PL230484B1 - Sposob wytwarzania peptydowych faz stacjonarnych dla kolumn chromatograficznych, zwlaszcza w chromatografii cieczowej - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania peptydowych faz stacjonarnych dla kolumn chromatograficznych, zwłaszcza w chromatografii cieczowej. Peptydowe fazy stacjonarne mają zastosowanie w technikach separacyjnych i technikach pokrewnych.

Peptydy stanowią jedną z najważniejszych grup związków będących składnikami niezbędnymi do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania każdego organizmu. Kluczowe znaczenie poszczególnych peptydów wynika z ich właściwości, które zależą od jednostek budulcowych - aminokwasów, ich liczby oraz kolejność w jakiej są połączone i to przede wszystkim decyduje o aktywności biologicznej cząsteczki danego polipeptydu. W związku z tym związanie na powierzchni nośnika (najczęściej żelu krzemionkowego) odpowiednich sekwencji aminokwasów pozwala uzyskać wysoce selektywne fazy stacjonarne o zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych dla bardzo dokładnej analizy chromatograficznej.

Znane są fazy stacjonarne zawierające na powierzchni nośnika chromatograficznego immobilizowane peptydy, przy czym ich wytwarzanie zachodzi w wyniku reakcji uprzednio zsyntetyzowanego peptydu z nośnikiem chromatograficznym, zazwyczaj żelem krzemionkowym modyfikowanym ligandami γ-aminopropylowymi.

Celem wynalazku jest opracowanie metody syntezy selektywnych, odtwarzalnych i stabilnych wypełnień kolumn do chromatografii cieczowej stosowanych zarówno w odwróconym układzie faz, jak i chromatografii oddziaływań hydrofilowych do rozdzielania związków biologicznie aktywnych.

Istota sposobu wytwarzaniu peptydowych faz stacjonarnych o ogólnym wzorze 1 na powierzchni nośnika chromatograficznego - żelu krzemionkowego modyfikowanego grupami aminopropylowymi według wynalazku polega na syntezie peptydu przez sekwencyjne przyłączanie aminokwasów poprzez reakcję chemiczną z N-blokowanym aminokwasem w środowisku polarnych rozpuszczalników aprotycznych, w obecności aktywatora grupy karboksylowej, w temperaturze od 20°C do 60°C przez okres od 4 godzin do 24 godzin, usunięciu nadmiaru substratów na filtrze ze spieku ceramicznego lub szklanego poprzez przemywanie kolejno toluenem i metanolem, a następnie poddaniu tak otrzymanego produktu zawierającego monowarstwę aminokwasu reakcji ze związkiem chemicznym odblokowującym grupę aminową przyłączonego aminokwasu rozpuszczonym w polarnym rozpuszczalniku aprotycznym o stężeniu od 10% do 30% objętościowych i mieszanie powstałej zawiesiny przez okres od 5 minut do 30 minut, po czym osunięciu nadmiaru substratów poprzez filtrację i przemywanie na filtrze ze spieku ceramicznego lub szklanego kolejno toluenem i metanolem, a następnie ponownie wielokrotne poddanie derywatyzacji wybranymi aminokwasami kolejno, w ten sam sposób jak wyżej opisany z wytworzeniem peptydu o zaplanowanej, dowolnej liczbie aminokwasów.

Korzystnie, gdy jako ugrupowanie blokujące w N-blokowanym aminokwasie stosuje się grupę 9-fluorenylometoksykarbonylową (Fmoc) albo t-butyloksykarbonylową (Boc), albo benzyloksykarbonylową (Z), albo tritylową (Trt), albo tertbutylową (OtBu), albo tosylową (Tos), albo ftalilową (Pht), albo formylową (For).

Korzystnie, gdy jako polarnych rozpuszczalników aprotycznych używa się chlorku metylenu lub dimetyloformamidu , albo dioksanu.

Korzystnie, gdy jako aktywatora grupy karboksylowej stosuje się N,N'-dicykloheksylokarbodiimid albo chloromrówczan s-butylu, albo N-etoksykarbonylo-2-etoksy-1,2-dihydrochinolinę, albo heksafluorofosforantris(dimetyloamino)-1-benzotriazyloksyfosfoniowy, albo heksafluorofosforan tris (pirolidyno)-1-benzotriazoliloksyfosfoniowy, albo tetrafluoroboran[2-(1-benzotriazolo)]-1,1,3,3-tetrametylouroniowy, albo heksafluorofosforan bromo-tris(pirolidyno)fosfoniowy, albo aktywne estry p nitrofenylowe, albo pentafiuorofenylowe, albo kwas azotowy (III) w ramach metody azydkowej.

Korzystnie, gdy jako czynnik odblokowujący grupę aminową stosuje się roztwór piperydyny w dimetyloformamidzie albo kwas trifluorooctowy w dichlorometanie, albo N,N-diizopropyloetyloaminy albo kwas chlorowodorowy w dioksanie, albo kwas metanosulfonowy w dioksanie, albo trimetylosililofenol w dichlorometanie, albo proces fotolizy.

