PL229593B1

PL229593B1 - Kompozycja kleju tkankowego, sposób jej otrzymywania i zastosowanie

Info

Publication number: PL229593B1
Application number: PL415767A
Authority: PL
Inventors: Renata WAWRZASZEK; Renata Wawrzaszek
Original assignee: Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu
Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2016-01-12
Publication date: 2018-08-31
Also published as: WO2017123109A1; PL415767A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowa kompozycja kleju tkankowego, sposób jej otrzymywania i zastosowanie w codzienne praktyce chirurgicznej, zwłaszcza do zamykania i uszczelniania niewydolnych naczyń układu żylnego lub wrodzonych anomalii naczyniowych.

Przewlekła niewydolność żylna to współcześnie problem społeczny w krajach rozwiniętych. Szacuje się że w Wielkiej Brytanii leczenie samych owrzodzeń żylnych rocznie kosztuje około 400600 mln funtów, w USA ponad 1 miliard rocznie. Z badań przeprowadzonych w krajach Europy Zachodniej wynika, że żylaki kończyn dolnych występują u 35-53% populacji, 25-33% kobiet i 10-20% mężczyzn. W Polsce w 2003 r. według badań wieloośrodkowych przewlekła niewydolność żylna we wszystkich stadiach zawansowania dotyczyła prawie połowy Polaków, częściej kobiet 50,99%. Żylaki kończyn dolnych stwierdzono łącznie u 34% badanych, u 25% badanych występowały na obu kończynach. Przewlekła niewydolność żylna to zaburzenia funkcji naczyń żylnych: powierzchniowych lub głębokich. Wywołana jest niewydolnością zastawek żylnych. Może być schorzeniem wrodzonym lub nabytym. Upośledzenie może dotyczyć żył powierzchniowych i łączących je perforatorów a także żył głębokich. Objawy, które zwiastują niewydolność żylną to skurcze w łydkach, drętwienie, mrowienie, pieczenie, obrzęki, ból nóg, uczucie ciężkości nóg, nocny kurcz mięśni, zespół niespokojnych nóg. Choroba żylna bywa przyczyną absencji chorobowej, długotrwałej niezdolności do pracy, niejednokrotnie może przyczynić się do wcześniejszego przejścia na rentę, może również prowadzić do zakrzepicy i zatorowości płucnej zagrażającej nagłą utratą życia.

Kleje tkankowe stosowane w medycynie uważane są za najbardziej przyszłościową metodę spajania. Kleje tkankowe mogą stanowić skuteczną alternatywę w praktyce klinicznej, w przypadkach gdy nie jest możliwe opanowanie krwawienia za pomocą skleroterapii lub opaskowania. Stosowanie klejów tkankowych usprawnia zabiegi i skraca czas hospitalizacji. Mimo zapotrzebowania w różnych dziedzinach medycyny wybór klejów tkankowych wciąż jest niewielki. Co więcej, kleje, mimo bardzo obiecujących wyników klinicznych, nie są pozbawione wad np. wywołują odczyn zapalny, degradują w wilgotnym środowisku biologicznym.

US7449498 ujawnia kompozycję kleju do naczyń żylnych obejmującą n-butylo-2-cyjanoakrylan i fosforan beta-trójwapniowy zmieszane w stosunku 1:4 lub 1:7.

US3667472 ujawnia zastosowanie chirurgiczne monomerycznych klejów C2-C4 alfa-cyjanoakrylanu. Wadą tej klasy klejów jest ich przeciwwskazanie do stosowania w narządach wewnętrznych, a tym samym zespoleniach ze względu na dobrze udokumentowaną toksyczność i działanie onkogenne.

Ze stanu techniki (US6174919) znany jest klej tkankowy n-butylo-2-cyjanoakrylowy (Histoacryl®). Mimo licznych prac badawczych z zakresu zastosowania kleju cyjanoakrylowego istnieją liczne, budzące kontrowersje doniesienia na temat jego aplikacji, bezpieczeństwa i wyników leczenia. Klej n-butylo-2-cyjanoakrylowy ulega polimeryzacji w kontakcie z żywą tkanką, polimeryzuje gwałtownie wg mechanizmu anionowego, czas polimeryzacji zależny jest od rodzaju tkanki (nie spływa w obecności krwi i płynów organicznych), maksymalną odporność mechaniczną osiąga po 60-90 sekundach, w czasie polimeryzacji temperatura nie jest wyższa niż 45°C (dochodzi do znaczącego lokalnego wzrostu temperatury w miejscach klejonych). Spoina po utwardzeniu jest twarda, nieelastyczna, kleje tego typu szybko inicjują hemostazę. Ich wadą jest dość duża kruchość, warstwa kleju eliminowana jest przez rozkład hydrolityczny. Stosuje się je do bardzo małych szczelin, max. do 0,15 mm. Im grubsza jest warstwa kleju, tym mniej kompletny jest proces polimeryzacji. Klej n-butylo-2-cyjanoakrylowy nie jest w stanie wypełnić żadnych ubytków, może być również trudne użycie go do aplikacji na ranach o dużej powierzchni. W czasie aplikacji klej n-butylo-2-cyjanoakrylowy przylega do rękawiczek i narzędzi chirurgicznych, co w pierwszej chwili utrudnia wprowadzenie, często też ulega utwardzeniu na etapie dozowania. Zbyt duża ilość podawanego kleju, duże rozcieńczenie z lipiodolem mogą sprzyjać powstaniu zatorów w krążeniu, natomiast zbyt szybkie podanie kleju może sprzyjać powikłaniom zatorowym. Ponadto, klej n-butylo-2-cyjanoakrylowy charakteryzuje ostry, gryzący zapach, który jest szczególnie odczuwalny przy zmniejszonej wilgotności powietrza. Działa w ten sposób drażniąco na układ oddechowy, a opary mogą wywoływać uczucie senności i zawroty głowy.

