인자 생성에 대하여 일련의 시험관내 표현형 분석 (총 30개의 표현형질)을 수행하고, 6,600개 이상의 표현형 데이터를 만들었다. 이러한 포괄적인 키나아제 페놈 (phenome) 데이터는 C. 네오포만스 키놈 데이터베이스 (http://kinase.cryptococcus.org)에서 검색할 수 있다. 키나아제 사이의 기능 및 조절에 있어서의 연결성을 밝히기 위하여, 피어슨 코릴레이션 분석 (Pearson Correlation analysis)을 통한 형질분석으로 키나아제를 그룹화 하였다 (도 2 참조). 이러한 분석의 논리적인 근거는 어떠한 신호경로내의 일군의 키나아제는, 공유하는 표현형질 특성에 따라 함께 클러스터링 되는 경향이 있다는 것이다. 예를 들어, 3단의 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 캐스케이드의 변이체는 이들이 거의 동일한 표현형질을 나타내기 때문에 함께 클러스터링되어야 한다. 실제로, 세포벽 완전성 MAPK (bck1 △, mkk1△, mpk1 △) 및 높은 오스몰 농도 글리세롤 반응 (HOG) MAPK (ssk2 △, pbs2 △, hog1 △), 및 페로몬-반응형 MAPK (ste11 △, ste7 △, cpk1 △) 경로 내 3단의 키나아제가 이들의 공유된 기능에 근거하여, 각각 함께 클러스터링되었다 (도 2). 그러므로, 본 분석에 의해 함께 클러스터링된 한 그룹의 키나아제들은, 동일하거나 관련된 신호 캐스케이드에서 기능할 가능성이 매우 높다. 본 발명자들은 알려진 신호경로와 기능적으로 연관된 알려지지 않은 몇몇 신규한 키나아제를 동정하였다. S . 세레비지애 내 Snf1 키나아제 복합체의 세 개의 가능성 있는 β-서브유닛 중 하나인 효모 Gal83에 대해 이종상동인 단백질을 인코딩하는 CNAG_06553을 동정하였다. 효모 Snf1 키나아제 복합체는 Snf1,촉매 α-서브유닛, Snf4, 조절 γ 서브유닛, 및 세 개의 가능성 있는 β 서브유닛 Gal83, Sip1 또는 Sip2 중 하나로 구성되고, 글루코오스 억제 (glucose depression) 하에서 전사 변화를 조절한다 (Jiang, R. & Carlson, M. The Snf1 protein kinase and its activating subunit, Snf4, interact with distinct domains of the Sip1/Sip2/Gal83 component in the kinase complex. Mol Cell Biol 17, 2099-2106, 1997; Schuller, H. J. Transcriptional control of nonfermentative metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet 43, 139-160, doi:10.1007/s00294-003-0381-8, 2003). C . 네오포만스에서 Snf1의 기능은 이미 보고된바 있다 (Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R. & Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcus neoformans during early murine pulmonary infection. Molecular microbiology 69, 1456-1475, doi:10.1111/j.1365-2958.2008.06374.x, 2008). 몇몇 실험적 증거는, Gal83이 C. 네오포만스에서 Snf1과 연관되어 기능한다는 것을 증명하였다. 첫째, gal83 △ 변이체의 시험관내 (생체외) 표현형질은 snf1 △ 변이체의 표현형질과 거의 동일하다 (도 3). gal83 △ 및 snf1 △ 변이체 모두 플루디옥소닐 (fludioxonil)에 대해 증가된 감수성을 보였으며, 유기 퍼옥시드 (tert-부틸 히드록퍼옥시드)에 대해 증가된 내성을 보였다. 둘째, 다른 탄소원 (예를 들어, 아세트산 칼륨, 아세트산 나트륨, 에탄올)에서의 snf1 △ 변이체의 성장 결함이 gal83 △ 변이체에서도 관찰되었다 (도 3). 따라서, Gal83은 C. 네오포만스내 Snf1 키나아제 복합체의 가능성 있는 β-서브유닛 복합체의 하나일 수 있다.
또한, 본 발명자들은 TOR 키나아제 복합체의 상류 또는 하류에서 잠재적 기능을 갖는 몇몇 키나아제를 확인하였다. Tor1 키나아제가 C. 네오포만스에 있어 필수적이기 때문에 이를 붕괴시킬 수는 없었으나, 대부분의 진핵생물에서 클러스터링 된 것으로 발견되는 3종의 키나아제 (Ipk1, Ypk1, 및 Gsk3), Tor1-의존성 시그널 캐스캐이드가 C. 네오포만스에서 클러스터링 될 수 있음을 발견하였다. 최근 Lev 등은 S. cerevisiae Ipk1에 대한 제한된 서열 상동성에 기초하여 이노시톨 헥사포스페이트 (inositol hexaphosphate) (IP6)의 생성에 관여할 수 있음을 제안하였다 (Lev, S. et al. Fungal Inositol Pyrophosphate IP7 Is Crucial for Metabolic Adaptation to the Host Environment and Pathogenicity. MBio 6, e00531-00515, doi:10.1128/mBio.00531-15 (2015)). 효모에서 Arg82로 동정된 IPMK (inositol polyphosphate multikinase)는, 포유동물에서, 5-IP7의 전구체인 IP6, Akt 활성을 저해하고 그에 따라 mTORC1-매개 단백질 번역을 감소시키며 GSK3-매개 글루코오스 항상성 (homeostasis), 지방세포형성 (adipogenesis), 및 행동성 (Chakraborty, A., Kim, S. & Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates as mammalian cell signals. Sci Signal 4, re1, doi:10.1126/scisignal.2001958 (2011))을 증가시킨다. S . cerevisiae에서, Ypk1는 아미노산 결핍 중에 자가소화작용을 증진시켜 TORC2의 직접적인 타겟이 되는 것이 보고되었다 (Vlahakis, A. & Powers, T. A role for TOR complex 2 signaling in promoting autophagy. Autophagy 10, 2085-2086, doi:10.4161/auto.36262 (2014)). C . 네오포만스에서, Tor1의 잠재적 하류 타겟인 Ypk1은 스핑고지질 (sphingolipid) 합성에 관여하며, YPK1의 결실은 병독성의 현저한 감소를 초래한다 (Lee, H., Khanal Lamichhane, A., Garraffo, H. M., Kwon-Chung, K. J. & Chang, Y. C. Involvement of PDK1, PKC and TOR signalling pathways in basal fluconazole tolerance in Cryptococcus neoformans. Mol. Microbiol. 84, 130-146, doi:10.1111/j.1365-2958.2012.08016.x (2012)). Tor1의 필수적인 역할을 반영하여, ipk1△, ypk1△, 및 gsk3△ 변이체 모두 특히, 고온에서, 성장인자 결핍을 나타냈다.
이러한 표현형 클러스터링 분석에서는 2가지 주요한 제한이 있다. 첫째, 동일한 경로에서 반대로 조절되는 키나아제는 클러스터링 될 수 없다. 둘째, 신호경로에서 조절되는 표현형의 서브셋을 조절하는 키나아제는 이것의 상류 키나아제와 클러스터링 될 수 없다. 이러한 예는 Hrk1 (CNAG_00130; Hog1-regulated kinase 1)를 포함한다. 본 발명자들이 Hrk1가 Hog1에 의해 조절됨을 입증한 바 있으나, Hrk1가 Hog1-의존성 표현형의 서브셋만을 조절하므로 Hrk1 및 Hog1는 함께 클러스터링 될 수 없다. Fpk1, 포스포리피드 플립파아제 (phospholipid flippase) 키나아제는 다른 예이다. S . 세레비지애에서, Fpk1의 활성은 Ypk136에 의한 직접적인 인산화에 의해 저해된다. 예상대로, Fpk1 및 Ypk1은 함께 클러스터링 되었다. Fpk1이 C. 네오포만스 Ypk1-의존성 표현형 특징을 조절하는 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 ypk1 △ 및 야생형 균주 배경에서 제작된 FPK1 과발현 균주를 구성하고 분석하는 상위분석 (epistatic analyses)을 수행했다. 예측한대로, FPK1의 과발현은 ypk1 변이체에서, 정상적인 성장, 및 스트레스 (삼투압, 산화, 유전자 독성, 및 세포벽/막 스트레스) 저항성 및 항진균 약물 (암포테리신 B) 내성을 부분적으로 회복시켰다 (도 4). 그러나, ypk1 △ 변이체의 아졸 감수성은 FPK1 과발현에 의해 회복될 수 없었다 (도 4 참조). 이러한 결과는 Fpk1가 Ypk1의 하류 타겟의 하나가 될 수 있으며, Ypk1에 의해 양성 조절될 수 있음을 제시한다.
