PL230549B1 - Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL2, jego metabolit oraz zastosowanie nowego szczepu Lactobacillus plantarum PL2 i jego metabolitu - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum PL2, jego metabolit oraz ich zastosowanie w leczeniu zakażeń grzybiczych i bakteryjnych. Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL2 został zdeponowany, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów we Wrocławiu pod numerem dostępu: B/00078. Przedmiotem wynalazku jest metabolit otrzymany z hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL2, który wykazuje właściwości przeciwgrzybicze i przeciwbakteryjne. Metabolit zawiera kwasy, w tym szczególnie 3-fenylomlekowy i δ-dodekalakton i peptydy, w tym przede wszystkim peptyd określony przez sekwencję NH2-LNPQLELVLLV-COOH. Ujawniono również zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 i/lub metabolitu wytworzonego przez szczep Lactobacillus plantarum PL2 jako środka hamującego rozwój i/lub ograniczającego wzrost populacji grzybów patogennych dla człowieka.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum PL2, jego metabolit oraz ich zastosowanie w leczeniu zakażeń grzybiczych i bakteryjnych.

W ostatnich latach nastąpił wzrost częstości występowania zakażeń grzybiczych u ludzi, wywołanych szczególnie przez gatunki Candida i Aspergillus. Leczenie zakażeń grzybiczych jest trudne z uwagi na ograniczoną liczbę leków i wyrobów medycznych o działaniu przeciwgrzybiczym. Standardowe leczenie zakażeń powodowanych przez grzyby opiera się na podawaniu chemioterapeutyków przeciwgrzybiczych. Dotyczy to szczególnie zakażeń uogólnionych jak np. sepsa u chorych w immunosupresji. Jednakże wzrost liczby takich oportunistycznych zakażeń grzybiczych, a ponadto szybko pojawiająca się oporność na podawane leki wymaga poszukiwań nowych czynników przeciwgrzybiczych do leczenia zakażeń uogólnionych. Badania te są jednak obarczone znacznymi kosztami finansowymi oraz ograniczeniami związanymi z wymogami eksperymentalnymi i klinicznymi.

Inna sytuacja występuje w przypadkach grzybic powierzchniowych pojawiających się coraz częściej i bardzo trudnych w leczeniu ze względu na ich oporność na leki. Dotyczy to przede wszystkim grzybic występujących na powierzchniach śluzówek jamy ustnej, przewodu pokarmowego i pochwy powodowanych przez grzyby z rodzaju Candida. W ostatnich dekadach nie wprowadzono do lecznictwa tych grzybic żadnych nowych grup leków. Zatem prowadzone są intensywne poszukiwania produktów przeciwgrzybiczych pochodzenia naturalnego, produkowanych przez rośliny, algi lub bakterie. Sposoby te są znane i stosowane do zwalczania chorób grzybowych roślin.

Od kilku lat przedmiotem badań naukowych (Chang i Yang i inni z Korei) jest aktywność grzyboi bakteriobójcza związków pochodzenia naturalnego. Prowadzone są badania nad wyselekcjonowaniem mikroorganizmów posiadających aktywność przeciwgrzybiczą.

Z dostępnych informacji wynika, że badania ukierunkowane są na wyselekcjonowanie szczepów Lactobacillus plantarum ze sfermentowanej żywności (kimchi), które przeznaczone są do konserwowania żywności oraz do produkcji kosmetyków.

Znany jest koreański opis patentowy: KR 20110125118 (KR1012221105B1) ujawniający mieszaninę związków zawartych w supernatancie szczepu Lactobacillus plantarum AF1 (KFCC-11340) wyizolowanego ze sfermentowanego kimchi. Patent wymienia takie związki jak kwas mlekowy, szczawiowy, cytrynowy, maleinowy i winowy. Związki te wykazują właściwości przeciwgrzybicze, ocenione w patencie za pomocą metody półilościowej w stosunku do grzybów pleśniowych z rodzajów Aspergillus i Cladosporium i Penicillium oraz drożdżopodobnych z gatunku Candida albicans. Podobną metodą wykazano działanie na 10 gatunków różnych bakterii. Ponadto za pomocą zaawansowanych metod spektroskopii i spektrometrii zidentyfikowano związek określony jako 3,6-bis (2-metylopropylo)-2,5-piperazynodion, czyli cyklo (Leu-Leu) o masie cząsteczkowej 226 i wzorze C12 H22 N2 O2. Należy zauważyć, że podobny związek (cyklo Pro-Leu) został opisany w 2013 roku jako działający hamująco na grzyby pleśniowe. Zatem, supernatant może być stosowany do konserwowania żywności i kosmetyków, jak również w medycynie do leczenia zakażeń powodowanych przez grzyby i pleśnie oraz bakterie. Jest nieszkodliwy dla ludzkiego ciała.

