PL229829B1 - Sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae), zastosowanie komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) i kompozycja zawierająca komórki macierzyste o symbolu MVC - Google Patents
Sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae), zastosowanie komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) i kompozycja zawierająca komórki macierzyste o symbolu MVCInfo
- Publication number
- PL229829B1 PL229829B1 PL413583A PL41358315A PL229829B1 PL 229829 B1 PL229829 B1 PL 229829B1 PL 413583 A PL413583 A PL 413583A PL 41358315 A PL41358315 A PL 41358315A PL 229829 B1 PL229829 B1 PL 229829B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mvc
- cells
- deer
- cervidae
- symbol
- Prior art date
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 52
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 5
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 title description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 67
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004706 scrotum Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims abstract description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 7
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 claims description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 claims description 4
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims description 3
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 claims description 3
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 201000001881 impotence Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000018406 regulation of metabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 3
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 claims description 2
- 230000034918 positive regulation of cell growth Effects 0.000 claims description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000009795 derivation Methods 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 9
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 6
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 5
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 NANOG Proteins 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 3
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 3
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 3
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 101150087690 ACTB gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010061299 CXCR4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000012000 CXCR4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102100040898 Growth/differentiation factor 11 Human genes 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000893545 Homo sapiens Growth/differentiation factor 11 Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100040681 Platelet-derived growth factor C Human genes 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- RSKPLCGMBWEANE-UHFFFAOYSA-N cacodyl Chemical group C[As](C)[As](C)C RSKPLCGMBWEANE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034196 cell chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 210000001173 gonocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000016548 negative regulation of prostaglandin secretion Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 108010017992 platelet-derived growth factor C Proteins 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002863 seminiferous tubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae), zastosowanie komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) i kompozycja zawierająca komórki macierzyste o symbolu MVC, które znajdują zastosowanie zwłaszcza w leczeniu trudno gojących się ran u ludzi i zwierząt. Komórki te mogą ponadto znaleźć zastosowanie w produkcji środków pielęgnacyjnych i wyrobów medycznych dla ludzi i zwierząt. Sposób polega na tym, że pośmiertnie po odkażeniu skóry worka mosznowego, w najkrótszym czasie, pobiera się jałowo wycinki o grubości od 0,2 cm do 0,4 cm i o powierzchni od 0,4 cm2 do 0,6 cm2 z jąder jeleniowatych (Cervidae), które następnie rozdrabnia się mechanicznie, aż do uzyskania mikroskopijnych fragmentów o wymiarach rzędu setek mikrometrów. Proliferujące komórki wyizolowuje się wykorzystując zjawisko ich migracji, natomiast z wyizolowanych komórek zakłada się hodowlę pierwotną, stosując jako płyn wzrostowy medium hodowlane z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej oraz roztworu glutaminy z penicyliną i streptomycyną, w ilości co najmniej 20% objętości komory hodowlanej. Hodowlę prowadzi się w 5% CO2 i temperaturze 37°C, przez czas potrzebny do co najmniej pięciu pasaży, po czym wyhodowaną linę komórkową zamraża się i przechowuje w ciekłym azocie, w standardowych naczyniach mrożeniowych. Ujawniono również zastosowanie linii komórek macierzystych o symbolu MVC i ich pochodnych jako wyrobu kosmetycznego lub medycznego oraz kompozycji farmaceutycznej lub kosmetycznej, w których substancję aktywną stanowi homogenat uzyskany z linii komórek macierzystych o symbolu MVC.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae), zastosowanie komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) i kompozycja zawierająca komórki macierzyste o symbolu MVC, które znajdują zastosowanie zwłaszcza w leczeniu trudno gojących się ran u ludzi i zwierząt. Komórki te mogą ponadto mogą znaleźć zastosowanie w produkcji środków pielęgnacyjnych i wyrobów medycznyc h dla ludzi i zwierząt.