W literaturze pojawiają się doniesienia o powikłaniach z użyciem n-butylo-2-cyjanoakrylanu, obserwowano przypadki zatorowych powikłań, czasami o bardzo ciężkim przebiegu. Opisano również pojedyncze przypadki zatorów w płucach, śledzionie, zator wrotnej żyły, zatoru lub zakrzepicy żyły wrotnej i śledzionowej, zatoru do mózgu i uogólnioną zatorowość w płucach, mózgu i naczyniach

PL 229 593 B1 wieńcowych oraz śledzionie. Znany jest także przypadek z zatorem zlokalizowanym w lewej żyle nerkowej, żyle głównej dolnej i równocześnie w tętnicy płucnej. U chorego występowały ponadto powikłania septyczne, pod postacią zapalenia płuc związanego z zawałem płuca i nawracających ropni około nerkowych z ciężkim przebiegiem.

Obserwowano także powikłania septyczne i ciężki przebieg u chorego z zatorami płucnymi. Przypadki o bardzo ciężkim przebiegu ze zgonem są sporadyczne.

Podsumowując, istnieje pilna potrzeba opracowania udoskonalonej kompozycji kleju tkankowego lub uszczelniacza, który znosi dotychczasowe wady stanu techniki i może być stosowany w codziennej praktyce chirurgicznej do zamykania i uszczelniania niewydolnych naczyń układu żylnego.

Celem wynalazku jest opracowanie receptury kleju, który minimalizowałby niepożądane efekty aktualnie stosowanych substancji klejących. Celem wynalazku jest dostarczenie kompozycji kleju medycznego, w którym składniki dobrane są jakościowo i ilościowo w taki sposób, że spoina klejowa umożliwia elastyczne i trwałe połączenie kleju ze ścianą żyły. Problemem technicznym rozwiązywanym przez wynalazek jest dostarczenie kompozycji kleju medycznego do zamykania lub uszczelniania niewydolnych naczyń układu żylnego lub wrodzonych anomalii naczyniowych. Dostarczana kompozycja umożliwi zakotwiczenie substancji klejącej w porach i nierównościach łączonych, a także oddziaływanie sił spójności wewnętrznej (kohezji), tak aby powstało silne wiązania chemiczne, charakteryzujące się dużą szczelnością, dobrymi wskaźnikami fizykochemicznymi (wytrzymałość, twardość, elastyczność) oraz odpornością wobec enzymów.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja kleju tkankowego do zamykania lub uszczelniania niewydolnych naczyń układu żylnego lub wrodzonych anomalii naczyniowych zawierająca:

a) od 85-86% wag. poli(metylo-winylo-siloksanu),

b) 5,4-6,5% wag. dwutlenku krzemu,

c) 8,5-8,6% wag. związku sieciującego, przy czym stosunek poli(metylo-winylo-siloksanu) do dwutlenku krzemu wynosi od 13:1 do 16:1.

Korzystnie, lepkość poli(metylo-winylo-siloksanu) wynosi 18 000 mPa-s - 23 000 mPa-s w temperaturze 25°C.

Korzystnie, powierzchnia BET dla dwutlenku krzemu wynosi 175-225 m²/g.

Korzystnie, związkiem sieciującym jest katalizator platynowy.

Korzystnie, kompozycja kleju medycznego zawiera 85% wag. poli(metylo-winylo-siloksanu), 6,5% wag. dwutlenku krzemu, 8,5% wag. platynowego katalizatora.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania kompozycji kleju tkankowego do zamykania lub uszczelniania niewydolnych naczyń układu żylnego lub wrodzonych anomalii naczyniowych jak przedstawiono powyżej, obejmujący:

a) zmieszanie poli(metylo-winylo-siloksanu) z dwutlenkiem krzemu w proporcjach 13:1-16:1,

b) homogenizowanie mieszaniny,

c) odstawienie mieszaniny na 12 h,

d) dodanie związku sieciującego,

e) homogenizowanie mieszaniny do momentu uzyskania kleju o jednorodnej konsystencji.

Korzystnie, dwutlenek krzemu przed wprowadzeniem do lepiszcza suszy się przez 48 h w temp.

50°C w suszarce laboratoryjnej.

Korzystnie, związkiem sieciującym jest katalizator platyny.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja kleju tkankowego określona powyżej do leczenia niewydolnych naczyń układu żylnego lub wrodzonych anomalii naczyniowych. Kompozycja kleju według wynalazku oznaczana jest w niniejszym opisie symbolem R_88. Bazę kleju stanowi lepiszcze poli(metylo-winylo-siloksan), mający w swojej ogólnej strukturze grupy funkcyjne, bezpośrednio przyłączone do łańcucha siloksanowego grupy metylenowe, grupy wodorometylowe (lepkość 18 000 m-Pas - 23 000 m-Pas w temperaturze 25°C), ponadto nowa kompozycja zawiera dwutlenek krzemu (powierzchnia BET 175-225 m²/g) oraz środek sieciujący - platynowy katalizator.