실시예 4: C. 네오포만스 내 병원성 키놈 네트워크
감염성 및 병독성 모두에 의해 지배되는, 병원성을 조절하는 키나아제를 동정하기 위해, 본 발명자들은 2가지 대규모의 생체 내 동물실험을 수행하였다: 병독원성 분석 및 STM-기반 생쥐 감염성 분석. 상기 두 가지 분석에서, 단일 변이체를 가지는 몇 가지 키나아제를 제외한, 각각의 키나아제에 대한 2개의 독립적 변이체를 모니터링 하였다. 그 결과, 곤충 사멸 분석에서 31개의 병독성-조절 키나아제 (도 5a 및 b) 및 STM-기반 생쥐 감염성 분석에서 54개의 감염성-조절 키나아제를 발견하였다 (도 6a, b, c 및 d). 이들 중, 25개의 키나아제는 2가지 분석 모두에서 공통적으로 동정되었는데 (도 7의 a), 이는 곤충 숙주에서의 병독원성과 생쥐 숙주에서의 감염성이 전에 보고된 바와 같이 밀접하게 관련되어 있다는 것을 나타낸다 (Jung, K. W. et al. Systematic functional profiling of transcription factor networks in Cryptococcus neoformans. Nat Comms 6, 6757, doi:10.1038/ncomms7757, 2015). 단 6개의 키나아제 변이체만이 곤충 사멸 분석에 의해서 발견되었다 (도 7의 b). 본 발명자들은 C. 네오포만스의 병원성과 관련된 총 60개의 키나아제 변이체를 발견하였다.
추가적으로, 많은 수의 알려진 병독성-조절 키나아제 (총 15개 키나아제)를 본 발명에서 재확인하였다 (도 7의 a에 검정색으로 표시된 키나아제). 이들은 Mpk1 MAPK (Gerik, K. J., Bhimireddy, S. R., Ryerse, J. S., Specht, C. A. & Lodge, J. K. PKC1 is essential for protection against both oxidative and nitrosative stresses, cell integrity, and normal manifestation of virulence factors in the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Eukaryot. Cell 7, 1685-1698, 2008; Kraus, P. R., Fox, D. S., Cox, G. M. & Heitman, J. The Cryptococcus neoformans MAP kinase Mpk1 regulates cell integrity in response to antifungal drugs and loss of calcineurin function. Mol. Microbiol. 48, 1377-1387, 2003); 높은 오스몰 농도 글리세롤 반응 (HOG) 경로 내 Ssk2 (Bahn, Y. S., Geunes-Boyer, S. & Heitman, J. Ssk2 mitogen-activated protein kinase kinase kinase governs divergent patterns of the stress-activated Hog1 signaling pathway in Cryptococcus neoformans. Eukaryot. Cell 6, 2278-2289, 2007), cAMP 경로 내 단백질 키나아제 A의 주 촉매 서브유닛 (Pka1) (D'Souza, C. A. et al. Cyclic AMP-dependent protein kinase controls virulence of the fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Mol. Cell. Biol. 21, 3179-3191, 2001); 비접힘 단백질 반응 (UPR) 경로내 Ire1 키나아제/엔도리보뉴클레아제 (Cheon, S. A. et al. Unique evolution of the UPR pathway with a novel bZIP transcription factor, Hxl1, for controlling pathogenicity of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathog. 7, e1002177, doi:10.1371/journal.ppat.1002177, 2011); Ypk1 (Kim, H. et al. Network-assisted genetic dissection of pathogenicity and drug resistance in the opportunistic human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Scientific reports 5, 8767, doi:10.1038/srep08767, 2015; Lee, H., Khanal Lamichhane, A., Garraffo, H. M., Kwon-Chung, K. J. & Chang, Y. C. Involvement of PDK1, PKC and TOR signalling pathways in basal fluconazole tolerance in Cryptococcus neoformans. Mol. Microbiol. 84, 130-146, doi:10.1111/j.1365-2958.2012.08016.x, 2012); 및 Snf1 (Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R. & Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcus neoformans during early murine pulmonary infection. Molecular microbiology 69, 1456-1475, doi:10.1111/j.1365-2958.2008.06374.x, 2008)를 포함한다. 혈청형 D에서 (B3501A) Gsk3의 기능을 조사하여, Gsk3가 C. 네오포만스의 낮은 산소분압 (1%)에서 생존하고, 생쥐 모델 시스템에서 병독성을 갖는데 필요하다는 것이 증명된바 있다 (Chang, Y. C., Ingavale, S. S., Bien, C., Espenshade, P. & Kwon-Chung, K. J. Conservation of the sterol regulatory element-binding protein pathway and its pathobiological importance in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell 8, 1770-1779, doi:10.1128/EC.00207-09, 2009). 본 발명자들은 Gsk3가 혈청형A의 C. 네오포만스 (H99S)에서도 필요하다는 것을 발견하였다. 비록 이전에 보고된바 없으나, 알려진 병독성-조절 키나아제와 기능적으로 관련된 키나아제의 결실 변이체가 병독성 또는 감염성을 약화시킨다는 것을 또한 발견하였다. 본 발명에서는 bck1 △ 및 mkk1 /2△ 변이체 (Mpk1 관련)와 gal83 △ 변이체(Snf1 관련)가 포함된다. 특히, 이들 중 44개 키나아제에 대해, 진균 병원성에 대한 역할을 최초로 확인하였다.
본 발명자들은 C. 네오포만스 내 60개의 병원성-관련 키나아제에 대해, 진균 종 및 다른 진핵생물 계, 동물 및 식물 내에서 있을 수 있는 이들의 이종상동 (orthologs)에 대한 표현형의 관련성을 분석하였다 (도 8의 a). 진균 병원체를 광범위하게 억제하기 위해, 바람직하게는 인간에 존재하지 않고 다수의 진균성 병원체에서 필요로 하는 키나아제를 타겟 하는 것이 이상적이다 (광범위-스펙트럼 항진균 타겟). C . 네오포만스에서 이러한 대규모 병독성 데이터를 다른 진균 병원체와 비교하였다. 밀 붉은곰팡이 (wheat scab) 식물 병원성 진균 푸사리움 그래미니아룸 (Fusarium graminearum)에서, 대규모 키놈 분석을 수행하여, 병독성에 관련된 42개 단백질 키나아제를 발견하였다 (Wang, C. et al. Functional analysis of the kinome of the wheat scab fungus Fusarium graminearum. PLoS Pathog 7, e1002460, doi:10.1371/journal.ppat.1002460, 2011). 이들 중 21개가 두 진균 모두의 병원성에 관련되어 있어, 광범위-스펙트럼 항진균 타겟으로 간주되었다: BUD32 (Fg10037), ATG1 (Fg05547), CDC28 (Fg08468), KIC1 (Fg05734), MEC1 (Fg13318), KIN4 (Fg11812), MKK1 /2 (Fg07295), BCK1 (Fb06326), SNF1 (Fg09897), SSK2 (Fg00408), PKA1 (Fg07251), GSK3 (Fg07329), CBK1 (Fg01188), KIN1 (Fg09274), SCH9 (Fg00472), RIM15 (Fg01312), HOG1 (Fg09612), 및 YAK1 (Fg05418). 다른 인간 진균 병원체 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)에서는, 대규모 병원성 키놈 분석을 수행하지 않았다. 구축된 칸디다 게놈 데이터베이스로 (http://www.candidagenome.org/)부터 수득한 정보에 따르면, 33개 키나아제가 칸디다 알비칸스의 병원성에 관여하는 것으로 알려졌다. 이들 중 13개가 C. 네오포만스 및 C. 칸디다의 병원성에 관련된 것을 확인할 수 있었다 (도 8의 b). 특히, 5개 키나아제 (Sch9, Snf1, Pka1, Hog1, and Swe1)가 모든 3개 진균 병원성에 관여하는 것으로서 중요한 병원성 키나아제인 것으로 밝혀졌다.
이와 반대로, C. 네오포만스를 선택적으로 억제하기 위하여, C. 네오포만스 내 존재하나 다른 진균 또는 인간에 존재하지 않는 병원성-관련 키나아제를 타겟하는 것이 이상적이다 (협범위-스펙트럼 항크립토코쿠스증 타겟). 이들 중, 식물에 존재하는 이노시톨 1,3,4,5,6-펜타키스포스페이트 2-키나아제 (inositol 1,3,4,5,6-pentakisphosphate 2-kinase)에 제한적으로 이종상동성이나, 자낭균과 인간에 존재하지 않거나 다소 (distantly) 관련된 단백질을 인코딩하는 CNAG_01294 (IPK1으로 명명)가 우수한 항-크립토코쿠스증 타겟으로 간주되었다. ipk1 △ 변이체는 병독성의 부족 및 다면발현성 표현형을 나타내었다 (도 9). IPK1의 결실은 캡슐 생성을 약간 증가시켰으나 (도 8의 b), 멜라닌 및 우레아제 생성을 하지 않도록 하였으며 (도 8의 c 및 d), 성분화에 대해 결함이 있게 만들고 (도 8의 e), 세포를 고온 (도 8의 f) 및 다양한 스트레스에 대해 고도로 감수성으로 만들었다 (도 8의 g). 특히, Ipk1는 이것의 결실이 다양한 종류의 항진균 약물에 대한 감수성을 현저하게 증가시키므로, 병행치료법의 유용한 타겟이 될 수 있다 (도 8의 g). 이와 같이, 본 발명자들은 C. 네오포만스의 병원성 키놈 분석으로 항크립토코쿠스증 및 항진균약물 타겟의 협범위- 및 광범위-스펙트럼을 밝혀내었다.