Z polskiego opisu patentowego Pat.209447 pt: „Nowe szczepy z rodzaju Lactobacillus i kompozycja składająca się z nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus znany jest szczep Lactobacillus plantarum 57 B. Wykazano, że cechą wiodącą tego szczepu są silne właściwości antagonistyczne na patogeny bakteryjne takie, jak Gardnerella vaginalis i Escherichia coli, a także średnie działanie antagonistyczne wobec grzybów Candida albicans. Szczep ten zastosowano w kompozycji, zawierającej dodatkowo szczep Lactobacillus fermentum 57 A i Lactobacillus gasseri 57 C, a przeznaczonej do kolonizacji nabłonka pochwy kobiet w celu zapobiegania bakteryjnym zakażeniom pochwy. Kompozycja ta ma działanie profilaktyczne, przy czym nie odnosi się ono do zapobiegania grzybicy pochwy, gdyż działanie zastosowanych bakterii jest zbyt słabe wobec patogennych grzybów.

Antagonizm szczepów probiotycznych wobec innych bakterii chorobotwórczych jest jednym z dokładniej poznanych i udowodnionych mechanizmów działania bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium w pochwie. Polega on na eliminacji drobnoustrojów chorobotwórczych dzięki wytwarzanym metabolitom, takim jak: kwas mlekowy i octowy, pochodzących głównie z fermentacji węglowodanów, syntezie swoistych związków antybakteryjnych czyli substancji podobnych do bakteriocyn: lantybiotyków, laktocyny czy acidofiliny.

Substancje podobne do bakteriocyn lub bardziej precyzyjnie lantybiotyki są aktywnymi biologicznie, peptydowymi substancjami działającymi bakteriobójczo na blisko spokrewnione drobnoustroje.

PL 230 549 B1

Mechanizm ich działania polega wytworzeniu por w ścianie komórek wrażliwych bakterii, przez które wypływają niskocząsteczkowe substancje, takie jak jony i elektrolity zawarte w cytoplaźmie, co w konsekwencji prowadzi do zniszczenia komórki. Szczepy wytwarzające bakteriocyny mają jednocześnie geny zabezpieczające je przed samounicestwieniem. Stosunkowo niewiele jednak wiadomo na temat antagonizmu szczepów probiotycznych wobec grzybów drożdżopodobnych wywołujących grzybicę pochwy i sromu. Ponadto nie jest oczywiste zastosowanie szczepu pochodzenia ludzkiego w odniesieniu do zakażeń ludzi.

Celem wynalazku było wyselekcjonowanie z kolekcji szczepów bakterii z rodzaju Lactobacillus, takiego nowego szczepu i jego metabolitu, które byłyby skuteczne w hamowaniu rozwoju i/lub ograniczaniu wzrostu populacji grzybów patogennych dla człowieka.

Terminem metabolit określa się naturalną mieszaninę każdego związku, substancji lub produktu ubocznego fermentacji prowadzonej przez mikroorganizmy, która ma aktywność bójczą w odniesieniu do bakterii i grzybów.

Istotą wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum PL2. Szczep Lactobacillus plantarum PL2 został zdeponowany, zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (53-114 Wrocław, ul. Rudolfa Weigla 12). Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL2 został zdeponowany w dniu 12 listopada 2014r. i otrzymał numer dostępu do depozytu B/00078.

Wynalazek obejmuje też nowy metabolit otrzymany z hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL2 określonego w zastrz. 1, który wykazuje właściwości antygrzybiczne i antybakteryjne.

Metabolit zawiera kwasy, w tym szczególnie 3-fenylomlekowy i S-dodekalakton.

Metabolit zawiera peptydy, w tym przede wszystkim peptyd określony przez sekwencję NH2-LNPQLELVLLV-COOH,

Wynalazek obejmuje też zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem dostępu B/00078 i/lub metabolitu wytworzonego przez szczep Lactobacillus plantarum PL2 jako środka hamującego rozwój i/lub ograniczającego wzrost populacji grzybów patogennych dla człowieka.

Badania przesiewowe pozwoliły na zidentyfikowanie szczepu Lactobacillus plantarum wyizolowanego z organizmu ludzkiego.