Klej według wynalazku jest klejem syntetycznym, wyklucza więc ryzyko związane z obecnością składnika pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego (bakterie, wirusy, alergie). Opracowany klej utwardza się poprzez reakcję z wilgocią (najpierw powstaje „skórka” na powierzchni, a następnie proces utwardzania następuje w głąb spoiny, reakcję dodatkowo przyspiesza podwyższona temperatura 37°C, czas utwardzania ulega nieznacznie wydłużeniu przy niższych poziomach wilgoci. Klejąca kompozycja jest zdolna do sieciowania w temperaturze 37°C, ma dobrą stabilność termiczną w stanie utwardzonym. Klej według wynalazku jest wysoce elastyczny, posiada właściwości kompensacyjne, co

PL 229 593 B1 prowadzi do tego że miejsce klejenia nie jest uszkadzane nawet w przypadku działania sił ściskających i powraca do położenia wyjściowego po usunięciu obciążenia. Otrzymany produkt jest bezbarwny, bezzapachowy, nie wykazuje objawów rozdzielania się czy pleśnienia. Podany stopniowo klej R_88 jest w stanie całkowicie wypełnić światło żyły, dopasowując się do kształtu, wnika w szczeliny dzięki swojej kapilarności. Wprowadzony do żyły inicjuje kompleksową reakcję pomiędzy składnikami krwi a powierzchnią kleju, ulegając polimeryzacji w wilgotnym środowisku, pozostaje w żyle i nie zostaje usunięty przez krew tamując jednocześnie krwawienie z żyły. Utwardzona spoina klejowa skuteczne uszczelnia z zachowaniem elastyczności.

Rozwiązanie dostarcza połączenie klejowe uwzględniające czynniki materiałowe (struktura i właściwości kleju), technologiczne (sposób przygotowania i nanoszenia masy klejowej), warunki utwardzania spoiny klejowej, konstrukcyjne (obciążenia, ukształtowanie elementów złącza), warunki eksploatacyjne pracy kleju (agresywność, zakres temperatury, wielkość i charakter naprężeń). Dodatkowo zaprojektowane i wytworzone spoiwo zespalające powierzchnie wykazuje elastyczność tak więc struktury zespalane mogą się odkształcać zgodnie z zachowaniem naturalnym w ciele człowieka lub zwierzęcia.

Klej do celów medycznych według wynalazku spełnia kryteria stawiane materiałom implant owanym, jednocześnie odznacza się wytrzymałością przy łączeniu z powierzchnią klejoną, wykazuje dobrą przyczepność z zachowaniem odpowiedniej elastyczności i trwałości w środowisku biologicznym.

Zaprojektowany klej może służyć do zamykania i uszczelniania niewydolnych naczyń układu żylnego.

Opis figur

Fig. 1 Zaklejanie żyły. Procedura wpuszczania kleju do naczynia odbywa się stopniowo przy pomocy skalibrowanego dozownika o wyglądzie pistoletu. Klej aplikowany jest do światła żylaka przy pomocy specjalnego zestawu cewników. Pozwala to na kontrolowane i bardzo precyzyjne zasklepienie niewydolnego naczynia żylnego. (http://www.centerforvein.com/blog/new-treatment-methods-in- phlebology, nasmed.com.pl).

Fig. 2 Wykres zmian pH roztworu Ringera kleju R_88 w czasie 33 miesięcy inkubacji.

Fig. 3 Zestawienie porównawcze wyników dla testu MTT przedstawiono jako średnią żywotność komórek w kleju w stosunku do kontroli, którą przyjęto za 100%.

Fig. 4 Zestawienie porównawcze wartości względnego wskaźnika żywotności komórek dla kleju R_88 i lepiszcza dla rozcieńczeń kondycjonowanego medium (100%, 50%, 25%, 12,5%).

Fig. 5 Wartości względnego wskaźnika żywotności komórek dla rozcieńczeń kondycjonowanego medium (0,2%, 0,15%, 0,1%, 0,05%).

Fig. 6a i 6b Wyniki badań in vitro, ocena mikroskopowa lepiszcza kleju: [7] wyciąg o stężeniu 100%; [8] wyciąg o stężeniu 50%; [9] wyciąg o stężeniu 25%; [10] wyciąg o stężeniu 12,5%, [11] próba pozytywna SLS (dodecylosiarczan sodu, zw. laurylosiarczan sodu) 0,2 mg/ml, [12] próba pozytywna SLS (dodecylosiarczan sodu, zw. laurylosiarczan sodu) 0,15 mg/ml, [13] wyciąg o SLS 0,1 mg/ml, [14] próba pozytywna SLS (dodecylosiarczan sodu, zw. laurylosiarczan sodu) 0,05 mg/ml, [15] kontrola, [16] brzeg lepiszcza, [17] pod lepiszczem, [18] pod lepiszczem hodowla po 24 h inkubacji.

Fig. 7a i 7b Wyniki badań in vitro, ocena mikroskopowa kleju R_88: [19] wyniki badań cytotoksyczności kleju R_88 wyciąg o stężeniu 100%, [20] wyciąg o stężeniu 50%, [21] wyciąg o stężeniu 25%, [22] wyciąg o stężeniu 12,5%, [23] próba pozytywna SLS (dodecylosiarczan sodu, zw. laurylosiarczan sodu) 0,2 mg/ml, [24] próba pozytywna SLS (dodecylosiarczan sodu, zw. laurylosiarczan sodu) 0,15 mg/ml, [25] wyniki badań cytotoksyczności kleju R_88 wyciąg o stężeniu SLS 0,1 mg/ml, [26] próba pozytywna SLS (dodecylosiarczan sodu, zw. laurylosiarczan sodu) 0,05 mg/ml, [27] kontrola, [28] brzeg kleju R_88, [29] pod klejem R88, [30] pod klejem, hodowla po 24 h inkubacji.

Fig. 8 Obraz mikroskopowy powierzchni kawałka króliczego ucha, żyła wypełniona całkowicie klejem R_88 po 90 dniach od implantacji.