실시예 5: C. 네오포만스의 병원성을 지배하는 키나아제의 생물학적 기능
병원성과 관련된 키나아제의 기능적 네트워크를 보다 더 명확하게 하기 위해, 본 발명자들은 본 발명자들이 최근에 구축한 C. 네오포만스에 대한 게놈 스케일의 공동기능네트워크, CryptoNet (www.inetbio.org/cryptonet)를 이용하였다 (Kim, H. et al. Network-assisted genetic dissection of pathogenicity and drug resistance in the opportunistic human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Scientific reports 5, 8767, doi:10.1038/srep08767 (2015)). 병원성 관련 키나아제에 대해 기능적으로 연결된 임의의 단백질을 검색함에 의해, 기존에 보고된 C. 네오포만스 내 정보 및 상응하는 키나아제 이종상동체 (orthologs)의 유전자 온톨로지 (Gene Ontology (GO) terms) 및 S. 세레비지애 및 다른 진균에서 상호작용하는 단백질을 검색하였다 (도 10). 이러한 분석은, 병원성 관련 키나아제의 생물학적인 기능이, 세포주기조절 (cell cycle regulation), 대사과정 (metabolic process), 세포벽 합성 (cell wall biogenesis and organization), DNA 손상 복구, 히스톤 변형 (histone modification), 트랜스멤브레인 수송 및 액포수송 (transmembrane transport and vacuole trafficking), tRNA 프로세싱, 세포골격화 (cytoskeleton organization), 스트레스 반응 및 신호전달 (stress response and signal transduction), 단백질 폴딩, mRNA 프로세싱, 및 전사조절을 포함하는 것을 밝혀 냈으며, 이는 다양한 상이한 생물학적 및 생리학적 기능이 C. 네오포만스의 병독성에 영향을 미치는 것을 제시한다 (도 10). 병원성-관련 키나아제 중에서, 세포 주기 및 성장 조절에 관련된 키나아제가 가장 빈번하게 확인되었다. 이들은 CDC7 , SSN3 , CKA1 , 및 MEC1을 포함한다. 특히, S. 세레비지애에서, Cdc7은 Dbf4-의존성 단백질 키나아제의 필수적인 촉매 서브유닛이고, Cdc7-Dbf4는 S. 세레비지애에서 S상 (phase)을 통한 복제기원 작동에 필수적이다 (Diffley, J. F., Cocker, J. H., Dowell, S. J., Harwood, J. & Rowley, A. Stepwise assembly of initiation complexes at budding yeast replication origins during the cell cycle. J Cell Sci Suppl 19, 67-72, 1995). 비록 주위 온도에서는 필수적이지 않으나, cdc7 △ 변이체는 고온에서 심각한 성장 결함을 나타내는데 (도 11의 a), 이는 C. 네오포만스의 병독성에 영향을 주기 쉽다. C . 네오포만스 내 cdc7 △ 변이체가 메틸메탄설포네이트 (MMS) 및 수산화요소 (HU)와 같은 유전자독성물질에 매우 민감하다는 것은 Cdc7이 DNA 복제 및 수선의 원인이 될 수 있음을 제시한다 (도 11의 a). Mec1은 S. 세레비지애에서 세포주기 체크포인트 (check point), 텔로미어 유지 및 사일런싱 (silencing), 및 DNA 손상복구에 필요하다 (Mills, K. D., Sinclair, D. A. & Guarente, L. MEC1-dependent redistribution of the Sir3 silencing protein from telomeres to DNA double-strand breaks. Cell 97, 609-620, 1999). 이러한 역할을 반영하여, MEC1의 결실은 C. 네오포만스에서 유전자독성물질에 대한 세포 감수성을 증가시켰으며 (도 11의 b), 이것은 염색체 완전성 (chromosome integrity)의 유지에서의 Mec1 역할이 보존될 수 있음을 나타낸다. C . 네오포만스의 경우와 유사하게, MEC1의 결실은 C. 알비칸스에서 어떠한 치사 (lethality) 또는 성장 결함을 유발하지 않았다 (Legrand, M., Chan, C. L., Jauert, P. A. & Kirkpatrick, D. T. The contribution of the S-phase checkpoint genes MEC1 and SGS1 to genome stability maintenance in Candida albicans. Fungal Genet Biol 48, 823-830, doi:10.1016/j.fgb.2011.04.005, 2011). Cka1 및 Cka2는 단백질 키나아제 CK2의 촉매 α-서브유닛으로, S. 세레비지애의 성장 및 번식에 필수적이며, 두 키나아제의 결실은 치사를 유발한다 (Padmanabha, R., Chen-Wu, J. L., Hanna, D. E. & Glover, C. V. Isolation, sequencing, and disruption of the yeast CKA2 gene: casein kinase II is essential for viability in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 10, 4089-4099, 1990). 흥미롭게도, C. 네오포만스는 Cka1 및 Cka2 둘 모두에 대해 이종상동인 단일 단백질 (CKA1)을 포함하는 것으로 나타났다. CKA1의 결실이, 비록 필수적이지 않다고 하더라도, C. 네오포만스 내 성장에 심각한 영향을 미치는 것으로 확인되었다 (도 11의 c). 특히, cka1 △ 변이체는 길어지고 변형된 세포 형태를 나타냈으며 (도 11의 d), 이것은 RAM 경로에서 2개의 키나아제 변이체 (cbk1 △ 및 kic1 △)에 필적한다. Cbk1 및 Kic1는 C. 네오포만스에서 세포 극성 및 형태를 조절하는 것으로 알려졌으나, 이들의 병독성과의 관련성에 대해서는 알려진 바 없다 (Walton, F. J., Heitman, J. & Idnurm, A. Conserved Elements of the RAM Signaling Pathway Establish Cell Polarity in the Basidiomycete Cryptococcus neoformans in a Divergent Fashion from Other Fungi. Mol. Biol. Cell, 2006). 본 발명자들은 C. 네오포만스에서 세포극성과 형태가 병독성에 관련되는 것을 밝혔다.
Bud32 또한 tRNA 변형에 관여함에 의해 잠재적으로 성장에 필수적인 것으로 여겨진다. Bud32는 박테리아, 고세균 및 진핵생물에서 보존되는, 비전형적인 단백질 키나아제의 piD261 계열에 속하는 것으로서, 염기성 물질을 인식하는 다른 진핵생물 단백질 키나아제와 달리 산성 물질을 인식한다 (Stocchetto, S., Marin, O., Carignani, G. & Pinna, L. A. Biochemical evidence that Saccharomyces cerevisiae YGR262c gene, required for normal growth, encodes a novel Ser/Thr-specific protein kinase. FEBS Lett 414, 171-175, 1997). S . 세레비지애에서, Bud32는 EKC (엔도펩티타아제-유사 및 키나아제-전사된 염색질 관련; Endopetidase-like and Kinase-associated to transcribed Chromatin)/KEOPS (키나아제, 추정 엔도펩티다아제 및 작은 크기의 다른 단백질; Kinase, putative endopetidase and other proteins of small size) 복합체의 구성성분이다. 이러한 복합체는 N-6 트레오닐카르바모일아데노신 (t6A) (N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A)) tRNA 변형에 필요한데, 이는 모든 tRNA에 대해서 코돈-안티코돈 상호작용을 유지하는데 중요하다. 그러므로, EKC/KEOPS 복합체에서 손상된 세포는 증가된 틀이동 돌연변이 (frameshift mutation) 비율 및 낮은 성장률을 가지는 경향이 있다 (Srinivasan, M. et al. The highly conserved KEOPS/EKC complex is essential for a universal tRNA modification, t6A. EMBO J 30, 873-881, doi:10.1038/emboj.2010.343, 2011). 예상대로, tRNA 변형에서의 이러한 결함은, C. 네오포만스의 다양한 생물학적 양상에 대한 극적인 효과를 미치는 것으로 나타났으며, 이는 결과적으로 병독성에 영향을 미친다. bud32 △ 변이체는 일반 및 대부분의 스트레스 조건 둘 다에서 매우 결함이 있는 성장을 나타냈을 뿐만 아니라 (도 12의 a), 훨씬 더 적은 양의 캡슐, 멜라닌 및 우레아제를 생산하였다 (도 12의 b). 또한, bud32 변이체는 유성생식능에 큰 결함을 보였다 (도 12의 c). 한가지 예외는 플루코나졸 저항성이었다 (도 12의 a). 흥미롭게도, 본 발명자들은 BUD32 결실이 플루코나졸 처리에 의한 스테롤 결실 시 발생하는 ERG11 유도를 손상시켰음을 확인하였다 (도 12의 d), 이것은 C. 네오포만스에서 Bud32가 에르고스테롤 유전자 발현 및 스테롤 생합성에 잠재적인 역할이 있음을 제시한다.