Komórki macierzyste to niedojrzałe i niezróżnicowane komórki zdolne do samoodnowy, tj. podziału i stworzenia równowartościowej potomnej komórki macierzystej lub do różnicowania w komórki wyspecjalizowane o biologicznej aktywności. W rozwoju zarodkowym są niezbędne do wzrostu i rozwoju narządów, zaś u organizmów dorosłych - do regeneracji, naprawy i utrzymania w dobrej kondycji wielu tkanek. Obecne są wszędzie tam, gdzie komórki zróżnicowane są eliminowane i wymagają uzupełniania przez całe życie. Obecność komórek macierzystych w szpiku kostnym warunkuje hematopoezę, w nabłonku jelit - regenerację, zaś w kanalikach nasiennych - spermatogenezę, co opisane zostało w następujących publikacjach: Oatley J. A., Brinster R. L.: Regulation of Spermatogonial Stem Cell Self-Renewal in Mammals, Annual Review of Cell and Developmental Biology, Annual Reviews, Palo Alto 2008, pp. 263-286, Rossi L., Challen G. A., Sirin O., Lin K. K.-Y., Goodell M. A.: Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 2011, 750, 47-59; Arwert E. N., Hoste E., Watt F. M.: Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nature Reviews Cancer 2012, 12, 170-180 oraz Blanpain C., Fuchs E.: Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2009, 10, 207-U267. Spermatogeneza jest złożonym procesem powstawania plemników w jądrach i stanowi fundament przetrwania gatunku i zróżnicowania genetycznego.
Spermatogonialne komórki macierzyste (SSCs, ang. spermatogonial stem cells) zwane spermatogoniami stanowią podstawę spermatogenezy i płodności osobników męskich. Zgodnie z pub likacją: Phillips B. 7., Gassei K., Orwig K. E.: Spermatogonial stem cell regulation and spermatogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences 2010, 365, 1663-1678, zdolność do odnawiania się i różnicowania we wszystkie komórki organizmu, pochodzące z trzech listków zarodkowych, charakteryzują pluripotancjalne właściwości SSCs.
Spermatogonialne komórki macierzyste są prymitywnymi, diploidalnymi komórkami rozrodczymi kanalików plemnikotwórczych. Odnawiają się niemal przez całe życie, po to aby zachować pulę niezróżnicowanych komórek zdolnych do spermatogenezy i produkcji gamet. Na podstawie badań histologicznych prowadzonych przez Clermont spermatogonia w kanalikach plemnikotwórczych podzielone zostały na dwa typy A i B. Typ A stanowią niezróżnicowane komórki macierzyste, zaś typ B to populacja komórek zróżnicowanych. Obserwacje histologiczne uwydatniły różnice w morfologii i strukturze obu typów komórek. W spermatogoniach typu A jądro właściwie nie zawiera heterochromatyny, co jest główną cechą charakterystyczną komórek niezróżnicowanych. Im bardziej zróżnicowana komórka tym więcej heterochromatyny widocznej w jądrach komórkowych za publikacją: Phillips B. T., Gassei K., Orwig K. E., Spermatogonial stem cell regulation and spermatogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences 2010, 365, 1663-1678. Jest to podstawą do podziału spermatogonii niezróżnicowanych na dwa podtypy: jasny Ap (ang. pale) oraz ciemny Ad (ang. dark). Barwienie histologiczne hematoksyliną i eozyną uwidacznia owalne komórki Ap z homogenną chromatyną. Zaś w mniejszych i okrąglejszych komórkach Ad chromatyna jest granularna, silnie wybarwiona i zlokalizowana głównie na obrzeżach jądra, z jaśniejszą przestrzenią wewnątrz. Sugeruje się, że komórki Ad dzielą się rzadko i stanowią rezerwuar komórek macierzystych. W razie potrzeby zmieniają się w typ Ap, który z kolei ma zdolność do samoodnowy lub do różnicowania, co opisano w publikacjach: Martin L. A., Seandel M.: Propagation of adult SSCs: from mouse to human. BioMed research international 2013, 2013, 384734 oraz Clermont Y.: Spermatogenesis in man - a study of spermatogonial population. Fertility and Sterility 1966, 17, 705.