Szczep Lactobacillus plantarum PL2 został wyizolowany w trakcie rutynowych badań ginekologicznych z tylnego sklepienia pochwy zdrowej kobiety w wieku rozrodczym (25 lat) z prawidłową mikroflorą. Materiał po pobraniu został natychmiast przetransportowany do Laboratorium Mikrobiologicznego firmy Prolab, gdzie został opracowany, a wyizolowane szczepy bakterii szczegółowo scharakteryzowane w oparciu o metody genotypowe oraz fenotypowe.

Szczep Lactobacillus plantarum PL2 jest to szczep, który w naturalny sposób kolonizuje drogi rodne kobiety. Dzięki temu oraz specyficznym cechom indywidualnym szczep Lactobacillus plantarum PL2 jest szczególnie predysponowany do leczenia zakażeń grzybiczych i bakteryjnych kobiecych dróg rodnych. Do tej pory nie był znany chemiczny skład metabolitu wytwarzanego przez nowy szczep Lactobacillus platarum PL2. Dzięki zidentyfikowaniu kwasów: 3-fenylomlekowego i δ-dodekalaktonu oraz peptydu o sekwencji: NH2-LNPQLELVLLV-COOH, przyporządkowano tej naturalnej mieszaninie wybitną zdolność do hamowania populaqi grzybów i bakterii.

Niniejszy wynalazek przedstawiono na załączonym rysunku, na którym:

Fig. 1. przedstawia wynik testu API 50 CH dla szczepu Lactobacillus plantarum PL2. Fig. 2 przestawia zdjęcie produktów reakcji PCR w kierunku Lactobacillus plantarum; ścieżki: 1-(szczep PL2);

2- kontrola negatywna; 3-kontrola pozytywna (szczep Lactobacillus plantarum 57B); M-marker wielkości.

Fig. 3. przedstawia strefy zahamowania wzrostu otrzymane dla szczepu Lactobacillus plantarum PL2.

Fig. 4. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wraz z wytworzonym metabolitem wobec wybranych gatunków grzybów drożdżopodobnych z wykorzystaniem metody półilościowej.

Fig. 5. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wraz z wytworzonym metabolitem wobec wybranych gatunków grzybów drożdżopodobnych z wykorzystaniem metody ilościowej.

Fig. 6. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wraz z wytworzonym metabolitem wobec wybranych gatunków bakterii chorobotwórczych z wykorzystaniem metody ilościowej.

Fig. 7. przedstawia antagonistyczne działanie naturalnej mieszaniny δ-dodekalaktonu, kwasu

3- fenylomlekowego oraz peptydu NH2-LNPQLELVLLV-COOH wobec wybranych czynników etiologicznych zakażeń pochwy i sromu.

PL 230 549 Β1

I. Fenotypowa identyfikacja szczepu PL2 z wykorzystaniem zestawu API®50 CH_firmy bioMerieux

Identyfikację fenotypową przeprowadzono za pomocą zestawu API 50 CH zgodnie z zaleceniami producenta. Jest to wy standaryzowany zestaw zawierający 50 testów biochemicznych do badania sposobu metabolizmu węglowodanów przez drobnoustroje. API 50 CH firmy bioMerieux wykorzystuje się do identyfikacji bakterii z rodzaju Lactobacillus i rodzajów spokrewnionych w połączeniu z API 50 CHL Medium (bioMerieux; USA).

Wynik testu API 50 CH dla badanego szczepu z rodzaju Lactobacillus przedstawia Tabela 1,

Tabela. 1. Wynik testu API 50 CH dla szczepu PL2

Probówka	TEST	Wynik
Szczep PL2
0	KONTROLA	-
1	Glicerol
2	Erytrotol	-
3	D-arabinoza	-
4	L-arabinoza	+
5	D-ryboza	-ł-
6	D-ksyloza	-
7	L-ksytoza	-
8	D-adonitol	-
9	Metylo-pD-ksylopiranozyd	-
10	D-galaktoza	+
11	D-glukoza	+
12	D-fruktoza	+
13	D-mannoza	+
14	L-sorboza	-
15	L-ramnoza	-
16	DuicytoJ	-
17	Inozytol	-
18	D-mannitol	+·
19	D-sorbitol
20	Metylo-aD-mannopiranozyd	-
21	Metylo-oD-glukopiranozyd	-
22	N-acctylo-glukozamina	+
23	Amigdalina	+
24	Arbutyna	+
25	Eskulina Cytrynian żelaza	4·
26	Salicyna	+
27	D-celobioza
28	D-maltoza	+
29	D-laktoza (wołowa)	+
30	D-melibioza	4-
31	D-sacharoza	+
32	D-trehaloza	-