Fig. 9a Obraz makroskopowy po operacji po 14 dniach zaklejenia żyły brzeżnej króliczego ucha klejem R_88.

Fig. 9b Grupa kontrolna po 14 dniach od operacji - klej tkankowy cyjanoakrylowy (Histoacryl®), obraz makroskopowy po 1 4 dniach po operacji zaklejenia żyły brzeżnej króliczego ucha.

Fig. 10a Obraz makroskopowy po 90 dniach zaklejenia żyły brzeżnej króliczego ucha klejem R_88.

Fig. 10b Grupa kontrolna: Obraz makroskopowy po 90 dniach od operacji zaklejenia żyły brzeżnej króliczego ucha klejem tkankowym Histoacryl®.

Fig. 11-13 Ocena histologiczna klejów.

PL 229 593 B1

Fig. 11 a Wyniki badań po 2 tygodniach dla żyły z klejem R_88, Histoacryl® (klej kontrolny) obraz mikroskopowy prawidłowej skóry wraz z przydatkami, tkanki chrzęstnej oraz naczyń krwionośnych. W świetle naczyń widoczne erytrocyty. Barwienie HE, pow. 100x.

Fig. 11 b Wyniki badań histologicznych po 2 tygodniach zdjęcie przedstawiające zachowanie żyły obok zaklejonego miejsca klejem R_88, klej Histoacryl® (klej kontrolny), obraz mikroskopowy prawidłowej skóry wraz z przydatkami, tkanki chrzęstnej oraz naczyń krwionośnych. W świetle naczyń widoczne erytrocyty. Barwienie HE, pow. 100x.

Fig. 12a Wyniki badań histologicznych po 30 dniach dla żyły z klejem R_88 i Histoacryl® (klej kontrolny) obraz mikroskopowy prawidłowej skóry wraz z przydatkami, tkanki chrzęstnej oraz naczyń krwionośnych. W świetle naczyń widoczne liczne erytrocyty. Barwienie HE, pow. 100x.

Fig. 12b Zestawienie porównawcze przedstawiające zachowanie żyły obok zaklejonego miejsca klejem R_88, Histoacryl® (klej kontrolny) po 30 dniach obraz mikroskopowy prawidłowej skóry wraz z przydatkami, tkanki chrzęstnej oraz naczyń krwionośnych. W świetle naczyń widoczne liczne erytrocyty. Barwienie HE, pow. 100x.

Fig. 13a Wyniki badań histologicznych po 90 dniach dla żyły wypełnionej klejem R_88, Histoacryl® (klej kontrolny), obraz mikroskopowy prawidłowej skóry, tkanki chrzęstnej oraz naczyń krwionośnych. W świetle naczyń widoczne liczne erytrocyty. Barwienie HE, pow. 100x.

Fig. 13b Zestawienie porównawcze przedstawiające zachowanie żyły obok zaklejonego miejsca klejem R_88, Histoacryl® (klej kontrolny) po 90 dniach obraz mikroskopowy prawidłowej skóry, tkanki chrzęstnej oraz naczyń krwionośnych o nieco poszerzonym świetle. W świetle naczyń widoczne grupy erytrocytów. Barwienie HE, pow. 100x.

Przykłady

P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie kleju medycznego

Spoiwo kleju, lepiszcze (lepkość 18 000 mPa-s - 23 000 mPa-s w temperaturze 25°C) zmieszano z dwutlenkiem krzemu (powierzchnia BET 175-225 m²/g), całość homogenizuje się w ciągu 60 min z szybkością obrotową mieszadła 300 [obr./min] mieszadłem mechanicznym laboratoryjnym, po czym odstawia się na 12 h, następnie dodaje się związek sieciujący, platynowy. Całość homogenizuje się po wprowadzeniu wszystkich wymienionych składników w podanych ilościach i kolejności jeszcze 5 minut z szybkością około 50 [obrotów/minutę] do momentu uzyskania kleju o jednorodnej konsystencji.

W składzie tych klejów nie ma zmiękczaczy, plastyfikatorów itp. substancji stabilizujących.

Dwutlenek krzemu przed wprowadzeniem do lepiszcza suszy się w suszarce 48 h w temp 50°C w suszarce laboratoryjnej.

Wszystkie lepkości, o których mowa w niniejszym opisie, odpowiadają wielkości lepkości dynamicznej w 25°C mierzonej, w sposób znany, jako gradient szybkości ścinania reprezentatywny dla swego zastosowania.

P r z y k ł a d 2. Ocena wyglądu zewnętrznego

Ocenę wyglądu zewnętrznego i właściwości dokonano na podstawie oględzin bezpośrednio po sporządzeniu kleju - ocena wizualna (Tabela 1)

T a b e l a 1

Klej	Badanie barwy	Badanie konsystencji	Zapach	Obecność zanieczyszczeń obcych
R_88	przezroczysta	jednorodna, nierozwarstwiająca, bez zbryleń, skoagulowanych, nieroztartych składników, daje się łatwo nakładać i rozprowadzać, brak grudek	brak	brak

P r z y k ł a d 3. Oznaczenie trwałości masy klejowej (cechy organoleptyczne)

Metoda polega na wzrokowej ocenie roztworu kleju (jak dla oznaczenia rozpuszczalności kleju), próbki kleju zamknięto szczelnie w pojemniku szklanym i przechowywano w temperaturze pokojowej. Po upływie 24 godzin oceniano stan masy klejowej - czy nie nastąpiło rozwarstwienie. Trwałości masy klejowej przedstawiono w Tabeli 2.