Wszystkie komórki typu A zlokalizowane są peryferialnie, przy błonie komórkowej. U myszy w zależności od zorganizowania komórki Ap dzieli się na podtypy: As (ang. single) - pojedyncze, niepołączone spermatogonia, które stanowią pulę komórek samoodnawiających się, Apr (ang. paired) - para komórek macierzystych, która po podziale pozostaje połączona mostkiem, podobnie jak kohorta 4, 8 lub 16 komórek również połączona mostkami nazywana Aa1 (ang. aligned). W przeciwieństwie do komórek pojedynczych Ap i Aa1 są komórkami progenitorowymi, które rozpoczną różnicowanie
PL 229 829 B1 i dojrzewanie, począwszy od fazy A1 do A4 i fazy pośredniej, kończąc na stadium zróżnicowanym jako komórki typu B, co opisano w publikacji: M anku G., Culty M.: M ammalian gonocyte and spermatogonia differentiation: recent advances and remaining challenges. Reproduction 2015, 149, R139R157. U ludzi rozróżnia się tylko komórki Ad, Ap oraz zróżnicowane komórki B. Spowodowane jest to unikalnością ludzkiego materiału biologicznego i jego ograniczoną dostępnością. W związku z tym procesy proliferacji i różnicowania spermatogonii u ludzi nadal nie są do końca poznane i w większości opierają się na hipotezach.
Rozwój nowego kierunku - medycyny regeneracyjnej spowodował wzrost zainteresowania komórkami wykazującymi dużą zdolność podziałową, które poddane odpowiednim modyfikacjom lub przetworzeniu mogą być stosowane w odnowie wielu tkanek. Alternatywą dla ludzkich komórek macierzystych, których nie można wykorzystywać przemysłowo mogłyby być zwierzęce zmodyfikowane komórki obcogatunkowe.
Spośród komórek obcogatunkowych zwrócono uwagę na spermatogonialne komórki macierzyste jelenia, charakteryzujące się szybkim procesem odnowy i wzrostu. Odnawiają się one niemal przez całe życie, po to aby zachować pulę niezróżnicowanych komórek zdolnych do spermatogenezy. Już w końcu 3 tygodnia rozwoju ludzkiego zarodka pierwotne komórki płciowe PGC (ang. primordial germ cells), identyfikowane są w węźle zarodkowym. Komórki płciowe w odróżnieniu od towarzyszących im komórek somatycznych wykazują dużą aktywność fosfatazy zasadowej, w ich dalszej migracji do powstających i różnicujących się gonad istotną rolę odgrywają hemokina - czynnik pochodzenia stromalnego 1 (SDF-1 ) dla którego pierwotne komórki płciowe mają receptor CXCR4 a dla przeżycia i proliferacji zasadnicze znaczenie ma receptor c-kit i jego ligand, czynnik wzrostu komórek macierzystych (SCF - ang. stem cell factor) (20). Przeprowadzona analiza i badania nad komórkami macierzystymi prowadzą do wniosku, że wskazane jest wyprowadzenie tych linii, które mogą posłużyć do odnowy i regeneracji tkanek ludzkich i zwierzęcych procedurach medycznych lub kosmetycznych.
Sposób hodowania spermatogonialnych komórek macierzystych ssaka znany z koreańskiego opisu patentowego nr KR20140056949, polega na tym, że komórki jądra oddzielone od jądra świni hoduje się w niskich temperaturach 30-40°C. Spermatogonia komórek macierzystych hodowane są przez długi okres czasu, który wynosi trzy miesiące lub dłużej, po czym są oddzielane i oczyszczane z zachowaniem wysokiej przeżywalności in vitro.
Sposób in vitro proliferacji komórek macierzystych spermatogoniów znany z japońskiego opisu patentowego nr JP2008104401, polega na tym, że komórki macierzyste spermatogoniów namnaża się w pożywce zawierającej PDGF-C lub GDF11.
Wynalazek dotyczy sposobu wyprowadzania linii komórek macierzystych symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) i kierunkowego zastosowania w procesach stymulacyjnych i regeneracyjnych tkanek ludzkich i zwierzęcych.
Istota sposobu według wynalazku polega na tym, że pośmiertnie po odkażeniu skóry worka mosznowego, w najkrótszym czasie, pobiera się jałowo wycinki o grubości od 0,2 cm do 0,4 cm i o powierzchni od 0,4 cm2 do 0,6 cm2 z jąder jeleniowatych (Cervidae), które następnie rozdrabnia się mechanicznie, aż do uzyskania mikroskopijnych fragmentów o wymiarach rzędu setek mikrometrów. Proliferujące komórki wyizolowuje się wykorzystując zjawisko ich migracji. Z wyizolowanych komórek zakłada się hodowlę pierwotną, stosując jako płyn wzrostowy medium hodowlane z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej oraz roztworu glutaminy z penicyliną i streptomycyną, w ilości co najmniej 20% objętości komory hodowlanej. Hodowlę prowadzi się w 5% CO2 i temperaturze 37°C, przez czas potrzebny do co najmniej pięciu pasaży, po czym wyhodowaną linę komórkową zamraża się przechowuje w ciekłym azocie, w standardowych naczyniach mrożeniowych.