영양대사에 관련된 키나아제 또한 C. 네오포만스의 병원성에 관련된다. S . 세레비지애에서, Arg5,6p는 단일 단백질로 합성되고, 이어서 미토콘드리아 매트릭스 내에서 2개의 별개의 효소, 아세틸글루타메이트 키나아제 및 N-아세틸-γ-글루타밀-포스페이트 리덕타아제로 프로세싱된다 (Boonchird, C., Messenguy, F. & Dubois, E. Determination of amino acid sequences involved in the processing of the ARG5/ARG6 precursor in Saccharomyces cerevisiae. Eur J Biochem 199, 325-335, 1991). 이들 효소는 아르기닌 생합성의 중간체인, 오르니틴 생합성을 촉매한다. 이를 뒷받침하는 것으로서, 본 발명자들은 arg5 ,6p△ 변이체가 아르기닌-영양요구성 (arginine-auxotrophic)인 것을 확인하였다 (도 13의 a). S . 세레비지애에서, ATP 설푸리라아제 (sulfurylase)를 인코딩하는 MET3가, 호모시스테인, 시스테인 및 메티오닌의 생합성의 전구체인 황화수소를 생성하는 황동화경로 (sulfur assimilation pathway)의 초기단계를 촉매한다 (Cherest, H., Nguyen, N. T. & Surdin-Kerjan, Y. Transcriptional regulation of the MET3 gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene 34, 269-281, 1985; Ullrich, T. C., Blaesse, M. & Huber, R. Crystal structure of ATP sulfurylase from Saccharomyces cerevisiae, a key enzyme in sulfate activation. EMBO J 20, 316-329, doi:10.1093/emboj/20.3.316, 2001). 실제로, met3 △ 변이체는 메티오닌 및 시스테인 둘 모두에 대해 영양요구성인 것으로 확인되었다 (도 13의 b). 특히, arg5 ,6p△ 및 met3 △ 두 변이체 모두 영양풍부배지 (YPD)에서 어떠한 성장 결함도 나타내지 않았으나, 다양한 스트레스 조건 하에서는 심각한 성장결함을 나타내었으며 (도 13의 c), 이것은 arg5 ,6p△ 및 met3 △ 변이체에서 관찰된 병독성 결함에 집합적으로 관여할 수 있을 것이다.
실시예 6: C. 네오포만스의 병원성을 지배하는 역행 (retrograde) 액포수송
C. 네오포만스의 병원성의 원인으로 알려지지 않은 주목할 만한 생물학적 기능은 역행 액포수송이다. C . 네오포만스에서, ESCRT 복합체-매개 일반적이지 않은 액포분류과정 (vacuolar sorting process)이, 몇몇 병독성 인자, 캡슐 및 멜라닌이 세포 외로 분비되어야만 하기 때문에, 병독성 과정에 관련되어 있음은 이미 보고된바 있다 (Godinho, R. M. et al. The vacuolar-sorting protein Snf7 is required for export of virulence determinants in members of the Cryptococcus neoformans complex. Scientific reports 4, 6198, doi:10.1038/srep06198, 2014; Hu, G. et al. Cryptococcus neoformans requires the ESCRT protein Vps23 for iron acquisition from heme, for capsule formation, and for virulence. Infect Immun 81, 292-302, doi:10.1128/IAI.01037-12, 2013). 그럼에도 불구하고, C. 네오포만스의 병독성에서 엔도좀-투-골지 (endosome-to-Golgi) 역행수송의 역할은 알려진 바 없다. 본 발명에서, 본 발명자들은 액포분류공정에 관련된 VPS15 이종상동체를 인코딩하는 CNAG_02680의 결실이 병독성을 상당히 감소시키는 것을 발견하였다 (도 14의 a). 이러한 결과는 VPS15의 변이가 C. 알비칸스의 병독성을 억제시킨다는 발견과 일치하여 (Liu, Y. et al. Role of retrograde trafficking in stress response, host cell interactions, and virulence of Candida albicans. Eukaryot Cell 13, 279-287, doi:10.1128/EC.00295-13, 2014), 진균 병독성에서의 Vps15의 역할이 진화적으로 보존된다는 것을 강하게 제안한다. S . 세레비지애에서, Vps15는 엔도좀-투-골지 역행 단백질 수송을 매개하는 액포단백질분류복합체 (Vps15/30/34/38)를 구성한다 (Stack, J. H., Horazdovsky, B. & Emr, S. D. Receptor-mediated protein sorting to the vacuole in yeast: roles for a protein kinase, a lipid kinase and GTP-binding proteins. Annu Rev Cell Dev Biol 11, 1-33, doi:10.1146/annurev.cb.11.110195.000245, 1995).
액포분류 및 역행 단백질 수송에서의 Vps15의 역할을 확인하기 위해, vps15 △ 변이체의 액포 형태학을 야생형 균주와 비교하여 조사하였다. C . 알비칸스의 vps15 △ 공 (null) 변이체와 유사하게, C. 네오포만스 vps15 △ 변이체도 매우 확장된 액포형태 (도 14의 b)를 나타냈다. 역행액포수송의 결함은 ER-내재 샤프론 단백질, Kar2의 세포 밖 분비를 야기하는 것으로 알려졌다 (Liu, Y. et al. Role of retrograde trafficking in stress response, host cell interactions, and virulence of Candida albicans. Eukaryot Cell 13, 279-287, doi:10.1128/EC.00295-13 (2014)). 이를 뒷받침하는 것으로서, 본 발명자들은 vps15 △ 변이체가 ER 스트레스 제제, 예를 들어 디티오트레이톨 (dithiothreitol) (DTT) 및 투카마이신 (tunicamycin) (TM)에 매우 민감함을 확인하였다 (도 14의 c). vps15 △ 변이체의 병독성이 크게 약화된 주요 원인은 37 ℃에서 이들의 성장 결함으로 나타났다 (도 14의 d). 이는 vps15△ 변이체에서 증가된 세포벽 및 세포막 불안정성에서 기인할 수 있다. C . 알비칸스에서, vps15△ 변이체 내 손상된 역행수송은 세포벽 스트레스를 유발하며, 이는 CRZ1 , CHR1 및 UTR2를 전사적으로 상향조절하여 칼시뉴린 신호경로를 활성화한다 (Liu, Y. et al. Role of retrograde trafficking in stress response, host cell interactions, and virulence of Candida albicans. Eukaryot Cell 13, 279-287, doi:10.1128/EC.00295-13, 2014). 그러나, C. 네오포만스에서, 이러한 vps15△ 변이체 내 칼시뉴린 경로의 활성화를 관찰하지 못하였다 (도 14의 e). vps15 △ 변이체 내 CRZ1, CHR1 및 UTR2의 발현수준은 야생형 균주의 발현수준과 대등하였다. C . 네오포만스에서, 세포벽 완전성은 UPR (unfolded protein response) 경로에 의해 또한 제어된다 (Cheon, S. A. et al. Unique evolution of the UPR pathway with a novel bZIP transcription factor, Hxl1, for controlling pathogenicity of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathog. 7, e1002177, doi:10.1371/journal.ppat.1002177 (2011)). 본 발명자들은 선행연구에서 Ire1 키나아제를 통한 UPR 경로 활성화가 HXL1 mRNA에서 일반적이지 않은 스플라이싱을 초래하고, 그에 따라 ER 스트레스 반응을 유발함을 밝힌 바 있다 (Cheon, S. A. et al. Unique evolution of the UPR pathway with a novel bZIP transcription factor, Hxl1, for controlling pathogenicity of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathog. 7, e1002177 (2011)). 실제로, 본 발명자들은 VPS15이 결실된 세포가 기초조건 (basal conditions)에서 야생형 균주와 비교하여 보다 더 많은 스플라이스 된 HXL1 mRNA (HXL1s)을 포함하는 것을 확인하였으며, 이는 C. 네오포만스에서 역행액포수송이 교란되는 경우 칼시뉴린 경로대신에 UPR 경로가 활성화 될 수 있음을 제시한다.
실시예 7: C. 네오포만스에 관련된 신규한 병독성 및 감염성 조절 키나아제
60개의 병원성-관련 키나아제 중에서, 8개는 모델 효모에서 분명한 이종상동체를 가지는 것으로 나타나지 않았고, 그에 따라 병독성-조절 키나아제 (Vrk1) 또는 감염성-조절 키나아제 1-7 (irk1-7)로 명명했다. 특히, Vrk1 (CNAG_06161)의 결실이 곤충 숙주모델에서 C. 네오포만스의 병독성을 감소시키고 (도 5), 생쥐 숙주모델에서 감염성을 약화시켰으므로 (도 6), Vrk1을 주목하였다 (도 15). 이것의 가장 근접한 효모 이종상동체는 Fab1 (score: 140.9, e-value: 3.2E-34)이나, C. 네오포만스에서 가장 근접한 Fab1 이종상동체는 CNAG_01209 (score: 349.7, e-value: 0.0)이다. 흥미롭게도, VRK1 결실은 과산화수소 (hydrogen peroxide) 및 캡슐 생성에 대한 세포 저항성을 증가시킨다 (도 15의 a 및 b). 또한 5-플루사이토신 (5-flucytosine)에 대한 세포 저항성을 증가시켰고 플루디옥시닐 (fludioxonil)에 대한 감수성을 증가시켰다 (도 15의 a). 본 발명자들의 키나아제 변이체 표현형 클러스터에 기초할 때 (도 2), Vrk1는 다른 키나아제와 명확하게 그룹 되어 지지 않았다. Vrk1의 조절 메커니즘을 보다 더 이해하기 위해, 본 발명자들은 야생형과 vrk1 △에 대해 상대적 포스포프로테오믹스분석 (comparative phosphoproteomics analysis)을 수행하여, Vrk1-특이적 포스포-타켓 단백질을 확인하였다. TiO2-부화 기초 포스포프로테오믹스분석은 8개의 잠재적 Vrk1 기질을 제시하였다: CNAG_04190 (TOP1, 토포이소머라아제I), CNAG_01744 (GPP2, a DL-글리세롤-3-포스페이트 포스파타아제), CNAG_05661 (POB3, 헤테로다이머 FACT 복합체 서브유닛), CNAG_01972, CNAG_07381, CNAG_00055, CNAG_02943 (SLM1, a 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 결합 단백질 (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate binding protein)), 및 CNAG_07878 (NOC2, 핵소체 복합체 관련 단백질 (a nucleolar complex associated protein)). CNAG_01972, 07381 및 00055는 명확한 진균 이종상동을 갖지 않았다. 후보 단백질이 Vrk1에 의해 직접 또는 간접적으로 인산화 되는지 명확하지는 않으나, vrk1Δ 변이체에서 5개 후보 단백질 (TOP1, GPP2, POB3, CNAG_01972 및 CNAG_07381)이 손상되었음을 발견하였고 (도 15의 c), 이것은 이들이 Vrk1에 의해 직접적으로 인산화될 수 있음을 제시한다. Vrk1-의존 기능 네트워크를 보다 더 이해하기 위해, 본 발명자들은 Vrk1-조절 표적 단백질 및 Vrk1 자체에 기능적으로 연결된 임의의 단백질을 CryptoNet를 이용하여 검색하였으며, 이들의 기능적 네트워크를 구성할 수 있었다. CNAG_01972 및 00055는 임의의 공지된 단백질에 대해 유의미한 관련성을 갖지 않았다. Vrk1 및 이것의 기질과 관련된 다양한 잠재적인 생물학적 기능 중에서, rRNA 프로세싱이 가장 과다하게 발생하였으며, 이것은 Vrk1이 리보솜 생합성 및 수송에 직접 또는 간접적으로 관련될 수 있음을 제시한다 (도 15의 d).