PL 230 549 Β1

33	Lrntlina	-
34	Dmeiezytoza	+
35	D-riifinoza	-
36	Skrobia	-
37	Glikogen	-
38	Ksylitol	-
39	Gcncjobioza
40	D-turanoza
41	D-liksoza	-
42	D-tagatoza	-
43	D-fukoza	-
44	L-fukoza	-
45	D-arabitol	-
46	L-arabitol	-
47	Glukonian potasu	+
48	2-ketoglukonian potasu	-
49	S-ketoglukonian potasu	-

Na podstawie otrzymanego profilu biochemicznego program apiWeb zidentyfikował szczep PL2 jako Lactobacillus plantarum (% ID=98 - Bardzo dobra identyfikacja). Wynik testu API 50 CH dla szczepu Lactobacillus plantarum PL2 przedstawiono na Fig. 1.

II. dentyfikacja szczepu Lactobacillus plantarum PL2 z wykorzystaniem metody PCR (ang. Polymerase Chain Reaction)

II. 1. Izolacja genomowego DNA bakterii:

Do izolacji genomowego DNA zastosowano zestaw DNA GeneMATRIX Basic DNA Purification Kit (EURx) wykorzystujący zdolność wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych. Procedura izolacji DNA przebiegała w następujący sposób:

1. 24-godzinną hodowlę komórek bakteryjnych prowadzoną w płynnym podłożu MRS (Biocorp) odwirowywano w objętości 1 ml (2 min., 12 000 rpm).

2. Supernatant usuwano, a osad dokładnie zawieszano w 250 μΙ buforu do zawieszania Celi R (w zestawie) z dodatkiem 200 μΙ niebieskiego buforu lizującego Lysis Blue (w zestawie), aż do uzyskania jednolitej, niebieskiej zawiesiny.

3. Do zawiesiny komórek dodawano 350 μΙ bufora neutralizującego Neutral B (w zestawie). Dokładnie i powoli mieszano zawartość probówek przez kilkukrotne odwracanie, aż do całkowitego zaniku niebieskiej barwy zawiesiny.

4. Po zakończeniu lizy mieszaninę odwirowywano (7 min., 12 000 rpm), a przesącz nakładano na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym i ponownie wirowano (1 min., 12 000 rpm).

5. Złoże dwukrotnie przepłukiwano: najpierw 500 μΙ bufora płuczącego Wash UX1, a następnie 650 pL bufora płuczącego Wash UX2 (w zestawie).

6. Oczyszczone DNA eluowano ze złoża za pomocą 50 μΙ buforu Elution (w zestawie), ogrzanego do temperatury 80°C.

7. Wyizolowane DNA przechowywano w probówce typu Eppendorf w temperaturze 4°C do czasu dalszych analiz.

II. 2. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR):

W tabeli 2 przedstawiono sekwencje użytych starterów oraz wielkość amplikonów.

PL 230 549 Β1

Tabela. 2. Sekwencje starterów i wielkość amplikonów poszukiwanego gatunku bakterii

Starter	Sekwencja 5'^3'	Gatunek	Wielkość amplikonów
Lfpr Planll	GCC GCC TAA GGT GGG AGA GAT TT A CCT AAC GGT A AA TGC GA	L. plantarum	283 pz

Program amplifikacji dla gatunku Lactobacillus prowadzony był w termocyklerze S 1000 (BioRad) i przedstawiał się następująco:

1. 92SC -	2 min
2.95SC -	30 sek^
3.55aC -	30 sek	30x
4.72fiC -	30 sek>
5. 72eC-	1 min

Amplifikację prowadzono zgodnie z metodą Walter i wsp. Z publikacji tej pochodzą również użyte sekwencje starterów.

Po skończonej reakcji PCR produkty amplifikacji byty analizowane w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Próbki nakładano do kieszonek żelu w objętości 7 μΙ z dodatkiem 3 μΙ buforu obciążającego. Elektroforezę prowadzono w buforze TBE o stężeniu 0,5x, przez 1,5 godziny, pod napięciem 80V, w aparacie do elektroforezy (BioRad). Obraz żelu oglądano przy użyciu systemu GelDoc XR + (BioRad), w skład którego wchodził transiluminator UV, kamera zbierająca obraz oraz program komputerowy do dokumentacji i analizy obrazu Image Lab (BioRad). Obecność produktu PCR o odpowiedniej ilości par zasad uznawana była za pozytywny wynik reakcji. Na każdym żelu umieszczano ponadto kontrolę negatywną, którą stanowiła woda destylowana dodawana do buforu reakcyjnego zamiast genomowego DNA bakterii, kontrolę pozytywną, jaką był produkt amplifikacji otrzymany z użyciem DNA szczepu wzorcowego oraz marker wielkości prążków (GeneRuler 100bp, Axygen).