Korzystnie, gdy filtracje i przemywanie prowadzi się na spieku szklanym o porowatości G-4 według Schotta.

Związanie na powierzchni krzemionki odpowiednich sekwencji aminokwasów, pozwala uzyskać fazy stacjonarne o różnej hydrofobowości i polarności w zależności od potrzeb aplikacyjnych.

W wyniku syntezy otrzymuje się użyteczne wypełnienia w odwróconym układzie faz chromatografii cieczowej, jak również chromatografii oddziaływań hydrofilowych. Dodatkowo specyficzne właści

PL 230 484 B1 wości zsyntetyzowanych faz peptydowych klasyfikują je jako chiralne fazy stacjonarne, zdolne do rozdzielania enancjomerów. Interesującą własnością omawianej grupy adsorbentów jest zmiana właściwości w zależności od zastosowanego pH fazy ruchomej. Zatem kombinacja odpowiednich aminokwasów (oparta głównie na rodzaju ich łańcuchów bocznych) pozwala otrzymać dwubiegunowe fazy stacjonarne, jako alternatywne materiały do analizy zjonizowanych analitów. Projektowanie sekwencji chemicznie związanych aminokwasów pozwala również kreować mechanizmy retencji oparte na specyficznych oddziaływaniach immobilizowanych molekuł z cząsteczkami analitów.

Peptydowe fazy stacjonarne odznaczają się wysoką selektywnością w analizie związków biologicznie aktywnych takich jak nukleozydy, zasady azotowe, flawonoidy, węglowodany oraz alkaloidy purynowe. Peptydowe wypełnienia znajdują również zastosowane do rozdzielania zarówno aminokwasów i peptydów, jak i ich izomerów oraz pochodnych.

Zastosowanie metod instrumentalnych (analiza elementarna pierwiastków, termiczna analiza grawimetryczna, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego dla ciała stałego oraz spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera) pozwoliło zdefiniować strukturę związanych ligandów oraz potwierdzić obecność pożądanych grup funkcyjnych na powierzchni zsyntetyzowanych faz stacjonarnych.

Sposób według wynalazku, nie ograniczając jego zakresu ochrony, został przedstawiony w niżej podanych przykładach jego wykonania.

P r z y k ł a d 1. W reaktorze uniemożliwiającym kontakt reagentów z otoczeniem umieszcza się 5,6 g żelu krzemionkowego modyfikowanego ligandami γ-aminopropylowymi, suszy się pod próżnią 10^-3 MPa w temperaturze 120°C w ciągu 6 godzin za pomocą łaźni olejowej.

Kolejno do reaktora zawierającego wysuszony modyfikowany żel krzemionkowy dodaje się zawiesinę zawierającą glicynę z nieaktywną grupą aminową (blokowaną za pomocą grupy 9-fluorenylometoksykarbonylowej), N,N'-dicykloheksylokarbodiimid (aktywator grupy karboksylowej) w dimetyloformamidzie i dichlorometanie. Reakcję prowadzi się w temperaturze 40°C w czasie 24 godzin.

Produkt reakcji oddziela się od mieszaniny poreakcyjnej na spieku szklanym Schotta o porowatości G-4, przemywa się kolejno toluenem i metanolem.

Następnym krokiem syntezy jest odbezpieczenie grupy aminowej przyłączonego aminokwasu. Usunięcie grupy blokującej przeprowadza się 20% roztworem piperydyny w dimetyloformamidzie, wprowadzając wymienione odczynniki do kolby zawierającej uprzednio przemyty adsorbent. Otrzymaną zawiesinę miesza się 15 minut, ponownie zawartość oczyszcza się od nadmiaru reagentów poprzez przemycie toluenem i metanolem, a następnie suszy w próżni w temperaturze 60°C.

Faza stacjonarna zawierająca pierwszą warstwę aminokwasów może zostać powtórnie poddana reakcji z kolejnym N-blokowanym aminokwasem w sposób analogiczny do wyżej opisanego. Umożliwia to otrzymanie peptydu o dowolnej długości.

P r z y k ł a d 2. W reaktorze uniemożliwiającym kontakt reagentów z otoczeniem umieszcza się 5,6 g żelu krzemionkowego modyfikowanego ligandami y-aminopropylowymi, suszy się pod próżnią 10-3 MPa w temperaturze 120°C w ciągu 6 godzin za pomocą łaźni olejowej.

Kolejno do reaktora zawierającego wysuszony modyfikowany żel krzemionkowy dodaje się zawiesinę zawierającą alaninę z nieaktywną grupą aminową (blokowaną za pomocą grupy 9-fluorenylometoksykarbonylowej), N,N-dicykloheksylokarbodiimid (aktywator grupy karboksylowej) w dimetyloformamidzie i dichlorometanie. Reakcje prowadzi się w temperaturze 40°C w czasie 24 godzin.