PL 229 593 B1

T a b e l a 2

Klej	Trwałość masy klejowej	Rodzaj spoiny
R_88	nie nastąpiło rozwarstwienie, spoina klejowa jest gładka, bez spękań, pomarszczeń	elastyczna

P r z y k ł a d 4. Badania twardości

Na każdej próbce dokonano pomiarów w pięciu miejscach. Odległości pomiędzy poszczególnymi miejscami pomiaru wynosiły co najmniej 5 mm. Twardość odczytywano po upływie 3 s od chwili przyłożenia twardościomierza do próbki. Za wynik oznaczania twardości przyjmuje się średnią arytmetyczną wszystkich pomiarów. Różnica między poszczególnymi wynikami a średnią arytmetyczną wszystkich pomiarów nie może być większa niż ±2 jednostki Shore'a. Twardość Shore'a typu A przedstawia Tabela 3.

T a b e l a 3

Klej	Twardość wyjściowa badanych próbek klejów (^oSh)
R_88	46

P r z y k ł a d 5. Oznaczenie trwałości masy klejowej (cechy organoleptyczne)

Metoda polega na wzrokowej ocenie roztworu kleju (jak dla oznaczenia rozpuszczalności kleju), próbki kleju zamknięto szczelnie w pojemniku szklanym i przechowywano w temperaturze pokojowej. Po upływie 24 godzin oceniano stan masy klejowej, czy nie nastąpiło rozwarstwienie (Tabela 4).

T a b e l a 4

P r z y k ł a d 6. Prowadzenie procesu degradacji długoterminowej

Badania długoterminowe kleju tkankowego polegały na inkubacji kleju tkankowego przez 33 miesiące w cieplarce w 37°C w roztworze Ringera (skład 1 l roztworu zawiera: substancje o stężeniu: chlorek sodu - 8,60 g/l, chlorek potasu - 0,30 g/l, chlorek wapnia 0,48 g/l, jony o stężeniu: Na+ 147,16 mmol/l, K+ 4,02 mmol/l, Ca+² 2,19 mmol/l, Cl^- 155,56 mmol/l) i wodzie destylowanej. Stosunek objętości roztworu do masy próbki był większy niż 30:1.

Zmiany stabilności zaprojektowanych próbek kleju monitorowano przez pomiar pH w roztworze Ringera i wodzie destylowanej. Pomiarów dokonywano przy użyciu pH-metru CP-315 Elamtron, przed każdym pomiarem urządzenie kalibrowano.

Uzyskane wyniki badań wykazują, że próbki kleju w roztworze symulującym środowisko żywego organizmu-roztworze Ringera, w temperaturze 37°C przez cały okres prowadzenia procesów degradacyjnych nie powodują zmian wartości pH. Wyniki badań są zgodne z wymaganiami normy ISO 1099312. Badany materiał jest trwały i zachowuje się bardzo stabilnie w środowisku płynów fizjologicznych, otrzymane wyciągi wodne były bezbarwne, klarowne i bez zapachu.

P r z y k ł a d 7. Wyniki badań cytotoksyczności

Ocena działania cytotoksycznego: test bezpośredni

Do badań wykorzystano płytki 12-dołkowe (Nunc), na które wysiano 1 ml komórek zawieszonych w pełnym medium hodowlanym (1x10⁵ kom/ml). Po 24 godzinnej inkubacji (37°C, 5% CO2) nałożono na warstwę komórek fragmenty kleju o powierzchni nie mniejszej niż 10% powierzchni dołka. Po 24 inkubacji oceniono mikroskopowo zmiany morfologiczne w hodowli. Test wykonano w 5-krotnym powtórzeniu. Test przeprowadzono zgodnie z normą ISO 10993-5:2009(E).

Przygotowanie wyciągów

Do przygotowania wyciągów użyto materiał w proporcji 3 cm² powierzchni/1 ml medium z surowicą. Wyciągi inkubowano 24 h w temperaturze 37°C. Do badań przygotowano stężenia wyciągów: 100%, 50%, 25%, 12,5%.

PL 229 593 B1

Ocena działania cytotoksycznego: test pośredni. Test MTT

Kleje tkankowe kontaktujące się z krwią bezpośrednio muszą się charakteryzować biozgodnością, choć zawsze w jakimś stopniu ulegają interakcji z płytkami krwi, oddziałują na czynniki układu krzepnięcia i fibrynolizy. Negatywnym wynikiem tego działania jest tworzenie zakrzepów, które mogą doprowadzić do zamknięcia światła żyły lub być źródłem powikłań zakrzepowo-zatorowych. Żywotność komórek w kondycjonowanym medium pozwala na analizę interakcji badanego kleju z medium hodowlanym naśladującym ustrojowe płyny, pozwala prognozować zachowywanie się badanego kleju przy dłuższym kontakcie z płynami ustrojowymi oraz określenie wpływu na odpowiedź biologiczną.

Badania przeprowadzono na linii komórkowej mysich fibroblastów L929 (pasaż 21). Hodowlę komórkową prowadzono w standardowych warunkach (37°C, 5% CO2) w inkubatorze (Thermo Scientific) w medium hodowlanym MEM (Pracownia Chemii Ogólnej IITD PAN we Wrocławiu). Medium suplementowano surowicą FBS (Lonza)-10%, oraz L-glutaminą ze streptomycyną (10 mg/ml) i penicyliną (10,000 U/ml) (Sigma)-1%, zgodnie z zaleceniami. Hodowle prowadzono w butelkach o powierzchni 75 cm² (Falcon). Komórki pasażowano wykorzystując 0,25% trypsynę w EDTA (Sigma), oraz PBS (Lonza). Do badań wykorzystano płytki 96-dołkowe (Falcon).