Fig. 2 przestawia zdjęcie produktów reakcji PCR w kierunku Lactobacillus plantarum ścieżki: 1-(szczep PL2); 2-kontrola negatywna; 3-kontrola pozytywna (szczep Lactobacillus plantarum 57B); M-marker wielkości.

Tabela 2a. Zestawienie wyników-identyfikacja gatunkowa przeprowadzona za pomocą testu API 50 CH oraz reakcji PCR

Numer szczepu	Obraz mikroskopowy	Obraz makroskopowy	Test API	Test PCR
PL2	L. plantarum	kremowy	L. plantarum	L. plantarum

III. Oznaczenie wrażliwości na antybiotyki szczepu Lactobacillus plantarum PL2.

W celu zbadania lekooporności szczepu L. plantarum PL2 metodą dyfuzyjne krążkową, zawiesinę hodowli (OD= 0,5 w skali McFarlanda) rozprowadzono na podłożu agarowym MRS (Oxoid) na płytce Petriego. Następnie podłoże z naniesioną zawiesiną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut w celu jej wysuszenia. Po tym czasie na płytkę naniesiono za pomocą jałowej pęsety krążki nasączone odpowiednimi antybiotykami. Inkubację prowadzono w warunkach beztlenowych, przez 24 h w temp. 37°C. Po inkubacji zmierzono strefy zahamowanego wzrostu szczepu bakteryjnego wokół krążka z antybiotykiem (w mm). Odczytu lekooporność różnicującego szczep L. plantarum

PL 230 549 Β1

PL2 na wrażliwy i oporny, dokonano zgodnie z EUCAST. W doświadczeniu wykorzystano następujące antybiotyki: penicylina, ciprofloksacyna, cefaklor, doksacyklina, oksacylina, kotrymoksazol, erytromycyna, ampicylina, klindamycyna, wankomycyna, gentamycyna, metronidazol, (Oxoid).

Tabela 3. Wielkość stref zahamowania wzrostu otrzymane dla badanego szczepu L. plantarum PL2 oraz szczepu wzorcowego L. plantarum ATCC 8014

Antybiotyk	L. plantarum	L. plantarum
Stężenie	PL2	ATCC 8014
Penicylina (P) [1 pg]	14 mm	13 mm
Ciprofloksacyna (CIP) [5 pg]	6 mm	11 mm
Cefaklor (CEC) [30 pg]	31 mm	32 mm
Doksycyklina (DO) [30 pg]	28 mm	26 mm
Oksycylina (ΟΧ) [1 pg]	6 mm	li mm
Kotrymoksazol (SXT) [25 pg]	25 mm	25 mm
Erytromycyna (E) [15 pg]	32 mm	26 mm
Ampicylina (AMP) [2 pg]	32 mm	32 mm
Klindamycyna (DA) [2 pg]	16 mm	18 mm
Gentamycyna (CN) [30 pg]	18 mm	18 mm
Wankomycyna (VA) [30 pg]	6 mm	6 mm
Metronidazol (MTZ) [5 pg]	6 mm	6 mm

Strefy zahamowania wzrostu otrzymane dla szczepu Lactobacillus plantarum PL2 przedstawiono na Fig. 3.

IV. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wobec grzybiczych czynników etiologicznych powodujących zakażenia pochwy i sromu z wykorzystaniem metody półilościowej.

Pierwszym etapem badań było określenie antagonistycznego działania szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wobec wybranych gatunków grzybów drożdżopodobnych związanych z grzybicą pochwy i sromu. Badanie to zostało przeprowadzone w oparciu o półilościową metodę słupkową.

Metoda słupkowa

W badaniu posłużono się zmodyfikowaną metodą półilościową według Fitzsimmons i Berry (Struś M., Kucharska A., Kukla G., Brzychczy-Włoch M., Maresz K., Heczko P.B., The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida, Infect. Dis, Obstet. Gynecol. 2005; 13:69-75).