실시예 8: C. 네오포만스 내 항진균 약물 내성에 관련된 키나아제 분석
키나아제 변이체 라이브러리의 항진균 약물 분석에 기초하여, 각각 총 43, 38 및 42개의 키나아제가 임상에서 사용 중인 항진균 약물인 암포테리신 B (amphotericin B) (a polyene), 플루코나졸 (fluconazole) (an azole) 및 플루사이토신 (flucytosine) (a nucleotide analog) 각각에 대해 증가되거나 감소된 감수성을 나타냈다 (표 4). 이들 약물에 대한 감수성을 증가시킨 결실을 지닌 키키나아제에의 경우, 본 발명자들은 39개 (암포테리신 B에 대해), 24개 (플루코나졸에 대해), 28개 (플루사이토신에 대해) 키나아제를 확인하였고, 이것은 각 약물에 대한 병행치료료 타겟으로 개발될 수 있을 것이다.
오포만스 내 항진균 약물 내성에 관련된 키나아제
Antifungal agents Kinase mutants showing increased resistance Kinase mutants showing increased susceptibility
Polyene (Amphotericin B) HRK1 / NPH1 , SPS1, SWE102 , TCO4 YPK1 , VPS15 , CBK1 , HOG1 , SSK2 , PBS2 , ARG5,6, GAL83 , SNF1 , MKK2 , MPK1 , BUD32 , CKA1, IPK1 , IRE1 , CDC7 , KIC1 , PKA1 , CRK1, BCK1 , TCO2 , IRK5 , IGI1 , GSK3 , UTR1, MEC1 , MET3 , PAN3 , MPS1 , PKH201 , PIK1 , HRK1 , KIC102 , ALK1 , TLK1 , ARK1 , IRK3, KIN1 , POS5
Azole (Fluconazole) GAL83 , PAN3 , ALK1 , TCO1 , STE11 , TCO2, SCH9 , SSK2 , PBS2 , HOG1 , BUD32, PKA1 , CHK1 , YAK1 YPK1 , VPS15 , CBK1 , MKK2 , MPK1 , IPK1 , IRE1, BCK1 , IGI1 , GSK3 , UTR1 , PIK1 , HRK1/NPH1, CDC7 , HRK1 , PSK201 , MPK2 , RAD53, ARG5 ,6, KIC1 , KIC102 , SPS1, IRK6 , MAK322
5-flucyotosine BCK1 , PSK201 , ARG5 ,6, GAL83 , TCO2, SNF1 , IRK5 , PKH201 , VRK1 , CKI1, TCO5 , STE7 , IGI1, URK1 YPK1 , VPS15 , GSK3 , UTR1 , HRK1 / NPH1 , SCH9, BUD32 , CKA1 , MEC1 , FBP26 , CBK1 , HOG1, IPK1 , IRE1 , SSK2 , PBS2 , MET3 , CDC7, KIC1 , PAN3 , TCO1 , PKA1 , CHK1 , CRK1, MPS1 , CDC2801 , TCO6 , BUB1
* 밑줄 표시된 키나아제는 본 발명에서 최초로 확인된 것임.
실시예 9: 성장 및 화학적 감수성 시험
키나아제 변이체 라이브러리의 성장 및 화학적 감수성을 분석하기 위하여, 30 ℃에서 밤새 성장시킨 C. 네오포만스 세포를 10배 연속적으로 희석하고 (0에서 104까지) 하기 화학적 시약을 포함하는 YPD 배지상에 스폿팅하였다: 글루코오스-풍부 (YPD) 또는 글루코오스-부족 (starved) (덱스트로오스 없는 YPD; YP) 조건 하에서, 삼투압 스트레스를 위한 2M 소르비톨 및 양이온/염 스트레스를 위한 1에서 1.5M의 NaCl 및 KCl; 산화적 스트레스를 위한 과산화수소 (H2O2), tert-부틸 하이드로퍼옥사이드 (탄(tan) 유기 퍼옥사이드), 메나디온 (menadione) (초과산화물 음이온 발생기), 디아미드 (티올-특이적 산화제); 독성 중금속 스트레스를 위한 CdSO4; 유전자 독성 스트레스를 위한 메틸 메탄설포네이트 (methyl methanesulfonate) 및 수산화요소 (hydroxyurea); 막 불안정화 스트레스를 위한 황산 도데실 나트륨 (SDS); 세포벽 불안정화 스트레스를 위한 칼코플루오르-화이트 (calcofluor white) 및 콩고 레드 (Congo red); ER 스트레스 및 스트레스 감소를 위한 튜니카마이신 (tunicamycin) 및 디티오트레이톨 (dithiothreitol, DTT); 항진균 약물 감수성을 위한 플루디옥소닐, 플루코나졸, 암포테리신 B, 플루시토신. 세포를 30 ℃에서 배양하고, 2 내지 5일 처리 후에 사진을 찍었다. 다른 온도에서 각각의 변이체의 성장률을 시험하기 위하여, 연속적으로 희석된 세포를 스폿팅한 YPD 플레이트를 25 ℃, 30 ℃, 37 ℃ 및 39 ℃에서 배양하고, 2-4일 후 사진을 찍었다.
실시예 10: 교배 (mating) 분석
각 키나아제 변이체의 교배 표현형을 분석하기 위하여, 상기 표 1의 MATα 키나아제 변이체를 교배 파트너인 혈청형 A MATa 야생형 KN99a 균주와 공배양하였다. 각각의 키나아제 변이체 MATα 균주 및 MATa WT KN99a 균주(입수처: 미국 듀크대학교 Joeseph Heitman 연구실로부터 입수)를 30, 16시간 동안 YPD 배지에서 배양하고 펠렛화 한 후, 세척하고 증류수에 재현탁시켰다. 재현탁된 상기 α 및 a 세포를 동일 농도로 (107 세포/ml) 혼합하고, 이들 5 ㎕를 V8 교배배지 (pH 5) 상에 스폿팅하였다. 교배한 플레이트를 암실에서 7 내지 14일 동안 실온에서 배양한 후, 매 주 관찰하였다.
실시예 11: 시험관내 병독성-인자 (virulence-factor) 생성 분석
병독성-인자 분석으로서, 각각의 키나아제 변이체에 대해 캡슐, 멜라닌 및 우레아제 생성을 조사하였다. 캡슐 생성은 인디아잉크 염색으로 정성 분석하고 (Bahn, Y. S., Hicks, J. K., Giles, S. S., Cox, G. M. & Heitman, J. Adenylyl cyclase-associated protein Aca1 regulates virulence and differentiation of Cryptococcus neoformans via the cyclic AMP-protein kinase A cascade. Eukaryot. Cell 3, 1476-1491 (2004), 크립토크릿 (Cryptocrit)으로 하기와 같이 정량분석하였다. 각각의 키나아제 변이체를 30 ℃, 하룻밤 동안 YPD배지에서 성장시키고, DME (Dulbecco's Modified Eagle's) 고체배지 상에 스폿팅 한 후, 캡슐 유도를 위해 2일 동안 37 ℃에서 배양하였다. 세포를 긁어내고, PBS로 세척한 후, 10% 포르말린 용액으로 고정시키고, PBS로 다시 씻어내었다. 각각의 변이체에 대하여 세포 농도를 3 X 108 세포/ml로 조정하고, 이들 50 ㎕를 3회 반복적으로 마이크로해마토크릿 (microhaematocrit) 모세관 (Kimble Chase) 으로 주입하였다. 모든 모세관을 3일 동안 수직으로 세워두었다. 충전된 세포부피 비를 전체 상 (세포상 및 액체 상)에 대한 충전된 세포 상의 길이의 비율로 계산하여 측정하였다. 상대적 충전 세포부피 비는, 각 변이체의 충전 세포부피 비를 야생형균주에 대한 충전 세포부피로 표준화 (normalization)하여 계산하였다. 상대적 충전 세포부피 비의 통계적 차이를 프리즘6를 이용한 본페로니 교정 (Bonferroni correction)에서 일원배치분산분석 (one-way ANOVA analysis)로 확인하였다 (GraphPad 소프트웨어).