Korzystnie, zamrożoną linę komórkową rozmraża się, a następnie poddaje dalszej hodowli.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie linii komórek macierzystych o symbolu MVC i ich pochodnych wyhodowanych z jałowych wycinków z jąder jeleniowatych, jako wyrobu kosmetycznego lub medycznego przeznaczonego do co najmniej jednej aktywności wybranej z grupy: pielęgnacja skóry, regeneracja tkanek ludzkich i zwierzęcych, gojenie ran, stymulacja wzrostu komórkowego, immunostymulacja, regulacja metabolizmu, proliferacja komórek i przyspieszania przemiany materii na poziomie komórkowym, przywracania prawidłowego funkcjonowania stawów, hamowania wydzielania prostaglandyn - działania przeciwzapalnego, stymulacja procesów regeneracyjnych elementów układu nerwowego impotencja, podnoszenia poziomu testosteronu w osoczu krwi u mężczyzn.
PL 229 829 B1
Istota kompozycji farmaceutycznej lub kosmetycznej według wynalazku, polega na tym, że substancję aktywną stanowi homogenat uzyskany z linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) lub jego pochodne.
Korzystnie, jedna jednostka homogenatu zawiera ekstrakt z 1 miliona komórek.
Korzystnym jest również to, że przeznaczona jest do podawania naskórnie, śródskórnie, doustnie lub iniekcyjnie.
Zalety sposobu wyprowadzania linii komórek macierzystych według wynalazku, to przede wszystkim niewygórowane warunki hodowli, duży potencjał proliferacyjny oraz brak problemów natury etycznej, jakie są formułowane wobec badań na ludzkich komórkach embrionalnych. Praktyczna nieśmiertelność komórek hodowlanych, oraz badania poziomu ekspresji genów: SOX2, POU5F1, NANOG, MYC oraz KLF4 w celu wykazania pluripotencji oraz charakteru komórek macierzystych badanej linii SSC dowodzą, że wśród badanej populacji komórek występują komórki macierzyste, wykazujące dużą zdolność podziałową. Wyhodowane komórki mogą być modyfikowane genetycznie i stosowane wówczas w odnowie wielu innych tkanek. Alternatywą dla ludzkich komórek macierzystych, których nie można wykorzystywać przemysłowo mogłyby być zwierzęce zmodyfikowane komórki obcogatunkowe.
W badaniach za pomocą mikroskopii elektronowej określano ultrastrukturę komórek pochodzących z wycinków jądra. Oceniano przede wszystkim ultrastrukturę dwóch populacji małych owalnych komórek niezróżnicowanych. Zarówno komórki jasne jak i ciemne cechuje obecność jądra komórkowego z charakterystycznie rozmieszczoną chromatyną. Niewielka ilość cytoplazmy otaczająca jądro zawiera duże ilości pęcherzyków, endosomów, co jest rzeczą charakterystyczną dla mezenchymalnych komórek macierzystych, oraz nieliczne mitochondria. W komórkach jasnych chromatyna jądrowa jest homogenna, a w ciemnych mniejszych i okrągłej szych komórkach chromatyna jest granularna, silnie wybarwiona i zlokalizowana głównie na obrzeżach jądra, z jaśniejszą przestrzenią wewnątrz, komórki te dzielą się rzadko i stanowią rezerwuar komórek macierzystych. Dodatkową zaletą jest to, że homogenat jest zawiesiną naturalnie skomponowanych w pełni aktywnych białek i peptydów otrzymywanych po rozbiciu ultradźwiękami hodowanych komórek.