Do badania wybrano pięć grzybów wzorcowych pochodzenia ludzkiego z kolekcji ATCC tj. Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata ATCC 15126, Candida krusei ATCC 34135, Candida tropicalis ATCC 750, Candida kefyr ATCC 4135.

Metoda polegała na zastosowaniu podłoży dwuwarstwowych. Pierwszą warstwę stanowiło podłoże dla wzrostu Lactobacillus oparte na związkach chemicznych o składzie:

PL 230 549 Β1 • Ekstrakt drożdżowy (Argenta) • Bezwodny octan sodu (Argenta) • Cytrynian sodu (Argenta) • Siarczan magnezu (Argenta) • Chlorek manganu (Argenta) • Siarczan amonu (Argenta) • Glukoza (Argenta)

Na podłoże to posiewano w formie paska o szerokości 2 cm badany szczep probiotyczny z rodzaju Lactobacillus. Po wymazaniu płytki inkubowano w temp. 37°C, w warunkach beztlenowych przez 48 godzin, a po upływie tego czasu na wierzch wylewano drugie, lekko przestudzone płynne podłoże Sabouraud Dextrose (Biocorp) w kierunku wzrostu grzybów wskaźnikowych. Po zastygnięciu, na podłoże wysiewano grzyby z rodzaju Candida o gęstości 0,5 MacFarlanda. Następnie płytki umieszczano na 4 godziny w lodówce (temperatura 4°C), a po upływie tego czasu dalszą inkubację prowadzono już w warunkach tlenowych, w temperaturze 37°C przez 24 godziny.

Uzyskane wyniki oceniono według następującej legendy:

- Brak działania antagonistycznego Lactobacillus wobec szczepów Candida (nie zaobserwowano żadnej strefy zahamowania wzrostu Candida wzdłuż paska z wymazanym szczepem probiotyczny m), + Częściowe działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepów Candida (obserwuje się lekkie zahamowania wzrostu Candida jedynie nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym), ++ Wyraźne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepów Candida (obserwuje się wyraźne zahamowania wzrostu. Candida nad paskiem z wymazanym szczepem pro biotycznym czasami wyraźniej w jego górnej i dolnej części), +++ Bardzo silne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepów Candida (obserwuje się wyraźne zahamowania wzrostu Candida nad paskiem i poza jego powierzchnią wzdłuż całej linii posiewu szczepu probiotycznego).

Tabela 4. Antagonistyczne działanie bakterii z rodzaju Lactobacillus wobec grzybów z rodzaju Candida przy zastosowaniu metody półilościowej

Bakterie z rodzaju Lactobacillus	Candida albicans ATCC 10231	Candida glabrnta ATCC 15126	Candida krusei ATCC 34135	Candida tropicalis ATCC 750	Candida kefyr ATCC 4135
PL2	++	Ήł·	++	+++

Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wobec grzybów z rodzaju Candida przedstawiono na Fig. 4.

V. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wobec grzybiczych czynników etiologicznych powodujących zakażenia pochwy i sromu z wykorzystaniem metody ilościowej.

Kolejnym etapem badań było określenie działania szczepu PL2 wobec tych samych grzybów wskaźnikowych wymienionych w punkcie IV, w oparciu o metodę ilościową. W metodzie ilościowej szczep probiotyczny oraz szczepy grzybów wskaźnikowych hodowano w tej samej probówce zawierającej po 900 mikrolitrów 24 godzinnej hodowli Lactobacillus o średniej gęstości 1x10⁹j.t.k/ml oraz 100 mikrolitrów 24 godzinnej hodowli grzybów wskaźnikowych o średniej gęstości 1x10⁶ j.t.k/ml. Całość dalej hodowano, a po upływie 8 i 24 godzin od rozpoczęcia badania materiał posiewano ilościowo zarówno na stale podłoże przeznaczone do wzrostu Lactobacillus oraz stałe podłoże Sabourauda przeznaczone do wzrostu pozostałych chorobotwórczych grzybów wskaźnikowych. Obliczano liczebność obu populacji, a wynik podawano w jednostkach tworzących kolonie w przeliczeniu na 1 ml (j.t.k./ml).