멜라닌 생성을 시험하기 위해, 각 키나아제 변이체를 30 ℃에서 YPD 배지에서 하룻밤 성장시키고, 각 배양액 5 ㎕을 0.1% 또는 0.2% 글루코오스를 함유하는 니거 (Niger) 시드 배지 상에 스폿팅 하였다. 니거시드 플레이트를 37 ℃에서 배양하고, 3-4일 후에 사진을 찍었다. 37 ℃에서 성장 결함을 보이는 키나아제 변이체에 대해서, 멜라닌 및 캡슐 생성을 30 ℃에서 평가하였다. 우레아제 생성을 시험하기 위해, 각 키나아제 변이체를 30 ℃에서 YPD 배지에서 하룻밤 성장시키고 증류수로 세척한 후, 동등한 수의 세포 (5 X 104)를 크리스텐슨 (Christensen's) 아가 배지 상에 스폿팅하였다. 플레이트를 30 ℃에서 2-3일 동안 배양하고, 사진을 찍었다.
실시예 12: 곤충-기반 생체 내 병독성 분석
시험된 C. 네오포만스 균주 각각에 대하여, 최종 영 유충기 (instar larval stage)에 있는 200 내지 300 ㎎의 체중의 벌집나방 (Galleria mellonella) 애벌레 15마리를 1그룹으로 임의로 선택하였다. 이들 에벌레는 수송 일로부터 7일 이내에 도착한 유충을 사용하였다 (Vanderhorst Inc. St Marys, OH, USA). 각각의 C. 네오포만스 균주를 30 ℃에서 하룻밤 YPD 액체배지에서 성장시키고, 3회 세척한 후 PBS에서 동일한 농도로 (106 세포/㎖) 재현탁시켰다. 유충 4 ㎕ 부피 당 총 4,000개의 C. 네오포만스 세포를 두 번째에서 마지막 전각을 통해 10 ㎕-크기 바늘이 구비된 100 ㎕ 해밀튼 주사기와 연속분주기 (PB600-1, Hamilton)를 이용하여 접종하였다. 동등한 부피 (4 ㎕)의 PBS를 비감염 대조군으로 사용하였다. 감염된 유충을 가습챔버 내 페트리디쉬에 두고, 37 ℃에서 배양하면서 매일 관찰하였다. 접촉 시 움직임을 나타내지 않은 유충은 죽은 것으로 간주하였다. 실험 동안 번데기가 된 유충은 통계학적 분석을 위하여 검사하였다. 생존곡선을 프리즘6 (GraphPad)를 이용하여 나타내었다. 로그-랭크 (Mantel-Cox) 시험을 통계학적 분석을 위하여 사용하였다. 각각의 키나아제 변이체에 대하여 두 개의 독립적인 변이체 균주를 시험하였다. 단일 균주를 가지는 키나아제 변이체에 대해서는, 두 번 실험을 반복하였다.
실시예 13: 표식인자 돌연변이유발-기반 생쥐 감염성 분석
고속 (high-through)의 생쥐 (murine) 감염성 분석을 위해, 45개의 상이한 표식인자를 포함하는 NAT 선택 마커를 갖는 키나아제 변이체 그룹을 모았다 (총 4개 그룹). ste50 △ 및 hxl1 △ 변이체를 각각 병독성 및 비병독성 대조균주로 사용하였다 (Cheon, S. A. et al. Unique evolution of the UPR pathway with a novel bZIP transcription factor, Hxl1, for controlling pathogenicity of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathog. 7, e1002177, doi:10.1371/journal.ppat.1002177 (2011), Jung, K. W., Kim, S. Y., Okagaki, L. H., Nielsen, K. & Bahn, Y. S. Ste50 adaptor protein governs sexual differentiation of Cryptococcus neoformans via the pheromone-response MAPK signaling pathway. Fungal Genet. Biol. 48, 154-165, doi:S1087-1845(10)00191-X [pii]10.1016/j.fgb.2010.10.006 (2011)). 각 그룹의 키나아제 변이체 라이브러리를 30 ℃에서 16시간 동안 YPD 배지에서 분리하여 성장시키고, PBS 버퍼로 3회 씻어 내었다. 각 변이체의 농도를 107 세포/㎖로 조정하고, 각 샘플 50 ㎕를 튜브에 넣었다. 각각의 키나아제 변이체 풀 (pool)의 인풋 (input) 게놈 DNA의 제조를 위하여, 200 ㎕의 변이체 풀을 YPD 플레이트 상에 펼치고, 30 ℃에서 2일간 배양한 후 긁어내었다. 아웃풋 (output) 게놈 DNA 샘플의 제조를 위해, 50 ㎕의 변이체 풀 (마우스 당 5 x 105 cells)을 비강 내 흡입을 통해 7주령 암컷 A/J 마우스 (Jackson Laboratory)에 감염시켰다. 감염 15일 후 아베르틴 (Avertin) 과다복용으로 희생시킨 쥐로부터 감염된 폐를 수득하고, 4 ㎖ PBS에서 균질화한 후 100 ㎍/㎖의 클로람페니콜 (chloramphenicol)을 함유하는 YPD 플레이트 상에 펼치고, 30 ℃에서 2일간 배양한 다음 긁어내었다. 전체 게놈 DNA를 CTAB 방법에 의하여 투입 및 생산 세포로부터 추출하였다 (Jung, K. W., Kim, S. Y., Okagaki, L. H., Nielsen, K. & Bahn, Y. S. Ste50 adaptor protein governs sexual differentiation of Cryptococcus neoformans via the pheromone-response MAPK signaling pathway. Fungal Genet. Biol. 48, 154-165, doi:S1087-1845(10)00191-X [pii]10.1016/j.fgb.2010.10.006 (2011)). 정량적 PCR을 표 2 및 표3에 나열된 태그-특이적 프라이머를 사용하고, MyiQ2 실시간 PCR검출시스템 (BioRad)로 수행하였다. STM 스코어를 계산하였다 (Jung, K. W. et al. Systematic functional profiling of transcription factor networks in Cryptococcus neoformans. Nat Comms 6, 6757, doi:10.1038/ncomms7757 (2015)). STM 스코어를 확인하기 위하여, 게놈 DNA 양의 상대적인 변화를 2-△△CT 방법(Choi, J. et al. CFGP 2.0: a versatile web-based platform for supporting comparative and evolutionary genomics of fungi and Oomycetes. Nucleic Acids Res 41, D714-719, doi:10.1093/nar/gks1163 (2013))으로 계산하였다. 투입 대 생산 샘플의 평균 폴드 변화량을 로그 스코어로 (Log2 2-( Ct,Target - Ct,Actin )output - ( Ct,Target - Ct,Actin )input) 계산하였다.
실시예 14: 액포 염색 (Vacuole staining)
액포 형태학을 가시화하기 위해, 야생형 H99S 균주 및 (입수처: 미국 듀크대학교 Joeseph Heitman 연구실로부터 입수) vsp15 △ 균주 (YSB1500 및 YSB1501)를 30에서 16시간 동안 액체 YPD 배지에서 배양하였다. FM4-64 염료(Life Technologies)를 최종 농도 10 μM으로 각각의 배양액에 첨가하고, 30 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 원심분리로 펠릿화 하고 신선한 액체 YPD 배지로 재현탁한 후, 30 ℃에서 30분 동안 추가로 배양하였다. 세포를 다시 펠릿화 하고 PBS 버퍼로 3회 세척 한 후, 1 ㎖의 PBS에 재현탁시켰다. 세포 10 ㎖ 및 마운팅솔루션 (Biomeda) 10 ml를 혼합하고 슬라이드글래스에 스폿팅하였다. 슬라이드글래스를 공초점 현미경 (Olympus BX51 현미경)으로 관찰하였다.