Na płytkach 96-dołkowych (Falcon) wysiano komórki w objętości 100 gl płynu hodowlanego w ilości 1x10⁵ kom/ml (1x10⁴ kom/dołek). Dla każdego wyciągu przygotowano n = 12 powtórzeń, dla kontroli n = 24. Do oceny cytotoksyczności wyciągów wykorzystano test MTT (Sigma) przeprowadzony po 24 godzinach inkubacji komórek z wyciągami. Po okresie inkubacji medium zlewano, dodawano do każdego dołka 50 gl roztworu MTT w medium MEM (stężenie 1 mg/ml) bez suplementów i bez czerwieni fenolowej (Pracownia Chemii Ogólnej IITD PAN we Wrocławiu). Po 2 godzinach inkubacji roztwór zlewano, do każdego dołka dodawano 100 gl izopropanolu. Po 0,5 h inkubacji mierzono absorbancję przy długości fali 570 nm (spektrofotometr Epoch, Biotek), obliczano żywotność komórek w procentach (V%) w stosunku do kontroli, którą przyjęto za 100%, na podstawie zależności:

V = (Pb/Pk) · 100% [%] gdzie: Pk - próba kontrolna, Pb - próba badana.

Test przeprowadzono zgodnie z normą ISO 10993-5:2009 (E).

Test MTT pozwala na ilościową ocenę cytotoksyczności badanych związków. Zasada testu opiera się na konwersji żółtej soli tetrazolowej (MTT) w mitochondriach żywych komórek do fioletowej pochodnej - formazanu. Stopnie toksyczności dla testu z zastosowaniem wyciągów (zgodnie z PN-EN ISO 10993-5:2009) przedstawiono w Tabeli 5.

T a b e l a 5

Stopień	Toksyczność	Opis zmian w hodowlach
0	brak	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek, brak zahamowania wzrostu komórek
1	słaba	nie więcej niż 20% komórek zaokrąglonych, obkurczonych, odklejających się od podłoża, bez zagęszczeń cytoplazmy, pojedyncze komórki rozerwane
2	umiarkowana	nie więcej niż 50% komórek zaokrąglonych, bez ziarnistości, rozległa liza komórek i puste przestrzenie między komórkami
3	średnia	nie więcej niż 70% komórek zaokrąglonych, komórki uległy lizie
4	silna	prawie całkowicie lub całkowicie zniszczona hodowla komórkowa

Zgodnie z normą PN-EN ISO 10993-5:2009 żywotność komórek na poziomie 70% i mniej oraz zmiany w hodowli komórkowej powyżej 2 stopnia świadczą o cytotoksyczności badanego biomateriału.

Dla spoiwa (lepiszcza) który jest głównym składnikiem kleju tkankowego i decyduje o pożądanej przyczepności, a także wytrzymałości mechanicznej spoiny, po jej zestaleniu (utwardzeniu) zaobserwowano zahamowanie wzrostu komórek i spadek żywotności do 66,70%, nie zaobserwowano także w tym wypadku lizy komórek ani zmian powyżej 2 stopnia w hodowli.

W przypadku kleju R_88 żywotność hodowli 96,92%.

Ważną zaletą kompozycji kleju według wynalazku jest jej nietoksyczny charakter, umożliwiający stosowanie kompozycji jako wewnętrzny klej, bez wiążących się z tym obaw o bezpieczeństwo, ponieważ z danych literaturowych wynika, iż kompozycje kleju GRF odniosły ograniczony sukces ze

PL 229 593 B1 względu na stosowanie gorących roztworów żelatyny, w wielu przypadkach dochodzi do podrażnienia tkanek na skutek użycia aldehydu. Kleje fibrynowe, podane donaczyniowo mogą doprowadzić do stanów zakrzepowo-zatorowych i rozsianego wykrzepiania śródnaczyniowego, w rzadkich przypadkach występują reakcje alergiczne (uczucie kłucia i pieczenia w miejscu aplikacji, skurcz oskrzeli, bradykardia, duszność, dreszcze uderzenia gorąca, ból głowy, pokrzywka, niedociśnienie, nudności, senność, świąd, niepokój, tachykardia, mrowienie, świszczący oddech, wymioty, ucisk w klatce piersiowej, świszczący oddech). W pojedynczych przypadkach reakcje te nasilają się do ciężkich anafilaktycznych reakcji, istnieje również ryzyko przeniesienia zakażenia wirusowego. Działanie cytotoksyczne lepiszcza kleju przedstawia Tabela 6. Działanie cytotoksyczne kleju R_88 przedstawia Tabela 7.

T a b e l a 6

Materiał	Ilość oznaczeń (n)	Wyciąg	Opis zmian w hodowli	Ocena zmian w hodowli
lepiszcze	6	100% (rys. 7)	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek i zmian kształtu, zahamowanie wzrostu komórek	1
	6	50% (rys. 8)	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek i zmian kształtu, zahamowanie wzrostu komórek	1
	6	25% (rys. 9)	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek i zmian kształtu, zahamowanie wzrostu komórek	1
	6	12,50% (rys. 10)	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek i zmian kształtu, nieznaczne zahamowanie wzrostu komórek	1
próba pozytywna	6	SLS 0,2 mg/ml (rys. 11)	całkowicie zniszczona hodowla komórkowa. Rozległa liza komórek	4
próba pozytywna	6	SLS 0,1 mg/ml (rys. 12)	całkowicie zniszczona hodowla komórkowa. Rozległa liza komórek	4
próba pozytywna	6	SLS 0,15 mg/ml (rys. 13)	nie więcej niż 70% komórek zaokrąglonych, komórki uległy lizie	4
próba pozytywna	6	SLS 0,05 mg/ml (rys. 14)	nie więcej niż 20% komórek zaokrąglonych, obkurczonych, odklejających się od podłoża, bez zagęszczeń cytoplazmy, pojedyncze komórki rozerwane	2
próba negatywna	6	(rys. 15)	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek, brak zahamowania wzrostu komórek	0