Przedmiot wynalazku objaśniony jest w przykładach wykonania i uwidoczniony na rysunku na którym fig. 1 przedstawia fotografie wykonane w odwróconym mikroskopie kontrastowo fazowym, hodowli pierwotnej komórek MVC w pierwszych dniach hodowli, przy czym rosnące komórki układają się w owalne struktury przypominające układ kanalików krętych jądra, fig. 2 - fotografie hodowanych komórek MVC utrwalonych 4% formaldehydem i znakowanych fluorescencyjne, przy czym czerwony barwnik falloidyna-AF647 w tym przypadku jest związany z przeciwciałami monoklonalnymi dla F-aktyny i pozwala na obserwację rozmieszczenia włókien aktynowych stanowiących składnik cytoszkieletu komórki, kolor niebieski to jądro komórkowe (Hoechst), a kolor zielony - cytoplazma komórki (CFSE), fig. 3 - fotografie hodowanych komórek MVC w kontraście Nomarskiego, obrazowane przyżyciowo, fig. 4 - fotografie populacji komórek jasnych i ciemnych w kanalikach krętych jądra jelenia wykonane w transmisyjnym mikroskopie elektronowym, a fig. 9 - poziomy ekspresji genów: SOX2, POU5F1, NANOG, MYC oraz KLF4 przyrównane do poziomu genu referencyjnego ACTB.
P r z y k ł a d 1
Sposób wyprowadzania linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae), polega na tym, że pośmiertnie po odkażeniu skóry worka mosznowego w najkrótszym czasie, pobiera się jałowo wycinki o grubości od 0,2 cm do 0,4 cm i o powierzchni od 0,4 cm2 do 0,6 cm2 z wypreparowanego jądra jeleniowatych (Cervidae). Pobrane wycinki rozdrobniono mechanicznie do uzyskania mikroskopijnych fragmentów o wymiarach około 100-900 mikrometrów. Połowę rozdrobnionej tkanki, pozostawiono do badań mikroskopowych i mikroskopowo-elektronowych a z przeznaczonego do hodowli rozdrobnionego jądra wyizolowano proliferujące komórki, wykorzystując zjawisko migracji. Wyizolowane komórki umieszczono w butelkach hodowlanych. Jako płyn wzrostowy zastosowano medium: SmGM-2 Single Quots firmy CAMBREX, z dodatkiem L-Glutaminy w ilości 1 mM/ml, Penicyliny w ilości 100 j/ml, Streptomycyny w ilości 0,1 mg/ml firmy SIGMA. Komórki umieszczono w cieplarce, gdzie rosły w 5% CO2 i temperaturze +37°C. Linię prowadzano przez cztery miesiące, z wydajnością około 5 milionów komórek w okresie jednego tygodnia. Wyhodowaną linię komórkową umieszczono w naczyniach mrożeniowych i poddano zamrożeniu w ciekłym azocie w temperaturze -176°C.
Następnie przeprowadzono badania porównawcze i identyfikacyjne na części rozdrobnionej tkanki.
PL 229 829 B1
Do badań mikroskopowych pobrany materiał został utrwalony w 4% roztworze zbuforowanej formaliny, odwodniony i zatopiony w bloczkach parafinowych. Skrawki do badań mikroskopowych barwiono hematoksyliną i eozyną (H+E). Na podstawie badań w mikroskopie świetlnym stwierdzono, że na błonie własnej kanalików krętych spoczywa tzw. nabłonek plemnikotwórczy, w którym obserwuje się różniące się morfologicznie komórki, których kształt i wielkość związana jest z przebiegiem spermatogenezy.
Materiał do badań mikroskopem elektronowym, utrwalano 2,5% aldehydem glutarolowym w buforze cacodylowym (0,1 M) pH 7,4, a następnie odwoniono i zatopiono w Eponie 812. Skrawki kontrastowano metodą rutynową i oglądano w mikroskopie SEM / FIB - FEI Helios NanoLab 450 HF.
Badania na wyprowadzonej linii komórek macierzystych.
Po kilku dniach obserwacji hodowli komórkowej w mikroskopie odwróconym kontrastowofazowym, zaobserwowano spontaniczne podziały i różnicowanie się komórek. W pierwszych dniach hodowli rosnące komórki układają się w owalne struktury przypominające układ kanalików krętych jądra. W hodowli zawsze obecne są małe nieprzytwierdzone, niezróżnicowane, owalne, opalizujące komórki. Z czasem rosnąc stają się większe, uzyskując obwodowe wypustki, którymi niejednokrotnie łączą się między sobą, a także z podłożem. Wzrost komórek jest nieograniczony i po wielu pasażach zachowują one swą aktywność podziałową.
Mikroskopem konfokalnym Zeiss Celi Observer SD wykonano przyżyciową analizę mikroskopową komórek w hodowli w świetle przechodzącym i techniką fluorescencji.