Produkt reakcji oddziela się od mieszaniny poreakcyjnej na spieku szklanym Schotta o porowatości G-4, przemywa się kolejno toluenem i metanolem.

Następnym krokiem syntezy jest odbezpieczenie grupy aminowej przyłączonego aminokwasu. Usunięcie grupy blokującej przeprowadza się 20% roztworem piperydyny w dimetyloformamidzie, wprowadzając wymienione odczynniki do kolby zawierającej uprzednio przemyty adsorbent. Otrzymaną zawiesinę miesza się 15 minut, ponownie zawartość oczyszcza się od nadmiaru reagentów poprzez przemycie toluenem i metanolem, a następnie suszy w próżni w temperaturze 60°C.

Faza stacjonarna zawierająca pierwszą warstwę aminokwasów może zostać powtórnie poddana reakcji z kolejnym N-blokowanym aminokwasem w sposób analogiczny do wyżej opisanego. Umożliwia to otrzymanie peptydu o dowolnej długości.

Peptydowych faz stacjonarnych według wynalazku mogą służyć do oznaczania wybranych związków biologicznie aktywnych takich jak: nukleozydy, zasady azotowe, węglowodany, flawonoidy oraz alkaloidy purynowe pozwalając na przeprowadzenie wysoce selektywnych rozdzieleń. Jako eluent można stosować typowe fazy ruchome stosowane w danym układzie chromatograficznym.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania peptydowych faz stacjonarnych dla kolumn chromatograficznych, zwłaszcza w chromatografii cieczowej o ogólnym wzorze 1 na powierzchni nośnika chromatograficznego - żelu krzemionkowego modyfikowanego grupami aminopropylowymi, znamienny tym, że utworzenie łańcucha peptydowego na powierzchni nośnika chromatograficznego następuje poprzez syntezę peptydu polegającą na sekwencyjnym przyłączaniu aminokwasów poprzez reakcję chemiczną z N-blokowanym aminokwasem w środowisku polarnych rozpuszczalników aprotycznych, w obecności aktywatora grupy karboksylowej, w temperaturze od 20°C do 60°C przez okres od 4 godzin do 24 godzin, usunięciu nadmiaru substratów na filtrze ze spieku ceramicznego lub szklanego poprzez przemywanie kolejno toluenem i metanolem, a następnie poddaniu tak otrzymanego produktu zawierającego monowarstwę aminokwasu reakcji ze związkiem chemicznym odblokowującym grupę aminową przyłączonego aminokwasu rozpuszczonym w polarnym rozpuszczalniku aprotycznym o stężeniu od 10% do 30% objętościowych i mieszanie powstałej zawiesiny przez okres od 5 minut do 30 minut, po czym osunięciu nadmiaru substratów poprzez filtrację i przemywanie na filtrze ze spieku ceramicznego lub szklanego kolejno toluenem i metanolem, a następnie ponownie wielokrotne poddanie derywatyzacji wybranymi aminokwasami kolejno, w ten sam sposób jak wyżej opisany z wytworzeniem peptydu o zaplanowanej, dowolnej liczbie aminokwasów.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako ugrupowanie blokujące w N-blokowanym aminokwasie stosuje się grupę 9-fluorenylometoksykarbonylową (Fmoc) albo t-butyloksykarbonylową (Boc), albo benzyloksykarbonylową (Z), albo tritylową (Trt), albo tertbutylową (OtBu), albo tosylową (Tos), albo ftalilową (Pht), albo formylową (For).
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako polarnych rozpuszczalników aprotycznych używa się chlorku metylenu lub dimetyloformamidu, albo dioksanu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aktywatora grupy karboksylowej stosuje się N,N'-dicykloheksylokarbodiimid albo chloromrówczan s-butylu, albo N-etoksykarbonylo-2-etoksy-1,2-dihydrochinolinę, albo heksafluorofosforantris(dimetyloamino)-1-benzotriazyloksyfosfoniowy, albo heksafluorofosforan tris (pirolidyno)-1-benzotriazoliloksyfosfoniowy, albo tetrafluoroboran[2-(1-benzotriazolo)]-1,1,3,3-tetrametylouroniowy, albo heksafluorofosforan bromotris(pirolidyno)fosfoniowy, albo aktywne estry p nitrofenylowe, albo pentafluorofenylowe, albo kwas azotowy (III) w ramach metody azydkowej.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako czynnik odblokowujący grupę aminową stosuje się roztwór piperydyny w dimetyloformamidzie albo kwas trifluorooctowy w dichlorometanie, albo N,N-diizopropyloetyloaminy albo kwas chlorowodorowy w dioksanie, albo kwas metanosulfonowy w dioksanie, albo trimetylosililofenol w dichlorometanie, albo proces fotolizy.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że filtracje i przemywanie prowadzi się na spieku szklanym o porowatości G-4 według Schotta.