PL 229 593 B1

T a b e l a 7

Materiał	Ilość oznaczeń (n)	Wyciąg	Opis zmian w hodowli Klej R_88	Ocena zmian w hodowli
klej R_88	6	100% (rys. 19)	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek i zmian kształtu, nieznaczne zahamowanie wzrostu komórek	0
	6	50% (rys. 20)	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek i zmian kształtu, nieznaczne zahamowanie wzrostu komórek	0
	6	25% (rys. 21)	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek i zmian kształtu, nieznaczne zahamowanie wzrostu komórek	0
	6	12,50% (rys. 22)	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek i zmian kształtu, nieznaczne zahamowanie wzrostu komórek	0

cd. tabeli 7

próba pozytywna	6	SLS 0,2 mg/ml (rys. 23)	całkowicie zniszczona hodowla komórkowa. Rozległa liza komórek	4
próba pozytywna	6	SLS 0,1 mg/ml (rys. 24)	całkowicie zniszczona hodowla komórkowa. Rozległa liza komórek	4
próba pozytywna	6	SLS 0,15 mg/ml (rys. 25)	nie więcej niż 70% komórek zaokrąglonych, komórki uległy lizie	4
próba pozytywna	6	SLS 0,05 mg/ml (rys. 26)	nie więcej niż 20% komórek zaokrąglonych, obkurczonych, odklejających się od podłoża, bez zagęszczeń cytoplazmy, pojedyncze komórki rozerwane	2
próba negatywna	6	(rys. 27)	pojedyncze wewnątrzcytoplazmatyczne ziarnistości, nie stwierdza się lizy komórek, brak zahamowania wzrostu komórek	0

P r z y k ł a d 8. Testy na zwierzętach

Właściwości zaprojektowanego kleju testowano na zwierzętach (uzyskano zgodę Lokalnej Komisji Etycznej we Wrocławiu, uchwała nr 60/2012 z dn. 17 października 2012 r. na badania doświadczalne na 20 królikach albinosach). Klej tkankowy poddany był badaniom przedklinicznym na zwierzętach - królikach albinosach, obojga płci i wadze ok. 3200-3500 g. Zwierzęta były hodowane i żywione w jednakowych warunkach (trzymane w osobnym pomieszczeniu w standardowych klatkach przeznaczonych do przetrzymywania królików laboratoryjnych w warunkach kontrolowanej wilgotności (4555%) oraz temperatury powietrza (18-25°C). Posiadły dostęp bez ograniczeń do standardowej paszy granulowanej dla królików oraz świeżej wody.

Przekazany do badań klej R_88 przed zabiegami operacyjnymi na zwierzętach był sterylizowany UV. Klej tkankowy Histoacryl - blue stanowił model porównawczy dla zaprojektowanego kleju R_88. Klej Histoacryl - blue używany jest w sklerotyzacji żylaków; zarówno na krwawiące jak i niekrwawiące żylaki. Królikom do żyły brzeżnej ucha wstrzyknięte zostały kleje w ilości 0,5 ml (igła 0,7 x 30 micropoint).

P r z y k ł a d 8.1. Badania z zastosowaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

Mikrostruktura powierzchni zaprojektowanego kleju i jej zachowanie w implantowanym miejscu - żyle króliczego ucha została zbadana za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, Phenom Pro TM. Wykonano serię zdjęć SEM obrazujących żyłę z klejem w okresie 14 dni, 30 dni, 90 dni od implantacji.

PL 229 593 B1

Obserwacje mikroskopowe pomogły zbadać zachowanie kleju zaaplikowanego w uchu zwierzęcia. Zdjęcia ze skaningowego mikroskopu elektronowego żyły brzeżnej wypełnionej klejem dały obraz spoiny klejowej, bez spękań, pomarszczeń, nie nastąpiło rozwarstwienie spolimeryzowanego kleju przez cały czas trwania eksperymentu. Klej R_88 ma dobrą adhezję do ściany żyły tworząc mocne wiązania kohezyjne ponieważ w miejscu sklejonym w żyle po przepukleniu i rozerwaniu destrukcja odbywa się nie w warstwie klejowej lecz w warstwach żyły. Klej po 14, 30, 90 dniach był w postaci twardej spolimeryzowanej masy klejowej, mocno zespolony ze ścianą żyły. Obserwowane próbki zaimplantowanego kleju metodą SEM pozwalają na oszacowanie erozji wywołanej środowiskiem biologicznym. Nie zaobserwowano procesów degradacyjnych kleju (brak mikropęknięć, szczelin, rozwarstwień, pęcherzy i pustek - efekt zmian chemicznych związanych z wydzieleniem niskocząsteczkowych produktów gazowych, nie stwierdzono łuszczenia kleju), klejowa spoina nie rozwarstwiała się co mogłoby mieć wpływ na obniżenie parametrów mechanicznych i degradacji.