Reakcją PCR wykonano badanie poziomu ekspresji genów: SOX2, POU5F1, NANOG, MYC oraz KLF4 w celu wykazania pluripotencji oraz charakteru komórek macierzystych badanej linii MVC. Poziomy badanych genów przyrównane zostały do poziomu genu referencyjnego ACTB. Wyniki eksperymentu wykazały zróżnicowany poziom ekspresji badanych genów, charakterystycznych dla komórek macierzystych. Mikroskopią elektronową badano ultrastrukturę komórek pochodzących z wycinków jądra. Oceniano przede wszystkim ultrastrukturę komórek nabłonka plemnikotwórczego zwracając szczególną uwagę na populacje komórek jasnych i ciemnych. W obu przypadkach cechuje je obecność dużego jądra komórkowego z aktywną luźną chromatyną i jąderkiem. Niewielka ilość cytoplazmy otaczająca jądro zawiera duże ilości pęcherzyków i wakuoli, nieliczne mitochondria.
P r z y k ł a d 2
Sposób wyprowadzania linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) przebiega jak w przykładzie pierwszym z tą równicą, że zamrożoną linę komórkową rozmraża się, a następnie poddaje dalszej hodowli.
P r z y k ł ad 3
Zastosowanie linii komórek macierzystych o symbolu MVC otrzymanej zgodnie z przykładem pierwszym ich pochodnych jako wyrobu kosmetycznego lub medycznego przeznaczonego do co najmniej jednej aktywności wybranej z grupy: pielęgnacja skóry, regeneracja tkanek ludzkich i zwierzęcych, gojenie ran, stymulacja wzrostu komórkowego, immunostymulacja, regulacja metabolizmu, proliferacja komórek i przyspieszania przemiany materii na poziomie komórkowym, przywracania prawidłowego funkcjonowania stawów, hamowania wydzielania prostaglandyn - działania przeciwzapalnego, stymulacja procesów regeneracyjnych elementów układu nerwowego, impotencja, podnoszenia poziomu testosteronu w osoczu krwi u mężczyzn.
P r z y k ł a d 4
Kompozycja farmaceutyczna lub kosmetyczna zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik jako substancję aktywną zawiera homogenat uzyskany z linii komórek macierzystych o symbolu MYC z jąder jeleniowatych (Cervidae) lub jego pochodne, przy czym jedna jednostka homogenatu zawiera ekstrakt z 1 miliona komórek. Kompozycja przeznaczona jest do podawania naskórnie, śródskórnie, doustnie lub iniekcyjnie.
Pochodna komórek macierzystych MVC jest oczyszczoną zawiesiną aktywnych białek, odgrywających kluczową rolę w procesach wzrostu, proliferacji i różnicowania się komórek. Są to białka o małej masie cząsteczkowej (7-20kDa) i dużej aktywności biologicznej. Mają postać cząstek sygnałowych, którymi są najczęściej czynniki wzrostu i różnicowania oraz cytokiny. Czynniki wzrostu są bardzo skutecznym induktorem procesów naprawczych organizmu. W zależności od typu, mogą stymulować proliferację komórek pochodzenia nabłonkowego, mezodermalnego lub endodermalnego, regulować proces angiogenezy oraz uczestniczyć w chemotaksji komórek. Czynniki wzrostu są ewolucyjnie konserwatywnymi białkami, działają przez receptory błonowe o charakterze kinazy tyrozynowej i wykazują działanie plejotropowe.
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wyprowadzania linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae), znamienny tym, że pośmiertnie po odkażeniu skóry worka mosznowego, w najkrótszym czasie, pobiera się jałowo wycinki o grubości od 0,2 cm do 0,4 cm i o powierzchni od 0,4 cm2 do 0,6 cm2 z jąder jeleniowatych (Cervidae), które następnie rozdrabnia się mechanicznie, aż do uzyskania mikroskopijnych fragmentów o wymiarach rzędu setek mikrometrów, zaś proliferujące komórki wyizolowuje się wykorzystując zjawisko ich migracji, natomiast z wyizolowanych komórek zakłada się hodowlę pierwotną, stosując jako płyn wzrostowy medium hodowlane z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydlęcej oraz roztworu glutaminy z penicyliną i streptomycyną, w ilości co najmniej 20% objętości komory hodowlanej, przy czym hodowlę prowadzi się w 5% CO2 i temperaturze 37°C, przez czas potrzebny do co najmniej pięciu pasaży, po czym wyhodowaną linę komórkową zamraża się i przechowuje w ciekłym azocie, w standardowych naczyniach mrożeniowych.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zamrożoną linę komórkową rozmraża się, a następnie poddaje dalszej hodowli.