PL 230 549 Β1

Tabela 5. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wraz z wytworzonym metabolitem wobec wybranych grzybiczych czynników etiologicznych powodujących zakażenia i sromu w oparciu o metodę ilościową

Szczep	O godz j.t.k./ml	8 godz j.t.k./ml	24 godz j.t.k./ml
Candida albicans ATCC 10231	Ι,ΟχΙΟ6	0	0
Candida glabrata ATCC 15126	l,2x!07	0	0
Candida kefyr ATCC 4135	2,0xl06	0	0
Candida krusei ATCC 34135	6,3xl06	0	0
Candida tropicalis ATCC 750	3,0x10^	0	0
Kontrola hodowli L. plantarum PL2	2,0x10’	3,3x10’	3,0xl08
Kontrola hodowli Candida albicans ATCC 10231	3,0xl06	2,5xl07	2,0xl07
Kontrola hodowli Candida glabrata ATCC 15126	5,0x106	3,0x107	2,5x107....................
Kontrola hodowli Candida kefijr ATCC 4135	Ι,ΟχΙΟ6	l,5xl07	3,0xl07
Kontrola hodowli Candida krusei ATCC 34135	3,0xl06	3,0xl07	Ι,ΟχΙΟ7
Kontrola hodowli Candida tropicalis ATCC 750	2,0xl06	l,8xl07	l,2xl07

Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wraz z wytworzonym metabolitem wobec wybranych przedstawiono na Fig. 5.

VI. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wobec bakteryjnych czynników etiologicznych powodujących zakażenia pochwy i sromu z wykorzystaniem metody ilościowej.

W celu określenia aktywności przeciwgrzybiczej szczepu L. plantarum PL2 do 900 mikrolitrów 24-godzinnej hodowli szczepu bakterii kwasu mlekowego o średniej gęstości 1x10⁹ j.t.k/ml, dodawano po 100 mikrolitrów 24-godzinnych hodowli badanych szczepów czynników etiologicznych zakażeń dróg rodnych o średniej gęstości 1x10⁷ j.t.k/ml, przygotowanych przez zawieszanie jednego oczka ezy w 10 ml bulionu TSB (Biocorp) dla bakterii tlenowych oraz 10 ml bulionu Scheadlera (Biocorp) dla bakterii beztlenowych. Całość inkubowano odpowiednio w warunkach tlenowych lub beztlenowych, w temperaturze 37°C. W czasie 0 h oraz po upływie 8 h i 24 godzin inkubacji z każdej z mieszanin wykonano rozcieńczenia dziesiętne, wysiewając kolejno po 100 mikrolitrów mieszaniny na podłoże

PL 230 549 Β1

Columbia (Biocorp) dla szczepów: Streptococcus agalactiae ATCC 13813, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 25923; podłoże McKonkeya (Biocorp) dla szczepu Escherichia coli ATCC 25922 oraz podłoże GV (Oxoid) dla szczepu Gardnerella vaginalis ATCC 14018. Obliczono liczbę kolonii bakterii badanych szczepów patogennych, a wyniki podano w jednostkach tworzących kolonie w przeliczeniu na 1 ml (j.t.k/ml).

Tabela 6. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wraz z wytworzonym metabolitem wobec bakteryjnych czynników etiologicznych powodujących zakażenia pochwy i sromu w oparciu o metodę ilościową

Szczep	O godz j.t.k./ml	8 godz j.t.k./ml	24 godz j.t.k./ml
Escherichia coli ATCC 25922	2x107	0	0
Enterococcus faecalis ATCC 29212	3x107	6x104	0
Staphylococcus aureus ATCC 25923	5x107	0	0
Streptococcus agalactiae ATCC 13813	5xl0ń	0	0
Gardnerella caginalis ATCC 14018	3x106	0	0
Kontrola hodowli L.plantarum PL2	2,0x10^	3,3x10^	3,0x10*
Kontrola hodowli Escherichia coli ATCC 25922	6x107	2x10x	2xlO8
Kontrola hodowli Enterococcus faecalis ATCC 29212	2xl07	3x108	2,2x108
Kontrola hodowli Staphyloco< cus aureus ATCC 25923	2x107	2,5xl08	6x108
Kontrola hodowli Streptococcus agalactiae ATCC 13813	2x107	1.7x106	4x108
Kontrola hodowli Gardnerella caginalis ATCC 14018	5x106	lxl08	lxl08

Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 wraz z wytworzonym metabolitem wobec wybranych gatunków bakterii chorobotwórczych przedstawiono na Fig. 6.

VII. Charakterystyka metabolitu produkowanego przez szczep Lactobacillus plantarum PL2

Termin metabolit określa się naturalną mieszaninę każdego związku, substancji lub produktu ubocznego fermentacji prowadzonej przez L. plantarum PL2 który ma aktywność bójczą w odniesieniu do bakterii i grzybów.