P r z y k ł a d 8.2. Wyniki badań pooperacyjnych

W przebiegu pooperacyjnym zwierzęta nie otrzymywały żadnych leków. W czasie pierwszych dni po operacji w skórze w okolicy rany można w obu przypadkach zaobserwować lekkie zaczerwienienie. Żyła wypełniona klejem R_88 po 7 dniach po operacji, jest bardziej miękka, elastyczna, mniej napięta i zaczerwieniona, nie staje się nadwrażliwa na dotyk niż bezpośrednio po zabiegu. Gojenie się rany w obrębie ucha następowało szybko, wyczuwalne było pod skórą wzdłuż żyły wałowate zgrubienie w postaci elastycznej masy tworzącej trwałe uszczelnienie. W żadnym przypadku nie stwierdzono infekcji miejsca implantowanego, obrzęku, objawów zapalnych i ropienia rany pooperacyjnej, nie stwierdzono zmian w wyglądzie, zmian zapalnych skóry wraz z przebarwieniami miejsca implantowanego. Nie zaobserwowano żadnych odczynów toksycznych ani alergicznych. Palpitacyjnie wyczuwano twarde, elastyczne grudki kleju silnie zespolone z żyłą, nie odnotowano zjawiska przemieszczania kleju w obrębie żyły samoistnie, powodując asymetrię miejsca wszczepu.

Po 14 dniach obserwacji nie odnotowano miejscowych reakcji zapalnych tkanki, nie stwierdzono obrzęku ucha, łuszczenia, silnego podrażnienia czy martwicy. W otoczeniu miejsca implantowanego nie pojawiły się cechy alergizacji (rumień, pęcherzyki, grudki) brak świądu w otoczeniu implantowanego miejsca, miejscowych reakcji zapalnych tkanki, nie stwierdzono obrzęku, łuszczenia, silnego podrażnienia czy martwicy.

P r z y k ł a d 8.3. Wyniki badań histologicznych

Z pobranych fragmentów uszu w terminach 14 dni, 30 dni, 90 dni od wstrzyknięcia kleju, sporządzono preparaty obejmujące implantowane materiały wraz z otaczającymi tkankami. Pobrany materiał był poddany obróbce histologicznej. Materiał do badań był utrwalany przez 48 h w 5% wodnym roztworze formaldehydu mrówkowego zobojętnionego buforem fosforanowym w pokojowej temperaturze. Preparaty kolejno umieszczano w alkoholu 70% i 96%. Z tak przygotowanych wycinków tkanek usuwano zbędne skrawki. Kolejnym etapem było trzykrotne odwadnianie w szeregu acetonowym trzy kąpiele po 90 minut w temperaturze 60°C oraz dwie kolejne kąpiele: karboksylowa oraz ksylenowa po 45 minut każda w temperaturze pokojowej. Po takim przygotowaniu tkanki zatapiano w bloczki parafinowe. Na mikrotomie (firmy Leica 2125RT) ścinano skrawki o grubości około 4 μm. Sporządzone preparaty barwiono Hematoksyliną (metoda Van Giesona (VG)). Otrzymano 100 preparatów histologicznych, które analizowano mikroskopowo wykorzystując mikroskop świetlny Axioscop (Zeiss) przy zastosowaniu różnych powiększeń, charakterystyczne obrazy histologiczne dokumentowano fotograficznie.

Zestawienie porównawcze przedstawiające zachowanie zaklejonej żyły klejem R_88, Histoacryl® (klej kontrolny stosowany na krwawiące i niekrwawiące żylaki). Wyniki badań histologicznych były identyczne zarówno po 14 dniach, 30 dniach i 90 dniach po zabiegu operacyjnym we wszystkich preparatach histologicznych stwierdzono obraz makroskopowy - prawidłowej skóry, tkanki chrzęstnej oraz naczyń krwionośnych w świetle naczyń widoczne liczne erytrocyty. Zestawienie porównawcze przedstawiające zachowanie żyły obok zaklejonego miejsca klejem R_88, Histoacryl® po 14 dniach, 30 dniach, 90 dniach wykazało obraz mikroskopowy prawidłowej skóry, tkanki chrzęstnej oraz naczyń krwionośnych o nieco poszerzonym świetle. W świetle naczyń widoczne grupy erytrocytów. Kompozycja okazała się mieć bardzo użyteczne właściwości podczas doświadczeń przeprowadzonych u zwierząt oraz jest bardzo dobrze tolerowana bez żadnych działań ubocznych i niepożądanych po 90 dniu od operacji.

Claims

1. Kompozycja kleju tkankowego do zamykania lub uszczelniania niewydolnych naczyń układu żylnego lub wrodzonych anomalii naczyniowych zawierająca:

a) od 85-86% wag. poli(metylo-winylo-siloksanu);

b) 5,4-6,5% wag. dwutlenku krzemu;

c) 8,5-8,6% wag. związku sieciującego;

przy czym stosunek poli(metylo-winylo-siloksanu) do dwutlenku krzemu wynosi od 13:1 do 16:1.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że lepkość poli(metylo-winylo-siloksanu) wynosi 18 000 mPa-s - 23 000 mPa-s w temperaturze 25°C.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że powierzchnia BET dla dwutlenku krzemu wynosi 175-225 m²/g.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że związkiem sieciującym jest katalizator platynowy.

5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera 85% wag. poli(metylo-winylosiloksanu), 6,5% wag. dwutlenku krzemu, 8,5% wag. platynowego katalizatora.

6. Sposób otrzymywania kompozycji kleju tkankowego do zamykania lub uszczelniania niewydolnych naczyń układu żylnego lub wrodzonych anomalii naczyniowych jak określono w zastrz. 1, obejmujący:

b) homogenizowanie mieszaniny,

c) odstawienie mieszaniny na 12 h,

d) dodanie związku sieciującego,

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że dwutlenek krzemu przed wprowadzeniem do lepiszcza suszy się przez 48 h w temp. 50°C w suszarce laboratoryjnej.

8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że związkiem sieciującym jest katalizator platyny.

9. Kompozycja kleju tkankowego jak określono w zastrz. 1 do leczenia niewydolnych naczyń układu żylnego lub wrodzonych anomalii naczyniowych.