실시예 15: TiO 2 -풍부 기반 포스포프로테오믹스 ( phosphoproteomics )
게놈 규모에서 Vrk1의 인산화된 타겟을 확인하기 위해, H99S 및 vrk1 △ 변이체 균주를 30 ℃에서 16시간 동안 YPD 액체 배지에서 배양하고, 신선한 1리터의 YPD 액체배지로 계대배양 한 후, 600 nm(OD600)에서 대략 0.9의 O.D.에 도달할 때까지 30 ℃에서 추가로 배양하였다. 전체 세포용해물 각각을 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 1% 디옥시콜산 나트륨 (sodium deoxycholate), 5 mM의 피로인산나트륨 (pyrophosphate), 0.2 mM의 오르토바나듐산 나트륨 (orthovanadate), 50 mM NaF, 0.1% SDS, 1% 트리톤 X-100, 0.5 mM 페닐메틸설포닐 플로라이드 (phenylmethylsulfonyl fluoride) (PMSF) 및 2.5x 프로테아제 억제제 칵테일 용액 (Merck Millipore)을 포함하는 용해 버퍼 (Calbiochem)로 제조하였다. 각각의 세포용해물의 단백질 농도를 Pierce BCA 단백질 키트 (Life Technology)를 이용하여 측정하였다. 실온에서 1시간 동안 10 mM DTT로 10 mg의 전체 단백질 용해물을 인큐베이션 하여 단백질 용해물내 시스테인 잔기 사이의 설프히드릴 결합을 감소시킨 후, 암실에서 실온으로 1시간 동안 50 mM 요오드아세트아미드로 알킬레이티드화 하였다. 이들 샘플을 실온에서 30분 동안 40 mM DTT로 다시 처리한 후, 트립신 (Sequencing grade trypsin, Promega)으로 하룻밤 동안 37에서 배양하여 기질 비 1:50 (w/w)로 분해하였다. 다음, 트립신-분해 단백질 용해물을 Sep-Pak C18 컬럼 (Waters corporation, Milford, MA)으로 정제하고 동결건조한 후, -80 ℃에서 저장하였다. 포스포펩타이드를 TiO2MagSepharose비드 (GE Healthcare)로 부화시킨 후, LC-MS/MS 분석을 위해 동결건조하였다. Q Exactive Hybrid Dionex U 3000 RSLC 나노 HPLC 시스템, 나노-일렉트로스프레이 이온화 소스가 장착되고, 퓨전된 실리카 에미터 팁 (New Objective, Wobum, MA) 피팅된 Quadrupole-Orbitrap 질량분석계 (Thermo Scientific, MA, USA)를 사용하여 질량분석을 수행하였다. 모든 포스포펩타이드 샘플을 용액 A (water/ acetonitrile (98:2, v/v), 0.1% formic acid)에서 재구성하고, LC- 나노 ESI-MS/MS 시스템으로 인젝션 했다. 샘플을 Acclaim PepMap 100 트랩 컬럼 (100 ㎛ i.d x 2 cm, nanoViper C18, 5 ㎛ 입자크기, 100 Å 세공 크기, Thermo Scientific)에서 1차 트랩핑 하고, 6분동안 4 ㎕/min의 유속에서 98% 용액A로 세척한 다음, Acclaim PepMap 100 모세관 컬럼 (75 ㎛ i.d x 15 cm, nanoViper C18, 3 ㎛ 입자 크기, 100Å 세공 크기, Thermo Scientific) 상에서 400 nl/min 유속으로 분리하였다. 펩타이드를 2% 내지 35% 용액B (물/아세토니트릴 (water/acetonitrile) (2:98, v/v), 0.1% 포름산 (formic acid)) 구배로 90분 동안, 35 % 내지 90 % 구배로 10분간 분석한 후, 90%로 5분간, 및 마지막으로 5%로 15분간 분석하였다. 펩타이드 결과물을 코팅된 실리카 팁 (PicoTip emitter, New Objective, MA, USA)으로 이온 스프레이 전압 2,000 eV에서 일렉트로스프레이 하였다. 펩타이드를 지정하기 위해, Proteome Discoverer platform (version 1.4, Thermo Scientific)를 통한 SEQUEST 서치 알고리즘을 이용하여, MS/MS 스펙트럼을 C. neoformans var. grubii H99 단백질 데이터베이스 (www.uniprot.org)에서 검색하였다. 다음의 검색 파라미터가 사용되었다: 고정 수식화로서 시스테인 카르바미도메킬레이션 (carbamidomethylation), 가변 수식화로서 메티오닌 산화 및 세린/트레오닌/티로신 인산화. 2개의 미스 클리비지 (miss cleavages)에 의해 펩타이드 확인이 가능하였다. 펩타이드 동정은 1% FDR 컷오프로 필터링 하였다. 스펙트럼 계산 (Spectral counts)으로 야생형과 변이체의 포스포펩타이드의 상대적 과량을 예측하였다. 샘플들 간의 차이를 평가하기 위해, 스투던트 t-테스트를 사용하였다.
실시예 16: ER 스트레스 분석
ER 스트레스-매개 UPR 유도를 모니터링 하기 위해, H99S 및 vps15Δ 변이체 균주를 YPD에서 30 ℃, 16시간 동안 배양하고, 신선한 YPD 액체 배지로 2차 배양한 후, 초기 대수증식기 (OD600 = 0.6)에 이를 때까지 30 ℃에서 추가 배양하였다. 세포를 0.3 ㎍/㎖ 투니카마이신 (TM)으로 1 시간 동안 처리하였다. 세포 펠릿을 액체 질소로 즉시 동결하여 동결건조 하였다. 전체 RNAs를 easy-BLUE (전체 RNA 추출 키트, iNtRON Biotechnology)로 추출하고, cDNA를 MMLV 역전사효소 (Invitrogen)로 합성하였다. HXL1 스플라이싱 패턴 (HXL1 [HXL1S]의 UPR-유도 스플라이싱된 형태 및 HXL1 [HXL1U]의 스플라이싱되지 않은 형태)을 각 균주의 cDNA 샘플과 프라이머 (B5251 및 B5252) 를 사용하는 PCR로 분석하였다 (표 3).
실시예 17: 발현 분석
ERG11의 발현분석을 위해, H99S 균주 및 bud32Δ 변이체를 YPD에서 30 ℃, 액상 YPD 배지에서 16시간 동안 배양하고, 신선한 액상 YPD로 2차배양 했다. 세포가 초기 대수증식기 (OD600 = 0.6)에 이르면, 배양액을 2개의 샘플로 나누었다: 하나는 플루코나졸 (FCZ)로 90분간 처리하고 다른 하나는 처리하지 않았다. 세포 펠릿을 즉시 액체 질소로 동결하여 동결건조하였다. 전체 RNA를 추출하고, 기존에 보고된 것과 같이 각 균주에 대한 전체 각 RNA 샘플로 노던분석을 수행하였다 (Jung, K. W., Kim, S. Y., Okagaki, L. H., Nielsen, K. & Bahn, Y. S. Ste50 adaptor protein governs sexual differentiation of Cryptococcus neoformans via the pheromone-response MAPK signaling pathway. Fungal Genet. Biol. 48, 154-165, doi:S1087-1845(10)00191-X [pii]10.1016/j.fgb.2010.10.006 (2011)). 칼시뉴린 경로에 관련된 유전자에 대한 정량적 역전사-PCR (qRT-PCR) 분석을 위해, H99S 균주 및 vps15Δ 변이체를 액상 YPD에서 30 ℃, 16시간 동안 배양하고, 신선한 액상 YPD 배지에서 초기 대수증식기 (OD600 = 0.8)에 이를 때까지 2차 배양하였다. 다음, 세포를 원심분리하여 펠릿화 하고 즉시 액체질소로 동결한 후, 동결건조 하였다. 전체 RNAs를 추출한 후, RTase (Thermo Scientific)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. CNA1 , CNB1 , CRZ1 , UTR2 및 ACT1-특이적 프라이머쌍 (각각 B7030 및 B7031, B7032 및 B7033, B7034 및 B7035, B7036 및 B7037, B679 및 B680) (표 3)을 qRT-PCR에 사용하였다.
실시예 18: FPK1 과발현 균주의 제작
FPK1 과발현 균주를 제작하기 위해, FPK1의 프로모터를 증폭된 상동재조합 카세트를 사용하여 히스톤 H3의 프로모터로 치환하였다 (도 4의 a). 1차라운드 PCR에서, FPK1의 5'-플랭킹 영역에 대해 프라이머쌍 L1/OEL2, 및 FPK1의 5'-코딩 영역을 위해 프라이머쌍 OER1/PO을 사용하였다. NEO-H3 프로모터는 프라이머쌍 B4017/B4018와 함께 증폭되었다. P H3 :FPK1 카세트의 5' 또는 3' 영역의 2차 라운드 PCR을 위해, 1차 라운드 결과물을 프라이머쌍 L1/GSL 또는 GSR/PO (표2 및 표3의 프라이머)로 DJ-PCR에 의해 오버랩핑 되도록 하였다. 다음, PH3:FPK1 카세트를 바이오리스틱 형질전환 (biolistic transformation)으로 야생형 균주 H99S (입수처: 미국 듀크대학교 Joeseph Heitman 연구실로부터 입수) 및 ypk1Δ 변이주 (YSB1736)내로 도입하였다. 안정적인 형질전환체를 G418를 함유하는 YPD 배지 상에서 선택하고 프라이머쌍 (SO/B79)을 사용하는 진단 PCR로 스크리닝 하였다. 정확한 유전자형을 프라이머 L1/PO를 사용하는 PCR로 증폭된 특이적 프로브를 사용하는 서던블롯으로 확인하였다. FPK1의 과발현이 프라이머 NP1 및 PO를 사용하는 PCR에 의해 증폭된 특이적 노던블롯롯 프로브에 의해 확인되었다 (도 4의 b, c).
실시예 19: 키나아제 페놈 클러스터링
각 키나아제 변이체의 시험관내 표현형 특징을 다음 정량적 기준으로 스코어링 하였다: -3 (강한 감수성 또는 결함), -2 (중간 수준의 감수성 또는 결함), -1 (약한 감수성 또는 결함), 0 (야생형 유사), +1 (약한 내성 또는 강화), +2 (중간 수준 내성 또는 강화), 및 +3 (강한 내성 또는 강화). 각 변이체에 대한 표현형 스코어를 함유하는 엑셀파일을 Gene-E 소프트웨어 (http://www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE-E/)에 업로딩 하였으며, 키나아제 페놈 클러스터링은 원마이너스 피어슨 상관관계 (One minus Pearson correlation)로 도출 될 수 있다.