- 3. Zastosowanie linii komórek macierzystych o symbolu MVC otrzymanej zgodnie z zastrz. 1, i ich pochodnych jako wyrobu kosmetycznego lub medycznego przeznaczonego do co najmniej jednej aktywności wybranej z grupy: pielęgnacja skóry, regeneracja tkanek ludzkich i zwierzęcych gojenie ran, stymulacja wzrostu komórkowego, immunostymulacja, regulacja metabolizmu, proliferacja komórek i przyspieszania przemiany materii na poziomie komórkowym, przywracania prawidłowego funkcjonowania stawów, hamowania wydzielania prostaglandyn - działania przeciwzapalnego, stymulacja procesów regeneracyjnych elementów układu nerwowego impotencja, podnoszenia poziomu testosteronu w osoczu krwi u mężczyzn.
- 4. Kompozycja farmaceutyczna lub kosmetyczna zawierająca substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że substancję aktywną stanowi homogenat uzyskany z linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) lub jego pochodne.
- 5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że jedna jednostka homogenatu zawiera ekstrakt z 1 miliona komórek.
- 6. Kompozycja według zastrz. 4 albo 5, znamienna tym, że przeznaczona jest do podawania naskórnie, śródskórnie, doustnie lub iniekcyjnie.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL413583A PL229829B1 (pl) | 2015-08-17 | 2015-08-17 | Sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae), zastosowanie komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) i kompozycja zawierająca komórki macierzyste o symbolu MVC |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL413583A PL229829B1 (pl) | 2015-08-17 | 2015-08-17 | Sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae), zastosowanie komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) i kompozycja zawierająca komórki macierzyste o symbolu MVC |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL413583A1 PL413583A1 (pl) | 2017-02-27 |
| PL229829B1 true PL229829B1 (pl) | 2018-08-31 |
Family
ID=58091986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL413583A PL229829B1 (pl) | 2015-08-17 | 2015-08-17 | Sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae), zastosowanie komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) i kompozycja zawierająca komórki macierzyste o symbolu MVC |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL229829B1 (pl) |
-
2015
- 2015-08-17 PL PL413583A patent/PL229829B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL413583A1 (pl) | 2017-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10072248B2 (en) | Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into hepatocyte | |
| AU2013403887B2 (en) | Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into neuron | |
| US9994820B2 (en) | Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into chondrocyte | |
| Resca et al. | Enrichment in c-Kit improved differentiation potential of amniotic membrane progenitor/stem cells | |
| RU2668803C2 (ru) | Способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью из мезенхимальных стволовых клеток путем использования фракции флоротаннина | |
| US10542743B2 (en) | Isolation, expansion and characterization of wharton's jelly mesenchymal stem cells | |
| RS65645B1 (sr) | Postupak za proizvodnju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija od adipoznih mezenhimalnih matičnih ćelija i indukovane pluripotentne matične ćelije proizvedene tim postupkom | |
| AU2013403883B2 (en) | Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into adipocyte | |
| US10053669B2 (en) | Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into osteoblast | |
| KR101895648B1 (ko) | 치수줄기세포를 포함하는 신경질환 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법 | |
| PL229829B1 (pl) | Sposób wyprowadzenia linii komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae), zastosowanie komórek macierzystych o symbolu MVC z jąder jeleniowatych (Cervidae) i kompozycja zawierająca komórki macierzyste o symbolu MVC | |
| Kolokol’tsova et al. | Characteristics of trophoblasts in long-term culture | |
| CN108048390A (zh) | 一种制备血管内皮细胞的方法及其专用试剂盒 | |
| KR101633019B1 (ko) | 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포주의 제조방법 및 수득된 세포주 | |
| CN105264066B (zh) | 由间充质干细胞生产诱导性多能干细胞的方法以及由该方法生产的诱导性多能干细胞 | |
| Asadollahi et al. | Effect of Mouse Liver Extract on in Vitro Differentiation of Amniotic Membrane Stem Cells into Hepatocyte-Like Cells. |