Przeprowadzone analizy jakościowe oraz ilościowe metabolitu bakterii Lactobacillus plantarum PL2 zostały wykonane przy wykorzystaniu metody LC/MS-MS. Ponadto przy zastosowaniu systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UltiMate 3000; Thermo Scientific) sprzężonej ze spektrometrem masowym (LCQ, Thermo Scientific) źródłem jonów typu nanoESI przeprowadzono analizę

PL 230 549 Β1 peptydów zawartych w badanej próbce po odcięciu dużych białek o masie 10 000 kDA. Przeprowadzone analizy pozwoliły na wykrycie w badanym metabolicie następujących kwasów:

• 5-dodekalakton • kwas 3-fenylomlekowy • kwas heksanowy • kwas mlekowy • kwas piroglutaminowy • Mewalonolakton • kwas 3-(4-hydroksyfenylo)mlekowy • cyklo(L-Leu-Gly) • kwas benzoesowy • kwas 3-hydroksydekanowy • kwas 3-hydroksydodekanowy, przy czym w dominującej ilości w metabolicie szczepu L. plantarum PL2 występowały: δ-dodekalakton oraz kwas 3-fenylomlekowy.

Ponadto, w metabolicie szczepu L. plantarum PL2 zidentyfikowano 13 mas peptydomu (min.: 702.57 Da, 626.42 Da, 707.95 Da, 768.79Da, 517.08 Da). Następnie masę 626,42 Da, dla której wykryto statystycznie istotną różnicę pomiędzy próbką kontrolną, którą stanowiło podłoże do hodowli, a badaną poddano sekwencjonowaniu de novo. Uzyskano 11-aminokwasowy peptyd o sekwencji: NH2-LNPQLELVLLV-COOH.

Przykład

Przeprowadzone analizy in vitro pozwoliły na przypisanie aktywności bakteriobójczej oraz grzybobójczej, naturalnej mieszaninie zawierającej δ-dodekalakton oraz kwas 3-fenylomlekowego w połączeniu z peptydem o sekwencji:

NH2-LNPQLELVLLV-COOH.

Antagonistyczne działanie naturalnej mieszaniny δ-dodekalaktonu, kwasu 3-fenylomlekowego oraz peptydu N H2-LNPQLELVLLV-COOH wobec wybranych czynników etiologicznych zakażeń pochwy i sromu przedstawiono na Fig. 7.

Tabela 7. Strefa zahamowania wzrostu badanych szczepów z kolekcji ATCC pod wpływem działania naturalnej mieszaniny δ-dodekalaktonu, kwasu 3-fenylomlekowego oraz peptydu NH2-LNPQLELVLLV-COOH.

Numer krążka	Badany kwas/stężenie	Streptococcus agalactiae	Escherichia coli	Candida albicans
1	Mieszanina: δ-dodekalakton[0,95 pg/mlj kwas 3-fenylomlekowy [687,95pg/ml] NH2-LNPQLELVLLVCOOH	20 mm	19 mm	18 mm

Z danych przestawionych w tabeli wynika, że zastosowanie metabolitu szczepu Lactobacillus plantaraum PL2 prowadzi do zahamowania wzrostu patogenów grzybiczych i bakteryjnych.

Wyniki przeprowadzonych badań wykazały, że szczep Lactobacillus plantaraum PL2 i wytworzony przez niego metabolit są skuteczne wobec grzybów patogennych i bakterii i mogą być wykorzystane jako składnik czynny środka hamującego rozwój i/lub ograniczającego wzrost populacji grzybów patogennych dla człowieka.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL2 zdeponowany w dniu 12 listopada 2014r. w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu pod numerem dostępu: B/00078.
2. 2. Metabolit otrzymany z hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL2 określonego w zastrz. 1, który wykazuje właściwości antygrzybicze i antybakteryjne.

   PL 230 549 Β1
3. 3. Metabolit według zastrz, 2, znamienny tym, że zawiera kwasy, w tym szczególnie 3-fenylomlekowy i 5-dodekalakton.
4. 4. Metabolit według zastrz, 2, znamienny tym, że zawiera peptydy, w tym przede wszystkim peptyd określony przez sekwencję NH2-LNPQLELVLLV-COOH.
5. 5. Zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL2 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem dostępu B/00078 i/lub metabolitu wytworzonego przez szczep Lactobacillus plantarum PL2 jako środka hamującego rozwój i/lub ograniczającego wzrost populacji grzybów patogennych dla człowieka.