실시예 20: 크립토코쿠스 키놈 웹-데이터베이스
본 발명자들이 구축한 C. 네오포만스 키나아제 변이체 라이브러리에 대한 페놈 및 게놈 데이터에 대한 일반인의 접근을 위해, 크립토코쿠스 키나아제 데이터베이스를 개발하였다 (http://kinase.cryptococcus.org/). C. neoformans var. grubii H99의 게놈 서열을 브로드 인스티튜트 (Broad Institute) (https://www.broadinstitute.org/annotation/genome/cryptococcus_neoformans/MultiHome.html)로부터 다운로딩하고, 비교 진균 게놈 플랫폼 (Comparative Fungal Genomics Platform) (CFGP 2.0; http://cfgp.snu.ac.kr/)의 표준화된 게놈 데이터 내로 통합하였다 (Choi, J. et al. CFGP 2.0: a versatile web-based platform for supporting comparative and evolutionary genomics of fungi and Oomycetes. Nucleic Acids Res 41, D714-719, doi:10.1093/nar/gks1163 (2013)). SUPERFAMILY (version 1.73)의 HMMER 서열 프로파일을 사용하여 단백질 키나아제 분류를 수행하였다 (Wilson, D. et al. SUPERFAMILY--sophisticated comparative genomics, data mining, visualization and phylogeny. Nucleic Acids Res 37, D380-386, doi:10.1093/nar/gkn762 (2009)). 38개 수퍼패밀리에 속하는 총 64개 패밀리를 잠재적인 키나아제 예측을 위해 사용하였다. 또한, Kinomer (version 1.0) (Martin, D. M., Miranda-Saavedra, D. & Barton, G. J. Kinomer v. 1.0: a database of systematically classified eukaryotic protein kinases. Nucleic Acids Res 37, D244-250, doi:10.1093/nar/gkn834 (2009); Miranda-Saavedra, D. & Barton, G. J. Classification and functional annotation of eukaryotic protein kinases. Proteins 68, 893-914, doi:10.1002/prot.21444 (2007)) 서열 프로파일 및 Microbial Kinome (Kannan, N., Taylor, S. S., Zhai, Y., Venter, J. C. & Manning, G. Structural and functional diversity of the microbial kinome. PLoS Biol 5, e17, doi:10.1371/journal.pbio.0050017 (2007))를 사용하여 키나아제 예측을 보완하였다. InterProScan 62 에 의해 예측된 C. neoformans var. grubii H99 및 단백질 도메인의 게놈 어노테이션 (genome annotation)으로부터의 정보를, 가능성 있는 키나아제- 인코딩 유전자의 최대 범위를 찾기 위해 채택하였다. 각 유전자에 대해, 8종의 바이오인포메틱스 프로그램으로부터의 결과를 제공하여 유전자 어노테이션에 대한 단서를 제시하였다. 또한, SUPERFAMILY, Kinomer 및 Microbial Kinome으로부터의 결과물을 예측의 견고함을 지지하기 제시하였다. 유전자가 C. neoformans var. neoformans JEC21에서 이종상동을 가지는 경우, KEGG 데이터베이스에 대한 링크를 또한 제공하였다. 중요한 생물학적 특성을 지닌 게놈 컨텍스트를 볼 수 있도록 서울대학교 게놈 브라우저 (SNUGB; http://genomebrowser.snu.ac.kr/) (Jung, K. et al. SNUGB: a versatile genome browser supporting comparative and functional fungal genomics. BMC Genomics 9, 586, doi:10.1186/1471-2164-9-586 (2008))가 크립토코쿠스 키나아제 페놈 데이터베이스 (Cryptococcus Kinase Phenome Database)에 제공된다. 키나아제 브라우저에서, SNUGB 모듈에 대한 직접적인 연결이 각 유전자에 대해 제공된다. 크립토코쿠스 키나아제 페놈 데이터베이스는 데이터베이스 관리에 대해 MySQL 5.0.81 (source code distribution) 및 웹 인터페이스에 대해 PHP 5.2.6가 제공된다. 웹 기반 사용자 인터페이스는 Apache 2.2.9 웹서버를 통해 제공된다.
한국미생물보존센터(국내) KCCM51297 20151107

Claims (14)

  1. 하기 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법:
    (a) 병원성-조절(pathogenicity-regulating) 키나아제 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항진균제임을 판별하는 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는 항진균제 스크리닝 방법:
    (a) 병원성-조절(pathogenicity-regulating) 키나아제 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 유전자의 발현량이 감소조절 (down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항진균제임을 판별하는 단계.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 병원성-조절 키나아제 단백질은 BUD32, ATG1, CDC28, KIC1, MEC1, KIN4, MKK1/2, BCK1, SNF1, SSK2, PKA1, GSK3, CBK1, KIN1, SCH9, RIM15, HOG1, YAK1, IPK1, CDC7, SSN3, CKA1, MEC1, ARG5,6P, MET3, VPS15 및 VRK1으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항진균제 스크리닝 방법.
  4. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포가 크립토코쿠스 네오포만스인 것을 특징으로 하는 항진균제 스크리닝 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 항진균제가 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코쿠스증(cryptococcosis)을 치료하기 위한 것을 특징으로 하는 항진균제 스크리닝 방법.
  6. 크립토코쿠스 네오포만스의 병원성-조절(pathogenicity-regulating) 키나아제 단백질에 대한 저해제를 포함하는 항진균용 약학 조성물.
  7. 크립토코쿠스 네오포만스의 병원성-조절(pathogenicity-regulating) 키나아제 단백질을 인코딩하는 유전자에 대한 저해제를 포함하는 항진균용 약학 조성물.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 병원성-조절 키나아제 단백질은 BUD32, ATG1, CDC28, KIC1, MEC1, KIN4, MKK1/2, BCK1, SNF1, SSK2, PKA1, GSK3, CBK1, KIN1, SCH9, RIM15, HOG1, YAK1, IPK1, CDC7, SSN3, CKA1, MEC1, ARG5,6P, MET3, VPS15 및 VRK1으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항진균용 약학 조성물.
  9. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 뇌수막뇌염(meningoencephalitis) 또는 크립토코쿠스증(cryptococcosis)을 치료하기 위한 것을 특징으로 하는 항진균용 약학 조성물.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 저해제가 상기 단백질에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 항진균용 약학 조성물.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 저해제가 상기 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터인 것을 특징으로 하는 항진균용 약학 조성물.
  12. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 아졸계열 또는 비-아졸계열 항진균제와 병용투여되는 것을 특징으로 하는 항진균용 약학 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 아졸계열 항진균제는 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 보리코나졸(voriconazole) 및 케토코나졸(ketoconazole)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항진균용 약학 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 비-아졸계열 항진균제는 암포테리신 B(amphotericin B), 나타마이신(natamycin), 리모시딘(rimocidin), 니스타틴(nystatin) 및 플루디옥소닐(fludioxonil)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항진균용 약학 조성물.


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KR20210061724A (ko) * 2019-11-20 2021-05-28 충남대학교산학협력단 Eif3b(Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B)를 표적으로 하는 항진균제의 스크리닝 방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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AU2000280393A1 (en) * 2000-10-03 2003-05-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Use of mutations of MEC-1 and its related genes in the identification of compounds for treatment of disease
US6953672B2 (en) * 2001-08-21 2005-10-11 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Screen for CDC7 inhibitors
US7125842B2 (en) * 2003-04-07 2006-10-24 Canbas Co. Ltd. Anti-fungal compounds and methods of use
CA2489194A1 (en) * 2004-12-03 2006-06-03 Guilhem Janbon Polypeptides involved in candida biofilm formation and uses thereof
US20060293381A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Kaihei Kojima Fungicidal effect by regulating signal transduction pathways
KR101167988B1 (ko) * 2009-12-18 2012-07-23 연세대학교 산학협력단 진균 감염의 치료를 위한 Ｒａｓ 및 ｃＡＭＰ 신호전달경로 유전자의 용도
WO2010079998A2 (ko) * 2009-01-09 2010-07-15 연세대학교 산학협력단 진균 감염의 치료를 위한 hog, ras 및 camp 신호전달경로 유전자의 용도
EP3338770B1 (en) * 2010-03-08 2023-06-07 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Cdc7 kinase inhibitors and uses thereof
AU2011201932A1 (en) * 2010-11-17 2012-05-31 University Of Rochester Treatment or prevention of fungal infections with PDK1 inhibitors
WO2014008167A2 (en) * 2012-07-02 2014-01-09 Cell Assay Innovations, Inc. Cell-based assays for post-translational enzyme activity

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021054786A2 (ko) 2019-09-18 2021-03-25 (주)앰틱스바이오 뇌수막뇌염 유발 진균의 뇌-혈관 장벽 통과 및 뇌-내부 생존 관련 유전자의 용도
KR20210061724A (ko) * 2019-11-20 2021-05-28 충남대학교산학협력단 Eif3b(Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B)를 표적으로 하는 항진균제의 스크리닝 방법

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Ballou et al. Two Rac paralogs regulate polarized growth in the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans
Chang et al. Molecular mechanisms of hypoxic responses via unique roles of Ras1, Cdc24 and Ptp3 in a human fungal pathogen Cryptococcus neoformans
Qi et al. Stress-and metabolic responses of Candida albicans require Tor1 kinase N-terminal HEAT repeats
Du et al. Identifying anti-prion chemical compounds using a newly established yeast high-throughput screening system
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